Изобретение относится к области экспериментальной и клинической медицины, а именно к фундаментальной иммунологии, и может быть использовано для создания экспериментальной модели иммунодефицитного состояния, обусловленного нарушением функций клеток врожденного иммунитета с целью изучения патогенеза заболеваний и разработки методов коррекции иммунной недостаточности.
Многие исследования в области иммунологии выполняются на животных с искусственно созданными дефектами иммунной системы. Из практики известен ряд способов снижения иммунитета, в частности снижения функциональной способности клеток врожденного иммунитета. Среди них - способ создания количественной депрессии нейтрофильных гранулоцитов в результате хирургического удаления вилочковой железы (тимэктомии). При этом депрессивный эффект обусловлен торможением дифференцировки стволовой клетки в направлении гранулоцитопоэза (Р.В. Петров, Р. М. Хаитов и др. "Влияние тимэктомии на гранулоцитопоэз", Радиобиология, 1976. - N 4, с. 560). Однако следует учитывать, что этот метод трудоемок, требует специальных навыков и аппаратуры и является достаточно длительным.
Существует способ моделирования иммунодефицита, который заключается в угнетении клеточного иммунитета экспериментальных животных путем бесконтактного воздействия на них постоянным электрическим полем 100-110 кВт/м в течение 20-22 дней с ежедневной четырехчасовой экспозицией (Авт. св. СССР N 1763459, G 09 В 23/28). К недостаткам данного способа моделирования относится длительность проведения манипуляций для достижения иммунодефицитного состояния и проявление этого состояния в дефектности функций клеток приобретенного иммунитета, а именно Т- и В-лимфоцитов.
Существуют способы моделирования иммунодефицитного состояния по системе нейтрофильных гранулоцитов, при которых внутрибрюшинно вводятся либо гепарин в дозе 100 мг/кг веса мыши, либо антипролиферативное средство - циклофосфамид в дозе 0,5 мг/кг, что позволяет добиваться максимальной депрессии количества этих клеток в периферической крови и угнетения их функций соответственно через 1 ч и через 15 ч после введения препарата (Авт. св. РФ №2107330, G09В 23/28; Авт. св. №2118850, РФ, G09В 23/28). Недостатками этих способов является моделирование дефектных функций только одного типа клеток врожденного иммунитета - нейтрофилов, а также возникновение целого ряда осложнений в ответ на введение препарата - развитие геморрагий, гипокоагуляций, приводящих к летальному исходу. Следует также учитывать индивидуальную непереносимость гепарина и появление аллергических реакций при его введении, а также алкилирующее воздействие циклофосфамида на ДНК клеток всего организма, которое выражается в его генотоксичности.
Наиболее близким к заявляемому нами техническому решению является способ моделирования дефекта макрофагов путем насыщения брюшной полости животных 0,6%-ным раствором перекиси водорода в количестве 2 мл на мышь, что позволяет провести блокаду миелопероксидазы этих клеток. При этом достигается достоверное снижение содержания активной пероксидазы перитонеальных макрофагов и их функциональной активности в отношении микобактерий лепры или туберкулеза (Авт. св. РФ №2105352, G09В 23/28). К недостаткам данного способа моделирования относится ограниченность применения модели, подходящей для узкого спектра патогенных факторов (лепры, туберкулеза). Кроме того, данная модель не соответствует физиологическим условиям нахождения организма в реальной среде и индуцируют функциональную недостаточность только одного типа клеток врожденного иммунитета - макрофагов. Этот способ принят нами в качестве прототипа.
Известно, что иммунодефицитные состояния клеток врожденного иммунитета (полиморфноядерных лейкоцитов, моноцитов/макрофагов) рассматриваются как фактор риска для развития многих патологических процессов. Большинство проникающих в организм инфекционных агентов подвергаются утилизации фагоцитирующими клетками даже без заметной стимуляции других звеньев иммунитета, поскольку эти клетки наиболее чувствительны к внешним воздействиям. При развитии патологий большое прогностическое значение принадлежит сценарию развертывания воспалительного процесса, стержнем которого являются патоген-опосредованные повреждения клеточных факторов врожденного иммунитета, в дальнейшем определяющих течение и исход заболеваний.
