СИНТЕТИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ПЕПТИДА, ПРОЯВЛЯЮЩЕЕ АНТИКОАГУЛЯНТНУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2009 года по МПК C07K5/62 A61K38/05 A61P7/02 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективного средства для профилактики и лечения тромбозов.

Тромбоэмболия (ТЭ) - частая причина смерти и нетрудоспособности. Нефракционированный/низкомолекулярный гепарин или варфарин, используемые в настоящее время для профилактики и лечения ТЭ могут вызывать серьезные кровотечения. Тромбин - ключевой фермент каскада свертывания крови играет центральную роль в физиологическом (гемостаз) и патологическом (тромбоз) процессах; превращает растворимый в плазме белок фибриноген в нерастворимый - фибрин; активирует факторы V, VIII, XI, и XIII и тромбоцитарные протеиназа-активированные рецепторы (platelet protease-activated receptor) (ПАР-1 и ПАР-4). На основе прямых ингибиторов тромбина разработан ряд антитромботических средств. Прямые ингибиторы тромбина (ПИТ) классифицируют в зависимости от механизма действия на унивалентные и бивалентные [Best Practice & Research Clinical Haematology Vol.17, No.1, pp.105-125, 2004]. Унивалентные ПИТ взаимодействуют только с активным (каталитическим) центром тромбина. Бивалентные - с активным центром и фибриноген-связывающим участком (экзосайт 1).

Бивалентные ингибиторы, особенно гирудин и его производные, имеют чрезвычайно высокую аффинность к тромбину [Thrombosis Research 2003; 109: S9-15]. Например, константы ингибирования (Ki) для двух производных гирудина lepirudin и desirudin составляют 60 и 200 фемтоМ [Current Pharmaceutical Design 2002; 8: 125-133]. Связывание с тромбином происходит в экзосайте 1 и аполярном связывающем участке, расположенном близко к каталитическому центру тромбина. Ki для двух унивалентных ПИТ (argatroban, melagatran) находятся в наномолярном диапазоне [Thrombosis Research 2003; 109: S9-15]. Аналог гирудина bivalirudin имеет намного меньшую аффинность к тромбину, чем производные гирудина, его Ki для тромбина составляет 2 нM [Biochemistry 1994; 33: 14807-14814], но большую тромбиновую специфичность [Biochemistry 1984; 23: 85-90] по сравнению с унивалентными ПИТ. При определении антикоагулянтной активности ПИТ используют коагулологические тесты тромбинового времени (ТТ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ). Унивалентные ПИТ способны ингибировать связанный со сгустком тромбин в большей степени, чем производные гирудина [Thrombosis and Haemostasis 1994; 72: 381-386], вероятно, потому что бивалентный ПИТ должен конкурировать с фибрином за связь с экзосайтом 1 тромбина и/или потому что маленькие молекулы унивалентного ПИТ диффундируют более эффективно через сгусток.

Известно, что гирудин, состоящий из полипептидной цепи из 65 аминокислот с тремя дисульфидными мостиками, получают из слюны пиявок. Сильный естественный антикоагулянт гирудин имеет сульфатную группу на Tyr63, которая увеличивает аффинность к тромбину, по сравнению с рекомбинантными гирудинами (r-гирудины), у которых эта группа отсутствует. Высокая стоимость (трехдневный курс лечения гирудином составляет 1000$) и большая вероятность кровотечений ограничили использование гирудина. В настоящее время используют два r-гирудина: lepirudin (Refludan, Pharmion, Великобритания и Berlex Лаборатории, США) и desirudin (Revasc, Novartis) [In Warkentin ТЕ & Greinacher A (eds). Heparin-induced Thrombocytopenia, 3rd edn. New York: Marcel Dekker, Inc., 2004, pp.397-436]. Они имеют незначительные структурные и фармакологические отличия: на N-конце последовательности - Leul-Tyr2 для lepirudin, и Vall-Val2 для desirudin. Lepirudin применяется внутривенно и его плазменный период полураспада (t) - приблизительно 1 час; лекарственное средство выводится через почки, и регулирование дозы требуется для пациентов с ослабляемой почечной функцией. Lepirudin имеет узкое терапевтическое окно. Следовательно, дозирование его эффекта противосвертывающего средства должно контролироваться, чтобы поддержать активизированное частичное время тромбопластина (АРТТ) в 1.5-2.0 больше по сравнению с контролем. Desirudin используют для предотвращения тромбозов после операций на бедре или коленной чашечке.

