СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОСОВМЕСТИМОСТИ ИНОРОДНОГО МАТЕРИАЛА С ОРГАНИЗМОМ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/48 G01N33/573 G01N33/15 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в ортопедической и хирургической практике.

Любое внедрение инородного материала в организм сопровождается его ответной реакцией. Поэтому основной проблемой при взаимодействии инородных материалов с организмом является подбор таких материалов, которые вызывают минимальную реакцию отторжения их организмом.

Известен способ определения биосовместимости организма с инородным материалом на основе определения величины адгезии культуральных клеток фибробластического и макрофагального ряда. При этом в клеточную субстанцию помещали кусочки инородного материала размером 20×20 мм, после чего вносили суспензию кератоцитов и перитонеальных макрофагов и по способности этих клеток адгезировать к материалу судят о биосовместимости организма. (Патент RU 2084468).

Недостатком данного способа является его трудоемкость, т.к. требует многих часов наблюдения за клетками под микроскопом, а также недостаточная точность оценки активности препаратов, т.к. оценка зависит от опытности наблюдателя, кроме того, в данном способе изучают реакцию я не индивидуального организма, а отражают общую клеточную реакцию на введение инородного материала в организм.

Известен способ исследования биосовместимости организма с инородным материалом по ответной реакции моноцитов и нейтрофилов на внедрение в них различных видов инородных материалов. При этом изучаемый имплантант, изготовленный из керамики, включающей оксид алюминия, вводится в культуру моноцитов и исследуется количество цитокинов. (Estes Comparison of the response of primary human blood monocytes and the U937 human monocytic cell line to two different sizes of alumina ceramic particles / E. Yagil-Kelmer, P. Kazmier, M.N. Rahaman, B.S. Bal, R.K. Tessman, D.M. // J. Or-thop. Res. - 2004. - Vol.22, N 4. - P.832-838).

Недостатком данного способа является его недостаточная достоверность, так как используется только один параметр - количество цитокинов, также в данном способе проводят оценку биосовместимости не индивидуального организма, а определяют общую клеточную реакцию на введение инородного материала в организм.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению относится способ определения биосовместимости конкретного организма с инородным материалом по цитохимическим показателям ферментативной активности метаболических процессов лимфоцитов: лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы (Логинов А.Г. Структурно-функционая характеристика регионарного лимфатического узла при стоматологической имплантации. А.р. канн. Мед. наук. - Новосибирск. 1998. - 18с.)

Недостатком этого способа является:

- во-первых - инородный материал вводится в организм до изучения индивидуальной реакции организма на биосовмемстимость;

- во-вторых - в качестве исследуемого материала используют лимфоциты, у которых ответная реакция на раздражитель достаточно медленная;

в третьих - достоверность полученных результатов низкая, так как используют недостаточное количество параметров, позволяющих объективно оценить реакцию клеток.

в четвертых - проводят исследование только по одному инородному материалу;

в пятых - отсутствует числовое выражение степени воздействия исследуемого материала на организм.

Задача изобретения - повышение оперативности, информативности и достоверности оценки биосовместимости организма с инородными материалами на основе оценки цитохимических показателей активности клеток.

Для решения поставленной задачи в способе определения биосовместимости организма с инородным материалом, включающем внесение инородного материала в организм индивидуума, отбор исследуемого материала из него, отделение клеточной субстанции, подготовку ее для исследования, определение цитохимических показателей ферментативной активности клеток, согласно изобретению отбор исследуемого материала у индивидуума осуществляют до внесения в организм инородного материала, инородный материал в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг добавляют непосредственно в клеточную субстанцию, цитохимические показатели ферментативной активности клеток определяют до и после внесения в клеточную субстанцию инородного материала, причем ферментативную активность плазматической мембраны и показателей бактерицидности клеток определяют не менее чем по 4-м параметрам через три временных промежутка 45, 60, 120 мин, путем определения оптической плотности клеточной субстанции и результаты выражают в виде индекса стимуляции, который рассчитывают по формуле:

Т=N_o/N_k; где:

Т - индекс стимуляции;

N_o - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции с инородным материалом;

N_k - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции без инородного материала;

после чего рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на каждый отдельный инородный материал, затем данные показатели отдельно по каждому инородному материалу суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции, строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости каждого отдельного инородного материала и данного организма, при этом чем меньше суммарный индекс стимуляции, тем более организм биосовместим с инородным материалом.

