СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ГРАНУЛ, СОДЕРЖАЩИХ МИЦЕЛИАЛЬНЫЕ ГРИБЫ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/14 A01N63/04 C12R1/645 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области средств защиты растений.

В частности, настоящее изобретение относится к осуществляющемуся в промышленном масштабе способу производства гранул или пеллет, содержащих мицелиальные грибы, а точнее - грибы-нематофаги.

Уровень техники

В общепринятую практику все в большей степени входит применение микроорганизмов и, в частности, грибов в качестве средств защиты растений.

Продукты на основе грибов уже предлагаются на рынке для борьбы с насекомыми, фитопатогенными грибами и другими паразитами сельскохозяйственных культур.

Например, в патенте US 5811092 описаны агенты-нематофаги, предназначенные для борьбы с нематодами родов Meloidogyne, Hetherodera и Ditylenchus и содержащие особые штаммы Arthrobotrys conoides Dreschsler, мицелиального гриба.

Указанные нематоды вызывают тяжелые болезни растений и грибные болезни и могут нанести большой экономический ущерб, поскольку они могут привести к потере 50-70% урожая.

Применение грибов-нематофагов в качестве альтернативы обычным противопаразитарным химикатам (например, метилбромиду, трихлорнитрометану, дихлорпропену и т.п.), вносимым в почву до выращивания растений, или карбаматам, вносимым на культурные растения, позволяет устранить серьезные недостатки, такие как стерилизация почвы, нарушение экологического равновесия и возможная токсичность для людей и животных.

Поэтому грибы-нематофаги являются особенно подходящими для применения в земледелии, в котором используются только органические удобрения, но в настоящее время существуют значительные затруднения в их производстве в промышленном масштабе с высокими выходами и в форме, обеспечивающей их удовлетворительную сохранность до применения.

В действительности в предшествующем уровне техники грибы-нематофаги готовят в подходящей культуральной среде. Затем грибы-нематофаги совместно с их культуральной средой или непосредственно разбрасывают по обрабатываемой почве или до применения хранят в культуральной среде. Однако при этих условиях хранения грибы-нематофаги продолжают довольно быстро размножаться и через непродолжительный период времени (1-2 недели), когда истощатся источники питательных веществ, они гибнут.

Задачей настоящего изобретения являлась разработка способа производства мицелиальных грибов в промышленном масштабе с высокими выходами при низкой стоимости и в форме, обеспечивающей их стабильность и жизнеспособность в течение длительных периодов хранения до внесения на обрабатываемую почву.

Краткое изложение сущности изобретения

Идея решения такой технической задачи заключалась во включении мицелиальных грибов в подходящие твердые композиции, которые обеспечат их стабильность и жизнеспособность в течение длительных периодов времени. В связи с этим показано, что гранулированные композиции или пеллеты, содержащие мицелиальные грибы, являются пригодными для задач настоящего изобретения.

В свете изложенного выше техническая задача, лежащая в основе настоящего изобретения, решена с помощью способа производства гранул или пеллет, содержащих мицелиальные грибы, включающего стадии:

- отбора и выращивания мицелиальных грибов в подходящей культуральной среде в течение заранее заданного периода времени,

- смешивания указанной культуральной среды, после указанного заранее заданного периода времени, с желирующим агентом и по меньшей мере одним носителем с получением смеси,

- желирования указанной смеси с помощью проводимого путем прибавления по каплям взаимодействия с раствором, содержащим соль кальция, что приводит к получению желированных пеллет или гранул, содержащих указанные мицелиальные грибы,

- сушки указанных желированных пеллет или гранул до влажности, составляющей 13-18%.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение будет дополнительно описано с помощью ряда типичных вариантов осуществления, приведенных для иллюстрации, а не для наложения ограничений.

До перехода к иллюстративным примерам может оказаться полезным описание материалов, используемых при выполнении различных стадий производственного способа, предлагаемого в настоящем изобретении.

Мицелиальные грибы, применяющиеся в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, относятся к семейству Moniliales, предпочтительны мицелиальные грибы Arthrobotrys conoides Dreschsler.

Культуральная среда для мицелиальных грибов включает по меньшей мере один источник углерода, выбранный из группы, включающей мелассу, солодовый экстракт и сахарозу, и по меньшей мере один источник органического азота, выбранный из группы, включающей дрожжевой экстракт и "жидкий кукурузный экстракт".

