КЛОН ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ХОЛЕРНОМУ ТОКСИНУ Российский патент 2010 года по МПК C12N5/18 C12P21/08 C07K16/12 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, конкретно к гибридомной технологии, и представляет собой клон гибридных клеток CT-F5/H3 животных Mus Musculus L, продуцирующих в клеточных культурах и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (далее МКАТ) к токсину холерного вибриона (XT). Гибридома может быть использована в диагностических тест-системах для специфической индикации холерного токсина в пищевой промышленности, в охране окружающей среды, в медицине.

Холерный вибрион (Vibrio cholerae) и продуцируемый им токсин являются причиной острого кишечного заболевания людей, нередко заканчивающегося летальным исходом. Токсин холерного вибриона полностью определяет симптоматику холеры и является одним из центральных объектов мониторинга бактериальных токсинов в окружающей среде и продуктах питания. В настоящее время анализ токсинов приобретает большое значение в связи с угрозой биотерроризма, так как многие природные токсины, в том числе холерный токсин, могут быть использованы в качестве компонентов биологического оружия. Доза токсинов, вызывающая заболевание, как правило, чрезвычайно мала [Scarlatos A., Welt В., Cooper В. et al // J. Food. Sci. 2005. V.70(8). P.121-124.], в связи с чем задача лабораторной диагностики токсинов заключается в разработке тестов с максимально возможной чувствительностью. XT необходимо тестировать в концентрации, не превышающей 1 нг/мл [Ramamurthy Т., Bhattacharya S.K., Uesaka Y., Horigome К., Paul M., Sen D., Pal S.C., Takeda Т., Takeda Y., Nair G.B. // J. Clin. Microbiol. 1992. V.30(7). P.1783-1786].

В настоящее время для быстрой и чувствительной диагностики токсинов наиболее используемыми и достоверными являются системы на основе иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител против токсинов [The EFSA Journal. 2007, V.130. P.4-352].

Чувствительность и специфичность ИФА определяется в значительной степени качеством антител. Моноклональные антитела имеют преимущества перед поликлональными, т.к. на их основе получают стандартизованные препараты. Антигенное сходство между представителями холероподобной группы токсинов, в первую очередь это относится к сходству между XT и термолабильным токсином E.coli (LT), диктует целесообразность использования МКАТ, обладающих строгой специфичностью к XT.

Для определения токсинов МКАТ стандартно используют в конкурентном и сэндвич-вариантах ИФА. В конкурентном варианте МКАТ сорбируют на твердую подложку, затем добавляют раствор высокоочищенного токсина, конъюгированного с пероксидазой, биотином или флуоресцентной меткой, и образец, содержащий токсин. Токсин, содержащийся в образце, конкурирует за места связывания на МКАТ с высокоочищенным, конъюгированным с метком токсином. Концентрацию тестируемого токсина определяют по калибровочной кривой, полученной в конкурентном ИФА с токсином известной концентрации. Чувствительность определения XT в конкурентном ИФА составляет 26 нг/мл [Rucker V.C., Havenstrite K.L., Herr А.Е. Antibody microarray for native toxin detection // Anal. Biochem. 2005. V.339. P.262-270]. В приведенном тесте использованы МКАТ («Biodesign International»).

В сэндвич-варианте токсин из раствора связывается МКАТ, сорбированными на твердой подложке, затем (вторым слоем) с токсином связываются другие детектирующие МКАТ, конъюгированные с меткой (например, с пероксидазой, биотином или флуоресцеином). Концентрацию тестируемого токсина определяют по калибровочной кривой, полученной в сэндвич-варианте ИФА с токсином известной концентрации. Чувствительность определения XT в сэндвич-варианте ИФА достигает 1 нг/мл [N. Koike, К. Okada, Y. Yabushita, D.Y. Zhang, К. Yamamoto, T. Miwatani, T. Honda. Rapid and differential detection of two analogous enterotoxins of Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli by a modified enzyme-linked immunosorbent assay // FEMS Immunol Med Microbiol. 1997 17(1):21-25].

При использовании МКАТ («Biodesign International») в сэндвич-варианте с иммобилизованным на липосомах ганглиозидом GM1 - клеточным рецептором XT и LT чувствительность определения достигает 10 фг/мл [Ann-Yoon S., DeCory T.R., Baeumner A.J., Durst R./Anal Chem. Ganglioside-liposome immunoassay for the ultrasensitive detection of cholera toxin. 2003.75. 2256-2261]. Использование ганглиозида GM1 ограничивает специфичность анализа, поскольку GM1 связывает как XT, так и LT.