Причем в качестве инородного материала используют изделия из керамики, металлические изделия, в частности титан, сталь, медь, а также синтетические изделия - латекс, ткань, асептический раствор, шовный материал.

При этом в качестве клеточной субстанции используют моноциты и нейтрофилы крови индивидуума. Ферментативную активность плазматической мембраны и показателей бактероцидности клеток организма определяют для ферментов: 5-нуклеотидазы, аденозинтрифосфатазы (АТФазы), мие-лопероксидазы, сукцинатдегидрогеназы и катионные белки.

Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab») при длине волны в соответствии для субстратного раствора каждого фермента.

Сущность способа поясняется следующей последовательностью операций:

Способ позволяет определить биосовместимость организма определенного человека к инородному материалу, который необходимо ввести ему в организм, например, в виде зубного или ортопедического протеза или в каком-то аналогичном случае.

Для этого у конкретного индивидуума производят отбор исследуемого материала - кровь из вены, готовят из нее клеточную субстанцию, а именно выделяют из нее клеточные элементы (моноциты и нейтрофилы) в конечной концентрации 4×10⁶ по 2 мл разносят в чашки Петри, дно которых предварительно покрывают Parafilms (известно, что фагоциты не способны прикрепляться к данному покрытию). Одну чашку оставляют для контроля, в остальные (по количеству исследуемых видов инородных материалов) вносят инородный материал в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг, при этом инородный материал добавляют непосредственно в клеточную субстанцию. В качестве инородных материалов использовали изделия из керамики, металлические изделия, в частности титан, сталь, медь, а также синтетические изделия - латекс, ткань, асептический раствор, шовный материал. Количество инородного материала и размер частиц были определены экспериментальным путем.

После контакта клеточных элементов с исследуемыми материалами через 45, 60 и 120 мин взвесь фагоцитов отбирают из чашки и разносят по 100 мкл на лунку, в триплетах на каждый образец. После адгезии при 37°С в течение 45 мин, для удаления не прикрепившейся популяции клеток, монослой клеток на лунках дважды отмывают теплой средой 199, после чего определяют цитохимические показатели ферментативной активности плазматической мембраны и показателей бактероцидности клеток организма.

Для увеличения достоверности определения биосовместимости организма с инородными материалами ферментативную активность элементов клеток организма определяют по пяти показателям: определяется активность ферментов плазматической мембраны (АТФ-аза, 5' нуклеотидаза) и показателей бактерицидности, а именно, активация сукцинатдегидрогеназы, миело-пероксидазы и катионных белков общепринятой методикой (Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Кондрашова Н.М., Запорожец Т.С. Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма. Методические рекомендации, Владивосток, 2005, 24 с.), через три временных промежутка 45, 60, 120 мин.

Оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab») при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.

Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов в фагоцитах выражались в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), который рассчитывают по формуле:

Т=N_o/N_k; где: Т - индекс стимуляции;

No - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции с инородным материалом;

N_k - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции без него.

Затем рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на каждый инородный материал путем суммирования значений индекса стимуляции в определенные промежутки времени и деления на количество этих промежутков.

Полученные показатели отдельно по каждому инородному материалу суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции. Значения больше единицы суммируются, а значения меньше единицы соответствуют нулю.

На основании этих показателей строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости каждого отдельного инородного материала и индивидуального организма, при этом чем сильнее влияет инородный материал на клетки, тем по большему числу параметров индекс стимуляции выше единицы, и сумма цифр выше, чем менее активен материал по отношению к клеткам, тем ниже суммарная оценка. Таким образом, степень влияния материала на клетки определяется согласно шкале биосовместимости в соответствии со значениями от 0 и далее.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна», так как биосовместимость организма и инородного материала определяется по реакции клеток индивидуального организма по совокупности ряда параметров с привлечением инструментального подсчета данных и оценки указанной реакции в соответствии со шкалой биосовместимости, что позволяет оценить степень влияния конкретного материала на конкретный организм в цифровых показателях.

