ПОСТОЯННАЯ ЛИНИЯ КЛЕТОК SSO-3 ПУЛА ПАРЕНХИМАТОЗНЫХ ОРГАНОВ СИБИРСКОГО ОСЕТРА ACIPENSER BAERI Российский патент 2009 года по МПК C12N5/06 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток рыб. пригодных для выделения и изучения вирусов рыб разных таксономических групп, разводимых в условиях аквакультуры.

Вирусные болезни - один из главных факторов, тормозящих развитие мировой аквакультуры. На сегодня известны около 400 вирусов рыб, и число их продолжает расти. Десять вирусов выявлено у осетровых рыб за рубежом. Поэтому в настоящее время весьма актуальна задача получения постоянных (перевиваемых) линий клеток, чувствительных к широкому кругу вирусов культивируемых рыб. Сибирский осетр (Acipenser baeri) является одним из наиболее популярных объектов разведения в аквакультуре, однако проведение вирусологических исследований при его заболевании затрудняется острым недостатком клеточных линий, полученных от осетров этого вида.

Известна только одна клеточная линия сибирского осетра, полученная из клеток спинного плавника [1]. Однако чувствительность ее к вирусам рыб не была определена, что не позволяет использовать ее в работах по выделению и изучению вирусов, вызывающих опасные заболевания рыб.

Целью изобретения является получение постоянной линии клеток сибирского осетра, пригодной для проведения вирусологических исследований осетра данного вида и чувствительной к вирусам других видов рыб.

Поставленная цель достигается получением постоянной клеточной линии SSO-3 пула паренхиматозных органов сеголетков сибирского осетра, Acipenser baeri, используемая в вирусологических исследованиях и чувствительная к 7 вирусам разных видов рыб.

Постоянная клеточная линия SSO-3 получена путем многократного пассирования первично-трипсинизированной культуры клеток из пула паренхиматозных органов (почка, печень, селезенка) двух сеголетков сибирского осетра Acipenser baeri.

Постоянная клеточная линия SSO-3 характеризуется следующими признаками.

Культуральные свойства. Жизненный цикл клеточной линии SSO-3, при котором сохраняются ее основные биологические показатели, составляет 251 пассаж. При посевной концентрации 60×10³ клеток/см² монослой формируется через сутки культивирования при 19-21°С и сохраняется без смены среды в течение 14-20 дней, если через 2-3 суток после его образования инкубацию продолжить при 15°С. Коэффициент пересева 1:4.

Клеточную линию SSO-3 культивируют в монослойных культурах в среде Игла MEM с двойным набором аминокислот и витаминов (2МЕМ) с 5% сыворотки эмбрионов коров. Для диспергирования клеточного монослоя при пересевах используют смесь 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1:1,5 при комнатной температуре. Урожай клеток с флакона площадью 20 см² составляет около 6 млн клеток.

Для криоконсервирования при температуре -196°С применяют смесь, состоящую 70% питательной среды 2МЕМ, 20% сыворотки эмбрионов коров и 10% диметилсульфоксида, при концентрации клеток 2-3×10⁶ в мл. Жизнеспособность клеток по тесту витального окрашивания трипановым синим после хранения в жидком азоте составляет 70-80%. Клетки восстанавливают исходные ростовые и морфологические свойства в течение 2-х пассажей.

Морфологические признаки. При посеве клетки SSO-3 равномерно распределяются по поверхности субстрата. Клетки однородные эпителиоподобные, полигональной формы с длинными цитоплазматическими отростками. По мере уплотнения монослоя отростки укорачиваются, и форма клеток приближается к кубической. Ядра крупные, овальные. Число ядрышек от 1 до 3, чаще 1-2.

Кариологическая характеристика. (2n=248±5). Интервал варьирования хромосом от 168 до 414. Модальное число 196 хромосомы. Величина модального класса 60%.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.

Контроль клеточной линии SSO-3 на посторонние контаминанты. При исследовании клеточной линии SSO-2 на стерильность (наличие бактерий, грибов, микоплазм) получены отрицательные результаты.

Клеточная линия SSO-3 может быть использована для выделения, накопления, титрования и изучения следующих вирусов рыб: герпесвируса сибирского осетра (SSHV), вирусов весенней виремии карпа (SVCV), вирусной геморрагической септицемии (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), рабдовируса европейского угря (Rhabdovirus anguilla), рабдовируса мальков щуки (PFRV) и рабдовируса европейской озерной кумжи (ELTV).

Постоянная клеточная линия SSO-3 депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №68.

Список литературы

1. Fontana F., Rossi R., Lanfredi M., Arlati G., Bronzi P. Cytogenetic characterization of cell lines from three sturgeon species // Caryologia. - 1997. - V. 50. - N 1. - P.91-95.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток рыб, пригодных для выделения и изучения вирусов рыб разных таксономических групп. Постоянная клеточная линия SSO-3 пула паренхиматозных органов сеголетков сибирского осетра, Acipenser baeri, депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №68. Линия может быть использована как тест-культура для выделения, накопления, титрования и изучения герпесвируса сибирского осетра (SSHV), вирусов весенней виремии карпа (SVCV), вирусной геморрагической септицемии (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани (IHNV), рабдовируса европейского угря (Rhabdovirus anguilla), рабдовируса мальков щуки (PFRV) и рабдовируса европейской озерной кумжи (ELTV).

Постоянная клеточная линия SSO-3 пула паренхиматозных органов сеголетков сибирского осетра, Acipenser baeri, используемая в вирусологических исследованиях и чувствительная к 7 вирусам разных видов рыб, депонирована в Специализированной коллекции перевиваемых соматических культур клеток сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН)под № 68.