Известно, что повышенный риск развития воспалительных процессов инфекционного генеза имеет место при резкой смене температурного фактора внешней среды, например, при межрегиональных перемещении «из зимы в лето и обратно». Кроме того, высокая температура обладает более выраженным стрессовым воздействием на защитную систему организма, инициируя таким образом иммунодефицитное состояние. В связи с этим для правильного подбора адекватных иммунокорректоров функций клеток врожденного иммунитета при воспалительных заболеваниях инфекционного генеза необходимо создание экспериментальной модели иммунодефицитного состояния с выраженной функциональной недостаточностью этих клеток.
Целью предлагаемого способа является моделирование реальных физиологических условий для индукции вторичного иммунодефицитного состояния по системе клеток врожденного иммунитета - нейтрофилов и макрофагов. Для этого необходимо решить следующие задачи: а) изучить влияние температурного фактора на функцию клеток врожденного иммунитета животных, подвергнутых воздействию высокой температуры; б) определить временной интервал, после которого развивается максимальный депрессирующий эффект высокой температуры по отношению к клеткам врожденного иммунитета этих животных; в) доказать влияние вызванного действием высокой температуры иммунодефицита на патогенез инфекционного заболевания.
Техническим результатом и преимуществом предлагаемого способа моделирования является адекватное воспроизведение физиологических условий нахождения организма в реальной среде, а также бесконтактное воздействие, которое снижает количество летальных исходов и осложнений, возникающих при использовании фармакологических веществ. Кроме того, в предлагаемом способе моделирования вторичного иммунодефицита целенаправленно создаются условия для индукции дефектов клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов), контролирующих первую линию обороны организма от инфекций.
Для достижения технического результата поставленной задачи в предлагаемом способе моделирования вторичного иммунодефицита на мелких лабораторных животных, включающем создание функциональной недостаточности клеток врожденного иммунитета, согласно изобретению предварительно в перитонеальную полость каждого животного вводят стерильную 1% пептонную воду в объеме 0,2 мл и через 18 часов осуществляют нагревание животных в течение 4-х часов в воздушном термостате при температуре +30°С с принудительной вентиляцией, при относительной влажности воздуха 60-68%, атмосферном давлении 744-760 мм рт.ст., содержании O2 и CO2 соответственно 20,5% и 0,10%.
Новизна предлагаемого способа заключается в том, что после 4 часов воздействия высокой температуры выявляется максимальное угнетение метаболизма и функциональной активности клеток врожденного иммунитета - нейтрофилов и макрофагов. Животных с индуцированным вторичным иммунодефицитом используют в качестве модели для изучения патогенеза инфекционных заболеваний.
Изобретательский уровень предложения заключается в его неочевидности. Авторам изобретения неизвестно использование предлагаемого способа для моделирования вторичного иммунодефицита. При этом обеспечивается его лучшая воспроизводимость.