При этом испытуемые материалы на уровне целого индивидуального организма имеют действие то же, что и на уровне клеток. Таким образом, изобретение позволяет сделать объективные выводы о биосовместимости конкретного организма и конкретного инородного материала.

Популяция фагоцитирующих клеток (моноцитов и нейтрофилов), активность ферментных систем которых отражает их реактивную способность, позволяет стимуляцию отразить в виде определенных цифровых показателей, которые можно получить с помощью инструментального (спектрофотометрического) объективного подсчета данных.

Простота выполнения, возможность одновременного исследования в одном образце ряда параметров и объективность учета результатов с помощью спектрофотометрии и унифицированного метода вычисления индекса стимуляции фагоцитов позволяет дать комплексную оценку состояния клеток.

Данная модель проста в постановке, легко воспроизводима, позволяет путем исследований in vitro судить о проявлении врожденной резистентности организма в ответ на присутствие инородных материалов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1.

Нами проведены исследования биосовместимости следующих материалов: 1 - керамика, 2 - титан, 3 - сталь, 4 - медь с организмом по показателям активности фагоцитирующей популяции клеток (моноцитов и нейтрофилов) крови индивидуума. Контроль составили адгезированные к пластику фагоциты без контакта с указанными веществами после их инкубирования в течение тех же промежутков времени в чашке Петри с Parafilms.

Из локтевой вены пациента обирали 5,0 мл крови, смешивали с гепарином (10 ед/мл), затем с 0,5 мл 1% раствора желатина на среде 199 и инкубировали при 37°С в термостате течение 30 мин. Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 12 мин, затем к осадку добавляли холодную среду 199 и осадок дважды ресуспендировали и таким образом отмывали от желатина в том же режиме по 7 мин. Клеточный осадок вновь ресуспендировали в 1 мл среды 199, а в камере Горяева подсчитывали количество клеток. Концентрация клеток доводится до 4 млн/мл.

Для определения биосовместимости клеточную суспензию в конечной концентрации 4×10⁶ по 2 мл разносили в чашки Петри, дно которых предварительно покрыто Parafilms. Одну чашку оставляли для контроля, в остальные 4 чашки непосредствнно в клеточную субстанцию вносят инородный материал: в первую чашку - керамику, во вторую - титан, в третью - сталь, в четвертую - медь (в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг) и помещали в термостат при 37°С. После контакта клеток с материалом через 45 мин, 60 и 120 мин клеточную субстанцию отбирали из чашки и разносили в иммунологические планшеты по 100 мкл на лунку, в триплетах на каждый образец.

Определение активности ферментов проводилось на фиксированных образцах, которые готовят следующим образом: после инкубации при 37°С в течение 45 мин клеточный монослой дважды отмывали теплой средой 199. Удаляли остатки среды путем постукивания планшета по фильтровальной бумаге, а монослой клеток фиксировали в парах формалина в течение 15 мин.

В качестве показателей стимуляции фагоцитов на материалы общеизвестным методам определяли активность ферментов плазматической мембраны (АТФ-аза, 5'-нуклеотидаза) и показателей бактерицидности, а именно активация сукцинатдегидрогеназы, миелопероксидазы и катионных белков.

1) Определение активности 5'-нуклеотидазы: в лунки планшета с фиксированным монослоем добавляли по 50 мкл субстрата для 5'-нуклеотидазы (4 мг adenosine-5'-mono phosphate (ICN) на 1 мл субстратного раствора, который готовится на основе 0,05 М трис-НСl-буфера (рН=7,8), путем растворения в 100 мл этого буфера 87 мг NaCl и 70 мг MgCl₂). Образцы оставляли в термостате при 37°С на 60 мин. Затем добавляли по 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин измеряли оптическую плотность полученных субстратов на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 620 нм.

