СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕТИЧЕСКИХ ИНФЕКЦИЙ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК ЖЕЛУДКА ИЛИ ПУЛЬПЫ ЗУБА Российский патент 2010 года по МПК A61B10/02 G01N1/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и стоматологии, и может использоваться для дифференциальной иммуногистохимической диагностики между герпетической микст-инфекцией и моноинфекцией с перекрестной иммунологической реакцией в слизистой оболочке желудка или пульпе зуба.

Стандартная иммуногистохимическая диагностика герпетических инфекций слизистых оболочек органов желудочно-кишечного тракта и пульпы зуба включает в себя 3 этапа:

- подготовку гистологического образца;

- собственно иммуногистохимический анализ;

- оценку гистологического образца в световом микроскопе;

- последующий анализ результатов.

В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ диагностики герпетических инфекций слизистых оболочек желудка путем иммуногистохимического исследования, включающего подготовку гистологического образца слизистой оболочки желудка, иммуногистохимический анализ, оценку гистологического образца в световом микроскопе с последующим анализом результатов (Новикова В.П., Аксенов О.А., Насыров Р.А., Крулевский В.А., Евстратова Ю.С. Герпетические инфекции при хроническом гастрите у лиц разного возраста. Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. СПб., 2006, - №2, - C.117-120).

По мнению авторов заявляемого способа при использовании способа, выбранного в качестве прототипа, а также способов аналогов, возможно получение ложноположительных результатов с любым из антигенов, вследствие отсутствия 100% специфичности реактива, то есть способы не обладают достаточно высокой точностью диагностики, так как с помощью данных способов невозможно проведение дифференциальной диагностики между микст-инфекцией и моноинфекцией с перекрестной иммунологической реакцией (Новикова В.П., Аксенов О.А., Насыров Р.А., Крулевский В.А., Евстратова Ю.С. Герпетические инфекции при хроническом гастрите у лиц разного возраста. Вестник Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И.Мечникова. СПб., 2006, - №2, - C.117-120).

Техническим результатом изобретения является повышение точности диагностики герпетических инфекций слизистой оболочки желудка или пульпы зуба за счет проведения дифференциальной диагностики между микст-инфекцией и моноинфекцией с перекрестной иммунологической реакцией.

Технический результат достигается тем, что осуществляют иммуногистохимическое исследование, включающее подготовку гистологического образца слизистой оболочки желудка или пульпы зуба. При подготовке гистологического образца биоптат маркируют путем нанесения на него координационной метки. Изготавливают гистологические срезы толщиной не более 3 мкм. Наносят полученные гистологические срезы на предметные стекла в следующей последовательности: первый гистологический срез укладывают на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности. После этого осуществляют иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных моноклональных антител. Фиксируют результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце и сохраняют изображения результатов каждой реакции в электронном виде. Затем совмещают полученные изображения последовательных срезов по координационной метке и при выявлении специфически окрашенных гранул антигенов различной локализации диагностируют герпетическую микст-инфекцию слизистой оболочки желудка или пульпы зуба, а при выявлении специфически окрашенных гранул антигенов одной локализации - герпетическую моноинфекцию с перекрестной иммунологической реакцией слизистой оболочки желудка или пульпы зуба.

Способ осуществляется следующим образом.

Биоптаты слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка или экстирпированную пульпу зуба фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина, налитого в пробирку V 1,5 мл на 24 часа (цель фиксации - сохранить прижизненную структуру клеток и тканей путем быстрого воздействия на них химическими агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений).

По окончании фиксации, для предотвращения выпадения формалинового осадка, кусочки промывают 3-кратно в проточной воде не менее 30 минут в каждой. Отложения солей кальция в пульпе зуба декальцинируют 3% раствором азотной кислоты. Фиксированную ткань обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и пропитывают парафином. Далее маркируют препарат путем нанесения на него координационной метки. Координационную метку наносят раскаленной иглой, в результате образуется зона коагуляционного некроза.

