ЗАМЕЩЕННЫЕ АМИДЫ ТИЕНОПИРРОЛКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, АМИДЫ ПИРРОЛОТИАЗОЛКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ И РОДСТВЕННЫЕ АНАЛОГИ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ КАЗЕИНКИНАЗЫ Iε Российский патент 2010 года по МПК C07D495/04 C07D513/04 A61K31/425 A61P25/24 

Предпосылки к созданию изобретения

1. Область изобретения

Настоящее изобретение относится к ряду замещенных амидов 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амидов 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты, амидов 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амидов 4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и родственных аналогов. Более конкретно настоящее изобретение относится к 3-арилтиозамещенным и 3-гетероциклотиозамещенным амидам 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амидам 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты, амидам 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амидам 4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и родственным аналогам, а также к способам получения соединений изобретения. Соединения настоящего изобретения являются ингибиторами фосфорилирования человеческой казеинкиназой Iε человеческого белка clock Period (hPER), а потому являются полезными в качестве фармацевтических средств, особенно для лечения и/или профилактики заболеваний или нарушений, связанных с центральной нервной системой.

2. Описание уровня техники

Ритмические колебания в поведении проявляются у многих организмов, от одноклеточных до человека. Если при постоянных условиях ритм сохраняется и имеет период около одного дня при малой зависимости от температуры, то такой ритм называется «циркадным» (Konopka, R.J. and Benzer, S. (1971) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68, 2112-2116).

Циркадные ритмы генерируются эндогенными биологическими ритмоводителями (циркадными часами) и существуют в различных организмах, включая человека, грибы, насекомых и бактерии (Dunlap, J.C. (1999) Cell 96, 271-290; Hastings, J.W. et al. Circadian Rhythms, The Physiology of Biological Timing. In: Prosser, C.L. ed. Neural and Integrative Animal Physiology, New York: Wiley-Liss (1991) 435-546; Allada, R. et al. (1998) Cell 93, 791-804; Kondo et al. (1994) Science 266, 1233-1236; Crosthwaite, S.K. et al. (1997) Science 276, 763-769; Shearman, L.P. et al. (1997) Neuron, 19, 1261-1269). Циркадные ритмы являются самоподдерживающимися и постоянными даже в условиях полной темноты, но могут быть синхронизованы (включены) с новым режимом день/ночь посредством таких внешних сигналов, как световые и температурные циклы (Pittendrigh, C.S. (1993) Annu. Rev. Physiol., 55, 16-54; Takahashi, J.S. (1995) Annu. Rev. Neurosci. 18, 531-553; Albrecht, U. et al. (1997) Cell, 91, 1055-1064). Циркадные часы имеют важное значение для поддержания биологических циклов и регулируют разнообразные формы циркадного поведения, например дневные колебания поведения, прием пищи и цикл сна/пробуждения, а также физиологические изменения, например секрецию гормонов и колебания температуры тела (Hastings, M. (1997) Trends Neurosci. 20, 459-464; Reppert, S.M. and Weaver, D.R. (1997) Cell 89, 487-490).

Генетические и молекулярные исследования плодовой мушки Drosophila melanogaster прояснили роль некоторых генов, участвующих в циркадной ритмичности. Подобные исследования привели к выявлению пути, который жестко авторегулируется и включает транскрипционную/трансляционную обратную связь (Dunlap, J.C. (1999) Cell, 96, 271-290; Dunlap, J.C. (1996) Annu. Rev. Genet. 30, 579-601; Hall, J.C. (1996) Neuron, 17, 799-802). Основными элементами циркадного осциллятора в Drosophila являются два стимулирующих белка dCLOCK/dBMAL (CYCLE) и два ингибирующих белка dPERIOD (dPER) и dTIMELESS (dTIM). dCLOCK и dBMAL гетеродимеризуются и образуют транскрипционный фактор dCLOCK/dBMAL, который промотирует экспрессию двух генов, называемых Drosophila Period (dper) и Drosophila Timeless (dtim). В конечном счете происходит считывание мРНК этих генов, чтобы обеспечить синтез белков dPER и dTIM соответственно. В течение нескольких часов происходит синтез и фосфорилирование белковых производных dPER и dTIM в цитоплазме, затем их уровень достигает критического, они образуют гетеродимеры и транслоцируются в ядро. Попав в ядро, dPER и dTIM функционируют как отрицательные регуляторы собственной транскрипции, накопление dPER и dTIM тормозится и вновь начинается активация dper и dtim за счет присутствия dCLOCK/dBMAL (Zylka, M.J. et al. (1998) Neuron 20, 1103-1110; Lowrey, P.L. et al. (2000) 288, 483-491). Было показано, что ген dper является необходимым элементом контроля циркадных ритмов вылупления взрослой особи (появление взрослой мухи из куколки), поведения и локомоторной деятельности (Konopka, R.J., & Benzer, S. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68, 2112-2116). Миссенс-мутации гена per могут либо укоротить (per ^S), либо удлинить (per ^L) период циркадного ритма, тогда как нонсенс-мутации (per ^o) порождают аритмичность в их поведении (Hall, J.C. (1995) Trends Neurosci. 18, 230-240).

У млекопитающих супрахиазматическое ядро (СХЯ) переднего гипоталамуса является местом нахождения главных биологических часов (см. обзор Panda et al., (2002) Nature 417, 329-335; Reppert, S.M. and Weaver, D.R. (1997) Cell, 89, 487-490). Часы СХЯ включены в 24-часовой дневной цикл за счет ежедневного цикла день-ночь, причем свет действует через прямые или непрямые пути сетчатка-СХЯ (Klein, D.C. et al. (1991) Suprachiasmatic Nuclei: The Mind's Clock, Oxford Univeristy Press, New York). В СХЯ грызунов выявлены и клонированы три гена Per, которые обозначаются как мышиные гены Per1 (mPer1), mPer2 и mPer3. Белки, соответствующие таким генам млекопитающих (mPER1, mPER2, mPER3), имеют несколько общих областей гомологии друг с другом, и каждый ген млекопитающих Per кодирует белок с доменом димеризации белка, который обозначается как PAS (PAS является инициальной аббревиатурой для первых трех белков PER, ARNT и SIM, которые, как было установлено, обладают таким функционально важным доменом димеризации), который высоко гомологичен домену PAS PER насекомых. Уровни матричных РНК Per (мРНК) и белка колеблются в течение циркадных суток и непосредственно участвуют в положительном и отрицательном регулировании биологических часов, но только mPER1 и mPER2 осциллируют в результате воздействия света (Zylka, M.J. et al. (1998) Neuron 20, 1103-1110; Albrecht, U. et al., (1997) Cell 91, 1055-1064; Shearman, L.P. et al. (1997) Neuron 19, 1261-1269). Гомолог гена Drosophila tim у млекопитающих был клонирован и обозначен как mTim. Тем не менее, не наблюдалось никаких доказательств взаимодействия mPER-mTIM, аналогичных регистрируемым у Drosophila, и было высказано предположение о том, что взаимодействия PER-PER могут быть заменены функциональными группами димеров PER-TIM при молекулярном действии циркадных часов млекопитающих (Zylka, M.J. et al., (1998) Neuron 21, 1115-1122). Другая возможность заключается в том, что ритмы в PER1 и PER2 образуют отрицательные обратные связи, которые регулируют транскрипционную активность белка Clock (через их домены PAS), что, в свою очередь, приводит в действие экспрессию любого или обоих генов Per (Shearman, L.P. et al. (1997) Neuron 19, 1261-1269).

Осмысление роли трех генов mPer в действии часового механизма млекопитающих были предметом множества исследований. Структурная гомология белков mPER по отношению к dPER позволила надеяться на то, что белки mPER будут функционировать в качестве отрицательных элементов в цепи обратной связи млекопитающих. Предполагается, что PER1 участвует в отрицательном регулировании собственной транскрипции в цепи обратной связи, но недавно полученные данные указывают на то, что он участвует во входном канале (Hastings, M.H. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 26, 15211-15216). PER2 является наиболее подробно описанным белком, а мутантный белок мыши mPER2 (mPer2 ^Brdm1), потерявший 87 остатков в карбоксильной части домена димеризации PAS, обладает укороченным циркадным циклом в нормальных условиях день-ночь, но проявляет аритмичность в полной темноте. Мутация также уменьшает осциллирующую экспрессию обоих mPer1 и mPer2 в СХЯ, показывая, что mPer2 может регулировать mPer1 «in vivo» (Zheng, B. et al. (1999) Nature 400, 169-173). Было показано, что PER2 обладает двойной функцией в регулировании «колесиков» в центральных часах (Shearman, L.P. et al. (2000) Science 288, 1013-1018). Данное исследование позволило продемонстрировать, что PER2 связывается с криптохромными (CRY) белками и транслоцируется в ядро, в котором отрицательно регулируемая транскрипция CRY приводится в действие положительными транскрипционными комплексами CLOCK и BMAL1. После проникновения в ядро PER2 инициирует положительный рычаг часов за счет положительного регулирования транскрипции BMAL1 по еще неизвестному механизму. Функция PER3 изучена недостаточно, однако, в mPer3 нокаутных мышей наблюдается слабое воздействие на циркадную активность и поэтому предполагалось, что PER3 участвует в циркадно регулируемых выходных каналах (Shearman, L.P. et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 17, 6269-6275). Как сообщалось, белки mPER взаимодействуют друг с другом, и mPER3 может служить носителем mPER1 и mPER2 для доставки их в ядро, что имеет важнейшее значение для генерации циркадных сигналов в СХЯ (Kume, K. et al. (1999) Cell 98, 193-205; Takano, A. et al. (2000), FEBS Letters, 477, 106-112).

Постулировалось, что фосфорилирование компонентов циркадных часов регулирует продолжительность цикла. Первым генетическим свидетельством того, что специфическая протеинкиназа регулирует циркадный ритм Drosophila, было открытие нового гена doubletime (dbt), кодирующего протеин серин-треонин киназу (Price J.L. et al. (1998) Cell 94, 83-95; Kloss B. et al. (1998) Cell 94, 97-107). Миссенс-мутации в dbt приводят к измененному циркадному ритму. Нулевые аллели dbt вызывают гипофосфорилирование dPER и аритмию.

К киназам млекопитающих, наиболее близкородственным DBT, относятся казеинкиназа Iε (CKIε) и казеинкиназа Iδ (CKIδ). Показано, что обе киназы связываются с mPER1; в нескольких исследованиях было продемонстрировано, что CKIε фосфорилирует и мышиный, и человеческий PER1 (Price J.L. et al. (1998) Cell 94, 83-95; Kloss B. et al. (1998) Cell 94, 97-107). В исследовании клеток эмбриона почки человека 293T при совместном трансфицировании с hCKIε дикого типа hPER1 продемонстрировал значительное повышение фосфорилирования (продемонстрированное на примере сдвига молекулярной массы). В указанном исследовании фосфорилированный hPER1 имеет период полураспада, равный примерно двенадцати часам, тогда как нефосфорилированный hPER1 остается стабильным в клетке более 24 часов, указывая на то, что фосфорилирование hPER1 приводит к падению стабильности белка (Kessler, G.A. et al. (2000) NeuroReport, 11, 951-955). Другое исследование также позволило продемонстрировать, что последовательность фосфорилирования PER1 посредством hCKIε включает цитоплазматическую фиксацию и нестабильность белка (Vielhaber, E. et al. (2000) Mol. Cell. Biol. 13, 4888-4899; Takano, A. et al. (2000) FEBS Letters 477, 106-112).

