СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ИХТИОВИРУСОВ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ОТ РЫБ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И МОНИТОРИНГОВЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для выделения вирусов-возбудителей весенней виремии карпа и герпесвирусной болезни сибирского осетра при проведении диагностических и мониторинговых исследований.

Известен способ выделения вирусов из клинического материала от рыб [Wolf К. Guidelines for virological examination of fishes. In: A Symposium on Diseases of Fishes and Shellfishes. S.F.Snieszko (ed.). Spec. Publ. N 5, American Fisheries Society, Washington, D.C., 1970, p.327-340; «Методические указания по идентификации вирусов и лабораторной диагностике вирусных болезней рыб», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 10.10.97 г., №13-4-2/1054. В кн.: Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. - М.: Отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - 4.1. - С.60-113.]. При его использовании исследуемый образец ткани обрабатывают без предварительной подготовки следующим образом: гомогенизация ткани, приготовление 10%-ной суспензии тканевого гомогената в питательной среде, центрифугирование, деконтаминация супернатанта, инокулирование чувствительной культуры клеток.

Известный способ быстр и чувствителен при работе с материалом, отобранным на стадии разгара эпизоотии, однако вероятность выделения им вируса мала при исследовании материала на поздних стадиях эпизоотии, материала от рыб-вирусоносителей в межэпизоотический период и при мониторинге популяций рыб на наличие вирусов-возбудителей заболеваний вследствие того, что уровень содержания в нем вирусов значительно ниже порога чувствительности метода, равного 10²-10³ ТЦД₅₀/г ткани.

Целью изобретения является разработка высокочувствительного способа выделения ихтиовирусов из клинического материала от рыб для проведения диагностических и мониторинговых исследований.

Сущность изобретения заключается в предварительной отмывке эксплантатов покровных тканей рыб в среде с повышенным содержанием антибиотиков, переносе их во флаконы с питательной средой (среда Игла MEM или среда 199 с 2% сыворотки крови плода коровы и 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина) и инкубации в течение 3-5 суток при оптимальной для репродукции вируса температуре (15°-21°С) при постоянном качании (50 качаний в минуту на шейкере), приводящей к увеличению содержания вируса в ткани в 100 и более раз, что выявляется при последующем выделении его известным способом с одновременным титрованием материала в культуре клеток. Способ пригоден для выявления вирусов, обладающих покровно-тканевым тропизмом.

Способ реализуют следующим образом.

Пробы покровных тканей (при выделении герпесвируса сибирского осетра рекомендуется отбирать плавники и кожу, при выделении рабдовируса весенней виремии карпа - кожу) измельчают на кусочки размером 3-5 мм и десятикратно отмывают во флаконе с питательной средой (среда 199 или Игла MEM), содержащей 500 ЕД/мл пенициллина, 500 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл нистатина при комнатной температуре, но не выше 20-22°С. Соотношение ткани и среды при каждой отмывке должно быть 1:20.

Продолжительность каждой отмывки, за исключением последней, - 5 мин при регулярном энергичном встряхивании. Продолжительность последней отмывки - 60 мин.

После отмывки кусочки ткани переносят в новые стерильные флаконы и добавляют среду 199 (при выделении герпесвируса сибирского осетра) или Игла MEM (при выделении рабдовируса весенней виремии карпа) с 2% сыворотки крови плода коровы и антибиотиками (200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина). Соотношение ткани и среды 1:100.

Флаконы помещают на шейкер (50 качаний в минуту) и инкубируют при температуре 15°С в течение 5 суток - для герпесвируса сибирского осетра или при 19-21°С в течение 3 суток - для вируса весенней виремии карпа.

По окончании инкубации ведут выделение вируса известным способом [Wolf, 1970; Метод. указания…, 1997]. При выделении герпесвируса сибирского осетра 10%-ную суспензию инкубируемого тканевого материала готовят в свежей питательной среде 199 с 2% сыворотки крови плода коровы и антибиотиками (200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина). Для выделения вируса используют клеточные линии осетрового происхождения (наиболее чувствительной является линия SSO-2 - пула печени, почки и селезенки сибирского осетра, Acipenser baeri). Инкубацию инокулированных культур ведут при 15°С.

