КУЛЬТУРАЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА НИТЧАТЫХ ГРИБОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/14 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области фитосанитарных агентов.

В частности, изобретение относится к культуральной среде для нитчатых грибов (гифомицетов), более конкретно к грибам-нематофагам.

Известный уровень техники

В настоящее время все более широкое применение находят микроорганизмы и прежде всего грибы в качестве фитосанитарных агентов.

В продаже уже имеются продукты на основе грибов, предназначенные для борьбы с насекомыми, фитопатогенными грибами и другими паразитами, характерными для сельскохозяйственных культур.

Например, в патенте US 5811092 описаны агенты-нематофаги, применяемые для борьбы с нематодами, относящимися к родам Meloidogyne, Hetherodera и Ditylenchus, которые представляют собой в основном штаммы нитчатого гриба Arthrobotrys conoides Dreschsler.

Указанные нематоды вызывают серьезные поражающие растительность и обусловливающие грибами заболевания и наносят большой экономический ущерб, что приводит к потере 50-70% урожая.

Применение грибов-нематофагов в качестве альтернативы общепринятым антипаразитическим химическим средствам (таким, например, как метилбромид, трихлорнитрометан, дихлорпропен и т.д.) для внесения в почву до ее обработки или карбаматов, которые наносят непосредственно на культуры, позволяет избежать серьезных проблем, таких как необходимость стерилизации почвы, нарушение экологического баланса и потенциальная токсичность для человека и животных.

Таким образом, грибы-нематофаги особенно пригодны для применения в «органическом земледелии», однако это является относительно дорогостоящим вследствие трудностей получения их в больших количествах в промышленном масштабе.

Следовательно, существует необходимость в создании более дешевых грибов-нематофагов, которые можно применять в сельском хозяйстве.

В основу настоящего изобретения была положена задача разработать культуральную среду для нитчатых грибов и прежде всего для грибов-нематофагов, которая дает возможность получать такие микроорганизмы с высоким выходом в промышленном масштабе и в течение коротких периодов времени, что позволяет существенно снизить стоимость конечного продукта.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно изобретению такую проблему решают с помощью культуральной среды для нитчатых грибов, которая содержит по меньшей мере один источник углерода, выбранный из группы, включающей мелассу, солодовый экстракт и сахарозу, и по меньшей мере один источник органического азота, выбранный из группы, включающей дрожжевой экстракт и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания.

Предпочтительно на долю вышеуказанного по меньшей мере одного источника углерода приходится от 70 до 85 мас.% сухой массы культуральной среды, а на долю вышеуказанного по меньшей мере одного источника органического азота приходится от 15 до 30 мас.% культуральной среды.

Культуральная среда, предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать также источник минерального азота, представляющий собой нитраты аммония или соли. Вышеуказанный источник минерального азота, как правило, добавляют в культуральную среду постепенно в течение периода роста грибов в количестве, составляющем не более 10 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды и, как правило, в количестве от 5 до 8 мас.%.

Предпочтительно в состав культуральной среды, предлагаемой в настоящем изобретении, входит солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.% (проценты даны, как указано в конце настоящего описания, в виде мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды).

В состав другой предпочтительной культуральной среды, предлагаемой в изобретении, входит меласса в количестве от 60 до 65%, сахароза в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 10 до 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%. Предпочтительно в состав такой культуральной среды входит также источник минерального азота в количестве от 5 до 8%, прежде всего вторичный кислый фосфат аммония.

В состав еще одной предпочтительной культуральной среды, предлагаемой в изобретении, входят два источника углерода, т.е. солодовый экстракт в количестве от 25 до 30% и меласса в количестве от 40 до 45%, а также жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 25 до 30%.

Подробное описание изобретения

Далее настоящее изобретение более подробно пояснено на примерах вариантов осуществления изобретения, приведенных с целью иллюстрации, но не ограничения его объема.

Перед описанием примеров авторы считают целесообразным дать некоторые определения, касающиеся компонентов культуральной среды, предлагаемой в изобретении.

В качестве источников углерода применяют солодовый экстракт и/или мелассу, и/или сахарозу.

Солодовый экстракт получают с помощью прорастания зерен хлебных злаков (как правило, ячменя). При прорастании образуются специфические ферменты (амилазы), которые обеспечивают превращение крахмала в сахара. В состав солодового экстракта входят мальтоза, витамины и многие микроэлементы в количестве, составляющем примерно 60%.