Не было никаких биохимических причин выбирать между CKIε или CKIδ как потенциальным регулятором у млекопитающих до тех пор, пока в работе Lowery et al. [(2000) Science 288, 483-491] не было обнаружено, что у сирийского золотистого хомячка полудоминантные мутации в CKIε (мутация tau, Ralph, M.R. and Menaker, M. (1988) Science 241, 1225-1227) вызывали сокращение циркадных суток как у гетерозиготных (22 ч), так и у гомозиготных (20 ч) животных. В этом случае пониженные уровни активности CKIε приводили к меньшему фосфорилированию PER при предположительно более высоких уровнях цитоплазмического белка PER, что вызывало повышенное проникновение в ядро и изменение циркадных циклов. Позднее было предложено, что CKIδ может также участвовать в регулировании циркадной ритмичности за счет посттрансляционной модификации clock белков млекопитающих hPER1 и hPER2 [Camacho, F. et al., (2001) FEBS Letters 489(2,3), 159-165]. Соответственно ингибиторы, включая ингибиторы из числа малых молекул, CKIε и/или CKIδ человека или млекопитающих предоставляют новые возможности фазового сдвига или сброса циркадных часов. Как показано ниже, изменение циркадного ритма может оказаться полезным для лечения расстройств сна или настроения.

В патенте США 6555328 B1 раскрываются методы скрининга в клетках для выявления соединений, которые изменяют циркадные ритмы, основанные на тестовом соединении, меняющем способность человеческой казеинкиназы 1ε и/или человеческой казеинкиназы 1δ фосфорилировать человеческие clock белки hPER1, hPER2 и hPER3. Например, клетки HEK293T трансфицируются совместно с hCKIε и Per1 или Per2. В целях оценки значимости ингибирования CKIε и ингибиторов CKIε для циркадной биологии была создана высокопродуктивная клеточная культура (33^rd Annual Meeting, Soc. for Neurosci., November 8-12, 2003, Abstract numbers 284.1, 284.2, and 284.3), в которой циркадные ритмы могут отслеживаться стандартным образом. Культура включает фибробласты Rat-1, стабильно экспрессирующие конструкцию Mper1-luc, тем самым позволяя определить ритмическую активацию промотера Mper1 в живых клетках посредством периодической оценки активности люциферазы с помощью мониторинга интенсивности света в течение нескольких дней. Формат периодического контроля культуры обеспечивает точную и воспроизводимую оценку концентрационно-зависимых эффектов воздействия ингибиторов CKIε на циркадный ритм и дает возможность, установить связь ингибирования CKIε с изменениями циркадного периода.

Нарушения сна подразделяют на четыре основные категории, которые включают первичные нарушения сна (диссомнии и парасомнии), расстройства сна, связанные с медицинскими/психическими нарушениями, и категорию предполагаемых расстройств сна для таких нарушений сна, которые невозможно классифицировать из-за недостатка данных. Считается, что первичные нарушения сна возникают из-за отклонений непосредственно в системах, ответственных за инициацию сна-пробуждения (гомеостатическая система) или регистрацию времени (циркадная система). Диссомнии относятся к нарушениям формирования или поддержания сна и включают первичную бессонницу, гиперсомнию (чрезмерную сонливость), нарколепсию, нарушения сна, связанные с дыханием, нарушения сна, связанные с циркадным ритмом, и диссомнии, не вошедшие в указанные категории. Первичная бессонница характеризуется сохраняющимися (>1 месяца) проблемами инициации и поддержания сна или невосстановительного сна. Проблемы сна, связанные с первичной бессонницей, приводят к значительным нарушениям или расстройствам, включая раздражительность в дневное время, потерю внимания и концентрации, усталость и недомогание и ухудшение настроения и мотивации. Нарушения сна, связанные с циркадным ритмом, включают синдром десинхроноза при перелетах, синдром нарушения сна при посменной работе, синдром преждевременной фазы сна и синдром задержки фазы сна (J. Wagner, M.L. Wagner and W.A. Hening, Annals of Pharmacotherapy (1998) 32, 680-691). Лица с режимом вынужденного сна демонстрируют более высокий уровень бодрствования в процентах от времени сна в определенные периоды циркадных суток (Dijk and Lockley, J. Appl. Physiol. (2002) 92, 852-862). Принято считать, что с возрастом происходит смещение циркадного ритма сна, которое часто приводит к менее качественному сну (Am J Physiol Endocrinol Metab. (2002) 282, E297-E303). Таким образом, сон, возникающий вне циркадной фазы, может быть ущербным с точки зрения качества и количества, что подкрепляется дополнительными примерами изменений сна при посменной работе и десинхронозе при перелетах. Изменение циркадных часов человека может вызывать нарушения сна, и агенты, которые модулируют циркадную ритмичность, например ингибитор CKIε и/или CKIδ, могут оказаться эффективными для лечения нарушений сна, в особенности тех из них, которые связаны с циркадным ритмом.

Нарушения настроения подразделяются на депрессивные расстройства («монополярные депрессии»), биполярные расстройства и два вида расстройств, основанных на этиологии, которые включают нарушения настроения, вызванные общим состоянием здоровья, и нарушение настроения, возникающие под воздействием наркотиков. Депрессивные расстройства дополнительно подразделяются на большие депрессивные расстройства, дистимические расстройства и депрессивные расстройства, не отнесенные к другим категориям. Биполярные расстройства дополнительно подразделяются на биполярные расстройства I и II типа. Отмечалось, что термин «сезонный характер» может применяться в отношении больших депрессивных расстройств, которые носят периодический характер, а также в отношении проявления приступов больших депрессивных расстройств в биполярных расстройствах I и II типа. Заметная анергия, гиперсомния, переедание, набор веса и потребность в углеводах часто характеризуют большие депрессивные проявления, которые носят сезонный характер. Неясно, являются ли подобные сезонные проявления нарушения настроения более характерными для больших депрессивных расстройств, носящих периодический характер, либо для биполярных расстройств. Тем не менее, в рамках биполярных расстройств сезонный характер представляется более вероятным при биполярных расстройствах II типа, чем при биполярных расстройствах I типа. У некоторых лиц вспышки маний или гипоманий могут быть также связаны с определенным временем года. Сезонность зимнего типа, как правило, различается в зависимости от географической широты, возраста и пола. Распространенность заболевания увеличивается в более высоких широтах, подверженность риску зимних вспышек депрессии уменьшается с возрастом, а женщины составляют от 60% до 90% от общего количества сезонно зависимых людей. Сезонные аффективные расстройства (SAD) - термин, широко используемый в литературе - являются подтипом расстройств настроения, которые в Руководстве по диагностике и статистике психических расстройств (DSM-IV) (American Psychiatric Association: "Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders", Fourth Edition, Text Revision. Washington, DC, American Psychiatric Association, 2000) обозначаются термином «сезонного характера» при описании сезонного характера приступов больших депрессивных расстройств при биполярных расстройствах I типа, биполярных расстройствах II типа или периодических больших депрессивных расстройствах (E. M. Tam et al., Can. J. Psychiatry (1995) 40, 457-466). Характеристики и диагнозы депрессивных нарушений, больших депрессивных расстройств, приступов больших депрессивных расстройств, биполярных расстройств I типа, биполярных расстройств II типа и сезонных эффектов описаны в DSM-IV.

Пациенты, страдающие большими депрессивными расстройствами, в том числе SAD, которые характеризуются периодическими приступами депрессии, обычно зимой, продемонстрировали позитивную ответную реакцию на световую терапию (Kripke, Journal of Affective Disorders (1998) 49(2), 109-117). Успех применения терапии, основанной на использовании яркого света, для пациентов, страдающих SAD и большой депрессией, позволили выдвинуть несколько гипотез для объяснения фундаментального механизма действия терапевтического эффекта света. К таким гипотезам относится «гипотеза циркадного ритма», согласно которой антидепрессивный эффект яркого света может быть связан с фазовым сдвигом циркадного водителя ритма по отношению ко сну (E. M. Tam et al., Can. J. Psychiatry (1995) 40, 457-466). Подтверждением связи между световой терапией и циркадным ритмом стал тот факт, что клинически эффективная световая терапия при больших депрессивных расстройствах вызывает сопутствующий сдвиг в циркадной фазе, следовательно, клиническая эффективность световой терапии должна зависеть от способности световой терапии обеспечивать световой сдвиг (Czeisler et al., The Journal of Physiology (2000) 526 (Part 3), 683-694; Terman et al., Arch. Gen. Psychiatry (2001) 58, 69-75). Кроме того, было показано, что световая терапия ускоряет и усиливает эффективность фармакологического лечения больших депрессивных расстройств (Benedetti et al., J. Clin. Psychiatry (2003) 64, 648-653). В связи с этим можно предположить, что ингибирование казеинкиназы Iε и/или казеинкиназы Iδ вызовет сдвиг циркадной фазы, и такое ингибирование представляет собой потенциально клинически эффективную моно- или комбинированную терапию для нарушений настроения.

Следует отметить, что нарушение сна является критическим симптомом для многих психиатрических расстройств (W.V.McCall, J. Clin. Psychiatry (2001) 62 (suppl 10), 27-32). Нарушения сна представляют собой общую особенность депрессивных нарушений, в частности бессонница является нарушением сна, которое часто наблюдается при депрессии, присутствуя у более чем 90% пациентов, страдающих депрессией (M.E. Thase, J. Clin. Psychiatry (1999) 60 (suppl 17), 28-31). Накопленные данные подтверждают общий патогенез для первичной бессонницы и больших депрессивных расстройств. Высказывалась гипотеза о том, что гиперактивность рилизинг-фактора кортикотропина (CRF) (в связи с генетической предрасположенностью или, возможно, из-за раннего стресса) и стресс вызывают процесс, приводящий к повышенным и протяженным нарушениям сна и в конечном счете к первичной бессоннице. Циркадная ритмичность при секреции CRF в отсутствии стресса может играть роль обычной экспрессии сон-пробуждение (G.S. Richardson and T. Roth, J. Clin Psychiatry (2001) 62 (suppl 10), 39-45). Следовательно, вещества, которые модулируют циркадную ритмичность, например, посредством ингибирования казеинкиназы Iε и/или казеинкиназы Iδ, могут оказаться эффективными при лечении депрессивных нарушений, связанных с эффектами секреции CRF.

Все ссылки, упомянутые выше в настоящем документе, посредством ссылки на них полностью включаются в настоящий документ.