Воспроизводимость способа моделирования вторичного иммунодефицита осуществлена в эксперименте, проведенном на 100 беспородных белых мышах весом 15-20 г, которые были разделены на 4 группы: 1-я - интактные, незараженные мыши (контроль 1, 10 шт. ), 2-я - незараженные животные, подвергнутые воздействию высокой (+30°С) температуры, (контроль 2, 30 шт. ); 3-я - животные, зараженные Y. pseudotuberculosis без температурного воздействия, 30 шт.; 4-я - опытные животные, подвергнутые воздействию высокой (+30°С) температуры и зараженные Y. pseudotuberculosis, 30 шт. За 18 часов до проведения эксперимента у животных вызывали внутрибрюшинное воспаление путем введения стерильной 1% пептонной воды в количестве 0,2 мл на мышь. Создание иммунодефицитного состояния осуществляли нагреванием животных в течение 2, 3 и 4 ч в воздушном термостате при температуре +30°С с принудительной вентиляцией при относительной влажности воздуха 60-68%, атмосферном давлении 744-760 мм рт.ст., содержании O2 и CO2 соответственно 20,5% и 0,10%. Оптимальный объем рабочей камеры воздушного термостата - 0,064 кубического метра. Измерение температуры нагреваемых животных производилось ректальным ртутным термометром с ценой деления 0,1°С. Затем у животных производили отбор клеток из перитонеального экссудата, промывая брюшную полость 5 мл холодной среды 199, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки и гепарин (5 ед./мл). Концентрацию клеток доводили до 2×106 кл/мл и разносили по 1 мл в пенициллиновые флаконы с помещенными внутрь покровными стеклами, куда вносили бактерии в соотношении 1:20, и в плоскодонные 96-луночные микропланшеты по 100 мкл на лунку. Для адгезии взвесь клеток оставляли в CO2-инкубаторе (МСО-15АС) при 37°С и 5% содержания CO2, через 40 мин монослой клеток дважды отмывали средой того же состава от неадгезированных клеток, после чего исследовали активность ферментов. Степень функциональной недостаточности клеток определяли по состоянию цитохимической ферментативной активности для составляющих элементов кислородзависимой системы: лактатдегидрогеназа (ЛДГ), цитохромоксидаза (ЦХО), миелопероксидаза (МПО), а также по внутриклеточному содержанию 5'нуклеотидазы (АМФазы) и содержанию оксида азота (NO) через 2, 3, и 4 ч после температурного воздействия на животных. Количество продуктов реакции определяли по поглощению раствора на спектрофотометре "Labsystem Multiscan RC" (Финляндия) при соответствующих для определяемых субстратов длинах волн. Результаты спектрофотометрического исследования выражали в виде индекса стимуляции (Т), который вычислялся как отношение разности между средними показателями оптической плотности растворов, содержащих продукты реакции клеток животных после воздействия температуры и клеток от интактных животных, к среднему показателю оптической плотности раствора для клеток от интактных животных, в процентах.
Также определяли фагоцитарные показатели клеток в отношении бактерий Y. Pseudotuberculosis после контакта в течение 30 и 120 мин. Помимо определения функциональной активности клеток проводили гистологическое исследование органов-мишеней (легкое, печень, селезенка) животных через 1, 2, 3, 7, 14 и 21 суток после заражения путем фиксации в 10% растворе формалина, забуференного по Лилли, затем обезвоживания в этаноле возрастающей концентрации и заливки в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 3-5 мкм депарафинировали, окрашивали гематоксилином и эозином.
Изложенная сущность способа поясняется в описании двумя таблицами. Согласно результатам эксперимента установлено, что воздействие высокой температуры на экспериментальных животных (+30°С) изменяет функциональное состояние клеток врожденного иммунитета по показателям фагоцитоза (табл. 1) и активности ферментов (табл. 2).
Представленные в таблице данные демонстрируют, что наибольшее значение ИЗФ, которое отражает размножение бактерий в клетках, и вычисляется как соотношение разницы между показателями ФИ через 120 мин и ФИ через 30 мин к показателю ФИ через 30 мин, определялось в клетках животных, подвергнутых воздействию высокой температуры (+30°С) в течение 4-х часов. Фермент АМФ-аза локализуется в основном в плазматической мембране клеток и является регулятором уровня циклического аденозинмонофосфата, который обеспечивает передачу сигналов от плазмалеммы внутрь клетки. Понижение активности эктофермента плазмалеммы АМФ под воздействием высокой температуры свидетельствует о снижении этой способности для клеток врожденного иммунитета, минимальный уровень фермента наблюдался через 4 часа после температурного воздействия и у животных, подвергнутых воздействию высокой температуры и зараженных Y. pseudotuberculosis (табл. 2).