Для выделения рабдовируса весенней виремии карпа можно отбирать только жидкость, в которой проводилась инкубация материала, и не использовать сам тканевой материал или готовить 10%-ную суспензию инкубируемого материала непосредственно в среде инкубации. Дальнейшую обработку и исследование материала проводят согласно вышеупомянутым «Метод. указаниям…» и «Инструкции о мероприятиях по профилактике и борьбе с весенней виремией карпа (ВВК)», утвержденной Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 26.11.97 г., №13-4-2/1091 (В кн.: Сб. инструкций по борьбе с болезнями рыб. - М.: Отдел маркетинга АМБ-агро. - 1998. - 4.1. - С.76-86).

Пример 1. Выделение герпесвируса сибирского осетра

В качестве клинического материала использовали:

1) объединенные в 4 пробы грудные плавники, ротовой аппарат, жаберные крышки и анус от 17 сеголетков гибрида русского и ленского осетров, отобранные из рыбоводного хозяйства на стадии завершения эпизоотии и повышения температуры воды до 20-23°С;

2) плавники и кожу от экспериментально зараженных герпесвирусом двухгодовиков сибирского осетра на разных стадиях течения заболевания.

Получены следующие результаты.

1) От рыб из хозяйства не удалось выделить герпесвирус известным способом после проведения 3 слепых пассажей материалов в чувствительных линиях клеток сибирского осетра SSO-2 (пул печени, почек и селезенки) и SSF-2 (плавники), а также белого осетра WSSK-1 (кожа). Предлагаемым способом тканевых эксплантатов вирус был выделен из 2 проб этих же материалов в клетках линии SSO-2 и WSSK-1 (табл.1).

2) Во всех вариантах эксперимента выделение герпесвируса предлагаемым способом тканевых эксплантатов оказалось более эффективным. Содержание вируса в исследуемом материале после его предварительной инкубации повышалось более чем в 100 раз. Из кожи рыбы №3 известным способом вирус не был выделен даже после проведения 3 слепых пассажей, но был выделен после инкубации тканевых эксплантатов в титре 10^4.1ТЦД₅₀/г ткани (табл.2).

Таблица 1 Сравнение двух способов выделения герпесвируса сибирского осетра от выздоравливающих рыб рыбоводного хозяйства на стадии завершения эпизоотии № пробы Известный способ Предлагаемый способ тканевых эксплантатов SSO-2 WSSK-1 1 н.о. +* н.о. 2 н.о. +* +** 3 н.о. н.о. н.о. 4 н.о. н.о. н.о. Примечание: н.о. - вирус не обнаружен после 3 «слепых» пассажей;
+*-вирус выделен во втором пассаже;
+** - вирус выделен в третьем пассаже.

Пример 2. Выделение рабдовируса весенней виремии карпа

В качестве клинического материала использовали:

1) кожу от 60 двухгодовиков карпа без признаков заболевания из рыбоводного хозяйства, неблагополучного по весенней виремии; в одну пробу объединяли материал от 5 рыб;

2) отдельно кожу, плавники, жабры и пул внутренних органов (печень, почка, селезенка) от экспериментально зараженных годовиков карпа на разных стадиях течения эпизоотии; в одну пробу объединяли материал от 5 рыб.

Получены следующие результаты.

1) Из 12 проб от рыб из неблагополучного хозяйства, обработанных известным способом, при инокуляции культуры клеток карпа ЕРС вирус был обнаружен в одной пробе (№10), а предлагаемым способом тканевых эксплантатов в 2-х пробах (№9 и 10). При этом содержание вируса в этих пробах повысилось более чем в 10³ раз по сравнению с таковым при известном способе выделения (табл.3).

