СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ С ПОМОЩЬЮ IFN-γ И TNF-α ДЛЯ АДОПТИВНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2024 года по МПК C12N5/783 A61K35/17 A61K39/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной биологии и может применяться для активации лимфоцитов человека с помощью IFN-γ и TNF-α с целью получения активированных Т-, NK-, NKT- лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии онкологическим больным.

Становятся все более значимыми в лечении различных видов онкологических заболеваний разработки с использованием методов противоопухолевой клеточной иммунотерапии. Данные подходы основаны на активировании лимфоцитов в условиях in vitro, с целью повышения их противоопухолевого потенциала. Так, например, иммунотерапия, основанная на применении Т-, NK-клеток (естественных киллеров), и ЦИК-клеток (Цитокин-индуцированные киллеры, от англ. Cytokine-induced killer cell, CIK) относится к числу перспективных подходов, разрабатываемых для лечения многих видов рака. ЦИК - это группа эффекторных иммунных клеток, которые сочетают в себе свойства T-лимфоцитов и NK-клеток, и они могут распознавать злокачественные клетки в отсутствие антител и молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС, от англ. Major Histocompatibility Complex, MHC), обеспечивая быстрый неспецифический иммунный ответ. Известно, что полностью дифференцированные ЦИК (CD3+CD56+) обладают способностью уничтожать опухолевые клетки, как несущие MHC на своей поверхности, так и не экспрессирующие ГКГС.

Известно, что иммунная система способна распознавать злокачественные клетки и реагировать на такое распознавание активацией и последующими каскадами иммунных реакций. Поэтому поиск новых подходов получения активированных лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии онкологических больных является актуальной задачей.

Изучение IFN-γ и TNF-α в протоколах культивирования является актуальным, т.к. известно, что данные цитокины вырабатываются различными клетками иммунной системы для регуляции комплекса межклеточных взаимодействий при иммунном ответе. Цитотоксические Т-лимфоциты, NK-клетки, а также макрофаги и нейтрофилы имеют рецепторы к IFN-γ, поэтому он активирует эффекторные функции этих клеток, в частности их цитотоксичность и цитокинопродукцию. В клинических исследованиях выявлена способность IFN-γ снижать процент супрессорных Т-клеток (CD4+CD25+FOXP3+), ингибировать В-клеточный ответ на IL-4 (интерлейкин), подавлять продукцию IgE и экспрессию CD23-антигена. IFN-γ способен отменять супрессивный эффект IL-4 на IL-2-зависимую пролиферацию и генерацию лимфокин активированных киллеров (ЛАК). TNF-α может выделяться NK-клетками периферической крови, Т-лимфоцитами и гранулоцитами. Он не оказывает цитотоксического действия на нормальные клетки, а оказывает стимулирующее влияние на цитотоксичность NK-клеток, и на фагоцитоз, усиливает экспрессию CD-4 и CD-8, являясь фактором дифференцировки Т-хелперов и Т-киллеров.

Известно, что TNF-a успешно используют в протоколах получения активированных ДК (дендритных клеток) совместно с (ГМ-КСФ) и IL-4, IL-1β, IL-6.

Известен способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью при раке молочной железы (RU 2521506 С1), включает выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови человека, разделение клеток на фракции, добавление к прилипающей фракции МНК ростовых факторов, нагрузку ДК антигенами опухолевого лизата в дозе 100 мкг/мл, и стимуляцию in vitro созревания ДК в течение 24 часов. Через 48 часов к клеткам вносят рекомбинантный человеческий (рч) TNF-α в дозе 25 нг/мл и проводят совместное культивирование зрелых активированных лизатом ДК и неприлипающей фракции МНК в соотношении 1:10 в присутствии рч IL-12 в дозе 10 нг/мл и рч IL-18 в дозе 100 нг/мл. Изобретение позволяет повысить уровень цитотоксической и интерферон-продуцирующей активности антиген-активированных ДК при сокращении сроков их культивирования.

Недостатком способа является то, что данная схема активации лимфоцитов не предусматривает получение активированных Т-, NK- и ЦИК-клетки, играющих огромную роль в противоопухолевом иммунном ответе, а только ДК. Метод усложнен.

