СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСА ЭБОЛА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2016 года по МПК G09B23/28 A61K38/21 A61P31/12 

Изобретение относится к способам неспецифической профилактики и экстренной профилактики вируса Эбола и может быть использовано в медицине и экспериментальной вирусологии.

В настоящее время эффективные средства, методы лечения и профилактики лихорадки Эбола, являющейся тяжелым, особо опасным заболеванием с летальностью до 88%, отсутствуют.

Масштабы последней вспышки заболевания в Гвинее, вызванного вирусом Эбола, а также опасения по поводу биотерроризма и завозных случаев геморрагических лихорадок вновь и вновь свидетельствуют об актуальности поиска и разработки новых эффективных профилактических и лечебных препаратов против заболеваний, вызываемых филовирусами (Bausch D., Sprecher A., Jeffs В., Boumandouki P. Treatment of Marburg and Ebola hemorrhagic fevers: A strategy for testing new drugs and vaccines under outbreak conditions / Antiviral Research 78 (2008) 150-161). Все это вызывает необходимость интенсивного развития исследований по пониманию патогенеза геморрагических лихорадок, их эпидемиологии и мерам предотвращения вспышек этой группы заболеваний. Однако, несмотря на многолетние усилия, в настоящее время отсутствуют клинически апробированные вакцины или специфические противовирусные препараты против геморрагической лихорадки, вызываемой вирусом Эбола (ГЛВВЭ).

На небольшом количестве случаев была показана эффективность лечения заболевших на основе сыворотки или препаратов крови реконвалесцентов (Mupapa, K., Mukundu, W., Bwaka, М.А., Kipasa, М., De Roo, A., Kuvula, K., Kibadi, K., Massamba, M., Ndaberey, D., Colebunders, R., Muyembe-Tamfum, J.J., 1999b. Ebola hemorrhagic fever and pregnancy. J. Infect. Dis. 179 (Suppl. 1), S11-S12).

Известно использование сыворотки крови людей, переболевших лихорадкой Эбола, в сочетании с большими дозами интерферона для лечения больного лихорадкой Эбола, заразившегося в результате случайного укола пальца (Emond R.T.D., Evans В., Bower E.T.W. et al. // Brit. Med.J. - 1977, - vol. 2. N 6086, - p. 541-544).

Однако данная стратегия лечения ограничена количеством самих реконвалесцентов и необходимостью контролировать сыворотки на контаминацию вирусами гепатита, ВИЧ и др.

Известно использование препарата, содержащего иммуноглобулин против лихорадки Эбола, обладающего вируснейтрализующей активностью к вирусу Эбола и используемого для экстренной профилактики лихорадки Эбола (патент РФ №2130318, МПК A61K 39/42, опубл. 20.05.1999 г.). Препарат представляет собой 9-11%-ный раствор иммуноглобулинов гипериммунной сыворотки крови лошади, содержащей антитела к вирусу Эбола и полученной после 3-х и более циклов иммунизации животного нативным вирусом Эбола, с содержанием гамма-глобулиновой фракции в количестве от 0,081 до 0,110 г/мл препарата, что соответствует не менее 90% от общего содержания белка, характеризующийся титром вируснейтрализующих антител не менее 1:4096, имеющий величину рН 7,0-7,5, содержащий в качестве неспецифических примесей альбумин, альфа- и бета-глобулиновые фракции в количестве не более 10% и остаточный этиловый спирт в количестве не более 4%.

Однако вышеприведенные аналоги имеют недостаточную эффективность использования, высокую стоимость используемых иммунных сывороток.

На основании накопленных клинических и лабораторных данных было сделано предположение, что, если в процессе реализации своей стратегии размножения филовирусы способны подавлять продукцию эндогенного интерферона типа 1, то введение экзогенного интерферона а должно оказаться очень эффективным (Kudoyarova-Zubavichene N.M., Sergeyev N.N., Chepurnov A.A., Netesov S.V., 1999. Preparation and use of hyperimmune serum for prophylaxis and therapy of Ebola virus infections. J. Infect. Dis. 179 (Suppl. 1), S218-S223). Однако в экспериментах с использованием различных животных моделей интерферон показал неодинаковую эффективность. Так, на модели белых мышей, инфицированных адаптированным вирусом Эбола штамм Заир, эффективность интерферона α была наиболее высокой в случае введения не позднее 2-го дня после заражения и при ежедневном введении в течение 5-7 дней (Bray М., Paragas J. Experimental therapy of filovirus infections Antiviral Research 54 (2002) 1-17).