Известен способ количественного обнаружения биологических токсинов на основе ИФА с помощью биологических микрочипов. Биологический микрочип представляет собой упорядоченный массив индивидуальных микроячеек на твердой подложке, в которых иммобилизуют МКАТ к различным биотоксинам бактериального и растительного происхождения. Применение микрочипов позволяет одновременно анализировать образец на наличие нескольких биотоксинов с чувствительностью, не уступающей чувствительности стандартных иммунологических тестов. В микрочипе используют конкурентный вариант и сэндвич-вариант ИФА. Чувствительность определения XT в биологическом чипе достигает 1,6 нг/мл [F.S. Ligler, С. Rowe Taitt, L.C. Shriver-Lake, K.E. Sapsford, Ya Shubin and J.P. Golden. Array biosensor for detection of toxins. 2003. Anal Bioanal Chem 377(3):469-477]. Такая чувствительность достигается при использовании чипа-биосенсора. Одновременно анализируют XT и четыре других токсина, а именно рицин, стафилококковый токсин SeB, ботулинический токсин А и токсин Bacillus globigii. В чипе применяют сэндвич-вариант ИФА, в котором связывающие МКАТ к XT и к четырем другим токсинам (рицину, стафилококковому токсину SeB, ботулиническому токсину А и токсину Bacillus globigii) локально иммобилизуют на поверхности стекла путем образования комплекса авидин-биотинилированные антитела. Для детекции XT и других токсинов используют флуоресцеин-меченые МКАТ. Флуоресцентные сигналы регистрируют с помощью конфокального микроскопа. Для детекции XT используют МКАТ клона гибридомы 3D11 (фирмы «Biodesign International»), которые не обладают строгой специфичностью, и связываются как с XT, так и с LT.

Известен гидрогелевый микрочип, который представляет собой упорядоченный массив трехмерных гидрогелевых ячеек на твердой подложке, полученный методом фото- или химически модифицированной полимеризации и содержащий иммобилизованные МКАТ к различным биотоксинам бактериального и растительного происхождения [Патент РФ N 2216547, C07K 17/08, опубл. 2003]. Гидрогелевый микрочип предназначен для скрининга широкого круга опасных токсинов, которые могут быть использованы в качестве компонентов биологического оружия. Однако в настоящее время чип выявляет ограниченное число токсинов и, в частности, не детектирует XT, который представляет серьезную угрозу здоровью и жизни людей.

Известен наиболее близкий к заявляемому клон гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L ВСКК (П) N 469D - продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину [Патент РФ N1835848, МКИ C12N 5/00, опубл. 1995], продуцирующий моноклональные антитела (N 469) класса lgM, полученные против хроматографически очищенного холерного токсина, при гибридизации спленоцитов с клетками миеломы X63.Ag8.653. МКАТ N 469 связываются с В-субъединицей холерного токсина. Основным недостатком клона, продуцирующего МКАТ N 469, является то, что при его участии в сэндвич-варианте ИФА выявляют холерный токсин с недостаточно высокой чувствительностью 1 нг/мл. Кроме того, для клона N 469 характерна довольно низкая продуктивность - титр антител в культуральной жидкости составляет 1:250-1:500, а в асцитной - 1:1000000. Клон N 469 продуцирует антитела класса lgM, вследствие чего затруднено получение чистых препаратов антител, т.к. для получения препарата чистых lgM антител непригодна стандартная методика - хроматография на протеин A сефарозе.

Задачей изобретения является получение клона гибридных клеток, продуцирующих высокоспецифичные МКАТ против холерного токсина, не обладающих связыванием с термолабильным токсином Е. coli и с другими бактериальными токсинами, с пределом обнаружения токсина в ИФА ниже 1 нг/мл.

Поставленная задача решается за счет клона гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L CT-F5/H3 - продуцента моноклональных антител к холерному токсину.