Таким образом, целью настоящего изобретения является получение ряда замещенных амидов 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амидов 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты, амидов 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амидов 4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и родственных аналогов, которые являются ингибиторами казеинкиназы Iε. Данная цель и другие цели настоящего изобретения раскрываются в приведенном ниже подробном описании изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает замещенные амиды 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амиды 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты, амиды 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты, амиды 4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и родственные аналоги формулы (I) и формулы (II), а также стереизомеры, энантиомеры, рацематы и таутомеры упомянутых соединений и их фармацевтически приемлемые соли в качестве ингибиторов казеинкиназы Iε, а также способы применение соединений формулы (I) и формулы (II) в качестве фармацевтических средств для лечения заболеваний и расстройств центральной нервной системы, таких как нарушения настроения, в том числе большие депрессивные расстройства, биполярные расстройства I типа, биполярные расстройства II типа и нарушения сна, включая нарушения сна, связанные с циркадным ритмом, например, расстройство сна при посменной работе, синдром десинхроноза при перелетах, синдром преждевременной фазы сна и синдром задержки фазы сна. В настоящем изобретении также приводятся способы получения соединений формулы (I) и формулы (II) настоящего изобретения.

Соответственно, общее воплощение настоящего изобретения сосредоточено на соединении формулы (I) или формулы (II):

где X - S или S(O)_n;

R₁ - H или C₁-C₆ алкил;

R₂ - NR₅R₆;

R₃ - арил или гетероцикл;

R₄ - H, C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, арил-(C₁-C₆ алкил), гетероцикл-(C₁-C₆ алкил), C₁-C₆ алкокси, арил-(C₁-C₆ алкокси), гетероцикл-(C₁-C₆ алкокси), CF₃, галоген, SH, C_1-6 алкилтио, арил-(C₁-C₆ алкилтио), гетероцикл-(C₁-C₆ алкилтио), NO₂, NH₂, NR₅R₆, арил-(C₁-C₆ алкиламино), гетероцикл-(C₁-C₆ алкиламино) или XR₃, где X и R₃ соответствуют вышеприведенному определению;

R₅ - H или C₁-C₆ алкил;

R₆ - H или C₁-C₆ алкил;

L - N или CR₇, где R₇ - H или C₁-C₆ алкил;

M - S, O или NR₈, где R₈ - H, C₁-C₆ алкил, арил-(C₁-C₆ алкил), гетероцикл-(C₁-C₆ алкил) или ацил;

n равно 1 или 2; или

его стереоизомере, энантиомере, рацемате или таутомере; или

их фармацевтически приемлемой соли.

Другое осуществление настоящего изобретения относится к способу ингибирования активности казеинкиназы Iε у пациента, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или формулы (II).

Еще одно осуществление настоящего изобретения относится к способу лечения пациента, страдающего заболеванием или нарушением, которое улучшается при ингибировании активности казеинкиназы Iε, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы I или формулы II.

Дальнейшее осуществление настоящего изобретения относится к способу получения соединения формулы (I) или формулы (II).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Используемый в настоящем документе термин «стереоизомер» является общим названием, применяемым для всех изомеров индивидуальных молекул, которые отличаются только пространственной ориентацией своих атомов. Термин «стереоизомер» включает зеркальные изомеры (энантиомеры), смеси зеркальных изомеров (рацематы, рацемические смеси), геометрические (цис/транс или E/Z) изомеры и изомеры соединений с несколькими хиральными центрами, не являющиеся зеркальными отображениями друг друга (диастереоизомеры). Соединения настоящего изобретения могут иметь асимметрические центры и существовать в виде рацематов, рацемических смесей, индивидуальных диастереоизомеров или энантиомеров, или же могут существовать в форме геометрических изомеров, причем все изомерные формы упомянутых соединений включены в настоящее изобретение.

Используемые в настоящем документе обозначения «R» и «S» применяются как повсеместно используемые в органической химии обозначения для указания специфической конфигурации хирального центра. Обозначение «R» (rectus, правый) относится к конфигурации хирального центра с расположением старших по рангу групп по часовой стрелке (от группы с наибольшим рангом к группе со вторым наименьшим), если смотреть вдоль связи в направлении группы, наименьшей по старшинству. Обозначение «S» (sinister, левый) относится к конфигурации хирального центра с расположением старших по рангу групп против часовой стрелки (от группы с наибольшим рангом к группе со вторым наименьшим), если смотреть вдоль связи в направлении группы, наименьшей по старшинству. Старшинство групп определяется правилами последовательности, причем приоритет, в первую очередь, основан на атомном номере (в порядке убывания атомных номеров). Перечень и обсуждение старшинства групп приводится в книге Stereochemistry of Organic Compounds, Ernest L. Eliel, Samuel H. Wilen and Lewis N. Mander, editors, Wiley-Interscience, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994.

Кроме системы (R)-(S), в настоящем документе может также применяться более ранняя система D-L для обозначения абсолютной конфигурации, особенно в отношении аминокислот. В данной системе формула проекции Фишера ориентируется таким образом, чтобы первый атом углерода основной цепи находился в верхней части. Префикс «D» используется для описания абсолютной конфигурации изомера, в которой функциональная (определяющая) группа находится справа от углерода хирального центра, а «L» - для изомера, в котором она расположена слева.

Используемые в настоящем документе термины «таутомер» или «таутомерия» описывают одновременное существование двух (или более) соединений, которые отличаются друг от друга только положением одного (или нескольких) подвижных атомов, а также распределением электронов, например кето-енольные таутомеры или таутомерия.

Применяемый в настоящем документе термин «алкил» относится к насыщенной алифатической углеводородной группе с линейной или разветвленной цепью, имеющей от одного до шести атомов углерода, и включает метил, этил, пропил, изопропил, бутил, втор-бутил, трет-бутил и подобные им группы. С термином «алкил» связаны также термины «алкилен» или «алкиленил», определение которых приводится ниже.

Использованные ниже в настоящем документе термины «алкилен» или «алкиленил» относятся к линейной или разветвленной двухвалентной насыщенной алифатической цепи, имеющей от одного до шести углеродов, и включают метиленил, этиленил, пропиленил, изопропиленил, бутиленил, изобутиленил, трет-бутиленил, пентиленил, изопентиленил, гексиленил и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «алкенил» относится к линейной или разветвленной, моновалентной ненасыщенной алифатической цепи, которую образуют от двух до шести атомов углерода, и включает этенил (также известный как винил), 1-метилэтенил, 1-метил-1-пропенил, 1-бутенил, 1-гексенил, 2-метил-2-пропенил, 2,4-гексадиенил, 1-пропенил, 2-пропенил, 2-бутенил, 2-пентенил и подобные им группы.

Упомянутый в настоящем документе термин «алкинил» относится к линейному или разветвленному моновалентному ненасыщенному углеводороду, содержащему от двух до шести атомов углерода, связанных по крайней мере одной тройной связью, и включает этинил, 1-пропинил, 1-бутинил, 1-гексинил, 2-пропинил, 2-бутинил, 2-пентинил и подобные им группы.

Использованный в настоящем документе термин «алкокси» или «алкилокси» относится к моновалентному заместителю, который включает линейную или разветвленную алкильную цепь, содержащую от одного до шести атомов углерода, связанную через атом кислорода простого эфира, и имеет свободную валентную связь от эфирного кислорода. Данное понятие объединяет метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, втор-бутокси, трет-бутокси и подобные им группы.

Применяемый в настоящем документе термин «алкилтио» относится к моновалентному заместителю, который включает линейную или разветвленную алкильную цепь, содержащую от одного до шести атомов углерода, связанную через атом серы, и имеет свободную валентную связь от серы. Сюда относятся метилтио, этилтио, пропилтио, изопропилтио, бутилтио, втор-бутилтио, трет-бутилтио и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «алкенилокси» относится к линейной или разветвленной, моновалентной ненасыщенной алифатической цепи, которую образуют от двух до шести атомов углерода, связанной через атом кислорода простого эфира, и имеет свободную валентную связь от эфирного кислорода. Данное понятие включает этенилокси (также известный как винилокси), 1-метилэтенилокси, 1-метил-1-пропенилокси, 1-бутенилокси, 1-гексенилокси, 2-метил-2-пропенилокси, 2,4-гексадиенилокси, 1-пропенилокси, 2-пропенилокси, 2-бутенилокси, 2-пентенилокси и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «алкинилокси» относится к линейной или разветвленной, моновалентной, ненасыщенной алифатической цепи, включающей от двух до шести атомов углерода с по крайней мере одной тройной связью, связанной через атом кислорода простого эфира и имеющей свободную валентную связь от эфирного кислорода, и включает этинилокси, 1-пропинилокси, 1-бутинилокси, 1-гексинилокси, 2-пропинилокси, 2-бутинилокси, 2-пентинилокси и подобные им группы.

Применяемый в настоящем документе термин C₃-C₈ циклоалкил относится к насыщенной углеводородной циклической структуре, содержащей от трех до восьми атомов углерода, и включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил и им подобные.

Используемый в настоящем документе термин «арил» или «Ar» означает любое стабильное моноциклическое, бициклическое или трициклическое углеродное кольцо (до семи членов в каждом кольце), причем по крайней мере одно кольцо является ароматическим и незамещенным или содержащим от одного до трех заместителей, выбранных из группы, включающей метилендиокси, гидрокси, C₁-C₆ алкокси, галоген, C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, трифторметокси, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ алкил), -N(C₁-C₆ алкил)₂, -NH-ацил и -N(C₁-C₆ алкил)ацил. Примеры «арил» или «Ar» включают фенил, 2-хлорфенил, 3-хлорфенил, 4-хлорфенил, 2-фторфенил, 3-фторфенил, 4-фторфенил, 2-бромфенил, 3-бромфенил, 4-бромфенил, 2-трифторметилфенил, 3-трифторметилфенил, 4-трифторметилфенил, 2-метоксифенил, 3-метоксифенил, 4-метоксифенил, 2-аминофенил, 3-аминофенил, 4-аминофенил, 2-метилфенил, 3-метилфенил, 4-метилфенил, 2-нитрофенил, 3-нитрофенил, 4-нитрофенил, 2,4-дихлорфенил, 2,3-дихлорфенил, 3,5-диметилфенил, 2-трифторметоксифенил, 3-трифторметоксифенил, 4-трифторметоксифенил, нафтил, тетрагидронафтил и бифенил.

Используемый в настоящем документе термин «арил-(C₁-C₆ алкил)» относится к арильной группе, соответствующей приведенному выше определению, связанной посредством линейной или разветвленной алкиленовой цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода и имеющей свободную валентную связь у одного из углеродов алкиленовой цепи. Примеры «арил-(C₁-C₆ алкила)» включают фенилметил (бензил), фенилэтил, п-метоксибензил, п-фторбензил, п-хлорбензил и подобные им группы.