Предпочтительно, чтобы указанный выше по меньшей мере один источник углерода составлял от 70 до 85 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды, и указанный выше по меньшей мере один источник органического азота составлял от 15 до 30 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды.

Культуральная среда также может включать источник неорганического азота, представляющий собой нитраты или соли аммония. Указанный выше источник неорганического азота обычно постепенно прибавляют в культуральную среду во время выращивания грибов в количестве, не превышающем 10 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды, и обычно - от 5 до 8 мас.%.

Предпочтительная композиция культуральной среды содержит 75-85% солодового экстракта и 15-25% дрожжевого экстракта, значения приведены в мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды.

Другая предпочтительная культуральная среда содержит 60-65% мелассы, 10-15% сахарозы, 10-15% жидкого кукурузного экстракта и 10-15% дрожжевого экстракта. Предпочтительно, если такая культуральная среда дополнительно содержит от 5 до 8% источника неорганического азота, предпочтительно - вторичного кислого фосфата аммония.

Еще одна предпочтительная культуральная среда содержит 2 источника углерода, т.е. солодовый экстракт в количестве, составляющем 25-30%, и мелассу в количестве, составляющем 40-45%, а также жидкий кукурузный экстракт в количестве, составляющем 25-30%.

Солодовый экстракт получают путем проращивания зерен злаков (обычно ячменя). Во время проращивания образуются особые ферменты (амилазы), которые обеспечивают превращение крахмала в сахара. Солодовый экстракт содержит примерно 60% мальтозы, витамины и различные питательные микроэлементы.

Меласса является побочным продуктом сахарной промышленности и поступает в виде коричнево-черноватой вязкой жидкости, содержащей 10% воды, 35% сахарозы, 20% других сахаров и 15% зольных веществ.

Дрожжевой экстракт получают аутолизом Saccharomyces cerevisiae, и он поступает в виде бледно-желтого порошка, хорошо растворимого в воде. Дрожжевой экстракт содержит пептиды, свободные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, а также растворимые в воде витамины группы В.

Дрожжевой экстракт обладает общим содержанием азота, равным 10%, и содержанием α-амминового азота, равным 5%.

Жидкий кукурузный экстракт получают путем замачивания зерен кукурузы при 50°С в течение 24-48 ч в воде, содержащей диоксид серы. Этот реагент обеспечивает гидролиз белковой структуры, окружающей зерна крахмала, и обладает тем достоинством, что предотвращает размножение нежелательных микроорганизмов при замачивании. Жидкий кукурузный экстракт общим содержанием азота, равным 7%, и содержанием α-амминового азота, равным 1,7%, а также содержит 5% сахаров, 4% калия, 3% фосфора и 17% других неорганических веществ.

В способе производства, предлагаемом в настоящем изобретении, выращивание мицелиальных грибов в указанных выше культуральных средах предпочтительно проводить в течение 5-10 суток при постоянной температуре, равной 23-30°С.

Желирующий агент предпочтительно представляет собой раствор, содержащий альгинат натрия в концентрации, равной 1-2%, предпочтительно - 1,3 мас.% в пересчете на массу раствора. Такой раствор предпочтительно прибавлять в культуральную среду мицелиальных грибов в объемном соотношении культуральная среда:раствор альгината, составляющем от 40:60 до 60:40.

Как известно, альгинат натрия может активировать желирование жидкой смеси, к которой он прибавлен, в случае взаимодействия этой смеси с раствором, содержащим соли кальция.

Важным моментом является прибавление носителей в культуральную среду. В настоящем изобретении термин "носитель" означает и вещество, обеспечивающее стабильность и/или предоставляющее питательные вещества грибам, диспергированным в гранулах, так чтобы они оставались жизнеспособными при хранении и до использования, и "наполнитель", т.е. вещество придающее гранулам необходимую консистенцию и объем.

Предпочтительно, если указанные выше носители выбираются из группы, включающей диатомовую землю, разные типы муки и сахара.

Предпочтительным носителем является Celaton FPM 0,08. Это - коммерческий продукт на основе оболочек диатомовых водорослей (одноклеточных кремневых водорослей) с размером частиц около 0,8 мкм. Это вещество может впитывать определенное количество воды и поэтому способствует приданию необходимого объема готовым гранулам.

Из типов муки, которые можно использовать в качестве носителей в настоящем изобретении, наиболее предпочтительной является кукурузная мука. Она является натуральным продуктом, способным впитывать количество воды, намного превышающее ее объем, и в данном конкретном случае также способствует приданию необходимого объема готовым гранулам. Кроме того, кукурузная мука является важным источником питательных веществ для мицелиальных грибов, диспергированных в гранулах, и при их хранении, и при их разбрасывании по обрабатываемой почве.