Указанный клон гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L CT-F5/H3 получают путем слияния клеток миеломы линии SP-2/0 и клеток лимфоузлов мышей BALB/c, иммунизированных холерным токсином (Sigma), при использовании в качестве сливающего агента полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 и последующим отбором гибридных клеток на селективной среде: на среде Игла в модификации Дульбекко с 20% сыворотки плода коровы, 4 мМ L-глутамином, 50 мкМ меркаптоэтанолом и ГАТ (0,1 мМ гипоксантином, 4×10^-7 M аминоптерином, 1,6×10^-5 M тимидином). Методом предельных разведений отбирают стабильные клоны, продуцирующие антитела, в непрямом ИФА специфически связывающие XT и не связывающие LT. На следующем этапе из клонов, продуцирующих МКАТ, специфичные к XT, отбирают клоны, которые в сэндвич-варианте ИФА определяют XT в концентрации ниже 1 нг/мл. Далее отбирают клоны, которые в микрочипе перекрестно не взаимодействуют с другими бактериальными токсинами, а именно с рицином, летальным фактором токсина Bacillus anthracis, протективным антигеном токсина Bacillus anthracis, дифтерийным токсином, стафилококковыми токсинами SeA, SeB, Sel, SeG. Отобранный клон CT-F5/H3 продуцирует антитела, которые при детекции XT в сэндвич-варианте ИФА, позволяют выявить XT в концентрации, не превышающей 1 нг/мл. В частности, чувствительность сэндвич-варианта ИФА, где в качестве связывающих антител используются МКАТ CT-F5/H3, а в качестве проявляющих антител используются МКАТ, узнающие другую антигенную детерминанту XT, составляет 0,2 нг/мл. Эта чувствительность сохраняется при определении холерного токсина в воде из открытого водоема, бульоне и молоке.

МКАТ могут быть использованы для количественного обнаружения холерного токсина в одновременном и параллельном анализе с рядом других биологических токсинов в формате биологического микрочипа. Чувствительность определения в формате микрочипа достигает 0,44 нг/мл.

Гибридома CT-F5/H3 характеризуется следующими свойствами.

1. Кариологическая характеристика

Кариотип клеток клона CT-F5/H3 по видовой принадлежности мышиный, по модальному числу хромосом 88.

2. Морфологическая характеристика

Клон гибридомы CT-F5/H3 представлен крупными округлыми клетками, близкими по морфологии клеткам исходной миеломной линии SP-2/0.

3. Стандартные условия выращивания in vitro

Посевная концентрация при выращивании in vitro - (1,0-2,0)×10⁵ кл/см³. Среда культивирования - среда Игла в модификации Дульбекко с 10% сыворотки плода коровы. Температура культивирования (37°C). Содержание СО₂ в атмосфере культивирования - 5%.

4. Культуральные свойства клона

Гибридома CT-F5/H3 является суспензионно-монослойным, около 60% клеток находятся в суспензии, не прикрепляясь к поверхности культурального сосуда, частота пассирования при посевной дозе (1,0-2,0)×10⁵ кл/см³ - 3-4 суток. Гибридный клон не теряет способности синтезировать антитела при пассировании in vitro в течение 6 месяцев (срок наблюдения). Продуктивность клона по антителам in vitro составляет в величинах титра супернатанта в ИФА 1:20000 1:40000.

5. Культивирование гибридомы в организме животного

Вид животного - инбредные мыши линии BALB/c. Доза клеток - 1-2×10⁶ на одну мышь. За 10-14 дней до введения гибридомы мышам в брюшную полость вводят 0,5 мл 2,6,10,14 - тетраметилпентадекана (пристана). Опухоль растет смешанным асцитно-солидным образом. Асцит образуется на 7-12 сутки в объеме от 3 до 10 мл в мыши. Перевиваемость 100%. Гибридный клон сохраняет способность продуцировать антитела на постоянном уровне (контроль по титру антител) при перевивании клеток животным на протяжении 6 пассажей (срок наблюдения). Титр МКАТ в асцитных жидкостях в ИФА составляет 1:2×10⁶-1:4×10⁶.

6. Контаминация клона

Контаминации CT-F5/H3 бактериями, дрожжами и грибами не выявлено.

7. Биотехнологическая характеристика полезного продукта

Антитела, продуцируемые клетками клона CT-F5/H3, относятся к классу иммуноглобулинов lgGl по данным ИФА с типирующими моноспецифическими антисыворотками против отдельных классов иммуноглобулинов мыши. Легкие цепи МКАТ CT-F5/H3 относятся к «κ» типу.

Иммуноблотингом показано, что МКАТ CT-F5/H3 связываются с В-субъединицей холерного токсина.

Константа аффинности, рассчитанная по методу Битти [Beatty J.D., Beatty B.G., and Vlahos W.G.: Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay. J Immnol Methods 1987; 100:173-179], составляет для МКАТ CT-F5/H3 - 2,6×l0⁹ M^-1.

8. Способ криоконсервации

Среда криоконсервирования содержит 90% сыворотки плода коровы и 10% криопротектора - диметилсульфоксида (ДМСО).