Известны способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с противоопухолевой активностью (RU 2458985 С1) и способ генерации антиген-специфических цитотоксических клеток с активностью против клеток рака яичника (RU 2508298 С2). В основе способов также лежит совместное культивирование неприлипающей фракции МНК, выделенных из периферической крови больных с ДК, которые активируют опухолевым антигеном. ДК получают из моноцитов прилипающей фракции МНК, для совместного культивирования берут зрелые ДК, полученные с помощью добавления аутологичных опухолевых клеток и провоспалительного цитокина TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа). Совместное культивирование неприлипающей фракции МНК и зрелых антиген-активированных ДК проводят в присутствии рч IL-12 и рч IL-18.

Недостатки способов заключаются в существенном усложнении культивирования клеток: разделением на фракции и использованием опухолевых антигенов для активирования ДК. Данная схема активации лимфоцитов также не предусматривает получение активированных Т-, NK- и ЦИК-клетки, играющих огромную роль в противоопухолевом иммунном ответе, а только ДК.

Известен улучшенный состав для ингибирования пролиферации опухолевых клеток (WO 2011098516 А1). В нем описана процедура обработки веществами натриевой соли полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (поли-I:C), резиквимодом (R848) и IFN-γ в дозе 1000000/мл для активации ДК после 3-5 дней культивирования, в течение 18 часов, после чего клетки трижды отмывали и в течение 24 часов инкубировали в свежей среде. Авторы демонстрируют исследование вакцины на модели опухоли показывая, что внутриопухолевая инъекция активированными ДК вызывает заметное привлечение воспалительных клеток, включая ДК, NK-клетки и Т-клетки в место инъекции (в опухоль), и описывают системный противоопухолевый эффект.

Недостатком состава является применение высоких доз IFN-γ, что является токсичным для клеток и не позволяет культивировать клетки более длительно. При данной схеме активации лимфоцитов невозможно получить активированные Т-, NK- и ЦИК-клетки сразу, а только ДК, которые в дальнейшем при введении уже способны привлекать воспалительные клетки.

Известна NK-клеточная линия, экспрессирующая PSMA-специфический химерный антигенный рецептор и секретирующая блокатор взаимодействия CD47/SIRPa (RU 2757353 C1). В ней описано, как для изучения функциональных блокаторов CD47/SIRPa, секретируемых CAR-YT клетками, для подготовки макрофагов их после культивирования инкубируют в течение 24 часов со смесью сред IMDM/Optimem 5% FBS с добавлением IFN-γ до 40 нг/мл и LPS до 20 нг/мл, данный протокол позволял получить порядка 10⁵ макрофагов на одну лунку.

Недостатком изобретения является то, что при данной схеме активации клеток с использованием низких доз IFN-γ до 40 нг/мл, невозможно получить активированные Т-, NK- и ЦИК-клетки, а только макрофаги.

Известна заявка на изобретение способ производства активированных лимфоцитов для иммунотерапии (RU 2009110156 А). В ней описано культивирование лимфоцитов in vitro в присутствии IL-2, IFN-γ, и анти-CD-3 антитела без IL-1, с получением активированных лимфоцитов.

Недостатком изобретения является использование анти-CD-3 антител для активации лимфоцитов, что делает данную процедуру более дорогостоящей.

Известны способ активации цитотоксических лимфоцитов человека (RU 2603079 C2) и способ лечения онкологических больных цитотоксическими лимфоцитами (RU 2596505 C1). В них описано, как МНК выделяют из крови человека, культивируют в бессывороточной среде, дополненной рч IL-2 (125-500 нг/мл) и IL-15 (2,5-5 нг/мл). Культивирование клеток предусматривается на протяжении 10-14 или 9 суток соответственно. Полученные данными способами цитотоксические лимфоциты обладают повышенной жизнеспособностью, пролиферативной активностью и функциональной противоопухолевой активностью.

Данные способы также не предусматривают применение IFN-γ или TNF-α совместно с IL-2 и IL-15 для активации лимфоцитов in vitro, с последующим их применением для адоптивной иммунотерапии, но выбраны как наиболее близкие к предлагаемому техническому решению в качестве прототипа.