2) Определение активности АТФазы. К монослою клеток добавлялось по 50 мкл субстрата для АТФазы (8 мг adenosine-5'-triphosphate (ICN) на 1 мл на основе трис-НСl-буфера рН=7,8, содержавшего 87 мг NaCl, 28,7 мг КСl, 5,2 мг MgCl₂ на 6 Н₂O). Образцы оставлялись в термостате при 37° с субстратом на 30 мин. Реакция останавливалась добавлением 100 мкл смеси аскорбиновой и молибденовой кислот в соотношении 1:1. Через 20 мин результаты учитывались с помощью спектрофотометра «Titertek Multiscan Plus» («Flow lab», Финляндия) при длине волны 620 нм. В качестве контроля использовались образцы с растворами субстратов и смеси кислот без клеток.

3) Определение активности миелопероксидазы. Свежеприготовленный субстратный раствор (к 10 мл фосфатно-цитратного буфера (рН 5,0) добавляем 4 мг o-phenylenediamine (ICN) и 500 мкл 0,33 % перекиси водорода) по 100 мкл вносили в лунки планшета. Затем его оставляли при комнатной температуре в течение 10 мин, после чего добавляли 10% раствор серной кислоты по 100 мкл на лунку. Определяли оптическую плотность на спектрофотометре "Multiscan Titertek Plus" ("Flow lab.") при длине волны 492 нм.

4) Определение активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Определение активности фермента проводили в МТТ-тесте, где в качестве субстрата использовали 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (метилтиазолилтетразолий бромид, МТТ, производства ICN). В лунки к фиксированным клеткам добавляли по 100 мкл МТТ (2 мг/мл) на основе 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), включающего 4 мл 1 % раствора МnСl₂. Монослой клеток вместе с раствором МТТ инкубировали при 37°С в течение 30 мин, после чего надосадок удаляли, монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса и высушивали на воздухе. Для подсчета гранул бромида диформазана клетки разрушали добавлением 100 мкл изопропилового спирта, подкисленного 0,4 М НСl. Оптическую плотность определяли на микроплатном рейдере при длине волны 540 нм. Бланкирование производится по подкисленному изопропиловому спирту.

5) Определение активности катионных белков.

В лунки с фиксированными на пластике клетками вносили по 50 мкл раствора, содержащего 10 мг прочного зеленого ("Fast Green", "Serva"), растворенного в 10 мл метанолового трис-буфера (рН 8,0-8,2). Планшет инкубировали в течение 30 мин при 37°С. Затем невключившийся краситель отмывали раствором Хенкса дважды, после чего добавляли 50 мкл диметилсульфоксида (DMSO, производство «ICN»), предварительно разогретого на водяной бане до 80°С. Результаты учитывали с помощью спектрофотометра «Titertek Multiscan Plus» при длине волны 620 нм.

Результаты спектрофотометрического анализа активности ферментов в фагоцитах выражались в виде унифицированного показателя - индекса стимуляции (Т), который рассчитывают по формуле:

Т=N_o/N_k; где:

Т - индекс стимуляции;

No - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции с инородным материалом;

N_k - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции без инородного материала.

Затем рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на каждый инородный материал путем суммирования значений индекса стимуляции в определенные промежутки времени и деления на количество этих промежутков.

Полученные показатели отдельно по каждому инородному материалу суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции. Значения больше единицы суммируются, тогда как значения меньше единицы соответствуют нулю.

На основании этих показателей строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости каждого отдельного инородного материала и конкретного организма, при этом чем сильнее влияет инородный материал на клетки, тем по большему числу параметров индекс стимуляции выше единицы, и сумма цифр выше, чем менее активен материал по отношению к клеткам, тем ниже суммарная оценка. Таким образом, степень влияния материала на клетки определяется согласно шкале биосовместимости в соответствии со значениями от 0 и далее.

Полученные данные представлены в таблицах 1-6.