В частности, применение кукурузной муки в качестве источника питательных вещество особенно предпочтительно в случае использования Arthrobotrys conoides Dreschsler, поскольку в этом случае неожиданно оказалось, что грибы образуют большее количество ловушек для нематод с последующим повышением эффективности их уничтожения.

Сахара эффективно обеспечивают жизнеспособность мицелиальных грибов при хранении вследствие стабилизации клеточных мембран. Из числа сахаров, которые можно использовать в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, особенно предпочтительной является сахароза.

В настоящем изобретении носители предпочтительно прибавлять в культуральную среду с помощью желирующего агента. На практике при использовании раствора альгината натрия в качестве желирующего агента носители предпочтительно прибавлять к указанному раствору альгината натрия в количестве, составляющем от 6% до 22 мас.% в пересчете на массу раствора. В особенно предпочтительном способе носители прибавляют к раствору альгината натрия в количестве, составляющем 15 мас.% в пересчете на массу раствора.

В способе, предлагаемом в настоящем изобретении, желирование смеси, содержащей мицелиальные грибы и соответствующую культуральную среду, а также активатор желирования и носители, предпочтительно выполнять путем проводимого по каплям прибавления указанной смеси к раствору соли кальция.

Соль кальция предпочтительно выбирать из группы, включающей хлорид кальция и глюконат кальция. Концентрация соли кальция в растворе составляет от 0,2 до 0,3 М и в случае хлорида кальция предпочтительно равна 0,25 М. При повышении концентрации соли кальция желирование обычно происходит быстрее.

Желированные гранулы или пеллеты, которые образуются при взаимодействии капель указанной выше смеси с заранее приготовленным раствором соли кальция, выдерживают в указанном выше растворе в течение заранее заданного периода времени, предпочтительно - 2-3 мин, чтобы завершить желирование. Извлечение желированных гранул или пеллет из раствора соли кальция проводят обычным образом, например, фильтрованием.

Сушку желированных гранул или пеллет можно с успехом провести в стерильном потоке воздуха при температуре, равной 25-30°С. Обычно желированные гранулы или пеллеты, полученные желированием капель смеси, прибавленной к заранее приготовленному раствору соли кальция, обладают влажностью, равной 80-90%. Такую влажность уменьшают путем сушки до значения, равного 13-18%. При этом гранулы приобретают необходимую консистенцию и объем, чему также способствуют носители, ранее прибавленные в культуральную среду.

Предпочтительно, чтобы в способе, предлагаемом в настоящем изобретении, получались гранулы или пеллеты, обладающие диаметром, равным 1-3 мм, что обеспечивает улучшенное распределение мицелиальных грибов по обрабатываемой почве.

Способ, предлагаемый в настоящем изобретении, можно с успехом осуществлять в промышленном масштабе с использованием оборудования, которое является недорогим и которое легко спроектировать. Подходящее оборудование, кратко описанное ниже в настоящем изобретении в качестве неограничивающего примера, включает реактор для выращивания необходимых мицелиальных грибов в подходящей культуральной среде, смеситель, в котором желирующий агент и носители смешиваются с культуральной средой с образованием смеси, устройства, пригодные для загрузки отмеренных количеств смеси в подходящие перфорированные элементы для формирования капель смеси, обладающих заранее заданным объемом, резервуар, содержащий водный раствор соли кальция, для сбора указанных выше капель и обеспечения их желирования и сушильный аппарат для сушки желированных гранул или пеллет, извлеченных из резервуара, содержащего водный раствор соли кальция.

Устройства для загрузки отмеренных количеств смеси могут, например, представлять собой перистальтический насос или аналогичные устройства, в которых перфорированными элементами могут быть трубки, на дне каждой из которых имеется отверстие заранее заданного диаметра, например 1-4 мм.

Важно, чтобы указанное выше оборудование эксплуатировалось в стерильных условиях, чтобы исключить загрязнение микроорганизмами, в особенности вредными для используемых мицелиальных грибов. Вещества, использующиеся для осуществления способа, предлагаемого в настоящем изобретении, в особенности вещества, прибавляемые в культуральную среду в смеси, перед использованием также должны быть надлежащим образом стерилизованы.