В российских и зарубежных базах данных отсутствует информация о дозировках препаратов IFN-γ и TNF-α совместно с IL-2 и IL-15 и без них, сроках культивирования, и влияния данных препаратов на уровень активации лимфоцитов (Т-, NK- и ЦИК-клеток) в условиях in vitro. Заявляемое изобретение направлено на решение данных задач.

Техническим результатом является создание схемы культивирования лимфоцитов человека с помощью IFN-γ и TNF-α с целью получения активированных Т-, NK-, NKT- лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии онкологических больных.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается за счет того, что также как в известном способе путем активации МНК in vitro, включающий выделение МНК из венозной крови донора, их ресуспендирование и культивирование в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл и культивирование в условиях СО2-инкубатора в питательной среде на основе RPMI, содержащей пируват натрия, L-глутамин, IL-2 в концентрации - 250 нг/мл и IL-15 в концентрации - 5 нг/мл, осуществляют, оценивая жизнеспособность и пролиферативную активность лимфоцитов, при этом каждые 48 часов обновляют половину объема питательной среды.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что в питательную среду совместно с IL-2 и IL-15 дополняют рекомбинантным человеческим интерфероном гамма - IFN-γ в концентрации - 500 Ме/мл и культивируют МНК 7 суток или рекомбинантным человеческим фактором некроза опухолей-тимозином альфа-1 - TNF-α в концентрации - 100 Ме/мл и культивируют МНК 3 суток, проводят оценку морфологических, фенотипических и цитокинопродуцирующих характеристик клеток.

При активации МНК заявленным способом можно отметить общую тенденцию к значительному увеличению показателей Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+), NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+), активированных лимфоцитов (HLA-DR+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), и маркеров активации на всех лимфоцитах (CD38+) и на Т-клетках (CD3+CD38+).

Сущность изобретения включает забор венозной крови у донора, выделение из нее МНК и их культивирование в CO2 -инкубаторе при 37°C и 5% СО2. Активацию и культивирование МНК проводят в полной питательной среде на основе RPMI, содержащей L-глутамин, пируват натрия, 250 МЕ/мл человеческого рч IL-2, 5 нг/мл человеческого рч IL-15, с добавлением 500 ме/мл IFN-γ или 100 ме/мл TNF-α на протяжении 3-7 дней. В результате данной процедуры получают активированные цитотоксические лимфоциты. При этом через каждые 48 часов обновляют половину объема питательной среды, определяют в ней концентрацию цитокинов, оценивают фенотип и маркеры активации МНК, оценивают их жизнеспособность и пролиферативную активность. Активированные цитотоксические лимфоциты, полученные предложенным способом, используют для фундаментальных исследований по выявлению новых закономерностей и морфо-функциональных особенностей активированных лимфоцитов человека и могут применяться для проведения адоптивной иммунотерапии онкологическим больным.

Перечень фигур.

Фиг. 1 - изменение жизнеспособности лимфоцитов (3, 7 и 12 сутки): а) от концентрации IFN-γ и дня культивирования или б) от концентрации TNF-α и дня культивирования.

Порядок реализации способа.

Для выделения МНК человека, гепаринизированную венозную кровь разбавляют в 2 раза физраствором NaCl 0,9% (Россия), кровь наслаивают на раствор Фиколла, плотностью-1,077 г/см³ (ПанЭко, Россия) и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 25 мин, что приводит к оседанию эритроцитов и гранулоцитов на дно пробирки. В результате центрифугирования МНК образуют интерфазное кольцо, которое собирают пипеткой. Собранные клетки ресуспендируют в 10-кратном объеме ФСБ (Россия) и отмывают от раствора Фиколла методом центрифугированя при 1800 об/мин в течение 10 мин дважды.

Выделенные МНК подсчитывают и ресуспендируют в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл в питательной среде, содержащей L-глутамин, пируват натрия, 250 МЕ/мл человеческий рч IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия), 5 нг/мл человеческий рч IL-15 (SciStore, Россия), с добавлением 500 ме/мл IFN-γ (рч интерферон гамма, Фармаклон, Россия) или 100 ме/мл TNF-α (рч фактор некроза опухолей-тимозин альфа-1, Фармаклон, Россия). В качестве питательной среды может быть использована RPMI-1640 (ПанЭко, Россия).