Применяемый в настоящем документе термин «арил-(C₁-C₆ алкокси)» относится к арильной группе, соответствующей приведенному выше определению, связанной посредстовом линейной или разветвленной алкиленовой цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода, связанной через атом кислорода простого эфира и имеющей свободную валентную связь у атома кислорода простого эфира. Примеры арил-(C₁-C₆ алкокси) включают фенилметокси (бензилокси), фенилэтокси и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «арил-(C₁-C₆ алкиламино)» относится к арильной группе, соответствующей приведенному выше определению, связанной линейной или разветвленной алкиленовой цепью, содержащей от одного до шести атомов углерода, связанной через атом азота и имеющей свободную валентную связь у атома азота, при этом упомянутый атом азота может быть замещен водородом или C₁-C₆ алкилом. Примеры арил-(C₁-C₆ алкиламино) включают фенилметиламино (бензиламино), фенилэтиламино, N-метил-N-бензиламино и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «арил-(C₁-C₆ алкилтио)» относится к арильной группе, соответствующей приведенному выше определению, связанной линейной или разветвленной алкиленовой цепью, содержащей от одного до шести атомов углерода, связанной через атом серы и имеющей свободную валентную связь у атома серы. Примеры арил-(C₁-C₆ алкилтио) включают фенилметилтио (бензилтио), фенилэтилтио и подобные им группы.

Применяемый в настоящем документе термин «ацил» относится к H-(C=O)-, C₁-C₆ алкил-(C=O)-, арил-(C=O)-, арил(C₁-C₆ алкил)-(C=O)-, гетероцикл-(C=O)- или гетероцикл(C₁-C₆ алкил)-(C=O)- группе, где алкил, арил и гетероцикл соответствуют определению, приведенному в настоящем документе, и имеют свободную валентную связь при карбонильной группе (C=O). В определение ацила включаются ацетил, пропионил, бутирил, изобутирил, трифторацетил, трихлорацетил, бензоил и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «гетероцикл» или «гетероциклил» применяется для описания стабильного 5-7-членного моноциклического или стабильного 8-11-членного бициклического гетероциклического кольца, которое является насыщенным или ненасыщенным и состоит из атомов углерода и одного-трех гетероатомов, выбираемых из группы, включающей N, O и S, и в котором гетероатомы азота и серы могут быть окислены, а гетероатом азота может быть кватернизирован, также включает любую бициклическую группу, в которой любое из определенных выше гетероциклических колец конденсировано с бензольным кольцом. Гетероциклическое кольцо может быть присоединено через любой гетероатом или атом углерода, что приводит к образованию стабильной структуры. Гетероциклическое кольцо может быть незамещенным или замещенным одним, двумя или тремя заместителями, выбранными из группы, включающей C₁-C₆ алкокси, гидрокси, галоген, C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, трифторметил, трифторметокси, -NO₂, -NH₂, -NH(C₁-C₆ алкил), -N(C₁-C₆ алкил)₂, -NH-ацил и -N(C₁-C₆ алкил)ацил. Примеры таких гетероциклических групп включают пиперидинил, пиперазинил, 2-оксопиперазинил, 2-оксопиперидинил, 2-оксопирролидинил, 2-оксоазепинил, азепинил, пирролил, пирролидинил, пиразолил, пиразолидинил, имидазолил, имидазолинил, имидазолидинил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил, оксазолил, оксазолидинил, изоксазолил, изоксалидинил, морфолинил, тиазолил, тиазолидинил, изотиазолил, хинуклидинил, изотиазолидинил, индолил, хинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, тиадиазолил, бензопиранил, бензотиазолил, бензооксазолил, фурил, тетрагидрофурил, бензофуранил, тетрагидропиранил, тиенил, бензотиенил, тиаморфолинил и оксадиазолил.

Используемый в настоящем документе термин «гетероцикл-(C₁-C₆ алкил)» или «гетероциклил-(C₁-C₆ алкил)» относится к гетероциклу или гетероциклическому кольцу, соответствующему приведенному выше определению, связанному посредством линейной или разветвленной алкиленовой цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода, с другим атомом углерода или гетероатомом, выбираемым из группы, включающей O, N и S. В понятие гетероцикл(C₁-C₆ алкил) или гетероциклил(C₁-C₆ алкил) включаются 4-пиридинилметил, 3-пиридинилметил, 2-пиридинилметил, 2-фуранилметил, 2-тенил (2-тиофенметил), 5-нитро-2-тенил, 5-(2-хлорфенил)-2-фуранметил, 1-(фенилсульфонил)-1H-пиррол-2-метил и подобные им группы.

Применяемый в настоящем документе термин «гетероцикл-(C₁-C₆ алкокси)» или «гетероциклил-(C₁-C₆ алкокси)» относится к гетероциклу или гетероциклическому кольцу, соответствующему приведенному выше определению, связанному посредством линейной или разветвленной алкиленовой цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода, связанной через эфирный атом кислорода и имеющей свободную валентную связь у эфирного атома кислорода. В понятие гетероцикл(C₁-C₆ алкокси) или гетероциклил(C₁-C₆ алкокси) включаются 2-тиенилметокси, 3-тиенилметокси, 2-фуранилметокси, 3-фуранметокси, 4-пиридинилметокси, 3-пиридинилметокси, 2-пиридинилметокси и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «гетероцикл-(C₁-C₆ алкиламино)» или «гетероциклил-(C₁-C₆ алкиламино)» относится к гетероциклу или гетероциклическому кольцу, соответствующему приведенному выше определению, связанному посредством линейной или разветвленной алкиленовой цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода, связанной через атом азота и имеющей свободную валентную связь у атома азота, при этом упомянутый атом азота может быть замещен водородом или C₁-C₆ алкилом. В понятие гетероцикл(C₁-C₆ алкиламино) или гетероциклил(C₁-C₆ алкиламин) включаются 2-тиенилметиламино, 3-тиенилметиламино, 2-фуранилметиламино, 3-фуранметиламино, 4-пиридинилметиламино, 3-пиридинилметиламино, 2-пиридинилметиламино и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «гетероцикл-(C₁-C₆ алкилтио)» или «гетероциклил-(C₁-C₆ алкилтио)» относится к гетероциклу или гетероциклическому кольцу, соответствующему приведенному выше определению, посредством связанному линейной или разветвленной алкиленовой цепи, содержащей от одного до шести атомов углерода, связанной через атом серы и имеющей свободную валентную связь у атома серы. В понятие гетероцикл(C₁-C₆ алкилтио) или гетероциклил(C₁-C₆ алкилтио) включаются 2-тиенилметилтио, 3-тиенилметилтио, 2-фуранилметилтио, 3-фуранметилтио, 4-пиридинилметилтио, 3-пиридинилметилтио, 2-пиридинилметилтио и подобные им группы.

Используемый в настоящем документе термин «галоген», «гал» или «гало» относится к представителям группы фтора, хлора, брома или йода.

Если любая из переменных (например, арил, гетероцикл, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈, X) встречается более одного раза в любом из составляющих, или в соединении формулы (I), или формулы (II) настоящего изобретения, ее определение в каждом случае не зависит от определений в каждом ином случае, если не указано особо. Кроме того, сочетание заместителей и/или переменных допускается, только если такие сочетания приводят к стабильным соединениям.

Используемый в настоящем документе термин «лечить», «проводить лечение» или «лечение» означает:

(i) профилактику заболевания, расстройства или состояния у пациента, который может быть предрасположен к заболеванию, расстройству и/или состоянию, однако, его наличие еще не было диагностировано;

(ii) подавление заболевания, расстройства или состояния, то есть замедление его развития; или

(iii) устранение заболевания, расстройства или состояния, то есть регрессия заболевания, расстройства и/или состояния.

Используемый в настоящем документе термин «пациент» относится к теплокровному животному, например млекопитающему, которое страдает конкретным заболеванием, расстройством или состоянием. Изначально предполагается, что морские свинки, собаки, кошки, крысы, мыши, лошади, крупный рогатый скот, овцы и люди являются примерами животных, объединенных данным термином.

Применяемый в настоящем документе термин «заболевание» относится к болезни, недомоганию или прекращению, прерыванию или нарушению функций организма, систем или органов.

Используемый в настоящем документе термин «расстройство» обозначает нарушение функции, структуры или и того, и другого, возникающее в результате генетического или эмбриологического нарушения развития или в связи с экзогенными факторами, например ядом, травмой или заболеванием.

Употребляемый в настоящем документе термин «состояние» обозначает общее состояние, здоровье или физическую форму.

Используемый в настоящем документе термин «профилактика» означает предупреждение заболевания.

Применяемый в настоящем документе термин «нарушение сна», «нарушения сна» или «расстройство сна» означает бессонницу.

Используемый в настоящем документе термин «бессонница» означает невозможность сна в отсутствие внешних препятствий, например шума, яркого света и т.п., в тот период суток, когда обычно наступает сон, и подобная невозможность может различаться по степени: от возбужденного состояния или тревожной дремоты до ограничения нормальной продолжительности сна или абсолютного бодрствования. Термин «бессонница» включает первичную бессонницу, бессонницу, связанную с психическим расстройством, бессонницу, вызванную приемом препаратов, и бессонницу циркадного ритма, связанную с изменением нормального режима сон-пробуждение (изменение рабочей смены, расстройство сна при посменной работе, десинхроноз при перелетах или синдром десинхроноза при перелетах и т.д.).

Используемый в настоящем документе термин «первичная бессонница» означает затруднения при засыпании, поддержании сна или при восстановительном сне, которые не вызваны психическим расстройством или не связаны с физиологическими последствиями приема определенных препаратов или отказа от них (бессонница, вызванная приемом препаратов).

Применяемый в настоящем документе термин «расстройство сна, связанное с циркадным ритмом» включает десинхроноз при перелетах или синдром десинхроноза при перелетах, нарушение сна при посменной работе, синдром преждевременной фазы сна и синдром задержки фазы сна.

Используемый в настоящем документе термин «эффективное ингибирующее количество соединения» или «эффективное количество соединения, ингибирующее казеинкиназу Iε» означает достаточное количество соединения, которое становится биодоступным посредством соответствующего способа введения для лечения пациента, страдающего заболеванием, расстройством или состоянием, поддающимся такому лечению.

Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» означает количество соединения, которое эффективно для лечения данного заболевания, расстройства или состояния.

Используемое в настоящем документе выражение «удлинение периода циркадного ритма» относится к увеличению интервала между основополагающими событиями в процессе, который происходит регулярно с периодичностью примерно один раз каждые 24 часа.

Применяемое в настоящем документе выражение «сокращение периода циркадного ритма» относится к уменьшению интервала между основополагающими событиями в процессе, который происходит регулярно с периодичностью примерно один раз каждые 24 часа.

Используемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемая соль» применим к любой соли, как ранее известной, так и к той, которая будет обнаружена в будущем, которая используется специалистом в данной области и является нетоксичной органической или неорганической аддитивной солью, которая пригодна для применения в качестве фармацевтического средства. К примерам оснований, образующих пригодные соли, относятся гидроксиды щелочных или щелочноземельных металлов, например гидроксиды натрия, калия, кальция или магния; аммиак и алифатические, циклические или ароматические амины, например метиламин, диметиламин, триэтиламин, диэтиламин, изопропилдиэтиламин, пиридин и пиколин. Примерами кислот, которые образуют пригодные соли, служат неорганические кислоты, например хлористоводородная, бромистоводородная, серная, фосфорная и другие подобные кислоты, а также органические карбоновые кислоты, например уксусная, пропионовая, гликолевая, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, гидроксималеиновая и дигидроксималеиновая, бензойная, фенилуксусная, 4-аминобензойная, 4-гидроксибензойная, антраниловая, коричная, салициловая, 4-аминосалициловая, 2-феноксибензойная, 2-ацетоксибензойная, миндальная и им подобные кислоты, а также органические сульфоновые кислоты, например метилсульфоновая, фенилсульфоновая и п-толуилсульфоновая кислоты.