Меласса представляет собой побочный продукт сахарной промышленности и находится в форме коричневато-черной вязкой жидкости, содержащей воду в количестве 10%, сахарозу в количестве 35%, другие сахара в количестве 20% и золу в количестве 15%.

В качестве источников органического азота применяют дрожжевой экстракт и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания.

Дрожжевой экстракт получают путем аутолиза Saccharomyces cerevisiae и он находится в форме мелкодисперсного светло-желтого порошка, легко растворимого в воде. Дрожжевой экстракт содержит пептиды, свободные аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, а также водорастворимые витамины В-группы. В дрожжевом экстракте общее содержание азота составляет 10% и содержание α-амминового азота составляет 5%.

Жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до разбухания, получают путем замачивания зерен кукурузы в течение 24-48 ч при 50°С в воде, содержащей диоксид серы. Этот реагент позволяет разрушать белковую сеть, окружающую крахмальные зерна, и дает преимущество, заключающееся в предотвращении развития нежелательных микроорганизмов в процессе замачивания. В жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до набухания, общее содержание азота составляет 7% и α-аминового азота 1,7%, в ее состав входит также сахар в количестве 5%, калий в количестве 4%, фосфор в количестве 3% и различные минералы в количестве 17%.

При создании изобретения тестировали различные культуральные среды, содержащие различные указанные выше источники углерода и азота. Эти среды можно разделить на следующие три класса:

класс 1: среды, в которых основным источником углерода является солодовый экстракт;

класс 2: среды, в которых основным источником углерода является меласса;

класс 3: среды, в которых основным источником углерода являются солодовый экстракт и меласса.

Процентное содержание источника органического азота в средах, предлагаемых в изобретении, можно снижать путем замены части такого источника органического азота на источник неорганического азота (нитраты аммония или его производные), которые постепенно добавляют в небольших количествах в процессе культивирования.

Такое добавление неорганического азота в процессе культивирования обеспечивает лучшее снабжение микроорганизма питательными веществами и в случае нитчатых грибов усиление филаментов мицелия.

Замена части источника органического азота на источник неорганического азота дает также преимущество с точки зрения снижения стоимости производства, поскольку источники органического азота (дрожжевой экстракт и жидкость, полученная после замачивания зерен кукурузы до набухания, являются наиболее дорогостоящими компонентами культуральной среды, предлагаемой в изобретении).

Культуральную среду, предлагаемую в изобретении, особенно предпочтительно применять для получения нитчатых грибов семейства Moniliales. В приведенных ниже примерах применяли, в частности, нитчатые грибы Arthrobotrys conoides Dreschsler.

Пример 1

В этом примере описана культуральная среда класса 1.

Выращивание нитчатых грибов осуществляли в колбе Эрлена вместимостью 300 мл, содержащей 150 мл культуральной среды.

Среда содержала солодовый экстракт в концентрации 20 г/л и дрожжевой экстракт в концентрации 4 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.

Культивирование осуществляли в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.

На третий день из культуральной среды брали образцы для определения содержания сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.

Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 1.

Таблица 1 День рН Сухая масса (г/л) КОЕ/л 0 6 0 0,00 3 5,26 1,505 1,92×10⁸ 4 5,79 3,345 1,30×10⁹ 5 6,56 5,05 3,07×10⁹ 6 6,11 9,895 4,43×10⁹

Пример 2

Тест, описанный в примере 1, повторяли в миниреакторе объемом 2 л, содержащем 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 1. Экспериментальные условия были такими же, как и в примере 1, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.

Используемый реактор представлял собой круглодонный контейнер, снабженный лопастной мешалкой, нагревающими и охлаждающими устройствами, устройствами для продувки воздухом, а также зондами для измерения значения рН, концентрации О₂ и температуры.

Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 2.

Таблица 2 День рН Сухая масса (г/л) КОЕ/л 0 6 0 0,00 1 5,51 1,175 2,50×10⁶ 2 5,5 1,3825 1,80×10⁷ 3 6,61 1,59 8,50×10⁷ 4 5,4 4,03 9,60×10⁸ 5 5,13 4,29 1,27×10⁹ 6 5,08 5,625 3,10×10⁹ 7 5,5 7,848 6,08×10⁹

В результате по истечении семи дней культивирования получали примерно 8 г грибов на литр культуральной среды, содержащих 6,08×10⁹ отростков.

Пример 3

В данном примере описан тест, проведенный с культуральной средой, относящейся к классу 2.

Культивирование нитчатых грибов осуществляли в колбах Эрлена вместимостью 300 мл, содержащих 150 мл культуральной среды.