Уровень ЛДГ в клетках коррелирует с уровнем энергетического потенциала клеток, по изменению активности ЛДГ оценивают их метаболический статус. Значительное снижение индекса стимуляции для ЛДГ наблюдалось через 4 часа после воздействия температурой, что говорит о снижении защитной способности клеток в этот период. Увеличение количества ЦХО на протяжении всего эксперимента указывает на активацию перекисного окисления липидов, что сопровождается деструкцией митохондриальных мембран. Повышение активности ЦХО при воздействии высокой температуры выявлялось на протяжении всего наблюдаемого периода. При исследовании активности МПО, маркера интенсивности воспалительных процессов было установлено достоверное максимальное снижение индекса стимуляции через 4 часа воздействия высокой температуры.
Подобная закономерность была обнаружена при выявлении показателей активности указанных ферментов в клетках животных, зараженных бактериями. Причем у животных, предварительно до инфицирования подвергнутых тепловому воздействию, индекс стимуляции значительно отличался от показателей активности ферментов клеток животных, зараженных бактериями. При гистологическом исследовании органов после воздействия высокой температуры в течение 4 часов у животных на фоне выраженного геморрагического компонента патологического процесса и слабой клеточной воспалительной реакции отмечалось истощение органов иммунной системы (делимфатизация), что указывало на развитие иммунодефицита. Также у таких животных после заражения обнаружены более тяжелые проявления псевдотуберкулезной инфекции с увеличением показателей летальности в 2,6 раза, по сравнению с животными без теплового стресса, а в органах-мишенях - легком, печени и селезенке, отмечалось резкое нарушение гемоциркуляции в сочетании со значительными деструктивными изменениями, характерными для генерализованной инфекции.
Таким образом, экспериментальные данные показывают, что воздействие высокой температуры (+30°С) может служить способом моделирования иммунодефицитного состояния по системе клеток врожденного иммунитета. Временной интервал, в течение которого развивается максимальный депрессирующий эффект по отношению к клеткам врожденного иммунитета - 4 часа непрерывного температурного воздействия. Именно в этот период значительно снижается киллинговый потенциал фагоцитов и в случае инфицирования утяжеляется течение инфекционного заболевания.
Пример
Мыши весом 20 г вводят однократно внутрибрюшнно стерильную 1% пептонную воду в количестве 0,2 мл. Через 18 часов мышь размещают в воздушном термостате при температуре +30°С с принудительной вентиляцией при относительной влажности воздуха 64%, атмосферном давлении 756 мм рт.ст., содержании O2 - 20,5% и СО2 - 0,10%. Оптимальный объем рабочей камеры воздушного термостата - 0,064 кубического метра.
Через 4 часа нахождения в термостате мышь использована как модель иммунодефицитного состояния клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов), т.к. в этот момент у нее отмечалась максимальная депрессия функций этих клеток.
Способ обеспечивает адекватное воспроизведение физиологических условий нахождения организма в реальной среде с целью индукции вторичного иммунодефицитного состояния организма. Преимуществом данного способа моделирования является бесконтактное воздействие, которое снижает количество летальных исходов и осложнений, возникающих при использовании фармакологических веществ. Кроме того, в предлагаемом способе моделирования вторичного иммунодефицита целенаправленно создаются условия для индукции дефектов клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов), контролирующих первую линию обороны организма от инфекций.