Таблица 3 Сравнение двух способов выделения рабдовируса весенней виремии карпа из проб кожи от клинически здоровых рыб-вирусоносителей из неблагополучного рыбоводного хозяйства № пробы Содержание вируса в пробе при разных способах выделения, lgТЦД₅₀/г ткани Известный способ Предлагаемый способ тканевых эксплантатов 1 н.о. н.о. 2 н.о. н.о. 3 н.о. н.о. 4 н.о. н.о. 5 н.о. н.о. 6 н.о. н.о. 7 н.о. н.о. 8 н.о. н.о. 9 н.о. 6,10 10 3,27 6,35 11 н.о. н.о. 12 н.о. н.о. Примечание: н.о. - вирус не обнаружен после 3-х «слепых» пассажей материала в клетках ЕРС.

2) В эксперименте по выделению вируса весенней виремии от карпов на разных стадиях эпизоотии получены следующие результаты. На стадии разгара эпизоотии известный метод не уступал методу тканевых эксплантатов в частоте выделения вируса из всех видов материала кроме кожи. При этом содержание вируса во внутренних органах этих же рыб, определенное известным способом, было даже выше, чем в эксплантатах кожи.

В то же время на стадии угасания эпизоотии, постэпизоотической и межэпизоотической стадиях частота выделения вируса из кожи при использовании предлагаемого способа тканевых эксплантатов возрастала, также как и содержание в ней вируса (в 100 и более раз). Известным способом вирус обнаружили только в одной пробе кожи из 11 исследованных, а предлагаемым способом тканевых эксплантатов в 9 пробах и в большем количестве. К тому же содержание вируса в среде, в которой проводилась инкубация, нередко было выше, чем в самой ткани (табл.4). Инкубация проб плавников и жабр увеличивала эффективность выделения вируса не столь значительно, а инкубация проб внутренних органов не влияла на результаты выделения.

Таким образом, использование предлагаемого метода тканевых эксплантатов позволяет значительно увеличить содержание вируса в инкубируемой ткани и повысить частоту выделения его от рыб на поздних стадиях эпизоотии и в межэпизоотический период.

Изобретение относится к области вирусологии. Сущность способа заключается в том, что кусочки покровных тканей, используемые для выделения вируса, после предварительной отмывки в среде с повышенным содержанием антибиотиков помещают во флаконы с питательной средой - среда Игла MEM или среда 199 с 2% сыворотки крови плода коровы и 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина. Инкубируют в течение 3-5 суток при оптимальной для репродукции вируса температуре и постоянном качании на шейкере (50 качаний в мин). После этого проводят выделение вируса из ткани. Использование способа позволяет повысить эффективность выделения вируса, позволяет выделять вирус при исследовании клинического материала от переболевших рыб на поздних стадиях эпизоотии, материала от рыб-вирусоносителей в межэпизоотический период и при мониторинге популяций осетровых и карповых рыб на наличие возбудителей герпесвирусной болезни и весенней виремии, когда мала вероятность выделения вируса известным способом. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ выделения ихтиовирусов из клинического материала от рыб для диагностических и мониторинговых исследований, включающий гомогенизацию тканевого материала, приготовление 10%-ной суспензии гомогената в питательной среде, центрифугирование, деконтаминацию супернатанта, инокулирование чувствительной культуры клеток, отличающийся тем, что тканевой материал перед гомогенизацией подвергают 10-кратной отмывке в среде 199 или Игла MEM с 500 ЕД/мл пенициллина, 500 мкг/мл стрептомицина и 500 мкг/мл нистатина, а затем инкубируют в течение 3-5 суток в свежей порции этих же сред с 2% сыворотки крови плода коровы и 200 ЕД/мл пенициллина, 200 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг/мл нистатина при постоянном качании на шейкере с частотой 50 качаний/мин, температуре 15-21°С и соотношении тканевого материала и среды 1:100.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для выделения вирусов в качестве тканевого материала используют кусочки кожи и плавников рыб.