СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СТАДИИ ЭМПИЕМЫ ПЛЕВРЫ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии и хирургии, и может быть использовано для диагностики стадии эмпиемы плевры.

Лечение больных с эмпиемой плевры в разные стадии заболевания кардинально различается: в I и II стадии применяются малотравматичные хирургические методики лечения, такие как дренирование плевральной полости и оперативная торакоскопия, тогда как в III стадии больным требуется выполнение обширных оперативных вмешательств - декортикации легкого и плеврэктомии (Бодня В.Н. Видеоторакоскопическое лечение хронической эмпиемы плевры. / В.Н.Бодня: Дис. канд. мед. наук. - Кубанская государственная медицинская академия, 2001. - 108 с.; Vyhnánek F, Fanta J, Jirava D, Ocadlik M. Contemporary approach to treatment of the posttraumatic empyema of the thorax. // Rozhl Chir. 2006 Jan; 85(1):14-8).

Ошибочное применение метода, лечения не соответствующего стадии заболевания, приводит к увеличению сроков лечения, неоправданному расширению объема и травматичности операций и, как следствие, ухудшению результатов лечения.

Диагноз стадии эмпиемы плевры устанавливается на основании выявления в субплеврально расположенной ткани легкого воспалительных и фиброзных изменений, выраженных в разной степени (Порханов В.А., Бодня В.Н., Ефимцев Ю.П. Видеоторакоскопия в лечении эмпиемы плевры. // Хирургия, №11. - 1999. - С.33-35; Grotenhuis BA, Janssen PJ, Eerenberg JP. The surgical treatment of stage III empyema: the effect on lung function. // Minerva Chir. 2008 Feb; 63(1):23-7).

Недостатком указанного способа является отсутствие четких количественных критериев при разграничении I, II и III стадий эмпиемы плевры.

Технический результат: повышение точности диагностики стадии эмпиемы плевры.

Указанная задача достигается тем, что в биопсийных образцах ткани легкого оценивают пролиферативную активность клеток соединительной ткани иммуногистохимическим методом посредством определения индекса пролиферации с помощью регуляторного протеина Ki-67.

Способ осуществляют следующим образом: забор материала (биоптат ткани легкого с висцеральной плеврой) осуществляют во время проведения торакоскопии. Материал фиксируют в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (рН 7,2). Гистологические препараты готовят по общепринятым методикам с заливкой в гистамикс. Срезы толщиной 3 мкм получают на ротационном микротоме, депарафинируют по стандартной схеме. С целью восстановления антигенных детерминант после формалиновой фиксации депарафинированные срезы подвергают нагреванию (Иммуногистохимическая диагностика опухолей человека: Руководство для врачей-морфологов. // Под ред. С.В.Петрова, А.П.Киясова - Казань, 1998 г.).

Для этого срезы помещают в 0,01 М цитратный буфер с рН 6,0 и кипятят в течение 20-30 минут. После остывания срезы переносят в трис-буфер (рН-7,5) на 5 минут, затем обрабатывают 0,3% раствором перекиси водорода (пероксидазный блок), после чего инкубируют с первичными антителами в течение 10-30 минут во влажной камере.

Для выявления пролиферативной активности в ткани легких используют моноклональные антитела к регуляторному пептиду Ki-67 и стандартные диагностические наборы для иммуногистохимических исследований (Rabbit Monoclonal Antibody to Human Ki-67, Clone SP6, Isotype IgG). Перед использованием концентрированные антитела разводят растворителем антител (Primary Antibody Diluent, Diagnostic BioSystems, USA) в титре 1:50 согласно инструкции фирмы-производителя. В качестве позитивного контроля экспрессии Ki-67 в исследуемых образцах используют экспрессию Ki-67 в реактивных центрах фолликулов небной миндалины человека.

Затем срезы трехкратно промывают в трис-буфере, после чего подвергают экспозиции с вторичными биотинилированными антителами (Diagnostic BioSystems, USA) в течение 10 минут, промывают в трис-буфере, обрабатывают конъюгированным с пероксидазой стрептавидином в течение 10 минут и подвергают окрашиванию DAB+(3,3'-диаминобензидин) (Diagnostic BioSystems, USA) в течение 1-2 минуты, не допуская появления фонового окрашивания, промывают в 2-3 порциях дистиллированной воды 10-15 минут и докрашивают гематоксилином Майера. Срезы заключают в канадский бальзам и исследуют в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

Определение индекса пролиферации Ki-67 проводят, учитывая число позитивных на 100 учтенных ядер (при учете 500-1000 клеток) (Корскакова Н.А. Оценка степени злокачественности эпителиальных новообразований толстой кишки на основе определения иммунофенотипа опухолевых клеток. / Н.А.Корсакова - Автореф. дисс. к.м.н. - Москва, 2007. - 23 с). Анализ гистологических препаратов осуществляют при микроскопии в проходящем свете при увеличении микроскопа ×400.