Гранулы или пеллеты, полученные способом, предлагаемым в настоящем изобретении, готовы для применения, и их достоинством является то, что содержащиеся в них мицелиальные грибы остаются стабильными и жизнеспособными в течение длительных периодов времени. Таким образом, указанные выше гранулы или пеллеты сами обеспечивают свою защиту или сохранность в течение длительного периода времени до использования и затем мицелиальные грибы сохраняют жизнеспособность, вполне удовлетворительную для применения, для которого они предназначены.

Длительность хранения гранул или пеллет, предлагаемых в настоящем изобретении, до их использования составляет более 8 недель и обычно составляет от 4 до 6 месяцев.

Приведенные ниже примеры осуществления способа, предлагаемого в настоящем изобретении, выполнены с мицелиальными грибами семейства Moniliales и предпочтительно - с мицелиальными грибами Arthrobotrys conoides Dreschsler.

ПРИМЕР 1

Выращивание мицелиальных грибов Arthrobotrys conoides Dreschsler проводили в реакторе объемом 2 л, содержащем 1,2 л культуральной среды.

Предпочтительно, если реактор включает круглодонный резервуар, снабженный лопастной мешалкой, устройствами нагрева и охлаждения, устройством подачи воздуха, а также датчиками рН, О₂ и температуры.

Среда содержит 20 г/л солодового экстракта и 4 г/л дрожжевого экстракта, и перед посевом конидий соответствующих грибов ее стерилизовали.

Культуру инкубировали в течение 6 суток после посева при температуре, равной примерно 27°°С.

Во время инкубации из культуральной среды отбирали пробы для определения сухой массы (г/л) и количества ростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды фильтровали, а затем сушили в сушильном шкафу при 100°С в течение 24 ч. Количество ростков определяли в пересчете на 1 мл культуральных сред.

Таким образом, в конце инкубационного периода получали почти 8 г/л грибов, содержащих 6×10⁹ ростков/л.

Затем культуральную среду, содержащую грибы, переносили в смеситель и в культуральную среду прибавляли 1800 мл водного раствора альгината натрия концентрации 1,3 мас.%, к которому прибавлен 6,6% раствор Celaton FPM 0,08 (в мас.% в пересчете на массу раствора).

Затем полученную смесь гомогенизировали в смесителе и после этого через перфорированную трубку (диаметр отверстия 1,6 мм) по каплям прибавляли в емкость, содержащую 0,25 М раствор хлорида кальция.

Таким образом получали желированные гранулы указанной выше смеси, которые выдерживали в растворе хлорида кальция в течение 3 мин.

По окончании периода выдерживания желированные гранулы отделяли декантацией и сушили на конвейерной ленте до влажности, составляющей 17%. Средний диаметр сухих гранул равнялся 2,2 мм.

Среднее количество ростков в сухих гранулах, определенное сразу же после их формирования, оставалось практически таким же, как и в конце инкубации мицелиальных грибов, что показывало, что после проведения грануляции, предлагаемой в настоящем изобретении, указанные выше ростки полностью сохранили жизнеспособность.

Указанные выше сухие гранулы хранили в течение 3 месяцев при комнатной температуре. По окончании периода хранения среднее количество жизнеспособных ростков составляло 50% от количества, обнаруженного после формирования гранул.

ПРИМЕР 2

В примере 2 исследование проводили по той же методике и при тех же экспериментальных условиях, что и в примере 1, с тем отличием, что в культуральную среду прибавляли 1800 мл водного раствора альгината натрия концентрации 1,3 мас.%, к которому прибавлен 6,6% раствор Celaton FPM 0,08 и 3,3% кукурузной муки (в мас.% в пересчете на массу раствора).

Средний диаметр сухих гранул равнялся 2,5 мм, и их влажность составляла 17%.

Среднее количество ростков в сухих гранулах, определенное сразу же после их формирования, оставалось практически таким же, как и в конце инкубации мицелиальных грибов, что показывало, что после проведения грануляции, предлагаемой в настоящем изобретении, указанные выше ростки полностью сохранили жизнеспособность.

Указанные выше сухие гранулы хранили в течение 3 месяцев при комнатной температуре. По окончании периода хранения среднее количество жизнеспособных ростков составляло 90% от количества, обнаруженного после формирования гранул, что позволяет эффективно применять сухие гранулы на почве в качестве средств защиты растений.

ПРИМЕР 3

В примере 2 исследование проводили по той же методике и при тех же экспериментальных условиях, что и в примере 1, с тем отличием, что в культуральную среду прибавляли 1800 мл водного раствора альгината натрия концентрации 1,3 мас.%, к которому прибавлен 6,6% раствор Celaton FPM 0,08 и 3,3% кукурузной муки и 5% сахарозы (в мас.% в пересчете на массу раствора).