Режим замораживания и отогрева.

Замораживание: осадок клеток, полученный после низкоскоростного центрифугирования, суспендируют в среде для криоконсервирования из расчета 1-3×10⁶ кл в мл среды. Суспензию клеток перемешивают и разливают по 1 мл в криопробирки (Nunc). Промаркированные пробирки помещают в низкотемпературный холодильник (-70°C) на сутки, а затем в сосуд Дьюара с жидким азотом (для долгосрочного хранения). Восстановление клеток после размораживания: быстрое размораживание на водяной бане при 37°C до полного оттаивания. Затем суспензию клеток переносят в стерильную центрифужную пробирку с 10 мл культуральной среды без сыворотки. Клетки осаждают центрифугированием (10 мин при 150g), затем осадок клеток суспендируют в среде Игла в модификации Дульбекко, содержащей 10% сыворотки плода коровы и переносят в емкость для культивирования. Жизнеспособность клеток после криоконсервирования составляет (80±10)%.

Изобретение иллюстрируют графические материалы.

Фиг.1. Сэндвич-анализ ИФА холерного токсина в PBS, молоке, мясном бульоне и воде на планшете с использованием МКАТ CT-F5/H3 в качестве связывающих антител. При анализе полученных данных оптическое поглощение (A 492 нм) рассчитывают как медиану оптического поглощения трех одинаковых ячеек микропланшета. Аналитическую чувствительность анализа, т.е. наименьшую тестируемую концентрацию CT, определяют как концентрацию, соответствующую значению оптического поглощения, превышающего, не менее чем на два стандартных отклонения, оптическое поглощение многократно измеренной нулевой точки.

Величину чувствительности определяют экспериментально, по полученным калибровочным кривым и рассчитывают следующим образом:

IF_o+2*SD,

где IF_o - значение интенсивности флуоресценции для каждого измерения нулевой пробы; SD - среднее квадратичное отклонение от среднего арифметического значения IF_o.

SD вычисляют по следующей формуле:

где - среднее арифметическое значение интенсивности флуоресценции при измерении нулевой пробы; n - число измерений.

Для представленной кривой чувствительность составляет 0,20 нг/мл.

Фиг.2. Калибровочные кривые для определения концентрации CT в сэндвич-анализе ИФА на микрочипах с использованием МКАТ CT-F5/H3 в качестве связывающих антител. Расчет интенсивности флуоресцентного сигнала от каждой ячейки биочипа и определение концентраций токсинов проводят с помощью специального программного обеспечения ImagelAssay (ИМБ, Москва). При анализе полученных данных интенсивность флуоресценции рассчитывают как медианный сигнал от четырех одинаковых гелевых ячеек.

Величину чувствительности определяют экспериментально, по полученным калибровочным кривым и рассчитывают, как указано в подписи к фиг.1. Для представленной кривой чувствительность составляет 0,44 нг/мл.

Изобретение иллюстрируют примеры

Пример 1. Получение клона CT-F5/H3.

Гибридому получают при слиянии мышиной миеломы SP-2/0 с клетками лимфоузлов мыши BALB/c конвенциональной категории, иммунизированной цельным холерным токсином (Sigma). В первый день иммунизации токсин вводят в подушечки задних лапок мышей по 2,5 мкг/мышь холерного токсина, разведенного в 0,1 мл физиологического раствора, с добавлением 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. На 14 и 28 сутки вводят холерный токсин с неполным адъювантом Фрейнда в дозе 5 и 20 мкг/мышь соответственно. Через 6 суток после последней иммунизации извлекают подколенные лимфоузлы и проводят гибридизацию 5×10⁶ лимфоцитов мыши с 1×10⁶ клетками миеломной линии SP-2/0 в 1 мл полиэтиленгликоля 4000 в течение 1 мин совместной инкубации.

После удаления полиэтиленгликоля центрифугированием клетки высевают на 96-луночные планшеты на слой фидерных клеток - макрофагов, выделенных из перитонеальной полости мыши инбредной линии. Селекцию гибридных клеток проводят на среде Игла в модификации Дульбекко, с 20% сыворотки плода коровы, 4 мМ L-глутамином, 50 мкМ меркаптоэтанолом, и ГАТ. Через 21 сутки - время полной гибели миеломных клеток, клетки гибридомы культивируют на среде без аминоптерина. Дальнейшее культивирование гибридом проводят на среде, не содержащей селективных компонентов ГАТ. 3-кратное клонирование гибридом проводят методом лимитирующих разведений в 96-луночных планшетах на слое фидерных клеток. В двух последних клонированиях процент позитивных клонов составляет 100%.