При определении в исследуемом образце индекса пролиферации не более 1% диагностируют I стадию эмпиемы плевры. При определении индекса пролиферации клеток соединительной ткани в зоне воспалительных изменений более 17% и в зоне легкого с визуально сохраненной структурой от 5 до 12% диагностируют II стадию эмпиемы плевры, при индексе пролиферации в зоне воспалительных изменений более 17% и в зоне легкого с визуально сохраненной структурой более 12% - III стадию эмпиемы плевры.

Пример 1

Мужчина, 66 л. Диагноз: Эмпиема плевры справа. Давность заболевания - 8 дней. При проведении торакоскопии в плевральной полости обнаружен серозно-гнойный экссудат, умеренные напластования фибрина на париетальной и висцеральной плевре, рыхлые плевральные сращения, неутолщенная и недеформированная париетальная и висцеральная плевра.

Биоптат ткани легкого и висцеральной плевры, полученный при проведении торакоскопии, фиксировали в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (рН 7,2), гистологические препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гистамикс. Серийные срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали по стандартной схеме и окрашивали гематоксилином, эозином и пикрофуксином по ван Гизону для оценки степени выраженности новообразования соединительной ткани. Для выявления пролиферативной активности в ткани легких использовали моноклональные антитела к регуляторному пептиду Ki-67 и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA). Готовые гистологические препараты исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

Гистологически в висцеральной плевре выявлялись очаги воспалительной инфильтрации, полнокровие кровеносных сосудов. Местами висцеральная плевра была утолщена за счет появления прослоек рыхлой неоформленной соединительной ткани. Субплеврально находили умеренно выраженную эмфизему. Глубже имелась полная сохранность альвеолярного аппарата, ацинусов и бронхиол.

Заключение по результатам гистологического исследования: I стадия эмпиемы плевры.

При проведении иммуногистохимического исследования в ткани легких и висцеральной плевре индекс пролиферации составил 0,12%.

После получения иммуногистохимической верификации стадии эмпиемы плевры решено дополнительных вмешательств больному не выполнять и продолжить лечение. В результате лечения легкое расправилось, больной выписан с выздоровлением на 28 сутки от поступления.

Пример 2

Пациент, 43 г. Диагноз: Внебольничная двусторонняя деструктивная пневмония, тяжелое течение. Эмпиема плевры справа. ОДН II-III ст. Болен в течение 3-х недель.

При проведении торакоскопии в плевральной полости обнаружена покрытая массивными фибринозными наложениями, резко утолщенная париетальная и висцеральная плевра.

Биоптат ткани легкого и висцеральной плевры, полученный при проведении торакоскопии, фиксировали в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (рН 7,2), гистологические препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гистамикс. Для выявления пролиферативной активности в ткани легких использовали моноклональные антитела к регуляторному пептиду Ki-67 и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA). Готовые гистологические препараты исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

При исследовании микропрепаратов выявлено значительное утолщение висцеральной плевры. Наряду с выраженной воспалительной инфильтрацией в ней имелись неправильно ориентированные тонкие пучки коллагеновых волокон, мелкие сосуды, зрелые фибробласты и лимфоциты. В субплевральном слое легочной паренхимы отмечались воспалительная инфильтрация ткани легкого, фиброзные изменения в виде появления коллагеновых волокон и фибробластов, нарушение структуры альвеол и ацинусов. В препаратах хорошо прослеживалась пограничная зона - зона формирующегося фиброза легочной паренхимы с сохраненной в значительной степени структурной организацией ткани легкого. В этой зоне отмечался фиброз отдельных межальвеолярных перегородок, воспалительные процессы, нарушение нормальной структуры альвеол и ацинусов, расширенные полнокровные капилляры. В ткани легкого, наиболее удаленной от плевры, признаки воспаления были менее выражены, фиброзные изменения практически отсутствовали.

Заключение: II стадия эмпиемы плевры.

При проведении иммуногистохимического исследования в зоне воспалительных изменений индекс пролиферации составил 16,54%, в зоне легкого с визуально неизмененной структурой - 5,2%.

Так как при торакоскопии обращала на себя внимание выраженная ригидность легкого, наличие большого количества гнойно-фибринозных напластований на париетальной и висцеральной плевре, предварительно больному была диагностирована III стадия эмпиемы плевры. Планировалось выполнение обширной операции: декортикации легкого и плеврэктомии. Однако после иммуногистохимической верификации II стадии эмпиемы плевры решено дополнительных вмешательств больному не выполнять и продолжить лечение дренированием. В результате лечения легкое расправилось, больной выписан с выздоровлением на 32 сутки от поступления.