Аналог гирудина bivalirudin - имеет меньшую полипептидную цепь, чем гирудин (20 против 65 аминокислот), и соответственно меньшую молекулярную массу (2180 против 7000 Da). Bivalirudin объединяет С-конец додекапептида, полученного из естественного гирудина (остатки 53-64) с N-концом "активное закрепление участка" тетрапептида (D-Phel-Pro2-Arg3-Pro4), с четырьмя остатками глицина, соединяющими эти два сегмента вместе [Biochemistry 1994; 33: 14807-14814]. Как и гирудин, С-конец bivalirudin взаимодействует с экзосайтом 1 тромбина. Из различных гирулогов (аналогов гирудина) только bivalirudin используется в клинической практике. Синтетический bivalirudin (hirulog-1 или Angiomax), в дополнении к аспирину, используют для предотвращения тромбоза у пациентов с нестабильной стенокардией после пластической операции на сосудах. Bivalirudin, имея меньшую молекулярную массу в сравнении с гирудином, все же обладает такими же побочными эффектами, но в меньшей степени.

Задача настоящего изобретения - расширить арсенал веществ, проявляющих антикоагулянтную активность. Задача решена путем получения синтетического производного пептида, обладающего антикоагулянтными свойствами и имеющего формулу 1, включая фармацевтически приемлемые соли.

Формула 1

Изобретение подтверждено на примерах использования синтетического производного пептида гидрохлорида фталил-глицил-аргинил-пиперидида, имеющего формулу Fta-Gly-Arg-Pip·HCl (далее «пептид»).

Антикоагулянтную активность заявляемого пептида in vitro оценивают по его способности ингибировать амидолитическую активность тромбина, для оценки последней используют метод, основанный на взаимодействии тромбина с хромогенным субстратом. Результат взаимодействия фиксируют спектрофотометрически по изменению скорости реакции гидролиза за 1 мин при длине волны 405 нм.

Концентрацию ингибитора, снижающую скорость амидолитической реакции в два раза [IC₅₀] рассчитывают по формуле

[Биоограническая химия ферментативного катализа, М.Бендер, Р.Бергенсон, М.Комияма, Москва, Мир, 1987, пер. с англ, под ред. И.В.Березина, 351].

Антикоагулянтную активность заявляемого пептида in vivo оценивают по его влиянию на антикоагулянтную активность плазмы крови самцов крыс линии Wistar (280-340 г) при внутривенном введении в дозах 1, 2 и 3 мг/кг в тестах активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) и тромбинового времени (ТТ).

Изобретение проиллюстрировано чертежом «Ингибирование амидолитической активности тромбина».

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 1. Синтез Fta-Gly-Arg-Pip·HCl

Сначала получают фталилглицин (Fta-Gly) спеканием эквимолярных количеств глицина и фталевого ангидрида при нагревании в масляной бане при 140-150°С в течение 30 минут. После охлаждения твердый продукт растворяют в минимальном объеме кипящего метанола и высаживают добавлением равного объема воды. Выпавший осадок отфильтровывают, сушат и переосаждают из метанола водой, затем сушат в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора. Выход 50%.

Замещенный амид аргинина Nα-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-Nω-(4-метокси-2,3,6-триметил-бензилсульфонил)-аргинил-пиперидид (Fmoc-Arg(Mtr)-Pip) получают взаимодействием Nα-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-Nω-(4-метокси-2,3,6-триметил-бензилсульфонил)-аргинина Fmoc-Arg(Mtr) и пиперидина, с использованием метода сукцинимидных эфиров аналогично способу, описанному для (Boc)₂Lys-Pip в публикации: Letters of Organic Chemistry, 2006, №3, 857-860.

Fmoc-защитную группу с Fmoc-Arg(Mtr)-Pip удаляют стандартным методом путем обработки пиперидином при комнатной температуре (А.А.Гершкович, В.К.Кибирев, «Синтез пептидов. Реагенты и методы», Киев, Наукова Думка, 1987, стр.151).

Синтез целевого пептидного производного Fta-Gly-Arg-Pip·HCl осуществляют следующим образом.