Срезы для микроскопического исследования приготавливают с помощью роторного микротома толщиной не более 3 мкм. Приготовленные срезы окрашивают по стандартной методике. Далее наносят полученные гистологические срезы на предметные стекла в следующей последовательности: первый гистологический срез укладывают на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности, после чего осуществляют иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных антител. В качестве первых антител используют поликлональные антитела к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов (производство ДАКО), моноклональные антитела к раннему антигену цитомегаловируса и моноклональные антитела к латентному мембранному протеину ВЭБ (производство Novocactra). Используют авидин-биотиновую систему детекции. На первом этапе на депарафинированные срезы наносят немеченые первичные антитела, далее следуют биотинилированные вторичные антитела и затем инкубируют с авидин-биотиновым комплексом с пероксидазой хрена. Данная методика известна как ABC-метод. Продукт реакции выявляют по наличию светло- и темно-коричневых гранул в структурах слизистой оболочки желудка или пульпы зуба при микроскопическом исследовании. Изображения результатов каждой реакции сохраняют в электронном виде, после чего совмещают полученные изображения последовательных срезов по координационной метке с помощью программы Видео-Тест. При выявлении специфически окрашенных гранул антигенов различной локализации диагностируют герпетическую микст-инфекцию слизистой оболочки желудка или пульпы зуба, а при выявлении специфически окрашенных гранул антигенов одной локализации - герпетическую моноинфекцию с перекрестной иммунологической реакцией.

Отличительными существенными признаками заявляемого способа являются:

1) маркировка биоптата или экстирпированной пульпы путем нанесения на него координационной метки;

2) изготовление гистологических срезов толщиной не более 3 мкм;

3) последовательность нанесения полученных гистологических срезов на предметные стекла: первый гистологический срез укладывают на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности;

4) сохранение изображений результатов каждой реакции в электронном виде;

5) совмещение полученных изображений последовательных срезов по координационной метке;

6) проведение диагностики герпетической микст-инфекции слизистой оболочки желудка или пульпы зуба - по выявлению специфически окрашенных гранул антигенов различной локализации, а герпетической моноинфекции с перекрестной иммунологической реакцией слизистой оболочки желудка или пульпы зуба - при выявлении специфически окрашенных гранул антигенов одной локализации.

Причинно-следственная связь между существенными отличительными признаками и достигаемым результатом:

1) маркировка биоптата путем нанесения на него координационной метки позволяет ориентировать и совместить полученные в дальнейшем компьютерные изображения слизистой оболочки желудка или пульпы зуба;

2) гистологические срезы изготавливают толщиной не более 3 мкм для обеспечения точного определения локализации антигенов вирусов в пределах одной клетки, без наслоения окружающих клеток тканей, что обеспечивает высококачественное изображение гистологической картины слизистой оболочки желудка или пульпы зуба в пределах одной клетки;

3) последовательность нанесения полученных гистологических срезов на предметные стекла - первый гистологический срез укладывают на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности - (количество стекол равно числу определяемых вирусов) необходима для получения изображения на разных стеклах в пределах одних и тех же клеток, что позволяет в последующем совместить эти изображения;

4) сохранение изображений результатов каждой реакции в электронном виде необходимо для возможности последующего совмещения изображений клетки с целью получения одинаковых полей изображения в пределах одних и тех же клеток на разных предметных стеклах;

5) совмещение полученных изображений последовательных срезов по координационной метке необходимо для сравнительной оценки локализаций специфически окрашенных гранул антигенов;

6) выявление специфически окрашенных гранул антигенов различной локализации позволяет диагностировать микст-инфекцию, а выявление специфически окрашенных гранул антигенов одной локализации - моноинфекцию с перекрестной иммунологической реакцией.

Совокупность существенных отличительных признаков является новой и повышает точность диагностики за счет проведения дифференциальной диагностики герпетических инфекций слизистой оболочки желудка или пульпы зуба.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. И/б №1012-07. Больная Т., 15 лет, биоптат из слизистой оболочки желудка.