Известен способ профилактики инфекции Эбола у обезьян, зараженных внутримышечным способом, который включает в себя введение человеческого интерферона (внутримышечно) за 2 сут до заражения или через 1 ч после инфицирования с последующим продолжением курса профилактической обработки (Bowen E.T.W. Baskerville A. // Ebola virus haemorragic fever. Ed. by Pattyn S.R. North Holland, Amsterdam, N-Y. Elsevier, 1978, p. 245 251).

Однако в результате этих опытов не было отмечено различий в клинике и исходе заболевания между опытными и контрольными группами обезьян.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ профилактики аэрогенной инфекции вируса Эбола, включающий внутримышечное введение в организм морских свинок препарата, содержащего интерферон, до начала или в период возможного попадания возбудителя инфекции в организм аэрогенным путем (патент РФ №2105565, МПК A61K 38/21, опубл. 27.02.1998 г.). Одновременно с внутримышечным введением препарата интерферона в организм дополнительно осуществляют интраназальное введение этого же препарата в тех же дозах, причем в качестве препарата, содержащего рекомбинантный интерферон альфа-2 человека, используют реаферон, который вводят в организм не чаще двух раз в сутки в суммарных дозах: реаферон (1,0-100,0)×10⁶ МЕ/кг.

Однако для достижения ингибирования вируса Эбола требуются высокие дозы реаферона (до 100×10⁶ МЕ/кг), что оказывает токсическое действие на организм морских свинок.

Техническим результатом является снижение профилактической и лечебной дозы рекомбинантного интерферона альфа-2 человека для достижения ингибирующего эффекта при профилактике и на ранних стадиях развития инфекции.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе ингибирования инфекционной активности вируса Эбола в эксперименте на морских свинках, включающем введение в организм препарата рекомбинантного интерферона альфа-2 человека до начала или в период попадания возбудителя инфекции в организм животного в суточной дозе, достаточной для проявления противовирусным препаратом ингибирующей активности, согласно изобретению в качестве препарата рекомбинантного интерферона альфа-2 человека используют препарат в липосомальной форме «Реаферон-Липинт» в суточной дозе от 200000 до 300000 МЕ/кг. При моделировании профилактики и лечения вирусной инфекции препарат в липосомальной форме «Реаферон-Липинт» вводят за 12 и 1 час до заражения вирусом Эбола, в момент заражения (в течение 1 часа после заражения) и через 12, 24, 36, 48, 60, 72 часов после заражения, а при моделировании лечения вирусной инфекции препарат вводят в момент заражения (в течение 1 часа после заражения) и через 12, 24, 36, 48, 60, 72 часов после заражения вирусом Эбола. Для оценки ингибирующего эффекта животных заражали вирусом Эбола внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл дозой 10-30 МИД₅₀.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

На фиг. 1 представлен график накопления вируса Эбола в плазме крови морских свинок в различные сроки. Для группы 1 использовалась профилактическая и лечебная схема введения препарата, для группы 2 -только лечебная схема. Контрольная группа препарат не получала. На фиг. 2 приведен график накопления вируса Эбола в печени морских свинок в различные сроки. Для группы 1 использовалась профилактическая и лечебная схема введения препарата, для группы 2 - только лечебная схема. Контрольная группа препарат не получала.

Все инфекционные работы с вирусом проводили на базе лаборатории коллекции вирусов I-й группы патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Лаборатория имеет лицензию и санитарно-эпидемиологическое разрешение на проведение работ с данным вирусным агентом. Работу проводили в соответствии с рекомендациями ВОЗ и требованиями Санитарных правил по работе с возбудителями I-II групп патогенности с требуемым уровнем биобезопасности - BSL4. Вирус. Вирус Эбола штамм МС 8 получен путем восьми серийных пассажей штамма Заир 76 (Maynga) вируса Эбола на морских свинках. Штамм МС 8 задепонирован в Государственной коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Препараты. «Реаферон-Липинт» (липосомальная форма интерферона) в виде лекарственной аптечной формы - капсулы, активность - 500000 МЕ/мл. Производитель ЗАО «Вектор-Медика». Препарат «Реаферон-Липинт» и «Липинт-Плацебо» были получены непосредственно от производителя.

Перед применением препарат был разведен в дистиллированной воде до требуемой концентрации.

Животные. Свободные от патогенной микрофлоры морские свинки массой 200-250 г были получены из питомника лабораторных животных ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово, Россия), для проведения этого исследования.

Их содержали на стандартном рационе. Исследования на животных проводили в сертифицированной лаборатории с уровнем биологической безопасности BSL4.

