ПОСТОЯННАЯ ЛИНИЯ КЛЕТОК ИЗ ПЛАВНИКОВ СИБИРСКОГО ОСЕТРА (Acipenser baeri), ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ РЫБ Российский патент 2013 года по МПК C12N5/71 C12N7/00 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии, в частности к получению перевиваемых линий клеток, используемых при вирусологических и биотехнологических исследованиях.

Россия располагает крупнейшим в мире водным фондом внутренних водоемов и прибрежных акваторий морей, использование которого носит комплексный многоотраслевой характер. На протяжении длительного периода времени рыбохозяйственной эксплуатации внутренних водоемов не придавалось большого значения, так как производство рыбной продукции осуществлялось за счет промыслового изъятия природных популяций рыб и других гидробионтов в Мировом океане. В последние десятилетия мировой вылов стабилизировался на уровне 90-93 млн. тонн, а прирост рыбопродукции идет исключительно за счет бурно развивающейся аквакультуры. Ускоренное развитие аквакультуры и активизация международной торговли живыми объектами разведения несут угрозу распространения заразных болезней рыб, поэтому для ихтиовирусологии исследования по получению перевиваемых клеточных линий рыб, являющихся ключевым инструментом при разработке методов диагностики и профилактики вирусных заболеваний, по-прежнему высокоактуальны.

В настоящее время существует более 10 линий клеток, полученных из разных органов и тканей рыб семейства Acipenseridae (осетровые), однако известна только одна линия сибирского осетра, полученная из клеток спинного плавника [1] (прототип).

Чувствительность к вирусам которой определена не была, таким образом невозможно использовать ее в работах по выделению и изучению вирусов-возбудителей опасных заболеваний рыб.

В задачу наших исследований входило - получить перевиваемую линию клеток из плавников сибирского осетра, обладающую высокой чувствительностью к ихтиовирусам различных таксономических групп.

Предложенная линия клеток получена из первично-трипсинизированной ткани плавников сибирского осетра путем длительного пассирования на среде 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки.

Линия клеток из плавников сибирского осетра (Acipenser baeri) названа авторами SSF (VIEV) - 1 и депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) под номером 76 в 2010 году.

Предложенная линия обладает следующими свойствами:

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ - постоянная линия плавников сибирского осетра представляет собой монослой из удлиненных фибробластоподобных клеток, лежащих пучками веерообразной формы под разными углами друг к другу, с крупными овальными ядрами, содержащими 2-3 ядрышка, в цитоплазме большинства клеток видны вакуоли разного размера. Клетки делятся обычным двуполюсным митозом. Кариотип соответствует виду сибирского осетра, модальный класс содержит 250 хромосом (2n=250±5) и составляет 70%, интервал изменчивости 190-290.

Видовая идентичность подтверждена кариологическими методами.

КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА - клетки выращивают при температуре - 21-22°С в пристеночных условиях в сосудах различной емкости; ростовой средой является среда 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки без антибиотиков, рН среды 7,4-7,6. Дезагрегацию монослоя при субкультивировании осуществляют смесью трипсина 0,25% и версена 0,02% (1:3), кратность рассева - 1:10. Посевная концентрация 250-300×10² клеток/мл. После формирования монослоя, клетки переносят на хранение при 15°С, рутинная частота пересева 1 раз 2-3 недели. При 22°С монослой формируется через сутки. При температуре 15°С может сохраняться до 2 месяцев без пересева.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ - линия клеток чувствительна к вирусам-возбудителям вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), иридовирусу карпов (CCIV), герпесвирусу осетровых (SbSHV).

КРИОКОНСЕРВАЦИЯ - криоконсервацию осуществляют по 2-ступечатому методу. Температуру снижают по 1-2°С до -30°С, далее по 3-5°С до -70°С. По достижении -70°С ампулы с клетками помещают в жидкий азот. Криозащитную среду готовят следующим образом: среда культивирования - 50%, сыворотка эмбриональная телячья - 40%, ДМСО - 10%, концентрация - 3-4 млн кл/мл.

КОНТРОЛЬ НА ПОСТОРОННИЕ КОНТАМИНАНТЫ - при исследовании клеточной линии SSF (VIEV) - 1 на наличие бактерий, грибов, микоплазм и латентных вирусов получены отрицательные результаты.