Для получения активированных лимфоцитов МНК культивируют в 24-луночных планшетах или пластиковых флаконах с вентилируемой крышкой в инкубаторе при температуре 37,0°C и 5% CO2, и если в состав добавляют:

- TNF-α в концентрации - 100 Ме/мл, то культивируют на протяжении 3 дней,

- IFN-γ в концентрации - 500 Ме/мл, то культивируют 7 дней.

Ежедневно проводят морфологическую оценку культуры лимфоцитов и визуальную оценку питательной среды на отсутствие патогенной микрофлоры. Для поддержания жизнеспособности цитотоксических лимфоцитов на высоком уровне, каждые 48 часов культивирования обновляют половину объема полной питательной среды. Для этого собирают половину суспензии, оценивают жизнеспособность клеток и уровень пролиферации. Суспензию клеток центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин, после чего супернатант собирают для ИФА, а к осадку клеток добавляют новую полную питательную среду, ресуспендируют и возвращают обратно во флакон или планшет, где до этого культивировались клетки. Концентрация клеток при этом не должна превышать 1,5-2×10⁶ кл/мл в конечном объеме питательной среды.

Жизнеспособность культивируемых клеток определяют методом подсчета в камере Горяева с помощью 0,4% раствора трипанового синего (Биолот, Россия), пересчитывают долю окрашенных (мертвых) к общему количеству клеток в процентном соотношении. Индекс пролиферации (ИП) клеток определяют по общеизвестной формуле: ИП=Х_n+1/Х_n, где Х_n - это общее исходное число посеянных клеток, Х_n+1 - это общее число полученных в итоге клеток после культивирования.

Для подтверждения факта активации клеток методом ИФА определяют концентрацию цитокинов в супернатантах и методом проточной цитометрии определяют фенотип и маркеры активации цитотоксических лимфоцитов до и после культивирования.

Иммуноферментный анализ (ИФА). В супернатантах, собранных в момент обновления полной питательной среды для определения функциональной активности клеток, измеряют концентрации цитокинов: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ и TNF-α. ИФА проводят с помощью наборов реагентов «Вектор Бест» по инструкции фирмы производителя. Оптическую плотность образцов измеряют на фотометре «ChroMate» («Awareness Technology», США) в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм.

Проточная цитометрия. Фенотипирование флуоресцентно меченых клеток проводят на цитофлуориметре (например: FACScanto II, Becton Dickinson, США). Оценивают субпопуляционный состав Т-, NK-, NKT-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD45, CD56) и маркеры активации на них (CD25, CD38 и HLA-DR). Субпопуляционный состав клеточной суспензии определяют до и после культивирования.

По окончанию культивирования получают активированные цитотоксические лимфоциты.

Примеры реализации способа.

Пример 1. Выделение МНК.

Для выделения МНК человека, гепаринизированную венозную кровь разбавляли в 2 раза физраствором NaCl 0,9% (Россия), наслаивали ее на раствор Фиколла, плотностью-1,077 г/см³ (ПанЭко, Россия) и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 25 мин. В результате центрифугирования эритроциты и гранулоциты оседали на дно пробирки, а МНК образовывали интерфазное кольцо, которое собирали пипеткой и двукратно отмывали центрифугированием в 10-кратном объеме ФСБ (Россия) при 1800 об/мин в течение 10 мин. Далее клетки ресуспендировали в изучаемой среде.

Пример 2. Подбор концентраций IFN-γ и TNF-α.