Таблица 1
Показания индекса стимуляции по активности фермента 5' нуклеотидазы плазматической мембраны фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин Виды инородных материалов контроль Керамика Титан Сталь Медь No No No No Nк 0         0,0585 45 0,05 0,084667 0,1395 0,170667   60 0,064 0,10175 0,151667 0,234333 120 0,05 0,120333 0,154333 0,257 Оптическая плотность (среднее значение) No(cp) 0,0547 0,101777 0,1485 0,22066 Т 0,934473 1,747863 2,538462 3,77208

Таблица 2
Показания индекса стимуляции активности фермента АТФазы фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин. Виды инородных материалов контроль керамика титан сталь медь   No No No No Nк 0         0,07375 45 0,07375 0,06775 0,08425 0,07625   60 0,0675 0,1445 0,175 0,2645 120 0,0525 0,18275 0,2 0,259333 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср.) 0,064583 0,131667 0,153083 0,200028 Т 0,875706 1,785311 2,075706 2,712241

Таблица 3.
Показания индекса стимуляции по активности фермента миелопероксидазы фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин Виды инородных материалов   керамика титан сталь медь контроль No No No No Nк 0         0,102533 45 0,102533 0,07667 0,175 0,111333   60 0,084667 0,09303 0,155667 0,183 120 0,093333 0,09333 0,108667 0,173 Оптическая плотность (среднее значение) No(cp.) 0,093511 0,087677 0,346444 0,155778 Т 0,912007 0,855107 1,0923852 1,399202

Таблица 4.
Показания индекса стимуляции по активности фермента сукцинатдегидрогеназы фагоцитов после их контакта с инородными материалами   Виды инородных материалов контроль Время контакта, мин Керамика Титан Сталь Медь No No No No Nк 0         0,171533 45 0,159 0,152333 0,177333 0,183   60 0,164 0,186 0,176 0,177667 120 0,185667 0,199 0,187667 0,207 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср.) 0,169556 0,179111 0,180333 0,189222 Т ср 0,98847 1,044177 1,051302 1,103122

Таблица 5.
Показания индекса стимуляции активности катионных белков фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин. Виды инородных материалов контроль керамика титан сталь медь   No No No No Nк 0         0,2635 45 0,298 0,2605 0,3175 0,2945   60 0,2635 0,2775 0,29 0,292 120 0,2205 0,3085 0,2285 0,257 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср.) 0,260667 0,282167 0,278667 0,281167 Т 0,970826 0,946868 1,057559 1,275132

Таблица 6.
Шкала биосовместимости организма и инородных материалов. Виды инородных материалов Суммарная оценка Т по шкале биосовместимости контроль 0 керамика 0 титан 3 сталь 7 медь 8

Таким образом, данному пациенту согласно оценке по шкалы биосовместимости больше всего подходит керамика, так как этот материал обладает наименее выраженным эффектом на метаболическую активность клеток. Наименьшей биосовместимостью с клетками обладала медь, затем сталь и титан.

Пример 2.

Способ осуществлялся аналогично примеру №1. Результаты по определению биосовместимости приведены в таблицах 7-12.

Таблица 7
Показания индекса стимуляции по активности фермента 5' нуклеотидазы плазматической мембраны фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин Виды инородных материалов контроль керамика титан сталь медь     No No No No Nк 0         0,0585 45 0,058 0,07467 0,1105 0,10667   60 0,074 0,09103 0,107 0,1093 120 0,069 0,10933 0,11433 0,157 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,067 0,0913 0,1106 0,1243 Т 1,145299 1,567105 1,890786 2,125185

Таблица 8.
Показания индекса стимуляции по активности АТФазы фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин Виды инородных материалов контроль Керамика Титан Сталь Медь     No No No No Nк 0         0,07375 45 0,0875 0,0775 0,0876 0,0856   60 0,0756 0,154 0,168 0,1876 120 0,0756 0,1775 0,117 0,15933 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,079567 0,136333 0,1242 0,144178 Т 1,07887 1,848588 1,684068 1,954951

Таблица 9. Показания индекса стимуляции по активности фермента миелопероксидазы фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин Виды инородных материалов             керамика титан сталь медь контроль   No No No No Nк 0         0,102533 45 0,115 0,357667 0,305 0,128   60 0,0976 0,303 0,367 0,179   120 0,0987 0,259333 0,307 0,181   Оптическая плотность (среднее значение) No (ср)           0,103767 0,306667 0,326333 0,162667   Т 1,012032 2,990907 3,182715 1,586481  