Используемый в настоящем документе термин «фармацевтический носитель» или «фармацевтически приемлемый носитель» относится к известным фармацевтическим эксципиентам, эффективным при приготовлении фармацевтически активных составов для введения, которые в значительной степени нетоксичны и не обладают сенсибилизирующим воздействием в условиях применения. Точная пропорция таких эксципиентов определяется растворимостью и химическими свойствами активного соединения, избранного пути введения, а также стандартной фармацевтической практикой. При практическом применении способов настоящего изобретения активный ингредиент предпочтительно включается в композицию, содержащую фармацевтический носитель, хотя соединения сами по себе являются эффективными и могут вводиться отдельно. При этом пропорция активного ингредиента может меняться от примерно 1 вес.% до практически 90 вес.%.

Другие сокращения, которые могут встретиться в тексте настоящей заявки, имеют следующие значения:

Me (метил), Et (этил), Ph (фенил), Et₃N (триэтиламин), p-TsOH (пара-толуилсульфоновая кислота), TsCl (пара-толуилсульфонилхлорид), hept (гептан), DMF (диметилформамид), NMP (1-метил-2-пирролидон или N-метил-2-пирролидон), IPA (изопропанол или изопропиловый спирт), DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен), DBN (1,5-диазабицикло[4.3.0]нон-5-ен), rt или r.t. (комнатная температура или температура окружающей среды), мин или мин (минуты), ч (час или часы), УФ- (ультрафиолет), ЖХМС (жидкостная хроматомасс-спектрометрия), t-Boc или Boc (трет-бутоксикарбонил), Bn (бензил), t-Bu (третичный бутил), i-Pr (изопропил), TFA (трифторуксусная кислота), HOAc (уксусная кислота), EtOAc (этилацетат), Et₂O (диэтиловый эфир), EtOH (этанол), DIEA (диизопропилэтиламин), EDC (1-(3-диэтиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид); HOBT (1-гидроксибензотриазол), г (грамм), мг (миллиграмм), мкг (микрограмм), нг (нанограмм), мл (миллилитр), мкл (микролитр), л (литр), ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), ТСХ, тсх или Тсх (тонкослойная хроматография), г/л (граммов на литр), SiO₂ (силикагель), л/мин (литров в минуту), мл/мин (миллилитров в минуту), ммоль (миллимоль), M (молярный), мМ (миллимолярный), мкМ (микромолярный), нМ (наномолярный), мкКи (микроКюри), CPM (счет в минуту), об/мин (оборотов в минуту), мм (миллиметр), мкм (микрометр), мк (микрон), нм (нанометр), м.д. (миллионные доли), ф/кв. дюйм (футов на кв. дюйм), экв. или эквив. (эквивалент), R_T (время удерживания), °C (градусы Цельсия) и K (Кельвина).

Соответственно, общее воплощение настоящего изобретения направлено на соединение формулы (I) или формулы (II):

где X - S или S(O)_n; R₁ - H или C₁-C₆ алкил; R₂ - NR₅R₆; R₃ - арил или гетероцикл; R₄ - H, C₁-C₆ алкил, C₂-C₆ алкенил, C₂-C₆ алкинил, арил-(C₁-C₆ алкил), гетероцикл-(C₁-C₆ алкил), C₁-C₆ алкокси, арил-(C₁-C₆ алкокси), гетероцикл-(C₁-C₆ алкокси), CF₃, галоген, SH, C_1-6 алкилтио, арил-(C₁-C₆ алкилтио), гетероцикл-(C₁-C₆ алкилтио), NO₂, NH₂, NR₅R₆, арил-(C₁-C₆ алкиламино), гетероцикл-(C₁-C₆ алкиламино) или XR₃, где X и R₃ определены выше; R₅ - H или C₁-C₆ алкил; R₆ - H или C₁-C₆ алкил; L - N или CR₇, где R₇ - H или C₁-C₆ алкил; M - S, O или NR₈, где R₈ - H, C₁-C₆ алкил, арил-(C₁-C₆ алкил), гетероцикл-(C₁-C₆ алкил) или ацил; n равно 1 или 2.

Другое осуществление настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I) или формулы (II), где M и X, каждый, - S.

Еще одно осуществление рассматриваемого изобретения относится к соединениям формулы (I), где L - CR₇, а M и X, каждый, - S.

Дальнейшее осуществление настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), в которых M и X, каждый, - S, L - CR₇, а R₇ - H. Следующие соединения являются показательными примерами, входящими в объем настоящего осуществления:

амид 6-фенилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(4-хлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2-аминофенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(пиридин-2-илсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-п-толилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(тиофен-2-илсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3,5-дихлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(пиридин-4-илсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-м-толилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-о-толилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2,3-дихлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2,5-дихлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2-этилфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-бромфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3,5-диметилфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2-метоксифенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2-трифторметилфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(2-фторфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты и

амид 6-(3-трифторметоксифенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты.

Дополнительное осуществление настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), в которых L - N, а M и X, каждый, - S. Следующие соединения являются показательными примерами, входящими в объем настоящего осуществления:

амид 6-фенилсульфанил-4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4H-пирроло[2,3-b]тиазол-5-карбоновой кислоты и

амид 6-(пиридин-2-илсульфанил)-4H-пирроло[2,3-b]тиазол-5-карбоновой кислоты.

Другое осуществление настоящего изобретения относится к соединениям формулы (II), где L - CR₇, а M и X, каждый, - S.

Еще одно осуществление настоящего изобретения относится к соединениям формулы (II), в которых M и X, каждый, - S, L - CR₇, а R₇ - H. Следующие соединения являются показательными примерами, входящими в объем настоящего осуществления:

амид 4-(пиридин-2-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(фенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(пиридин-4-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(3,5-дихлорфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(тиофен-2-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(3-бромфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(3-метоксифенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(2-метоксифенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,

амид 4-(3-хлорфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты и

амид 4-(3-метилфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты.

Еще одно осуществление настоящего изобретения относится к соединениям формулы (II), в которых L - N, а M и X, каждый, - S. Следующие соединения являются показательными примерами, входящими в объем настоящего осуществления:

амид 2-метил-6-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-хлорфенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-трифторметоксифенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 2,6-бис-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 2,6-бис-(3-метоксифенилсульфанил)-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,

амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты.

Другое осуществление настоящего изобретения касается способа ингибирования активности казеинкиназы Iε у пациента, включающего введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или формулы (II), что приводит к удлинению периода циркадного ритма.

Другое осуществление настоящего изобретения относится к способу лечения страдающего заболеванием или нарушением пациента, которое улучшается при ингибировании активности казеинкиназы Iε, включающему введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или формулы (II), причем указанное ингбирование активности казеинкиназы Iε приводит к удлинению периода циркадного ритма.

Соединения настоящего изобретения могут быть получены с помощью способов, аналогичных тем, что известны специалистам в данной области. Реакционные схемы 1, 2 и 3, а также соответствующий текст описания содержат изложения получения различных соединений настоящего изобретения. Раскрываемые способы и примеры приводятся для целей пояснения и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Альтернативные реагенты, условия реакции и другие сочетания и вариации стадий, описанных в настоящем документе для получения индивидуальных соединений, являются очевидными для специалистов в данной области. В таблицах 1, 2, 3 и 4 приводится сводная информация примеров соединений; биологические данные для примеров соединений содержатся в таблице 5.

ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ

Схема 1

Схема 1 описывает синтез 4H-тиено[3,2-b]пирролов (M представляет S), 4H-фуро[3,2-b]пирролов (M представляет O) и 1,4-дигидропирроло[3,2-b]пирролов (M представляет NR₈) формулы (I), где L - CR₇, а также синтез 6H-тиено[2,3-b]пирролов (M представляет S), 6H-фуро[2,3-b]пирролов (M представляет O) и 1,6-дигидропирроло[2,3-b]пирролов (M представляет NR₈) формулы (II), где L - CR₇ из известных или коммерчески доступных эфиров или карбоновых кислот 1 и 3, соответственно, где R - алкил или H.

На схеме 1, на стадии а, сложные исходные эфиры 1 или 3, где R - алкил, превращают в амиды 2 или 4 соответственно с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области. Таким образом, обработка смеси примерно 7М аммиака и сложного эфира 1 или 3 в соответствующем полярном растворителе, например, в метаноле или этаноле, с небольшой добавкой гидроксида лития и нагревание полученной смеси в сосуде под давлением примерно при 100°C около 16 часов после хроматографической очистки, которая хорошо известна специалистам в рассматриваемой области, позволяет получить первичный амид 2 или 4 соответственно. В альтернативном варианте можно использовать другие условия проведения реакции, хорошо известные специалистам в указанной области, например обработка раствора сложного эфира 1 или 3 в подходящем полярном растворителе, например в метаноле или этаноле, раствором аммиака примерно от 5М до 7М в течение периода от одного до трех дней при комнатной температуре или при нагревании раствора до примерно 55°C в течение примерно 10 часов после выделения с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области, приводит к образованию первичного амида 2 или 4 соответственно. В альтернативном варианте сложный эфир 1 или 3 можно суспендировать в смеси концентрированного раствора гидроокиси аммония и хлорида лития при комнатной температуре в течение примерно от трех до пяти дней, до тех пор, пока тонкослойный хроматографический анализ или другой пригодный хроматографический анализ, известный специалистам в заданной области, не покажет, что реакция практически завершена. Первичные амиды 2 или 4 выделяют из реакционной смеси с помощью методов, хорошо известных специалистам в рассматриваемой области. Если вместо аммиака или гидроокиси аммония используются первичные или вторичные C₁-C₆ алкиламины, получают соответствующие вторичные и третичные амиды 2 или 4, где R₂ - NR₅R₆, R₅ - H или C₁-C₆ алкил, и R₆ - C₁-C₆ алкил.