Применяя метод титрования, изучали следующие концентрации: 63, 135, 210, 250, 313, 450, 500, 625, 833, 1000, 1250, 1666, 2000, 2500, 3333, 4000, 5000, 6666, 10000, 13333, 20000 Ме/мл. Для препарата TNF-α изучали концентрации: 11, 23, 37, 47, 55, 77, 94, 115, 157, 188, 235, 313, 375, 470, 627, 750, 940, 1250, 1500, 1875, 2500, 3750, 5000, 7500 Ме/мл. Выделенные МНК доноров (n=5) культивировали в планшетах в среде RPMI-1640, содержащей пируват натрия, L-глутамин, с добавлением IFN-γ (рч интерферон гамма, Фармаклон, Россия) или TNF-α (рч фактор некроза опухолей-тимозин альфа-1, Фармаклон, Россия) в одной из указанных концентрациях. В качестве контроля МНК культивировали в среде без IFN-γ и TNF-α. МНК культивировали до 12 дней в условиях СО₂ - инкубатора, каждые 48 часов меняли половину объема питательной среды в каждой лунке в соответствии с изучаемой концентрацией препарата. При культивировании МНК с IFN-γ, наиболее высоким уровнем жизнеспособности на протяжении 12 дней обладали клетки, активированные при концентрации от 250 до 1250 Ме/мл (Фиг. 1а). При культивировании МНК с TNF-α - от 100 до 627 Ме/мл (Фиг. 1 б).

При изучении фенотипа активированных клеток в концентрациях IFN-γ: 250 Ме/мл, 500 Ме/мл, 1000 Ме/мл, у всех доноров наблюдалась одна и та же тенденция к небольшому увеличению количества Т-клеток (CD3+CD45+) и Т-хелперов (CD3+CD4+), особенно при концентрации 500 Ме/мл - в среднем на 2,7% и 5,3% соответственно. Незначительно увеличивалось содержание CD38+ на всех лимфоцитах на 7 сутки культивирования при всех изучаемых концентрациях препарата (в среднем на 3,2-3,5%). Содержание маркера апоптоза на всех лимфоцитах (CD95+) на 7 сутки увеличивалось при концентрации 250 Ме/мл в среднем на 9,3%, а при увеличении концентрации до 500 или 1000 Ме/мл - уменьшалось на 10,3-10,5%. Содержание NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) и активированных лимфоцитов (HLA-DR+) увеличивалось незначительно при концентрации 250 Ме/мл.

При изучении фенотипа активированных клеток в концентрациях TNF-α: 100 Ме/мл, 250 Ме/мл, 500 Ме/мл у всех доноров наблюдалась одна и та же тенденция к небольшому увеличению количества Т-хелперов (CD3+CD4+), особенно при концентрации 100 Ме/мл - в среднем на 5,6%, небольшое увеличение NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+) - в среднем на 2,2% и лимфоцитов с маркером активации (CD38+) - на 3,8%. Также при концентрации 100 Ме/мл, отмечалось увеличение активированных лимфоцитов (HLA-DR+) и незначительное увеличение активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) на 5,0% и 1,9% соответственно. Содержание маркера апоптоза на всех лимфоцитах (CD95+) на 7 сутки увеличивалось при концентрации 500 Ме/мл в среднем на 13,8%, а при снижении концентрации до 100 Ме/мл - на 7,1%.

Таким образом, оценив полученные данные активации клеток и жизнеспособности, для изучения морфо-функциональных характеристик клеток при культивировании в среде с IFN-γ актуально применять концентрациию - 500 Ме/мл, в среде с TNF-α - 100 Ме/мл.

Пример 3. Культивирование МНК.

Выделенные МНК доноров культивировали в условиях СО₂ - инкубатора в 24-луночных планшетах в концентрации клеток 1,5 млн/мл в среде на основе RPMI-1640, содержащей L-глутамин, пируват натрия, 250 МЕ/мл человеческий рч IL-2 (ронколейкин, Биотех, Россия), 5 нг/мл человеческий рч IL-15 (SciStore, Россия), с добавлением 500 ме/мл IFN-γ (рч интерферон гамма, Фармаклон, Россия) или 100 ме/мл TNF-α (рч фактор некроза опухолей-тимозин альфа-1, Фармаклон, Россия). Изучали и сравнивали способ культивирования лимфоцитов в среде, содержащей только IFN-γ (группа 1), содержащей IFN-γ, IL-2 и IL-15 (группа 2), содержащей только TNF-α без интерлейкинов (группа 3), содержащей TNF-α, IL-2 и IL-15 (группа 4) и содержащей только IL-2 и IL-15 (группа контроля). Проводили ежедневную морфологическую оценку культивируемых МНК. Каждые 48 часов обновляли половину объема питательной среды, на 3 и 7 дни культивирования собирали и замораживали супернатанты для ИФА: группа 1, группа 2, группа 3, группа 4 и группа контроля. До и после культивирования оценивали жизнеспособность изучаемых клеток и проводили фенотипирование (CD3, CD4, CD14, CD16, CD25, HLA-DR, CD45, CD56, CD95).