Биоптат больной Т., 15 лет, страдающей хроническим гастродуоденитом, маркировали путем нанесения на него координационной метки, были изготовлены гистологические срезы толщиной не более 3 мкм. Полученные гистологические срезы были нанесены на предметные стекла в следующей последовательности: первый гистологический срез укладывали на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности, после чего осуществляли иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных моноклональных антител. Фиксировали результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце и сохраняли в электронном виде. После этого совмещали полученные изображения последовательных срезов по координационной метке (Фиг.1а) и выявили специфически окрашенные гранулы антигенов различной локализации и диагностировали микст-инфекцию.

Иллюстрацией служит Фиг.1, где на Фиг.1б и Фиг.1в отражены результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце. На Фиг.1г отражен результат наложения двух компьютерных изображений по координационной метке:

Фиг.1б) Экспрессия антигена (++) вируса Эпштейн-Бар в слизистой оболочке желудка. ИГХМ. Об.×400.

Фиг.1в) Экспрессия антигена (++) вируса простого герпеса в слизистой оболочке желудка. ИГХМ. Об.×400.

Фиг.1г) Экспрессия антигена (++) вируса Эпштейн-Бар и антигена (++) вируса простого герпеса (микст-инфекция) в слизистой оболочке желудка. ИГХМ. Об.×400. Наложение двух компьютерных изображений по координационной метке.

У больной Т., 15 лет, диагностирована микст-инфекция в слизистой оболочке желудка вирусами простого герпеса и ВЭБ.

Пример 2. И/б №1008-07. Больной А., 46 лет, биоптат из слизистой оболочки желудка.

Биоптат был подготовлен согласно заявляемому способу, подготовка биоптата описана в примере 1. После чего осуществляли иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных моноклональных антител. Фиксировали результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце и сохраняли изображения результатов каждой реакции в электронном виде, после чего совместили полученные изображения последовательных срезов по координационной метке и выявили гранулы одной локализации - моноинфекцию с перекрестной иммунологической реакцией.

Иллюстрацией служит Фиг.2, где на Фиг.2а и Фиг.2б отражены результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце. На Фиг.2в отражен результат наложения двух компьютерных изображений по координационной метке:

а) Экспрессия антигена (++) вируса простого герпеса в слизистой оболочке желудка. ИГХМ. Об.×400.

б) Экспрессия антигена (++) цитомегаловируса в слизистой оболочке желудка. ИГХМ. Об.×400.

в) Экспрессия вирусного антигена (++) в слизистой оболочке желудка. ИГХМ. Об.×400. Наложение двух компьютерных изображений по координационной метке. Перекрестная иммунологическая реакция между антигенами простого герпеса и цитомегаловируса.

У больного А., 46 лет, страдающего хроническим гастродуоденитом, обнаружена перекрестная иммунологическая реакция между антигенами простого герпеса и цитомегаловируса. Диагностирована моноинфекция с перекрестной иммунологической реакцией в слизистой оболочке желудка.

Пример 3. И/б №1005-07. Больной Д., 16 лет, препарат из пульпы зуба.

Препарат больного Д., 16 лет, был подготовлен согласно заявляемому способу, подготовка биоптата описана в примере 1. Затем осуществляли иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных моноклональных антител. Фиксировали результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце и сохраняли изображения результатов каждой реакции в электронном виде, после чего совместили полученные изображения последовательных срезов по координационной метке и выявили специфически окрашенные гранулы антигенов различной локализации и диагностировали микст-инфекцию.

Иллюстрацией служит Фиг.3, где отражен результат наложения двух компьютерных изображений по координационной метке:

Экспрессия антигена (++) ВЭБ и антигена (++) цитомегаловируса в пульпе зуба. ИГХМ. Об.×400.

У больного Д., 16 лет, диагностирована микст-инфекция в пульпе зуба вирусами ВЭБ и цитомегаловируса.

Заявляемый способ был апробирован в группе, состоящей из 33 больных с хроническим гастритом, у которых при использовании способа-прототипа выявлена герпетическая микст-инфекция слизистых оболочек желудка. При использовании способа-прототипа Вирус Эпштейна Барр и вирус простого герпеса выявлены у 19 больных, вирус простого герпеса и цитомегаловирус - у 10 человек, вирус Эпштейна Барр и цитомегаловирус - у 2 человек, все три изучаемых антигена обнаруживались у 2 пациентов.