ПРИМЕР: Культуру клеток SSF (VIEV) - 1 культивируют на среде 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки без антибиотиков. При пересеве клетки снимают со стекла (пластика) 0,25% раствором трипсина и 0,02% раствором версена (1:3) при температуре 22°С. Монослой формируется на 1-2 сутки культивирования. После образования монослоя культуру заражают вирусом и инкубируют при температуре оптимальной для исследуемого вируса.

Экспериментальные данные по чувствительности клеточной линии SSF (VIEV) - 1 к патогенным вирусам рыб приведены в таблице 1.

Таблица 1   Культуры клеток   SSF (VIEV) - 1 Референтная для данного вируса Вирус Проявление ЦПД вируса, суток. Титр вируса ТЦД_50/мл Проявление ЦПД вируса, час. Проявление ЦПД вируса, час. геморрагической септицемии лососевых (VHSV) 3 10^9,0 2 ЕРС/10^7,5 инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV) 3 10^8,75 3 ЕРС/10^7,5 весенней виремии карпов (SVCV) 5 10^8,0 5 ЕРС/10^8,0 иридовирус карпов (CCIV) 2 10^7,2 2 FHM/10^6,0 герпес-осетровых (SbSHV) 3 10^8,0 5 WSSK-1/10^6,0

Титры исследованных вирусов в культуре клеток SSF (VIEV) - 1 через 5 дней инкубации на порядок выше, чем в референтной для каждого вируса культуре.

Отличительной особенностью предложенной культуры клеток является высокий коэффициент пересева - 1:10, что позволяет накапливать большое количество биоматериала за короткий срок.

При получении больших масс вирусов, выделенных от рыб неосетровых пород - лососевых, карповых (VHSV, IHNV, SVCV, CCIV), использование культуры клеток SSF (VIEV) - 1 более предпочтительно, так как титры не только не уступают, а даже превосходят таковые в референтной культуре, но при этом сама клеточная система является гетерогенной, что исключает возможность неспецифических реакций за счет отсутствия антител к клеточным белкам.

Предложенная клеточная линия апробирована с положительным результатом в лаборатории ихтиопатологии ВИЭВ с января 2010 по январь 2012 года для накопления, титрования и изучения вируса-возбудителя вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), иридовируса карпов (CCIV), герпес вируса осетровых (SbSHV) и для диагностической работы по выявлению этих вирусов при мониторинговых исследованиях.

Постоянная линия клеток SSF (VIEV) - 1 найдет широкое применение в лабораторных исследованиях по вирусологии и в биотехнологии при производстве вирус-вакцин и диагностикумов.

ИСТОЧНИК ИНФОРМАЦИИ

1. Fontana F. et al. Cytogenetic characterization of cell lines from three sturgeon species, Cariologia. - 1997 - V50 - N1 - p.91-95.

Изобретение относится к области ветеринарной биотехнологии и касается линии клеток из плавников сибирского осетра (Acipenser baeri). Представленная линия клеток получена из первично-трипсинизированной ткани плавников сибирского осетра путем длительного пассирования на среде 199 с солями Хенкса с 10% эмбриональной сыворотки и депонирована в СХЖ РАСХН под №76. Линия клеток имеет высокий коэффициент пересева - 1:10, что позволяет накапливать большое количество биоматериала за короткий срок, и является перспективной гетерогенной системой для культивирования вирусов от рыб неосетровых пород, предупреждающей развитие неспецифических реакций за счет отсутствия антител к клеточным белкам. Линия может быть использована в лабораторных исследованиях при производстве вирус-вакцин и диагностикумов для выделения, накопления, титрования и изучения вируса-возбудителя вирусной геморрагической септицемии лососевых (VHSV), инфекционного некроза гемопоэтической ткани лососевых (IHNV), весенней виремии карпов (SVCV), иридовируса карпов (CCIV) и герпес-вируса осетровых (SbSHV). 1 табл.

Постоянная линия клеток из плавников сибирского осетра (Acipenser baeri), используемая для вирусологических исследований рыб, депонирована в Специализированной Коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных Российской коллекции культур клеток при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии (СХЖ РАСХН) под №76.