К раствору 0,5 ммоль Nω-(4-метокси-2,3,6-триметил-бензилсульфонил)-аргинил-пиперидида (Arg(Mtr)-Pip) в смеси 1,5 мл диметилформамида и 0,25 мл этилацетата добавляют последовательно 1,2-кратный избыток Fta-Gly, 1 эквивалент 1-гидроксибензотриазола и при охлаждении льдом 2-кратный избыток дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают на магнитной мешалке в течение ночи, затем растворитель удаляют в вакууме, к остатку добавляют 100 мл этилацетата, смесь фильтруют через стеклянный, пористый фильтр (пор. 40), осадок отбрасывают. Фильтрат промывают последовательно: 5% гидрокарбонатом натрия, водой, 0,5 М соляной кислотой (3×30 мл каждого реактива), затем водой до нейтральной реакции. Органический раствор сушат сульфатом натрия, упаривают в вакууме и фталилглицил-Nω-(4-метокси-2,3,б-триметил-бензилсульфонил)-аргинил-пиперидид (Fta-Gly-Arg(Mtr)-Pip) переосаждают из этилацетата гексаном. Дипептид растворяют в хлористом метилене и Mtr-защитную группу удаляют действием избытка трифторуксусной кислоты при комнатной температуре (Applied Biosystems, Technical Bulletin, p.4). Через 6 часов целевой пептид высаживают абсолютным эфиром. Выход продукта составляет 50%.

Пример 2. Ингибирование заявленным пептидом амидолитической активности тромбина in vitro.

20 мкл пептида в конечных концентрациях 41, 77, 109, 128, 161, 177, 188, 295, 300, 321, 364, 394, 453, 712, 749, 771, 804, 1440, 1514, 1625 и 1791 мкМ добавляют к 0,180 мл (0,006 мкг - 0,015 ЕД) тромбина в 0,05 М Трис-HCl буфера с 0,0075 М Na₂-ЭДТА и 0,175 М NaCl, pH 7,4. Через 1 мин инкубации при 37°С добавляют 0,180 мл раствора хромогенного субстрата на тромбин S-2238 фирмы «Behring» (2 мМ Трис-ЭДТА буфера). По изменению оптической плотности раствора за минуту при длине волны 405 нм судят об активности исследуемого образца. При увеличении количества пептида наблюдают снижение скорости гидролиза хромогенного субстрата. Концентрация пептида, при которой наблюдают снижение скорости реакции гидролиза в два раза (IC₅₀), равна 281±15 мкМ (см. чертеж). Полученная константа ингибирования на 2-3 порядка выше, чем у известных коммерческих пептидов ингибиторов тромбина. Так, для бивалентных ингибиторов тромбина константы ингибирования составляют 1,9-2,3 нМ (lepirudin, Biochemistry 1994; 33: 14807-14814]), 200 фМ (desirudin, Biochemistry 1988; 27: 6517-6522]), 60 фМ (bivalirudin, Haemostasis 1993; 23: 249-258); для унивалентных - 5 нМ (argatroban, In Warkentin ТЕ & Greinacher A (eds) Heparin-induced Thrombocytopenia, 3rd edn. New York: Marcel Dekker, 2004, pp.437-474) и 2 нМ (ximelagatran, Thrombosis Research 2003; 109: S9-15).

Пример 3. Оценка антикоагулянтной активности заявляемого пептида in vivo (тест АЧТВ).

Самцам крыс линии Wistar (280-340 г) для наркоза вводят внутрибрюшинно нембутал в дозе 60 мг/кг. Пептид вводят в отпрепарированную левую яремную вену в дозах 1, 2 и 3 мг/кг. Из правой яремной вены отбирают кровь в пластиковую пробирку с 0,11 М водным раствором цитрата натрия в соотношении 9:1, в разные интервалы времени после введения (5, 15, 30, 60 90, 120, 150, 180, 210 мин). Для получения бедной тромбоцитами плазмы осадок отделяют центрифугированием при 1400 g 20 мин. Далее 0,1 мл плазмы инкубируют с 0,1 мл раствора эллаговой кислоты с фосфолипидами сои (использован набор НПО "Ренам" АЧТВ-тест) в течение 3 мин при 37°С. После добавления 0,1 мл 0,025М раствора хлорида кальция фиксируют время образования сгустка (табл.1). В качестве контроля используют кровь крыс до инъекции.