Инфицирование и лечение животных. Для определения инфицирующей дозы МИД₅₀, морских свинок заражали в/бр в объеме 0,5 мл серией 10-тикратных разведений вируса. Количество испытанных доз было 5 и на каждую дозу заражения брали по 8 свинок. На 6-е сут п/з с соблюдением асептических условий производили забор крови, затем животных подвергали эвтаназии с помощью хлороформа, производили вскрытие и забирали легкие. Легкие взвешивали, гомогенизировали и готовили 10% суспензию на среде DMEM с добавлением антибиотиков. Центрифугировали при 5 тыс. об/мин в течение 10 минут для избавления от клеточных обломков ткани легкого. По 2 аликвоты каждой пробы были помещены на хранение при -80°С. Наличие вируса в легких мышей определяли путем титрования на культуре клеток Vero, как описано выше. Изучение противовирусного действия препарата in vivo проводили на нескольких группах животных. Препарат вводился как по профилактической схеме, так и терапевтической. В этом исследовании животных заражали в/бр в объеме 0,5 мл дозой 10-30 МИД₅₀.

1-я группа. Профилактика и лечение. Препарат вводится за 12 и 1 час до заражения вирусом, в момент заражения (в течение 1 часа после заражения) через 12, 24, 36, 48, 60, 72 часов п/з.

2-я группа. Лечение. Препарат вводится в момент заражения (в течение 1 часа после заражения) через 12, 24, 36, 48, 60, 72 часов п/з.

3-я группа. Контрольная группа без заражения (контроль стада). Препарат (физ. раствор) вводится за 12 час и 1 час до начала эксперимента и через 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 после начала эксперимента без заражения.

4-я группа. Контрольная группа с заражением. Препарат «Липинт-Плацебо» вводится за 12 час и 1 час до заражения и через 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 час п/з.

Во всех группах ежедневно, начиная с 2-х суток и по 6-е сутки включительно, у 3-х свинок производили забор крови и легких для определения концентрации вируса.

Контроль использованной заражающей дозы в данном опыте проводили с использованием 20 свинок.

Концентрацию вируса в плазме крови и легких определяли путем титрования на культуре клеток Vero, как описано выше. Использовали 10-тикратные разведения от 10^-1 до 10^-6 не менее чем в 4 повторах на каждое разведение пробы. Концентрацию оценивали в ЦПД₅₀/мл.

Противовирусный эффект препарата оценивали по степени подавления репродукции вируса Эбола на 2, 3, 4, 5 и 6 сутки п/з.

Анализ данных. Значение 50% инфекционной дозы (ИД₅₀) вируса Эбола для морских свинок при в/бр заражении и 50% тканевой цитопатической инфекционной дозы (ЦПД₅₀) рассчитывали по методу Рида-Менча и выражали как среднее lgЦПД₅₀/мл ± стандартное отклонение (SD). Определение достоверности различий значений титров вируса между экспериментальными группами и/или контролем было проведено при помощи Критерия Стъюдента.

Изучение противовирусного действия препарата «Реаферон-Липинт» (липосомальная форма интерферона) в экспериментах in vivo на морских свинках

Для определения значения инфицирующей дозы (ИД₅₀) пять групп животных по 8 морских свинок в каждой, были заражены в/бр серией 10-кратных разведений. Объем инокулята - 0,5 мл. Инфекционный титр рабочего стока вируссодержащей суспензии, определенный на культуре клеток Vero, составлял 4,8 lgЦПД₅₀/мл. Результаты эксперимента представлены в табл. 1.

Для определения ИД₅₀ была использована формула Спирмана-Кербера [26]. В результате расчета получено значение - Lg ИД₅₀=-2,63±0,25. Зная инфекционный титр ВСС на культуре клеток Vero, значения инфицирующей дозы (ИД₅₀) для в/бр заражения морских свинок можно выразить в ЦПД₅₀, т.е. 1 ИД₅₀ равна примерно 74 ЦПД₅₀. Величине заражающей дозе 30 ИД₅₀/животное, которое мы планируем использовать при изучении противовирусной активности препарата «Реаферон-Липинт» в экспериментах in vivo, будет соответствовать 2 224 ЦПД₅₀ или 10^3,35 ЦПД₅₀.

Как видно из табл. 1, 0,5 мл 10^-1 разведения рабочего стока вируса будет соответствовать примерно дозе заражения 30 ИД₅₀/животное. Это разведение и было использовано для заражения морских свинок при изучении противовирусной активности препарата «Реаферон-Липинт».

Схема введения профилактическая и/или терапевтическая и время введения препарата подробно была описана выше по тексту. Препараты вводили животным перорально в объеме 1 мл/животное. Доза препарата Реаферон-Липинт составляла 50000 МЕ/животное (200000-300000 МЕ/кг).

Животных из каждой группы содержали в раздельных садках с крышкой, снабженной НЕРА-фильтром, чтобы избежать постконтактную передачу вируса.