Таблица 10
Показания индекса стимуляции по активности фермента сукцинатдегидрогеназы фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время контакта, мин Виды инородных материалов контроль керамика титан сталь медь No No No No Nк 0         0,171533 45 0,1619 0,174 0,271 0,193   60 0,159 0,178 0,25 0,18667 120 0,1667 0,189 0,204 0,197 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,162533 0,180333 0,241667 0,192223 Т 0,947534 1,051304 1,408864 1,12062

Таблица 11.
Показания индекса стимуляции активности катионных белков фагоцитов после их контакта с инородными материалами Время Виды инородных материалов   контакта, мин керамика титан сталь медь контроль   No No No No Nк 0           45 0,208 0,31 0,2175 0,467   60 0,2743 0,367 0,345 0,586 120 0,2196 0,358 0,385 0,577 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,233967 0,345 0,315833 0,543333 Т 0,887919 1,309298 1,198608 2,061986

Таблица 12.
Шкала биосовместимости инородных организма и материалов. Виды неорганических материалов Суммарная оценка по шкале биосовместимости контроль 0 керамика 3 титан 6 сталь 7 медь 7

Таким образом, данному пациенту в соответствии с табл. 12 суммарная оценка по шкале биосовместимости по всем показателем значительно больше контроля и можно предполагать, что в этом случае внедрение в организм каких-либо протезов, изготовленных из исследуемых материалов, вызовет воспалительную реакцию организма. Это, в свою очередь, может оказать влияние на развитие отторжения внедренного протеза.

Пример 3.

Для доказательства эффективности шкалы биосовместимости мы сочли необходимым провести исследование функциональной активности клеток при их взаимодействии с материалами, контакт с которыми возможен при хирургической операции. В качестве тестируемых материалов мы использовали латекс (из которого произведены хирургические перчатки), ткань (марлевые тампоны), асептический раствор и капроновую нить для наложения шва.

Способ осуществлялся аналогично примеру №1. Результаты по определению биосовместимости приведены в таблицах 13-17.

Таблица 13.
Показания индекса стимуляции по активности фермента 5' нуклеотидазы плазматической мембраны фагоцитов после их контакта с инородными материалами время контакта, мин. Виды инородных материалов   титан латекс ткань асептический раствор нить контроль   No No No No No Nк 0           0,0388 45 0,035 0,04 0,039 0,049 0,046   60 0,042 0,046 0,039 0,048 0,045   120 0,036 0,037 0,038 0,047 0,042   Оптическая плотность (среднее значение) No (ср)                                                 0,037 0,038 0,0388 0,047 0,0436   Т 0,953608 0,979381 1,0 1,21134 1,123711  

Таблица 14.
Показания индекса стимуляции по активности АТФазы фагоцитов после их
контакта с инородными материалами время контакта, мин. Виды инородных материалов   титан пластик ткань асептический раствор нить контроль   No No No No No Nк 0           0,0383 45 0,041 0,039 0,036 0,045 0,045   60 0,038 0,035 0,033 0,044 0,038   120 0,039 0,035 0,034 0,049 0,041   Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,03933 0,036 0,0344 0,045 0,04   Т 1,02698 0,939948 0,898172 1,174935 1,044386  

Таблица 15.
Показания индекса стимуляции по активности фермента миелопероксидазы фагоцитов после их контакта с инородными материалами время контакта, мин Виды инородных материалов   титан латекс ткань асептический раствор нить контроль   No No No No No Nк 0           0,053 45 0,053 0,058 0,052 0,054 0,056   60 0,053 0,055 0,056 0,052 0,053 120 0,054 0,055 0,055 0,052 0,054 Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,0508 0,0538 0,0542 0,053 0,0536 Т 0,958491 1,015094 1,022642 1 1,011321

Таблица 16.
Показания индекса стимуляции активности катионных белков фагоцитов после их контакта с инородными материалами время контакта, мин Виды инородных материалов   титан латекс ткань асептический раствор нить контроль   No No No No No Nк 0           0,073 45 0,07 0,065 0,071 0,082 0,087   60 0,07 0,068 0,087 0,074 0,077   120 0,09 0,074 0,09 0,09 0,075   Оптическая плотность (среднее значение) No (ср) 0,0682 0,0718 0,0776 0,0774 0,079   Т 0,934247 0,983562 1,063014 1,060274 1,082192  