Источники информации
1. Влияние тимэктомии на гранулоцитопоэз. Петров Р.В., Хаитов P.M. и др. Радиобиология, 1976. - №4, с. 560;
2. Авт. св. СССР №1763459, G09В 23/28;
3. Авт. св. РФ №2107330, G09В 23/28;
4. Авт. св. РФ №2118850, G09В 23/28;
5. Авт. св. РФ №2105352, G09В 23/28.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ "БАКТИМ" ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ И СПОСОБ ИХ ПРОФИЛАКТИКИ | 1995 |
|
RU2119339C1 |
Метабиотический препарат-иммуномодулятор, содержащий клеточные стенки симбионтных коринебактерий, для укрепления врожденного иммунитета и способ его получения | 2017 |
|
RU2648156C1 |
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА | 2001 |
|
RU2194419C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХЕЛПЕРНЫХ ФРАКЦИЙ НЕЙТРОФИЛОКИНОВ, СИНТЕЗИРОВАННЫХ НЕЙТРОФИЛАМИ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОД ВЛИЯНИЕМ КЛЕТОК ВАКЦИННОГО ШТАММА ЧУМНОГО МИКРОБА | 2007 |
|
RU2341561C1 |
Способ инкорпорации биологически активных микро- и наночастиц в нейтрофилы | 2016 |
|
RU2633502C2 |
БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ УСТРАНЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1998 |
|
RU2128999C1 |
СРЕДСТВО С ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ | 1995 |
|
RU2093162C1 |
СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ У МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2008 |
|
RU2363483C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРОНДОЗИДА А И СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ | 2005 |
|
RU2339644C2 |
СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2009 |
|
RU2406524C1 |
Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования иммунодефицитного состояния, обусловленного нарушением функций клеток врожденного иммунитета. Для этого в перитонеальную полость мелких лабораторных животных вводят стерильную 1% пептонную воду в объеме 0,2 мл. Через 18 часов после введения животных размещают на 4 часа в воздушном термостате при температуре +30°С с принудительной вентиляцией, при относительной влажности воздуха 60-68%, атмосферном давлении 744-760 мм рт.ст. и содержании O2 и CO2 соответственно 20,5% и 0,10%. Способ обеспечивает адекватное воспроизведение физиологических условий нахождения организма в реальной среде при моделировании вторичного иммунодефицита, связанного с дефектом клеток врожденного иммунитета (нейтрофилов и макрофагов), контролирующих первую линию обороны организма от инфекций. 2 табл., 1 пр.
Способ моделирования вторичного иммунодефицита на мелких лабораторных животных, включающий создание функциональной недостаточности клеток врожденного иммунитета, отличающийся тем, что предварительно в перитонеальную полость каждого животного вводят стерильную 1% пептонную воду в объеме 0,2 мл и через 18 ч осуществляют нагревание животных в течение 4 ч в воздушном термостате при температуре +30°С с принудительной вентиляцией, при относительной влажности воздуха 60-68%, атмосферном давлении 744-760 мм рт.ст., содержании O2 и CO2 соответственно 20,5% и 0,10%.
ПЕТРОВ Р.В | |||
и др | |||
Влияние тимэктомии на гранулоцитопоэз | |||
Радиобиология, 1976, N 4, с | |||
СКЛАДНАЯ НИВЕЛЛИРОВОЧНАЯ РЕЙКА | 1923 |
|
SU560A1 |
СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТНОГО СОСТОЯНИЯ ПО Т-КЛЕТОЧНОМУ ТИПУ | 1992 |
|
RU2050020C1 |
СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПОСТМЕДИКАМЕНТОЗНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА | 2007 |
|
RU2351019C1 |
Пурка | 1928 |
|
SU12382A1 |
WO 2015195768 A1, 23.12.2015 | |||
CN 105237634 A (UNIV CHINA AGRIC), 13.01.2016 | |||
ЗАЦАРИННАЯ С.К | |||
Вторичные иммунодефицитные состояния в эксперименте и клинике: проблемы моделирования, диагностики, коррекции и реабилитации | |||
Кубанский научный медицинский вестник, 1995 | |||
Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
С | |||
Способ получения на волокне оливково-зеленой окраски путем образования никелевого лака азокрасителя | 1920 |
|
SU57A1 |
LAZARUS AH et al | |||
Induction of a secondary human anti-HLA alloimmune response in severe combined immunodeficient mice engrafted with human lymphocytes | |||
Transfusion | |||
Электрическое сопротивление для нагревательных приборов и нагревательный элемент для этих приборов | 1922 |
|
SU1997A1 |
Авторы
Даты
2018-02-12—Публикация
2016-03-28—Подача