Для скрининга антителопродуцирующих клонов, продуцирующих МКАТ, специфически связывающие XT, используют непрямой ИФА с XT. В лунки ИФА-планшета сорбируют холерный токсин при концентрации белка 1 мкг/мл в 0,1 М бикарбонатом буфере pH 9,0. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора антигена и инкубируют в течение ночи при 4°C. После сорбции свободные центры связывания блокируют 1% раствором бычьего сывороточного альбумина при 37°C в течение 1 ч. Лунки планшета отмывают ФСБ с 0,1% твин-20, далее вносят по 100 мкл/лунку анализируемых супернатантов, отобранных из лунок планшета, в которых растут и продуцируют антитела гибридомы. Инкубируют в течение 1 ч при 37°C. Отмывают, как описано выше, вносят по 100 мкл/лунку пероксидазного конъюгата кроличьих антител против иммуноглобулинов мыши, инкубируют 40 мин при 37°C, отмывают и вносят по 100 мкл/лунку субстрата пероксидазы: раствор ортофенилдиамина в концентрации 1 мг/мл в 50 мМ цитратном буфере pH 4,5, содержащем 0,015% перекиси водорода. После развития окраски реакцию останавливают добавлением 100 мкл/лунку 10% серной кислоты. Интенсивность окраски регистрируют спектрофотометрически, определяя оптическое поглощение при длине волны 492 нм. Отбирают клоны, продуцирующие МКАТ, специфически связывающие XT.

Для скрининга антителопродуцирующих клонов, продуцирующих МКАТ, не взаимодействующих с термолабильным токсином E.coli, используют непрямой ИФА с термолабильным токсином E.coli. Анализ проводят как с XT, но в лунки ИФА-планшета сорбируют термолабильный токсин E.coli при концентрации белка 1 мкг/мл в 0,1 M бикарбонатном буфере pH 9,0. В каждую лунку вносят по 100 мкл раствора антигена и инкубируют в течение ночи при 4°C. Отбирают клоны, продуцирующие МКАТ, не взаимодействующие с термолабильным токсином E.coli.

Пример 2. Применение МКАТ CT-F5/H3 в сэндвич-варианте ИФА на холерный токсин.

В сэндвич-варианте ИФА используют МКАТ CT-F5/H3 в качестве связывающих антител, и в качестве детектирующих МКАТ, направленные против эпитопов молекулы холерного токсина, с которыми не взаимодействует МКАТ CT-F5/H3. МКАТ CT-F5/H3 сорбируют первым слоем на дне ИФА-микропланшетов по 100 мкл/лунку в концентрации 10 мкг/мл. Свободные центры связывания пластика блокируют 1%-ным раствором сухого молока в течение 1 часа при 37°C. Отмывают ФСБ с 0,1% твин-20. Затем вносят анализируемые образцы в объеме 100 мкл/лунку, содержащие холерный токсин в различных разведениях, инкубируют 45 мин при 37°C, отмывают ФСБ с 0,1% твин-20. Вносят конъюгат детектирующих МКАТ с биотином в объеме 100 мкл/лунку при концентрации антител 10 мкг/мл. Инкубируют 45 мин при 37°C, отмывают, вносят конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена, инкубируют (45 мин при 37°C) и отмывают. Затем вносят субстрат пероксидазы: раствор ортофенилдиамина в концентрации 1 мг/мл в 50 мМ цитратном буфере pH 4,5, содержащем 0,015% перекиси водорода. Через 15 мин реакцию останавливают добавлением 10% серной кислоты. Интенсивность окраски регистрируют спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Анализ растворов с известной концентрацией холерного токсина показывает, что чувствительность определения XT достигает 0,2 нг/мл. При инкубации холерного токсина с МКАТ CT-F5/H3 не в ФСБ, а в 10% молоке, бульоне, воде из открытого водоема чувствительность определения XT не меняется и составляет - 0,2 нг/мл (фиг.1).

Пример 3. Количественный анализ холерного токсина с использованием биологического микрочипа

На гидрогелевые чипы иммобилизуют МКАТ CT-F5/H3 и МКАТ против 8 других токсинов (рицина, летального фактора токсина Bacillus anthracis, протективного антигена токсина Bacillus anthracis, дифтерийного токсина, стафилококковых токсинов SeA, SeB, Sel, SeG). Концентрация каждого из антител в полимеризационной смеси составляет 0,8±0,2 мг/мл, объем гелевого элемента 0,1 нл. Каждый гелевый элемент содержит одно из девяти вышеназванных МКАТ, кроме того, в чип входят контрольные гелевые элементы, не содержащие антител.