Среда содержала мелассу в количестве 25 г/л, сахарозу в количестве 5 г/л, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве 5 г/л и дрожжевой экстракт в количестве 5 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.

Культуру инкубировали в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.

Начиная с третьего дня, брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.

Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 3.

Таблица 3 День рН Сухая масса (г/л) КОЕ/л 0 5,07 0 0,0 3 4,87 1,58 3,2×10⁷ 4 4,20 3,82 1,0×10⁸ 5 6,46 6,76 1,0×10⁹ 6 6,98 9,995 3,5×10⁹

Пример 4

Тест, описанный в примере 3, повторяли согласно методу, описанному в примере 2, в миниреакторе вместимостью 2 л, который содержал 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 3. Экспериментальные условия были такими же, что и в примере 3, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.

Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 4.

Таблица 4 День рН Сухая масса (г/л) КОЕ/л 0 5,07 0 0,00 1 5,04 2,675 9,90×10⁷ 2 5,01 3,9 3,00×10⁸ 3 5,44 5,125 5,00×10⁸ 4 6,11 8,295 8,20×10⁸ 5 6,69 2,75 1,07×10⁹ 6 7,32 3,485 2,10×10⁹ 7 7,65 10,164 3,77×10⁹

Результаты, приведенные для периода времени после пятого дня, могут показаться аномальными, однако они обусловлены лишь избыточной концентрацией грибов в культуральной среде, что не позволяло далее отбирать гомогенные образцы.

Последний образец брали непосредственно из реактора.

В этом случае в течение семи дней получали более 10 г грибов на литр культуральной среды с содержанием отростков 3,77×10⁹.

Пример 5

В этом примере описан тест, проведенный с использованием культуральной среды класса 3.

Культивирование нитчатого гриба осуществляли в колбе Эрлена вместимостью 300 мл, содержащей 150 мл культуральной среды.

Среда содержала мелассу в количестве 15 г/л, солодовый экстракт в количестве 10 г/л и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве 10 г/л, и ее стерилизовали перед посевом конидий рассматриваемого гриба.

Культуру инкубировали в течение 6 дней после посева при температуре примерно 27°С.

Начиная с третьего дня, брали образцы культуральной среды для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.

Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 5.

Таблица 5 День рН Сухая масса (г/л) КОЕ/л 0 4,7 0 0,00 3 4,49 1,82 2,38×10⁷ 4 4,62 3,815 1,78×10⁸ 5 5,25 5,57 1,23×10⁹ 6 6,03 8,555 1,35×10⁹

Пример 6

Тест, описанный в примере 5, повторяли согласно методу, описанному в примере 2, в миниреакторе вместимостью 2 л, который содержал 1,2 л культуральной среды, описанной в примере 5. Экспериментальные условия были такими же, что и в примере 5, за исключением того, что сбор образцов начинали через один день после посева конидий.

Обобщение полученных результатов приведено ниже в таблице 6.

Таблица 6 День рН Сухая масса (г/л) КОЕ/л 0 4,7 0 0,00 1 4,61 2,905 5,60×10⁶ 2 4,7 3,085 6,00×10⁷ 3 4,56 3,265 1,23×10⁸ 4 6,11 5,295 3,20×10⁸ 5 5,99 5,88 7,00×10⁸ 6 6,94 6,305 9,50×10⁸ 7 7 10,026 2,22×10⁹

В течение семи дней получали более 10 г грибов на литр культуральной среды с содержанием отростков 2,22×10⁹.

Пример 7

Культуральную среду, описанную в примере 3, модифицировали, как указано ниже, для уменьшения содержания двух источников органического азота, которые являются наиболее дорогостоящими компонентами:

25 г/л мелассы;

5 г/л сахарозы;

2,5 г/л жидкости, полученной после замачивания зерен кукурузы до разбухания;

2,5 г/л дрожжевого экстракта.

В такой культуральной среде проводили тестирование культуры (А), с использованием указанного выше гриба с целью сравнения с результатами тестирования двух других культур (Б и В), в которых применяли такую же культуральную среду и в которые последовательно добавляли, начиная с четвертого дня, источник минерального азота.

В тесте Б. Начиная с четвертого дня (более конкретно, на четвертый, шестой и восьмой день), трижды добавляли по 0,21 г вторичного кислого фосфата аммония, так что общее количество указанного ингредиента составляло 0,63 г, а в тесте В, начиная с четвертого дня (более конкретно, на четвертый, шестой и восьмой день), трижды добавляли по 0,28 г, так что общее количество добавленного ингредиента составляло 0,84 г.