Как показано на схеме 1, стадия b, коммерчески доступные или известные карбоновые кислоты 1 или 3 (где R - H) можно превратить в амиды 2 или 4 соответственно с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области. При желании, карбоновые кислоты 1 или 3 (R представляет H) могут быть также получены путем гидролиза соответствующих сложных эфиров 1 или 3 (R представляет алкил) с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области. Так, соответствующее основание, например, гидроксид калия, гидроксид натрия, гидроксид лития и подобные им основания добавляют к смеси эфира 1 или 3 в подходящем растворителе, например смеси тетрагидрофурана и воды. Смесь нагревают при температуре 90-110°C в течение 0,5-2 часов. Продукт выделяют в виде соли посредством фильтрации, и фильтрат концентрируют, чтобы получить дополнительный материал в виде осадка. Остаток на фильтре и осадок объединяют и подкисляют методами, применяемыми специалистами в указанной области, например подкислением подходящей кислотой, например уксусной кислотой в подходящем растворителе, например метаноле, этаноле и подобным им растворителях, для получения карбоновых кислот 1 или 3 соответственно, где R - H. Как показано на схеме 1, стадия b, например, раствор карбоновой кислоты 1 или 3 в подходящем растворителе, таком как диметилформамид, обрабатывают основанием, например диизопропилэтиламином, карбодиимидом, например (1-(3-диметиламинопропил)-3-этил)карбодиимидгидрохлоридом, 1-гидроксибензотриазолом и хлоридом аммония. После завершения реакции, что устанавливается тонкослойной хроматографией или с помощью иных применимых методов хроматографического анализа, знакомых специалистам в данной области, смесь разбавляют подходящим растворителем, а продукт выделяют и хроматографически очищают с помощью методов, хорошо известных специалистам в рассматриваемой области, с тем чтобы получить первичные амиды 2 или 4 соответственно, где R₂ - NH₂. Если вместо хлорида аммония используются первичные или вторичные C₁-C₆ алкиламины, образуются соответствующие вторичные и третичные амиды 2 или 4, где R₂ - NR₅R₆, R₅ - H или C₁-C₆ алкил, и R₆ - C₁-C₆ алкил.

Как показано на схеме 1, стадия c, каждый из промежуточных амидов 2 или 4 тиоарилирован в положении 3 связанного с амидом пиррольного кольца с помощью способов, применяемых специалистами в указанной области. Так, смесь промежуточного амида 2 или 4 в подходящем растворителе, например диметилформамиде или NMP, обрабатывают подходящим основанием, например гидридом натрия или гидридом калия, при комнатной температуре с последующей обработкой подходящим диарилсульфидом или дигетероциклодисульфидом, а затем смесь перемешивают при температуре от комнатной до примерно 100°C в течение 12-20 часов. Ход реакции отслеживают с помощью тонкослойного хроматографического анализа или других хроматографических методов, знакомых специалистам в данной области. После завершения реакции реакционную смесь обрабатывают экстракционными методами, широко применяемыми специалистами в рассматриваемой области. Искомые 4H-тиено[3,2-b]пирролы (M представляет S), 4H-фуро[3,2-b]пирролы (M представляет O) и 1,4-дигидропирроло[3,2-b]пирролы (M представляет NR₈) формулы (I), где L - CR₇, X - S, и R₃ - арил или гетероцикл, и 6H-тиено[2,3-b]пирролы (M представляет S), 6H-фуро[2,3-b]пирролы (M представляет O) и 1,6-дигидропирроло[2,3-b]пирролы (M представляет NR₈) формулы (II), где L - CR₇, X - S, и R₃ - арил или гетероцикл, выделяются и хроматографически очищаются с помощью методов, хорошо известных специалистам в данной области.

В альтернативном варианте смесь диарилсульфида или дигетероциклодисульфида и примерно одного эквивалента карбоната цезия в подходящем растворителе, например диметилформамиде или NMP, обрабатывают промежуточным амидом 2 или 4, а затем смесь нагревают при температуре порядка 80-120°C в течение примерно 1-6 часов. Ход реакции отслеживают с помощью тонкослойного хроматографического анализа или других хроматографических методов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Искомые 4H-тиено[3,2-b]пирролы (M представляет S), 4H-фуро[3,2-b]пирролы (M представляет O) и 1,4-дигидропирроло[3,2-b]пирролы (M представляет NR₈) формулы (I), где L - CR₇, X - S, и R₃ - арил или гетероцикл, и 6H-тиено[2,3-b]пирролы (M представляет S), 6H-фуро[2,3-b]пирролы (M представляет O) и 1,6-дигидропирроло[2,3-b]пирролы (M представляет NR₈) формулы (II), где L - CR₇, X - S, и R₃ - арил или гетероцикл, выделяют и хроматографически очищают с помощью методов, знакомых специалистам в рассматриваемой области.

Как показано на схеме 1, можно провести стадию d, азот пиррольного кольца соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - H, подвергается N-алкилированию обработкой раствора соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - H, в подходящем растворителе, например, 1,3-диметил-3,4,5,6-тетрагидро-2(1H)-пиримидиноне с C₁-C₆-диалкилсульфатом и подходящим основанием, например карбонатом цезия, при комнатной температуре в течение примерно 12-20 часов. Окончание реакции определяют тонкослойным хроматографическим анализом или другими хроматографическими методами, широко применяемыми специалистами в данной области. После завершения реакционную смесь разбавляют водой, а соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - C₁-C₆алкил, выделяют и очищают методами, хорошо известными специалистам в данной области.

В альтернативном варианте азот пиррольного кольца, приведенного на схеме 1 соединения формулы (I) или формулы (II), алкилируют обработкой пиридинового раствора соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - H, C₁-C₆-алкилгалогенидом, в присутствии подходящего основания, например карбоната цезия, с нагреванием в течение примерно 0,25-3 часов. Реакционную смесь охлаждают, разбавляют водой или концентрируют досуха и экстрагируют этилацетатом. Концентрирование и последующая очистка хроматографическими методами, которые хорошо известны специалистам в данной области, позволяют получить приведенные на схеме 1 соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - C₁-C₆-алкил.

Кроме того, N-алкилирование азота пиррольного кольца соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - H, достигают другими способами, известными специалистам в рассматриваемой области, например обработкой соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - H, в подходящем полярном растворителе, таком как диметилформамид или NMP, с подходящим основанием, например гидридом натрия или трет-бутоксидом калия, а затем C₁-C₆ алкилгалогенидом, как, например, добавлением пропилиодида. Окончание реакции определяют тонкослойным хроматографическим анализом или другими хроматографическими методами, широко применяемыми специалистами в данной области. После завершения реакционную смесь разбавляют водой, а приведенные на схеме 1 соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - C₁-C₆алкил, выделяют и очищают методами, знакомыми специалистам в соответствующей области.

Как известно специалистам в данной области, при M - NR₈, и R₈ - H в описанных выше условиях N-алкилирование может также проходить по упомянутому выше атому азота NR₈ с образованием приведенных на схеме 1 соединений формулы (I) или формулы (II), где R₁ и R₈ - одинаковые C₁-C₆ алкильные группы. Установлено, что исходные сложные эфиры 1, где R - этил, R₄ и R₇ - H, M - NR₈, и R₈ - метил, могут быть получены путем термолиза 2-азидоакрилатов (также известных как эфиры 2-азидоакриловой кислоты), что описано ниже на схеме 2 (H. Hemetsberger and D. Knittel, Monatsh. Chem. (1972) 103(1), 194-204). Исходный эфир 1, где M - NR₈, и R₈ - C₁-C₆ алкил, получают в соответствии с описанной методикой, а затем превращают, как показано на схеме 1, в соединение формулы (I), где M - NR₈, R₈ - C₁-C₆ алкил, и R₁ - H или C₁-C₆ алкил, и где упомянутые R₁ и R₈ C₁-C₆ алкильные группы могут быть одинаковыми или разными. Подобная методология также используется для аналогичного получения замещенных сложных эфиров 3, которые трансформируются, как описано на схеме 1, в соединения формулы (II), где R₈ - C₁-C₆ алкил, и R₁ - H или C₁-C₆ алкил, и где упомянутые выше R₁ и R₈ C₁-C₆ алкильные группы могут быть одинаковыми или разными.

Кроме того, соединения формулы (I) или формулы (II) на схеме 1, где R₁ - H или C₁-C₆ алкил, а X - S, можно также окислить до сульфона или сульфоксида, где X - S(O)_n, и n равно 1 или 2 соответственно с помощью способов, хорошо известных специалистам в рассматриваемой области, например, посредством обработки раствора упомянутого соединения формулы (I) или формулы (II) H₂O₂ и Na₂CO₃. В альтернативном варианте соединение 2 или 4 на схеме 1 обрабатывают арилсульфонилхлоридом, арилсульфинилхлоридом, гетероциклосульфонилхлоридом или гетероциклосульфинилхлоридом (используемым вместо диарилсульфида или дигетероциклодисульфида), как описано выше на стадии с, с тем, чтобы получить приведенное на схеме 1 соединение формулы (I) или формулы (II), где X - S(O)_n, n равно 1 или 2, и R₃ - арил или гетероцикл.

Схема 2, которая приводится ниже, описывает синтез 4H-пирроло[2,3-d]тиазолов (M представляет S), 4H-пирроло[2,3-d]оксазолов (M представляет O) и 1,4-дигидропирроло[2,3-d]имидазолов (M представляет NR₈) формулы (I), где L - N, а также синтез 6H-пирроло[3,2-d]тиазолов (M представляет S), 6H-пирроло[3,2-d]оксазолов (M представляет O) и 3,4-дигидропирроло[2,3-d]имидазолов (M представляет NR₈) формулы (II), где L - N, из известных или коммерчески доступных исходных веществ. Специалисту в данной области не составит труда понять, что если L - N, M - NR₈, и R₈ - H, имидазольное кольцо может существовать в таутомерных формах. На схеме 2, стадия a, карбоксальдегид 5 или 7 конденсируют с эфиром 2-азидоацетата 6, где R - алкил, в присутствии подходящего основания, например гидроксида калия, гидроксида натрия или подобных им оснований, с тем, чтобы получить соответствующий эфир 2-азидоакриловой кислоты 8 или 11 соответственно, где R - алкил.

Схема 2

Как показано на схеме 2, стадия b, термолиз сложного эфира 2-азидоакриловой кислоты 8 или 11 осуществляется при нагревании смеси эфира 2-азидоакриловой кислоты 8 или 11 в подходящем растворителе, например ксилоле, при температуре примерно 120-140°C в течение 30-90 минут, чтобы после хроматографической очистки с помощью методов, применяемых специалистами в данной области, получить сложный эфир 9 или 12 соответственно, где R - алкил.

Как показано на схеме 2, необязательная стадия c, эфир 9 или 12, полученный на стадии b, может быть гидролизован с помощью способов, известных специалистам в рассматриваемой области, с тем, чтобы получить карбоновые кислоты 9 или 12 соответственно, где R - H. Так, подходящее основание, например гидроокись калия, гидроокись натрия, гидроокись лития и подобные им основания, добавляют к смеси эфира 9 или 12 и подходящего растворителя, например смеси тетрагидрофурана и воды. Смесь нагревают при температуре 90-110°C в течение около 0,5-2 часов. Продукт выделяют в виде соли посредством фильтрации, и фильтрат концентрируют, чтобы получить дополнительный материал в виде осадка. Остаток на фильтре и осадок объединяют и подкисляют методами, известными специалистам в данной области, как, например, подкислением подходящей кислотой, например уксусной кислотой, в соответствующем растворителе, таком как метанол, этанол и подобные им растворители, чтобы получить карбоновые кислоты 9 или 12 соответственно, где R - H.