Средний диаметр сухих гранул равнялся 2,9 мм, и их влажность составляла 17%.

Среднее количество ростков в сухих гранулах, определенное сразу же после их формирования, оставалось практически таким же, как и в конце инкубации мицелиальных грибов, что показывало, что после проведения грануляции, предлагаемой в настоящем изобретении, указанные выше ростки полностью сохранили жизнеспособность.

Указанные выше сухие гранулы хранили в течение 3 месяцев при комнатной температуре. По окончании периода хранения среднее количество жизнеспособных ростков составляло 100% от количества, обнаруженного после формирования гранул, что позволяет эффективно применять сухие гранулы на почве в качестве средств защиты растений.

Кроме того, в случае применения указанных выше гранул грибы более эффективно уничтожают нематоды вследствие того, что грибы формируют большее количество ловушек для этих нематод.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в качестве средств для защиты растений. Способ включает отбор и выращивание грибов Arthrobotrys conoides Dreschsler в подходящей культуральной среде. В культуральную среду добавляют желирующий агент и, по меньшей мере, один носитель с получением смеси. Осуществляют желирование указанной смеси с помощью проводимого путем прибавления по каплям взаимодействия с раствором, содержащим соль кальция. Полученные гранулы сушат до влажности, составляющей 13-18%. Способ позволяет получить гранулы, обеспечивающие стабильность и жизнеспособность мицелиальных грибов. 13 з.п. ф-лы.

1. Способ производства гранул, содержащих грибы Arthrobotrys conoides Dreschsler, включающий стадии:
отбора и выращивания грибов Arthrobotrys conoides Dreschsler в подходящей культуральной среде,
смешивания указанной культуральной среды после указанного заранее заданного периода времени с желирующим агентом и по меньшей мере одним носителем с получением смеси,
желирования указанной смеси с помощью проводимого путем прибавления по каплям взаимодействия с раствором, содержащим соль кальция, что приводит к получению гранул, содержащих указанные грибы,
сушки указанных гранул до влажности, составляющей 13-18%.

2. Способ по п.1, в котором указанная культуральная среда для грибов Arthrobotrys conoides Dreschsler включает по меньшей мере один источник углерода, выбранный из группы, включающей мелассу, солодовый экстракт и сахарозу, и по меньшей мере один источник органического азота, выбранный из группы, включающей дрожжевой экстракт и "жидкий кукурузный экстракт".

3. Способ по п.2, в котором указанный по меньшей мере один источник углерода составляет от 70 до 85 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды, и указанный по меньшей мере один источник органического азота составляет от 15 до 30 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды.

4. Способ по п.2, в котором указанная культуральная среда дополнительно включает источник неорганического азота.

5. Способ по п.3, в котором указанная культуральная среда дополнительно включает источник неорганического азота.

6. Способ по п.4, в котором указанный источник неорганического азота содержится в количестве, не превышающем 10 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды, и предпочтительно - от 5 до 8 мас.%.

7. Способ по п.1, в котором желирующий агент представляет собой раствор, содержащий от 1 до 2 мас.% альгината натрия.

8. Способ по п.7, в котором указанный раствор альгината натрия прибавляют в культуральную среду грибов Arthrobotrys conoides Dreschsler предпочтительно в объемном соотношении культуральная среда/раствор альгината, составляющем от 40:60 до 60:40.

9. Способ по п.1, в котором указанные носители выбирают из группы, включающей диатомовую землю, предпочтительно - Celaton FPM 0,08, разные типы муки, предпочтительно - кукурузную муку, и сахара.

10. Способ по п.9, в котором указанные носители включают по меньшей мере кукурузную муку.

11. Способ по п.9, в котором носители прибавляют в раствор альгината натрия в количестве, составляющем от 6 до 22 мас.% в пересчете на массу раствора.

12. Способ по п.10, в котором носители прибавляют в раствор альгината натрия в количестве, составляющем от 6 до 22 мас.% в пересчете на массу раствора.

13. Способ по п.1, в котором раствором, содержащим соль кальция, предпочтительно является водный раствор хлорида кальция или раствор глюконата кальция, обладающий концентрацией, равной 0,2-0,3 М.

14. Способ по п.1, в котором высушенные гранулы обладают средним диаметром, равным от 1 до 3 мм.