Пример 3

Пациент, 62 г. Диагноз: Острая внебольничная деструктивная пневмония справа. Буллезная эмфизема легких. ХОБЛ. Острая ограниченная парапневмоническая эмпиема плевры. ОЛН II ст. Болен в течение 1,5 месяцев.

При проведении торакоскопии в плевральной полости обнаружено небольшое количество фибрина, на висцеральной и частично париетальной плевре - розового цвета грануляционную ткань, в легких - гнойно-некротические секвестры темно-серого цвета.

Биоптат ткани легкого и висцеральной плевры, полученный при проведении торакоскопии, фиксировали в 10%-ном забуференном по Лилли формалине (рН 7,2), гистологические препараты готовили по стандартным методикам с заливкой в гистамикс. Для выявления пролиферативной активности в ткани легких использовали моноклональные антитела к регуляторному пептиду Ki-67 и полный диагностический набор компании Diagnostic BioSystems (USA). Готовые гистологические препараты исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении ×400.

В плевре и субплеврально расположенной легочной паренхиме воспалительные изменения отсутствовали. Как плевра, так и паренхима легкого замещались в данном случае грубой волокнистой соединительной тканью, деформирующей орган. В плевре находили соединительную ткань с утолщенными сосудами, многочисленными фибробластами и диффузно рассеянными лимфоцитами. Субплеврально расположенная паренхима легкого была замещена соединительной тканью.

В препаратах четко прослеживалась последовательность изменений субплеврально расположенной ткани легкого по мере удаления от плевры. За зоной выраженного фиброза следовала переходная, или пограничная, зона - зона формирующихся фиброзных изменений, в которой определялись утолщенные межальвеолярные перегородки, значительно уменьшенные в размерах и деформированные сохранившиеся альвеолы и ацинусы. Пневматизация легкого в этой зоне была нарушена. Вслед за ней выявлялась третья зона, максимально удаленная от плевры, в которой процессы воспаления и фиброза были выражены минимально. В этой зоне выявлялись расширенные полнокровные сосуды, умеренное нарушение нормальной структуры альвеол и ацинусов. Паренхима легких находилась в состоянии частичного ателектаза. Далее следовала ткань легкого, не подвергшаяся патологическим изменениям.

Заключение: III стадия эмпиемы плевры.

При проведении иммуногистохимических исследований индекс пролиферации в зоне воспалительных изменений составил 21,9%, в зоне легкого с визуально неизмененной структурой - 14,6%.

После иммуногистохимической верификации III стадии эмпиемы плевры и стабилизации общего состояния больной оперирован (на 5-е сутки от поступления). Выполнена декортикация легкого и париетальная плеврэктомия. Течение послеоперационного периода без особенностей, легкое полностью расправилось, больной выписан на 33 день от поступления в стационар с полным выздоровлением.

Положительный эффект: повышение точности диагностики стадии эмпиемы плевры, объективизация диагностики вследствие введения количественного критерия.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным методам диагностики, и касается способа диагностики стадии эмпиемы плевры. Сущность способа заключается в том, что в биопсийных образцах ткани легкого оценивают пролиферативную активность клеток соединительной ткани иммуногистохимическим методом посредством определения индекса пролиферации с помощью регуляторного протеина Ki-67. При определении в исследуемом образце индекса пролиферации не более 1% диагностируют I стадию эмпиемы плевры, при определении индекса пролиферации в исследуемом образце в зоне воспалительных изменений более 17% и в зоне легкого с визуально сохраненной структурой от 5 до 12% диагностируют II стадию эмпиемы плевры, при индексе пролиферации в зоне воспалительных изменений более 17% и в зоне легкого с визуально сохраненной структурой более 12% - III стадию эмпиемы плевры. Использование способа позволяет повысить точность диагностики стадии эмпиемы плевры.

Способ диагностики стадии эмпиемы плевры с помощью гистологического исследования биоптата ткани легкого, отличающийся тем, что в биопсийных образцах ткани легкого оценивают пролиферативную активность клеток соединительной ткани иммуногистохимическим методом посредством определения индекса пролиферации с помощью маркера пролиферации регуляторного протеина Ki-67 и при определении в исследуемом образце индекса пролиферации не более 1% диагностируют I стадию эмпиемы плевры, при определении индекса пролиферации в исследуемом образце в зоне воспалительных изменений более 17% и в зоне легкого с визуально сохраненной структурой от 5 до 12% диагностируют II стадию эмпиемы плевры, при индексе пролиферации в зоне воспалительных изменений более 17% и в зоне легкого с визуально сохраненной структурой более 12% - III стадию эмпиемы плевры.