Как показано на схеме 2, стадия d, эфир 9 или 12, где R - алкил, превращается в амид 10 или 13 соответственно, как было видно из схемы 1, стадия a. В альтернативном варианте карбоновая кислота 9 или 12, где R - H, превращается в амид 10 или 13 соответственно с помощью способов, широко применяемых специалистами в рассматриваемой области и описанных на схеме 1, стадия b. Так, раствор карбоновой кислоты 9 или 12 в соответствующем растворителе, например, диметилформамиде, обрабатывают основанием, таким как диизопропилэтиламин, с карбодиимидом, например (1-(3-диметиламинопропил)-3-этил)карбодиимидгидрохлоридом, 1-гидроксибензотриазолом и хлоридом аммония. После завершения реакции смесь разбавляют подходящим растворителем, и продукт выделяют и очищают хроматографически с использованием методов, хорошо известных специалистам в данной области, с тем, чтобы получить соответствующий первичный амид 4H-пирроло[2,3-d]тиазола (M представляет S), 4-H-пирроло[2,3-d]оксазола, (M представляет O) или 1,4-дигидропирроло[2,3-d]имидазола (M представляет NR₈) 10 или первичный амид 6H-пирроло[3,2-d]тиазола (M представляет S), 6H-пирроло[3,2-d]оксазола (M представляет O) или 3,4-дигидропирроло[2,3-d]имидазола (M представляет NR₈) 13 соответственно, где R₂ - NH₂. Если вместо хлорида аммония используются первичные или вторичные C₁-C₆ алкиламины, образуются соответствующие вторичные и третичные амиды 10 или 13, где R₂ - NR₅R₆, R₅ - H или C₁-C₆ алкил, и R₆ - C₁-C₆ алкил.

Как показано на схеме 2, стадия е, промежуточный амид 10 или 13 тиоарилируется по положению 3 амида, имеющего пиррольное кольцо, с использованием способов, аналогичных способам, описанным выше для схемы 1, стадия с, с тем, чтобы получить соответствующий амид 4H-пирроло[2,3-d]тиазола (M представляет S), 4-H-пирроло[2,3-d]оксазола, (M представляет O) или 1,4-дигидропирроло[2,3-d]имидазола (M представляет NR₈) формулы (I) или амид 6H-пирроло[3,2-d]тиазола (M представляет S), 6H-пирроло[3,2-d]оксазола (M представляет O) или 3,4-дигидропирроло[2,3-d]имидазола (M представляет NR₈) формулы (II) соответственно, где X - S, и R₃ - арил или гетероцикл.

В случаях, когда R₄ - галоген, например Br, в промежуточном амиде 10 или 13, тиоарилирование в положении 3 имеющего амидный заместитель пиррольного кольца, а также замещение при упомянутом выше атоме галогена могут происходить в ранее описанных условиях. Поэтому одновременное замещение упомянутого галогена в промежуточном амиде 10 или 13 в описанных условиях для указанной выше стадии е с использованием диарилсульфида или дигетероциклосульфида успешно используется для получения приведенного на схеме 2 соединения формулы (I) или формулы (II), где R₄ - арилтио или гетероциклотио функциональная группа (то есть XR₃), которая идентична функциональной группе пиррольного кольца XR₃, где X - S, и R₃ - арил или гетероцикл. Кроме того, замещение упомянутого выше атома галогена в промежуточном амиде 10 или 13 или в предшествующем промежуточном соединении, например промежуточном эфире 9 или 12, анионом, полученным обработкой арилтиола или гетероциклотиола подходящим основанием, также приводит к получению соединения формулы (I) или формулы (II), где R₄ - арилтио или гетероциклотио функциональная группа, которая может быть такой же или отличающейся от функциональной группы XR₃, вводимой посредством тиоарилирования, которое описано выше для схемы 2, стадия е. Помимо этого, замещение упомянутого выше галогена в промежуточном эфире 9 или 12 или в промежуточном амиде 10 или 13 анионом, полученным способами, применяемыми специалистами в данной области, из C₁-C₆ алкил-OH, арил(C₁-C₆алкил)-OH, гетероцикл(C₁-C₆ алкил)-OH, C₁-C₆ алкил-SH, арил(C₁-C₆ алкил)-SH, гетероцикл(C₁-C₆ алкил)-SH, C₁-C₆ алкил-NH₂, (C₁-C₆ алкил)₂NH или арил(C₁-C₆ алкил)амина или гетероцикл(C₁-C₆ алкил)амина, где азот названного амина может быть замещен C₁-C₆ алкилом, после тиоарилирования дает приведенное на схеме 2 соединение формулы (I) или формулы (II), в котором R₄ - C₁-C₆ алкокси, арил-(C₁-C₆ алкокси), гетероцикл-(C₁-C₆ алкокси), C_1-6 алкилтио, арил-(C₁-C₆ алкилтио), гетероцикл-(C₁-C₆ алкилтио), NR₅R₆, где R₅ - H или C₁-C₆ алкил, и R₆ - C₁-C₆ алкил или арил(C₁-C₆ алкил)амино или гетероцикл(C₁-C₆ алкил)амино, где указанный азот амина может быть замещен C₁-C₆ алкилом.

Как показано на схеме 2, вариант f, азот пиррольного кольца соединения формулы (I) или формулы (II), где R₁ - H, подвергается N-алкилированию с использованием способов, описанных выше для схемы 1, необязательная стадия d, с тем, чтобы получить приведенное на схеме 2 соединение формулы (I) или формулы (II), в котором R₁ - C₁-C₆ алкил.

Кроме того, соединение формулы (I) или формулы (II) на схеме 2, где R₁ - H или C₁-C₆ алкил, а X - S, может дополнительно окисляться до сульфона или сульфоксида, где X - S(O)_n, и n равно 1 или 2 соответственно, с помощью способов, известных специалистам в рассматриваемой области, например, путем обработки раствора упомянутого соединения формулы (I) или формулы (II), где X - S, H₂O₂ и Na₂CO₃. В альтернативном варианте соединение 10 или 13 на схеме 2 обрабатывают арилсульфонилхлоридом, арилсульфинилхлоридом, гетероциклосульфонилхлоридом или гетероциклосульфинилхлоридом (используемым вместо диарилдисульфида или дигетероциклодисульфида), как описано выше на стадии е, с тем, чтобы получить приведенное на схеме 2 соединение формулы (I) или формулы (II), где X - S(O)_n, n равно 1 или 2, и R₃ - арил или гетероцикл.

Схема 3

Как показано на схеме 3, диарилдисульфиды получают посредством обработки раствора арилсульфида в подходящем органическом растворителе, например метаноле, водным раствором пербората натрия и выдерживанием смеси в течение 12-24 часов при комнатной температуре. Диарилдисульфид можно выделить и очистить методами, применяемыми специалистами в данной области. Дигетероциклодисульфиды, например бис(2-пиридинил)дисульфид, получают аналогичным способом. Как арилсульфид, так и гетероциклосульфид, который может быть замещен, как это было определено выше для терминов «арил» и «гетероцикл».

Все различные соединения в примерах осуществления настоящего изобретения, которые приведены в настоящем документе, могут использоваться в способе лечения описанных здесь различных заболеваний и нарушений. Согласно данному документу соединения, использованные в способе настоящего изобретения, в состоянии способны ингибировать эффекты казеинкиназы Iε.

В одном из осуществлений настоящего изобретения предлагается способ лечения нарушений настроения или нарушений сна. Другое осуществление настоящего изобретения относится к способу лечения нарушений настроения, где нарушение представляет собой депрессивное расстройство или биполярное расстройство. Еще одно осуществление рассматриваемого изобретения включает способ лечения депрессивных расстройств из разряда больших депрессивных расстройств. В другом осуществлении настоящего изобретения предлагается способ лечения нарушений настроения, причем такие нарушения настроения являются биполярными расстройствами, и биполярные расстройства выбираются из группы, включающей биполярные расстройства I типа и биполярные расстройства II типа. Другое осуществление данного изобретения включает способ лечения нарушений сна. Еще одно осуществление настоящего изобретения включает способ лечения нарушений сна, относящихся к категории расстройств сна, связанных с циркадным ритмом. В другом осуществлении рассматриваемого изобретения предлагается способ лечения расстройств сна, связанных с циркадным ритмом, причем расстройства сна, связанные с циркадным ритмом, выбираются из группы, включающей расстройства сна при посменной работе, синдром десинхроноза при перелетах, синдром преждевременной фазы сна и синдром задержки фазы сна. Специалист в указанной области может с легкостью установить, что заболевания и нарушения, особо оговоренные в настоящем документе, не подразумевают ограничительность характера, а, скорее, иллюстрируют эффективность соединений настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что соединения рассматриваемого изобретения могут быть использованы для лечения любого заболевания или нарушения, при которых состояние пациентов улучшается при ингибировании казеинкиназы Iε.

В еще одном осуществлении настоящего изобретения фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и соединение формулы (I), или формулы (II), или стереоизомер, энантиомер, рацемат или таутомер указанного соединения, или их фармацевтически приемлемую соль, получают с использованием способа, хорошо известного специалистам в области фармацевтики. Носитель или эксципиент могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими материалами, которые способны служить носителем или средой для активного ингредиента. Подходящие носители или эксципиенты хорошо знакомы специалистам в данной области. Фармацевтическую композицию можно адаптировать для перорального, ингаляционного, парентерального и местного применения и вводить пациенту в форме таблеток, капсул, суспензий, сиропов, аэрозолей, средств для ингаляции, суппозиториев, мазей, порошков, растворов и т.п. Используемый в настоящем документе термин «фармацевтический носитель» означает один или несколько эксципиентов. Как показано в рассматриваемом документе, фармацевтические композиции данного изобретения обеспечивают ингибирование казеинкиназы Iε, а потому полезны для лечения заболеваний или расстройств, которые облегчаются при ингибировании казеинкиназы Iε.

В процессе приготовления фармацевтических композиций или составов соединений настоящего изобретения следует учитывать необходимость обеспечения биодоступности эффективного терапевтического количества активного соединения или соединений, выбирая способ введения (в том числе пероральный, парентеральный или подкожный). Эффективные способы введения могут включать подкожный, внутривенный, чрескожный, интраназальный, ректальный, вагинальный и подобные им способы, включая высвобождение из имплантов, а также инъекцию активного ингредиента и/или композиции непосредственно в ткань.