Добавляют 30 мкл анализируемого образца и 30 мкл раствора проявляющих биотинилированных моноклональных антител специфичных к XT (как в примере 2) и инкубируют на биочипе в течение 17 ч при 37°C. После процедуры отмывки (20 мин, ФСБ с 0,1% твин-20) добавляют флуоресцентно меченный стрептавидин, инкубируют 10 мин при 37°C, повторно отмывают и регистрируют флуоресцентные сигналы (фиг.2).

Гидрогелевые чипы получают следующим образом [Патент РФ N 2216547, МКИ С07К 17/08, опубл. 2003]. Стеклянные слайды для изготовления микрочипов обрабатывают растворами 1 н. NaOH, H₂SO₄, промывают водой, затем погружают в раствор 1% 3-метакрилоксипропилтриметоксисилана в этиловом спирте, отмывают в этиловом спирте, воде и высушивают. Полимеризационную смесь, содержащую гелеобразующие мономеры на основе метакриламида и N-замещенных аминосахаров, а также подлежащие иммобилизации МКАТ, наносят с помощью робота QArray (Genetix, Великобритания) в виде микрокапель объемом 0,1 нл на поверхность активированной подложки. Полимеризацию гелевых ячеек проводят под лампой ультрафиолетового света с максимумом излучения 350 нм (Sylvania GTE lamp, F15T8/350B1, Великобритания) на расстоянии 8 см от лампы, в течение 50 мин при 20°C в токе азота. При нанесении пином 150 мкм получают гелевые элементы полусферической формы диаметром 120 мкм. Биочипы после полимеризации отмывают в течение 40 мин ФСБ с 0,1% твин-20. Для уменьшения неспецифического взаимодействия реагентов с поверхностью биочипа поверхность обрабатывают блокирующим буфером в течение 1 ч, затем промывают дистиллированной водой.

Качество полученных биочипов проверяют в проходящем свете с помощью биочипа-анализатора (ИМБ РАН), снабженного специальным программным обеспечением TestChip и QualityControl (ИМБ РАН). В результате проверки качества отбраковывают биочипы, для которых отклонения значений радиусов гелевых элементов превышают 5% внутри каждого биочипа и 8% между всеми биочипами данной партии.

Пример 4. Одновременный анализ нескольких биотоксинов, в том числе холерного токсина на одном микрочипе.

Анализ проводят, как в примере 3, но биотинилированные МКАТ, детектирующие XT, вносят в смеси с биотинилированными антителами к другим токсинам (рицину, летальному фактору токсина Bacillus anthracis, протективному антигену токсина Bacillus anthracis, дифтерийному токсину, стафилококковым токсинам SeA, SeB, Sel, SeG). Пределы обнаружения биотоксинов для параллельного анализа такие же, как и при определении каждого токсина в отдельности. Для XT минимально детектируемая доза составляет 0,44 нг/мл.

Предложенные анализы можно использовать для тестирования на наличие токсина в продуктах питания, в воде и биоматериалах.

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для создания диагностических тест-систем. Получен новый клон гибридных клеток CT-F5/H3, продуцирующий в условиях клеточной культуры и брюшной полости сингенных животных моноклональные антитела (МКАТ) к холерному токсину. Клон получен путем слияния клеток мышиной миеломы SP-2/0 с клетками подколенных лимфоузлов мышей линии BALB/c, иммунизированных в подушечки задних лапок коммерческим препаратом холерного токсина (SIGMA). В качестве сливающего агента используют полиэтиленгликоль с м.м. 4000. Селекция гибридомы проведена на среде Игла в модификации Дульбекко с добавлением сыворотки плода коровы и гипоксантина-аминоптерина-тимидина. Гибридома синтезирует МКАТ, специфически взаимодействующие с холерным токсином и не взаимодействующие с термолабильным токсином E.coli. Титр антител достигает в культуральной жидкости 1:20000 1:40000, в асцитной - 1:4000000. Антитела могут быть использованы для конструирования иммунобиологических систем детекции холерного токсина, превосходящих по чувствительности имеющиеся аналоги. 2 ил.

Клон гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L СТ-F5/H3 - продуцент моноклональных антител к холерному токсину.