Тесты проводили в колбах Эрлена вместимостью 500 мл, содержащих 300 мл культуральной среды, которую стерилизовали перед посевом конидий.

На девятый и последний день культивирования общее содержание азота в культуральной среде (А) составляло 0,85 г/л, в то время как в средах, в которые добавляли вторичный кислый фосфат аммония (А и Б), оно составляло 1,05 г/л (А) и 1,26 г/л (Б) соответственно.

Начиная с третьего дня, из культуральных сред через каждые два дня брали образцы для определения сухой массы (г/л) и количества отростков (КОЕ/л). Для определения сухой массы 20 мл культуральной среды подвергали фильтрации и затем сушили в печи при 100°С в течение 24 ч. Количество отростков оценивали в 1 мл культуральной среды.

Обобщение полученных результатов дано в приведенной ниже таблице 7.

Таблица 7 День А рН А CM A КОЕ Б pН Б CM Б КОЕ В рН В CM В КОЕ 0 5,06 0,00 0,00 5,06 0,00 0,00 5,09 0,00 0,00 3 4,92 3,94 5,50×10⁶ 4,80 2,84 2,50×10⁴ 4,80 3,36 2,50×10⁴ 5 5,12 3,44 1,75×10⁸ 4,89 4,57 4,73×10⁸ 5,30 3,48 3,05×10⁸ 7 6,68 6,45 1,58×10⁹ 5,47 8,32 3,15×10⁹ 6,39 5,48 4,00×10⁹ 9 7,14 8,63 3,20×10⁹ 5,44 11,30 7,25×10⁹ 5,86 7,86 6,78×10⁹ CM = сухая масса (г/л)
КОЕ = количество отростков/литр

Как видно из приведенной выше таблицы, добавление источника минерального азота, прежде всего в небольших количествах (тест Б), позволяет существенно увеличивать количество сухой массы, которую получают, начиная с седьмого дня культивирования, и достигать более чем 100%-ного увеличения количества отростков, полученных в течение этого же периода культивирования.

Изобретение относится к биотехнологии. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys содержит солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.%, где указанные проценты представляют собой мас.% в пересчете на сухую массу указанной культуральной среды. Другая культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys содержит мелассу в количестве от 60 до 65%, сахарозу в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания, в количестве от 10 от 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%. Третья культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys содержит солодовый экстракт в количестве от 25 до 30 мас.%, мелассу в количестве от 40 до 45 мас.% и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания в количестве от 25 до 30%, в пересчете на сухую массу среды. Способ получения нитчатых грибов рода Arthrobotrys в промышленном масштабе заключается в том, что осуществляют посев конидий вышеуказанных грибов в культуральную среду и выдерживают культуральную среду при температуре 23-30°С в течение 5-10 дней для оценки репродукции и роста грибов. Изобретение позволяет получить через 7 дней культивирования сухую массу культивируемых грибов порядка 9-10 г при концентрации около 10⁹ КОЕ/л, 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 табл.

1. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys, содержащая солодовый экстракт в количестве от 75 до 85 мас.% и дрожжевой экстракт в количестве от 15 до 25 мас.%, где указанные проценты представляют собой мас.% в пересчете на сухую массу указанной культуральной среды.

2. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys, содержащая мелассу в количестве от 60 до 65%, сахарозу в количестве от 10 до 15%, жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания в количестве от 10 от 15% и дрожжевой экстракт в количестве от 10 до 15%.

3. Культуральная среда по п.2, дополнительно содержащая источник минерального азота в количестве от 5 до 8%.

4. Культуральная среда по п.3, в которой источник минерального азота представляет собой вторичный кислый фосфат аммония.

5. Культуральная среда для нитчатых грибов рода Arthrobotrys, содержащая солодовый экстракт в количестве от 25 до 30 мас.%, мелассу в количестве от 40 до 45 мас.% и жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания в количестве от 25 до 30%, в пересчете на сухую массу среды.

6. Способ получения нитчатых грибов рода Arthrobotrys в промышленном масштабе, заключающийся в том, что осуществляют посев конидий указанных грибов в культуральную среду согласно одному из пп.1, 2 и 5, выдерживают культуральную среду при температуре 23-30°С в течение 5-10 дней для оценки репродукции и роста грибов.

7. Способ по п.6, дополнительно включающий этап постепенного добавления минерального органического источника к указанной культуральной среде, предпочтительно начиная с четвертого дня после посева конидий, где указанный минеральный источник добавляется в количестве от 5 до 8 мас.% в пересчете на сухую массу культуральной среды.