Жизнеспособность выделенных МНК до культивирования составляла 99,7±0,3% и постепенно снижалась во всех группах с последующим днем активации (р<0,05). Применяя IFN-γ или TNF-α в комбинации с IL-2 и IL-15 уровень жизнеспособности клеток был более высоким, чем без цитокинов (р<0,05). В группе контроля и группах 2 и 4 - клетки достаточно хорошо пролиферировали (1,5-2 раза), чего не наблюдалось в группах 1 и 3, из-за присутствия в среде IL-2 и IL-15, способствующих данному процессу.

Пример 4. Проточная цитометрия.

Фенотипирование флуоресцентно меченых клеток проводили на цитофлуориметре (FACScanto II, Becton Dickinson, США). Оценивали субпопуляционный состав Т-, NK-, NKT-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD14, CD16, CD45, CD56) и маркеры активации на них (CD25, CD38 и HLA-DR). Субпопуляционный состав клеточной суспензии определяли до и после культивирования на 12 сутки (Таблица 1).

Таблица 1

Фенотип лимфоцитов до активации и через 12 суток

после культивирования по группам

(значения указаны как среднее по группе ± стандартное отклонение, %).

Фенотип лимфоцитов 0-сутки, % 12 сутки, % группа 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа контроля Т-клетки (CD3+CD45+) 72,5±4,6 82,3±5,7 92,1±3,5 85,0±4,9 89,9±3,1 90,0±2,5 Т-хелперы (CD3+CD4+) 44,5±10,6 56,4±8,6 48,7±14,4 58,2±9,7 44,8±10,7 45,7±11,4 Т-цитотоксические (CD3+CD8+) 22,2±9,8 23,3±5,8 33,8±4,4 23,4±7,2 33,7±8,2 33,2±7,7 NKT-клетки (CD3+CD16+CD56+) 3,4±2,3 7,0±3,5 9,1±4,0 6,4±3,6 7,4±3,3 8,9±3,2 NK-клетки (CD3-CD16+CD56+) 14,6±4,8 7,5±5,7 2,5±1,7 7,2±5,5 4,6±1,4 5,5±1,5 Активированные лимфоциты
(HLA-DR+) 12,1±2,0 17,8±5,5 37,1±6,6 15,9±6,2 38,2±6,7 36,3±6,7 Активированные
Т-лимфоциты
(CD3+HLA-DR+) 4,0±1,4 12,2±4,0 34,4±6,1 12,4±4,0 34,4±6,1 33,3±7,0 CD4+CD25+
(от Т-лимфоцитов) 9,1±7,1 7,4±2,4 10,9±6,7 8,7±3,0 12,4±8,6 15,2±12,3 Маркер активации на всех лимфоцитах
(CD38+) 21,7±11,6 20,6±5,6 58,0±9,2 21,1±4,5 51,0±7,7 56,3±10,7 Маркер активации
на Т-клетках
(CD3+CD38+) 7,9±10,1 10,6±4,5 53,3±8,2 12,7±5,8 44,1±7,6 48,5±10,2 Примечание:
группа 1- среда только с IFN-γ без интерлейкинов;
группа 2 - среда с IFN-γ в сочетании с IL-2 и IL-15;
группа 3 - среда только с TNF-α без интерлейкинов;
группа 4 - среда с TNF-α в сочетании с IL-2 и IL-15;
группа контроля - среда без IFN-γ или TNF-α, содержащая только IL-2 и IL-15