Таблица 1 Активированное частичное тромбопластиновое время плазмы крыс после внутривенного введения пептида в разных дозах. Доза, мг/кг Время после введения, мин 0 5 15 30 60 90 120 150 180 210 1   23±2 29±4* 314* 29±6* 23±1 23±3 21±1 21±2   2 21±1 26±2 40±8* 35±9* 32±7* 28±5* 23±2 24±2 22±3   3   35±5* 53±6* 50±5* 55±8* 42±4* 28±3* 25±3 26±3 22±1 Примечание: результаты представлены как x_cp ± стандартная ошибка средней (n=10); • - р<0.05 - достоверность различий с данными, полученными до введения (0 мин пос введения)

Пример 4. Оценка антикоагуляционной активности заявляемого пептида in vivo (тест тромбинового времени).

Как в примере 3, но после центрифугирования при 1400 g 20 мин, 0,1 мл плазмы инкубируют 2 мин при 37°С. После добавления 0,1 мл раствора тромбина (использован набор НПО "Ренам" Тромбин-тест) фиксируют время образования сгустка (табл.2).

Таблица 2 Тромбиновое время плазмы крови крыс после внутривенного введения пептида.   Время после введения, мин Доза, мг/кг 0 5 15 30 60 90 120 150 180 210 1 10,4±0,5 12,3±0,8 13,7±1,3 12,3±1,5 12,7±1,2 13,2±1,3 11,0±0,9 12,6±1,6 11,9±1,0   2 14,5±2,0* 14,8±1,7* 13,2±1,0 13,5±1,8 12,4±0,6 12,0±0,7 11,5±0,6 11,0±0,6   3   21,0+1,1* 16,4±1,0* 15,5±2,0* 15,0±1,2* 14,7±0,8* 13,3±0,9* 13,1±0,5* 13,6±0,7* 12,0±0,7 Примечание: результаты представлены как x_cp ± стандартная ошибка средней (n=10); * - р<0.05 - достоверность различий с данными, полученными до введения (0 мин после введения)

Из результатов, приведенных в таблицах 1 и 2, следует, что при внутривенном введении пептида самцам крыс линии Wistar отмечено удлинение времени свертывания плазмы крови животных в тестах АЧТВ (Табл.1) и ТВ (Табл.2) в зависимости от дозы.

Удлинение времени свертывания плазмы крови крыс в тесте АЧТВ в 1,5-2 раза в сравнении с контрольным наблюдали при дозах 2 мг/кг (через 15, 30, 60 и 90 мин после введения) и 3 мг/кг (в течение двух часов после введения).

Удлинение времени свертывания плазмы крови крыс в тесте тромбинового времени в 1,5-2 раза в сравнении с контрольным наблюдали при дозах 2 мг/кг (через 5 и 15 мин после введения) и 3 мг/кг (в течение трех часов после введения). Таким образом, найдена минимальная, эффективная доза ингибитора тромбина - пептида, при которой отмечали двойное удлинение времени свертывания плазмы крыс в тестах АЧТВ и ТВ, наблюдаемое в течение 2-3 часов.

Синтезированное производное пептида, имеющее формулу Fta-Gly-Arg-Pip·HCl и являющееся представителем заявленных соединений формулы 1, проявляет антикоагулянтную активность, оцененную путем ингибирования амидолитической активности тромбина в системе in vitro, и удлинение времени свертывания плазмы крови крыс в 2 раза по сравнению с контролем в тестах активированного частичного тромбопластинового времени и тромбинового времени в системе in vivo.

Получено синтетическое производное пептида фталил-глицил-аггинил-пиперидида, проявляющее антикоагулянтную активность, оцененную путем ингибирования амидолитической активности тромбина в системе in vitro, и удлинение времени свертывания плазмы крови крыс в 2 раза по сравнению с контролем в тестах активированного частичного тромбопластинового времени и тромбинового времени, и имеющее формулу 1, включая фармацевтически приемлемые соли. 2 табл., 1 ил.

Формула 1

Синтетическое производное пептида фталил-глицил-аргинил-пиперидида, проявляющее антикоагулянтную активность и имеющее формулу 1, включая его фармацевтически приемлемые соли:
Формула 1