Таблица 17.
Шкала биосовместимости организма и инородных материалов. Виды неорганических материалов Суммарная оценка по шкале биосовместимости контроль 0 титан 1 латекс 1 ткань 3 асептический раствор 4 нить 4

Таким образом, согласно оценке по шкале наибольшей биосовместимостью с клетками обладают титан и латекс, а наименьшим выраженным эффектом на метаболическую активность клеток обладали асептический раствор, нить и ткань. Причем у данного пациента в отношении титана по сравнению с данными, полученными по активности клеток первого и второго пациента, стимуляция клеток была на 1 единицу, что указывает на среднюю реакцию клеток в отношении этого материала.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в ортопедической и хирургической практике. Для осуществления способа определения биосовместимости организма с инородным материалом до его внесения в организм проводят отбор исследуемого материала у индивидуума, инородный материал в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг добавляют непосредственно в клеточную субстанцию и определяют цитохимические показатели ферментативной активности клеток до и после внесения в клеточную субстанцию инородного материала. Причем ферментативную активность клеток определяют не менее чем по 5 параметрам, через три временных промежутка, путем определения оптической плотности клеточной субстанции, а полученные показатели выражают в виде индекса стимуляции, после чего рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на каждый инородный материал. Затем данные показатели отдельно по каждому инородному материалу суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции, строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости каждого отдельного инородного материала и конкретного организма, при этом чем меньше суммарный индекс стимуляции, тем больше инородный материал биосовместим с организмом. 4 з.п. ф-лы, 17 табл.

1. Способ определения биосовместимости организма с инородным материалом, включающий внесение инородного материала в организм индивидуума, отбор исследуемого материала у него, отделение клеточной субстанции, подготовку ее для исследования, определение цитохимических показателей ферментативной активности клеток, отличающийся тем, что отбор исследуемого материала у индивидуума осуществляют до внесения в организм инородного материала, инородный материал в виде порошка с размером частиц от 0,5 до 1 мм³ в количестве 500 мкг добавляют непосредственно в клеточную субстанцию, определяют цитохимические показатели ферментативной активности клеток до и после внесения в клеточную субстанцию инородного материала, причем ферментативную активность плазматической мембраны и показателей бактерицидности клеток определяют не менее чем по 5 параметрам, через три временных промежутка 45, 60, 120 мин, путем определения оптической плотности клеточной субстанции, а полученные показатели выражают в виде индекса стимуляции, который рассчитывают по формуле:
Т=N_о/N_k,
где Т - индекс стимуляции;
N_o - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции с инородным материалом;
N_k - средний показатель оптической плотности клеточной субстанции без него;
после чего рассчитывают среднеарифметическое значение индекса стимуляции каждого отдельного цитохимического показателя по реакции клеточной субстанции на каждый инородный материал, затем данные показатели отдельно по каждому инородному материалу суммируют, при этом используют только целую часть числа индекса стимуляции, строят шкалу биосовместимости и по ней судят о степени биосовместимости каждого отдельного инородного материала и конкретного организма, при этом чем меньше суммарный индекс стимуляции, тем больше инородный материал биосовместим с организмом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве инородного материала используют керамику, металлические изделия, в частности титан, сталь, медь, а также синтетические изделия - латекс, ткань, асептический раствор и шовный материал.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве клеточной субстанции используют моноциты и нейтрофилы крови индивидуума.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментативную активность плазматической мембраны и показателей бактерицидности клеток определяют не менее чем по 5 параметрам элементов клеток организма определяют для ферментов 5'-нуклеотидазы, аденозинтрифосфатазы, миелопероксидазы, сукцинатдегидрогеназы и катионные белки.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптическую плотность раствора измеряют на микропроцессоре Titertek Multiscan Plus ("Flow lab») при длине волны в соответствии для субстратного раствора для каждого фермента.