При изучении фенотипа клеток после культивирования на 12 сутки, относительно клеток до активации (n=9), отмечается общая тенденция к существенному увеличению показателей Т-клеток (CD3+CD45+), NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+), активированных лимфоцитов (HLA-DR+) и Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+). В группах 1 и 3 замечен рост показателей Т-хелперов (CD3+CD4+) в среднем на 11,9% и 13,7%. В группах 2, 4 и контрольной группе замечен существенный рост показателей Т-цитотоксических клеток (CD3+CD8+) в среднем на 11,2%, 11,0% и на 11% соответственно. Аналогичная тенденция наблюдается и для NKT-клеток (CD3+CD16+CD56+), активированных лимфоцитов (HLA-DR+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+), маркеров активации на всех лимфоцитах (CD38+) и на Т-клетках (CD3+CD38+), что указывает на эффективность применения IFN-γ или TNF-α совместно с IL-2 и IL-15 для активации клеток in vitro. Так при сравнении показателей группы 1 с группой 2 и группы 3 с 4 можно отметить существенное увеличение активированных лимфоцитов (HLA-DR+) в 2,1 раза (на 19,3%) и в 2,4 раза (на 22,3%) соответственно, активированных Т-лимфоцитов (CD3+HLA-DR+) в 2,8 раз (на 22,2% и на 22,0% соответственно), маркеров активации на всех лимфоцитах (CD38+) в 2,8 раз (на 37,4%) и в 2,4 раза (на 30,0%), на Т-клетках (CD3+CD38+) в 5,0 раз (на 42,7%) и в 3,5 раз (на 31,4%) соответственно.

Пример 5. Иммуноферментный анализ (ИФА).

Для определения функциональной активности клеток (подтверждения факта продукции цитокинов в процессе культивирования клеток) методом ИФА определяли концентрации цитокинов в супернатантах, собранных на 3 и 7 сутки. Измеряли концентрации цитокинов: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ и TNF-α. ИФА проводили с помощью наборов реагентов «Вектор Бест» по инструкции фирмы производителя. Оптическую плотность образцов измеряли на фотометре «ChroMate» («Awareness Technology», США) в двухволновом режиме: основной фильтр - 450 нм, референс-фильтр - 620 нм (Таблица 2).

Таблица 2

Результаты ИФА супернатантов после культивирования МНК

по группам на 3 и 7 сутки.

сутки цитокин группа 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа
контроля 3 IL-2 38,2* 287,2 30,7** 289,3 284,0 IL-4 1,5 1,7 1,5 1,5 1,7 IL-6 2,2* 44,7 8,8** 45,2 41,7 IL-10 15,2* 213,7 18,3** 206,5 188,7 IFN-γ 120,8* 1203,2 6,8** 694,8 549,5 TNF-α 7,8* 166,7 141,8 147,5 96,3 7 IL-2 16,8* 317,5 10,2** 299,5 294,7 IL-4 2,0 6,5 1,8** 3,8 6,0 IL-6 7,5* 35,0 7,7** 34,3 32,5 IL-10 57,0 325,7 115,3 189,7 212,0 IFN-γ 72,7* 867,7 30,3** 650,8 661,3 TNF-α 31,2* 143,3 135,3 155,0 118,5 Примечание:
группа 1- среда только с IFN-γ без интерлейкинов;
группа 2 - среда с IFN-γ в сочетании с IL-2 и IL-15;
группа 3 - среда только с TNF-α без интерлейкинов;
группа 4 - среда с TNF-α в сочетании с IL-2 и IL-15;
группа контроля - среда без IFN-γ или TNF-α, содержащая только IL-2 и IL-15;
* - сравнение группы 1 с группой 2;
** - сравнение группы 3 с группой 4;
р<0,05 - различия статистически значимы

При сравнении группы 1 (в среде содержащей только IFN-γ) с группой 2 (в среде содержащей IFN-γ, IL-2 и IL-15) на 3-е сутки культивирования наблюдается значительное превышение концентраций цитокинов: IL-2, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α, а на 7-е сутки цитокинов: IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IFN-γ, TNF-α. Сравнив группу 3 с группой 4 на 3-е и 7-е сутки культивирования, заметили значительное превышение концентраций цитокинов IL-2, IL-6, IL-10 и IFN-γ в среде содержащей TNF-α, IL-2 и IL-15, чем в среде содержащей только TNF-α. Основными продуцентами данных цитокинов являются именно активированные цитотоксические Т-лимфоциты, NKT- и NK-клетки.