Концентрацию вируса в крови и печени свинок определяли путем титрования на культуре клеток Vero. Результаты экспериментов представлены в табл. 2 и 3, фиг. 1 и 2.

Результаты, представленные в табл. 2, 3 и фиг. 1 и 2 показывают, что препарат «Реаферон-Липинт» обладает способностью эффективно задерживать и подавлять репликацию вируса Эбола в организме морских свинок.

При схеме введения препарата «профилактика-лечение» вирус обнаруживается позднее на двое суток, чем в группе с контрольными животными (плацебо). На 4-е сутки после заражения вирусная нагрузка (титр) в данной группе в 100 раз ниже, чем в группе с контрольными животными (плацебо). На последующие сутки эта тенденция сохраняется, но в меньшей степени - снижение титра вируса примерно в 10 раз. Это позволяет сделать хорошую прогностическую оценку. Возможно, что животные из группы «профилактика-лечение» могли выжить.

Следует отметить, что и в группе «лечение» инфекция развивается на 1 сутки позднее, и на следующие сутки заболевания наблюдается меньшая вирусная нагрузка у животных, чем в группе с контрольными животными. Но начиная с 3-их суток нет различий по вирусной нагрузке по сравнению с контрольной группой.

Отсутствие вируса в контрольной группе без заражения свидетельствует о том, что при содержании животных в инфекционном виварии не происходит неконтролируемой передачи вируса и не происходит «перезаражения» животных.

Таким образом, в экспериментах in vivo на морских свинках с адаптированным штаммом МС 8 вируса Эбола показано, что препарат «Реаферон-Липинт» (липосомальна форма интерферона) обладает способностью эффективно задерживать и подавлять репликацию вируса Эбола в организме экспериментальных животных. При схеме введения препарата «профилактика-лечение» вирус обнаруживается позднее на двое суток, чем в группе с контрольными животными (плацебо). На 4-е сутки после заражения вирусная нагрузка (титр) в данной группе в 100 раз ниже, чем в группе с контрольными животными (плацебо). На последующие сутки эта тенденция сохраняется, но в меньшей степени - снижение титра вируса примерно в 10 раз. Это позволяет сделать хорошую прогностическую оценку.

Эффективное лечение лихорадки Эбола может потребовать комбинации препаратов, которые будут подавлять репликацию вируса в клетках-мишенях (моноцитах/макрофагоподобных клетках), тем самым уменьшая патологические эффекты, например коагулопатию.

Использование препарата «Реаферон-Липинт» (липосомальная форма интерферона) на ранних стадиях инфекции или в профилактических целях при контакте с больными людьми (при подтвержденном тесном контакте) может предотвратить заболевание или улучшить клинический исход. Кроме того, снижение вирусной нагрузки, возможно, приведет к снижению контаминации окружающей среды и, таким образом, снизит риск вторичной передачи.

Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной вирусологии, и может быть использовано для ингибирования инфекционной активности вируса Эбола в эксперименте. Способ включает введение морским свинкам препарата рекомбинантного интерферона альфа-2 человека до начала или в период попадания возбудителя инфекции в организм животного в суточной дозе, достаточной для проявления противовирусным препаратом ингибирующей активности. Для этого используют препарат в липосомальной форме «Реаферон-Липинт» в суточной дозе от 200000 до 300000 МЕ/кг. При моделировании профилактики и лечения вирусной инфекции этот препарат вводят за 12 и 1 час до заражения вирусом Эбола, в момент заражения и через 12, 24, 36, 48, 60, 72 часов после заражения вирусом Эбола. Способ обеспечивает достижение ингибирующего эффекта при снижении профилактической и лечебной дозы рекомбинантного интерферона альфа-2 человека. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 ил.

1. Способ ингибирования инфекционной активности вируса Эбола в эксперименте на морских свинках, включающий введение в организм препарата рекомбинантного интерферона альфа-2 человека до начала или в период попадания возбудителя инфекции в организм животного в суточной дозе, достаточной для проявления противовирусным препаратом ингибирующей активности, отличающийся тем, что в качестве препарата рекомбинантного интерферона альфа-2 человека используют препарат в липосомальной форме «Реаферон-Липинт» в суточной дозе от 200000 до 300000 МЕ/кг, а при моделировании профилактики и лечения вирусной инфекции препарат в липосомальной форме «Реаферон-Липинт» вводят за 12 и 1 час до заражения вирусом Эбола, в момент заражения и через 12, 24, 36, 48, 60, 72 часов после заражения вирусом Эбола.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что животных заражают вирусом Эбола внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл дозой 10-30 МИД₅₀.