При апробации заявляемого способа герпетическая микст-инфекция слизистой оболочки желудка выявлена у 22 из 33 больных. Перекрестные реакции между антигенами ВЭБ и вируса простого герпеса отмечены у 2 из 19 пациентов с двойной инфекцией и у 2 из 2 с тройной, между антигенами цитомегаловируса и вируса простого герпеса - у 7 из 10. Перекрестных реакций между антигенами ВЭБ и антигенами цитомегаловируса не отмечалось.

Заявляемый способ был апробирован также в группе, состоящей из 14 больных с острым пульпитом, у которых при использовании способа-прототипа выявлена герпетическая микст-инфекция в экстирпированной пульпе зуба (ВЭБ и вирус простого герпеса).

При апробации заявляемого способа в этой группе герпетическая микст-инфекция пульпы зуба выявлена у 10 из 14 больных, причем у 4 больных из 14 выявлена моноинфекция с перекрестной иммунологической реакцией между антигенами ВЭБ и вируса простого герпеса.

Таким образом, вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что при использовании способа-прототипа микст-инфекция была ошибочно диагностирована вместо моноинфекции с перекрестной иммунологической реакцией в слизистой оболочке желудка у 11 из 33 больных, что составляет 33,3% и у 4 больных из 14 в экстирпированной пульпе зуба, что составляет 28,6%.

Заявляемый способ на 33,3% повышает точность диагностики герпетических инфекций слизистой оболочки желудка и на 28,6% - герпетических инфекций пульпы зуба за счет возможности проведения дифференциальной диагностики между микст-инфекцией и моноинфекцией с перекрестной иммунологической реакцией.

Изобретение относится к области медицины, а именно к гастроэнтерологии и стоматологии. Для дифференциальной диагностики герпетических инфекций слизистых оболочек желудка или пульпы зуба биоптат маркируют путем нанесения на него координационной метки. Изготавливают гистологические срезы толщиной не более 3 мкм. Наносят полученные срезы на предметные стекла в следующей последовательности: первый срез укладывают на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности, при этом количество предметных стекол равно числу определяемых вирусов. Проводят иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных моноклональных антител. Фиксируют результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце и сохраняют изображения результатов каждой реакции в электронном виде. Совмещают полученные изображения последовательных срезов по координационной метке. При выявлении специфически окрашенных гранул антигенов различной локализации диагностируют герпетическую микст-инфекцию слизистой оболочки желудка или пульпы зуба. При выявлении специфически окрашенных гранул антигенов одной локализации диагностируют герпетическую моноинфекцию с перекрестной иммунологической реакцией. Способ повышает точность диагностики герпетических инфекций слизистой оболочки желудка или пульпы зуба за счет проведения дифференциальной диагностики между микст-инфекцией и моноинфекцией с перекрестной иммунологической реакцией. 3 ил.

Способ дифференциальной диагностики герпетических инфекций слизистых оболочек желудка или пульпы зуба путем иммуногистохимического исследования, включающего подготовку гистологического образца слизистых оболочек органов желудочно-кишечного тракта и пульпы зуба, при этом биоптат маркируют путем нанесения на него координационной метки, изготавливают гистологические срезы толщиной не более 3 мкм, наносят полученные гистологические срезы на предметные стекла в следующей последовательности: первый гистологический срез укладывают на первое предметное стекло, второй - на второе, третий - на третье, четвертый - на первое и далее в той же последовательности, при этом количество предметных стекол равно числу определяемых вирусов, после чего осуществляют иммуногистохимические исследования каждого препарата на отдельные вирусы герпетической группы с использованием специфичных моноклональных антител, фиксируют результаты каждой реакции по наличию специфически окрашенных гранул антигена в гистологическом образце и сохраняют изображения результатов каждой реакции в электронном виде, после чего совмещают полученные изображения последовательных срезов по координационной метке и при выявлении специфически окрашенных гранул антигенов различной локализации диагностируют герпетическую микст-инфекцию слизистой оболочки желудка или пульпы зуба, а одной локализации - герпетическую моноинфекцию с перекрестной иммунологической реакцией.