При сравнении группы 2 и группы 4 с группой контроля на 3 сутки можно отметить, что уровень IL-10 во 2 группе был несколько выше, чем в контрольной на 13,2%, а в 4 группе - на 9,4%. Уровень IFN-γ во 2 группе был значительно выше, чем в контрольной - в 2,2 раза (р<0,05), а в 4 группе - на 26,8%. Уровень TNF-α во 2 группе был выше, чем в контрольной на 71,3%, а в 4 группе - на 53,2%, что указывает на факт их активации при культивировании заявленным способом.

Показано, что при совместном применении IFN-γ с IL-2 и IL-15 в протоколах культивирования к 7 суткам уровень IL-6, IFN-γ, TNF-α остается выше, чем в среде только с IL-2 и IL-15, но постепенно начинает снижаться по сравнению с 3 сутками активации. При совместном применении TNF-α с IL-2 и IL-15 в протоколах культивирования после 3 суток отмечается снижение уровня IL-6, IL-10, IFN-γ, причем концентрации IL-10 и IFN-γ уже несколько ниже контрольных значений, что указывает на снижение цитокинопродуцирующей способности клеток в данной схеме культивирования к 7 дню, и соответственно на пик активации клеток на 3 сутки.

Таким образом, установлены оптимальные сроки культивирования для получения активированных лимфоцитов доноров заявленным способом, а именно до 7 суток с IFN-γ, с TNF-α - до 3 суток.

Предлагаемое изобретение позволяет получить активированные лимфоциты с высокой жизнеспособностью и функциональной активностью. Применение IFN-γ и TNF-α для активации лимфоцитов, позволит снизить возможные побочные эффекты от непосредственного введения самих препаратов пациентам (например, такие как: лихорадка, озноб, цитокиновый шторм), за счет добавления малых доз IFN-γ и TNF-α - для активации клеток.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения цитотоксических лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии путем активации МНК in vitro, включающему культивирование МНК в питательной среде на основе RPMI, содержащей IL-2 в концентрации 250 нг/мл и IL-15 в концентрации 5 нг/мл, отличающемуся тем, что питательную среду совместно с IL-2 и IL-15 дополняют рекомбинантным человеческим интерфероном гамма - IFN-γ в концентрации 500 МЕ/мл и культивируют МНК 7 суток или дополняют рекомбинантным человеческим фактором некроза опухолей-тимозином альфа-1 - TNF-α в концентрации 100 МЕ/мл и культивируют МНК 3 суток, проводят оценку морфологических, фенотипических и цитокинопродуцирующих характеристик клеток. Технический результат заключается в получении активированных Т-, NK-, NKT-лимфоцитов для адоптивной иммунотерапии онкологических больных. 1 ил., 2 табл., 5 пр.

Способ получения цитотоксических лимфоцитов с помощью IFN-γ или TNF-α для адоптивной иммунотерапии путем активации МНК in vitro, включающий выделение МНК из венозной крови донора, их ресуспендирование и культивирование в концентрации 1,5-2×10⁶ кл/мл, причем культивируют в условиях СО₂-инкубатора в питательной среде на основе RPMI, содержащей пируват натрия, L-глутамин, IL-2 в концентрации 250 нг/мл и IL-15 в концентрации 5 нг/мл, оценивают жизнеспособность и пролиферативную активность лимфоцитов, при этом каждые 48 ч обновляют половину объема питательной среды, отличающийся тем, что питательную среду совместно с IL-2 и IL-15 дополняют рекомбинантным человеческим интерфероном гамма - IFN-γ в концентрации 500 МЕ/мл и культивируют МНК 7 суток или дополняют рекомбинантным человеческим фактором некроза опухолей-тимозином альфа-1 - TNF-α в концентрации 100 МЕ/мл и культивируют МНК 3 суток, проводят оценку морфологических, фенотипических и цитокинопродуцирующих характеристик клеток.