При пероральном введении соединения настоящего изобретения могут включаться в состав твердых или жидких препаратов с инертными разбавителями или съедобными носителями или без них (капсулы, пилюли, таблетки, пастилки, порошки, растворы, суспензии или эмульсии). Капсулы, пилюли, таблетки, пастилки и т.п. могут также содержать один или несколько следующих вспомогательных веществ: связывающее вещество, например микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь; эксципиент, например крахмал или лактоза, дезинтегрирующий агент, например альгиновая кислота, кукурузный крахмал и т.п., лубрикант, например стеариновая кислота, стеарат магния или Sterotex® (Stokely-Van Camp Inc., Indinapolis, Indiana), вещество, облегчающее скольжение, в частности коллоидный диоксид кремния, подсластитель, например сахароза или сахарин, или ароматизатор, например перечная мята, метилсалицилат или фруктовый ароматизатор. Если единичной дозированной формой является капсула, она также может содержать жидкий носитель, например полиэтиленгликоль или жирное масло. Используемые вещества должны быть фармацевтически чистыми и нетоксичными в применяемых количествах. В альтернативном варианте фармацевтические композиции могут приготавливаться в форме, пригодной для пролонгированного высвобождения, с тем, чтобы обеспечить доступность терапевтического количества соединения формулы (I) настоящего изобретения в удобной форме раз в день, раз в неделю или раз в месяц с использованием методов, применяемых специалистами в данной области. Например, можно предусмотреть использование разлагаемого полимера, содержащего активный ингредиент.

При парентеральном введении соединения настоящего изобретения могут вводиться в форме инъекционных доз раствора или суспензии соединения в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем, в качестве которого может выступать стерильная жидкость, например вода-в-масле, или без добавления поверхностно-активного вещества и других фармацевтически приемлемых эксципиентов. Примерами масел, применяемых в препаратах, являются масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло и минеральное масло. В общем случае, вода, физиологический раствор, водная декстроза и растворы подобных сахаров, этанол и гликоли, например пропиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, особенно для инъекционных растворов. Препарат для парентерального применения может быть расфасован в ампулы, одноразовые шприцы, а также флаконы с несколькими уровнями из инертного пластика или стекла.

Растворы или суспензии, описанные выше, могут также включать одно или несколько следующих вспомогательных веществ: стерильные разбавители, например вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, например аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, например этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, например ацетаты, цитраты или фосфаты, а также агенты для регулирования изотоничности, например хлорид натрия или декстроза.

Соединения настоящего изобретения могут вводиться в форме кожных пластырей, депо-инъекций или имплантируемого препарата, получаемого таким образом, чтобы обеспечить замедленное высвобождение активного ингредиента. Активный ингредиент может прессоваться в гранулы или небольшие цилиндры и имплантироваться подкожно или внутримышечно в форме депо-инъекции или импланта. Для имплантов существует возможность применения инертных материалов, например биоразрушаемых полимеров и синтетических силиконов. Подходящие фармацевтические носители и способы приготовления композиций приводятся в стандартных пособиях, например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19^th edition, Volumes 1 and 2, 1995, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, USA, которое в силу ссылки на него включается в настоящий документ.

Для лечения различных заболеваний, расстройств и состояний, описанных в данном документе, подходящие уровни доз составляют от 0,01 до 250 мг/кг в день, предпочтительно от 0,05 до 100 мг/кг в день, а в особенности от примерно 0,05 до примерно 40 мг/кг в день. Соединения настоящего изобретения могут вводиться по схеме от 1 до 4 раз в день, что определяется характером заболевания, расстройства или состояния, лечение которого проводится.

ПРИМЕРЫ

Приведенные ниже примеры приводятся для более подробной иллюстрации изобретения, никоим образом не ограничивая объем изобретения. В таблицах 1, 2, 3 и 4 приводится сводная информация по примерам соединений, которые получены в соответствии с настоящим изобретением.

Если не указано иначе, все исходные материалы, реагенты и растворители были получены от коммерческих поставщиков и использовались без дополнительной очистки. Все реакции проводились в инертной атмосфере с сухими реагентами и растворителями. Флеш-хроматография проводилась на силикагеле 60 (35-70 мкм) в соответствии с описанной в литературе процедурой (Still, W.C.; Kahn, M; Mitra, A. J. Org. Chem. 1978 43, 2923) или вариацией этого метода с использованием коммерчески доступного картриджа силикагеля (например, Isco Redi Sep). Тонкослойная хроматография (ТСХ) проводилась на пластинках, покрытых силикагелем 60F-254 (EM) с толщиной до 0,25 мм со стеклянной подложкой. Пластинки элюировали системами растворителей (по объему) в соответствии с описанием, проявляли в парах йода под УФ-излучением или с помощью окрашивающего реагента, например раствора KMnO₄.

¹H ЯМР спектры записывали на спектрометрах Varian Gemini 300, Unity 300, Unity 400 или Unity 500, причем значения химических сдвигов (δ) приводятся в м.д. относительно тетраметилсилана (0,00 м.д.) или хлороформа (7,26 м.д.), используемых в качестве стандарта. Спектры жидкостной хроматомасс-спектрометрии (ЖХМС) записывали на масс-спектрометре Micromass LCTAPI LC-TOF (время-пролетный) с системой обработки данных Masslynx. Способ ионизации = электрораспыление (esi), значения определялись для протонированных молекулярных ионов (M⁺+1) с использованием колонки Synergi 2U HYDRO-RP 20×4 мм при элюировании 0,1% TFA в смеси вода/ацетонитрил.

Этиловый эфир 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты и этиловый эфир 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты получали в соответствии с методикой, описанной в Eras, J.; Galvez, C.; Garcia, F. Journal of Heterocyclic Chemistry (1984), 21(1), 215-17. Этиловые эфиры 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты, 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и 2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты получали тем же способом, что и описанный в WO9940914. 2-Алкилтио, 2-арилалкилтио- и 2-алкилзамещенные эфиры пирроло[2,3-d]имидазол-5-карбоновой кислоты могут быть получены по методике, описанной в Shafiee, A. and Hadizadeh, F., J. of Heterocyclic Chemistry (1997), 34, 549-550 и в Shafiee, A.; Shahbazi Mojarrad, J.; Jalili, M.A.; Adhami, H.R. and Hadizadeh, F. Journal of Heterocyclic Chemistry, 39, 367-373. 4-Тиазолкарбоксальдегид, 5-тиазолкарбоксальдегид и 2-метил-5-тиазолкарбоксальдегид приобретали у коммерческих поставщиков. Этиловый эфир 1,4-дигидро-4-метилпирроло[3,2-b]пиррол-2-карбоновой кислоты получали в соответствии с методикой, описанной в H.Hemetsberger and D.Knittel, Monatsh. Chem. (1972) 103(1), 194-204.

Получение этилового эфира 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

Этиловый эфир 2-азидо-3-(2-бром-4-тиазолил)акриловой кислоты

К раствору этоксида калия (30 мл, 24 вес.%, 3 экв. EtOK) медленно добавляют взвесь 2-бром-4-тиазолилкарбоксальдегида (3,87 г, 30 моль) и этилового эфира 2-азидоацетата (11,5 г, 3 экв.) в смешанном растворителе, содержащем этанол (150 мл), DMF (5 мл) и хлористый метилен (DCM, 20 мл), при 0°C в течение 15-20 минут. Полученную смесь перемешивают в течение ночи (18 ч) при комнатной температуре, реакцию гасят хлоридом аммония и удаляют этанол (~50 мл) на ротационном испарителе. Водную смесь экстрагируют DCM (порциями 3×250 мл), промывают органическую фазу соляным раствором и сушат над MgSO₄. Фильтруют и концентрируют фильтрат, и очищают сырую смесь (12,2 г) флеш-хроматографией [ISCO, SiO₂, картридж 120 г, элюент метанол: DCM (0-5%)], чтобы получить искомое соединение (3,6 г, 45%).

ЖХМС: время удерживания = 3,68 мин, (M⁺) = 302,98

Этиловый эфир 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

К горячему ксилолу (13°C, 4 мл) по каплям добавляют раствор этилового эфира 2-азидо-3-(2-бром-4-тиазолил)акриловой кислоты (60 мг, 0,2 ммоля) в DCM (1 мл). Нагревают смесь в течение одного часа, затем охлаждают до комнатной температуры, наносят смесь на подложку силикагеля и элюируют смесью гептан:DCM (50-100%), чтобы получить искомое соединение (14 мг).

ЖХМС: время удерживания = 3,04 мин, (M⁺) = 274,92

Получение этилового эфира 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

Этиловый эфир 4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты получают аналогичным образом, как описано выше при получении этилового эфира 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты из 2-бром-4-тиазолилкарбоксальдегида.

Получение 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

Добавляют КОН (1,07 г, 2 экв.) к смеси этилового эфира 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты (2,6 г, 9,38 ммоль) в THF (15 мл) и воды (20 мл), а затем нагревают при 100°C в течение 1 ч. Выдерживают в течение ночи при комнатной температуре и собирают кристаллический твердый осадок посредством фильтрации (вес 1,7 г). Концентрируют водный раствор в вакууме и объединяют осадок с ранее выделенным кристаллическим осадком. Подкисляют уксусной кислотой в метаноле, чтобы получить искомое соединение (2,31 г).

ЖХМС: время удерживания = 2,35 мин, (M⁺) = 246,93

Получение 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

Получают 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновую кислоту гидролизом этилового эфира 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты аналогичным способом, который описан выше для получения 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты из этилового эфира 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты.

Получение промежуточных амидов карбоновых кислот

Амид 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты

К этиловому эфиру 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (1,74 г, 8,9 ммоль) и 7M аммиака в метаноле (100 мл) в стальной бомбе добавляют крошку гидроксида лития (0,1 г). Бомбу герметизируют и нагревают до 100°C в течение 16 ч. Охлаждают до комнатной температуры и концентрируют смесь для удаления летучих соединений. Сырой продукт очищают флеш-хроматографией (ISCO, картридж силикагеля, 40 г, элюируют метанолом 0-5% в метиленхлориде), чтобы получить искомое соединение (560 мг, 38%) в форме беловатого порошка.

ЖХМС: время удерживания = 2,08 мин, (M⁺) = 166,02

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO-D₆) δ м.д. 6,95 (д, J=5,25 Гц, 1H) 7,05-7,08 (м, 1H) 7,11 (уш. с, 1H) 7,37 (д, J=5,25 Гц, 1H) 7,68 (уш. с, 1H) 11,64 (с, 1H).

С помощью приведенной выше процедуры были также получены следующие амиды:

Амид 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты (ЖХМС: время удерживания = 1,63 мин, (M⁺) = 168,00)

Амид 2-метил-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты (ЖХМС: время удерживания = 1,28 мин, (M⁺+Н) = 182)

Амид 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

К раствору 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты (2,53 г, 10 ммоль) в DMF (45 мл) добавляют DIEA (диизопропилэтиламин, 10 мл, 6 экв.), EDC (1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид HCl, 5,0 г, 3,5 экв.); HOBT (1-гидроксибензотриазол, 1,91 г, 14 ммоль, 1,4 экв.) и NH₄Cl (2,25 г, 42 ммоль). Перемешивают смесь при комнатной температуре в течение 6 ч и следят по ЖХМС. После завершения реакции смесь разбавляют этилацетатом и промывают водой и соляным раствором. Собирают твердую фазу фильтрацией (2,21 г) и очищают хроматографией на силикагеле (ISCO картридж с силикагелем, 4 г, элюент метанол (10-40%) в метиленхлориде), чтобы получить искомое соединение (550 мг).

ЖХМС: время удерживания = 2,11 мин, (M⁺) = 245,98

Амид 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты

Получают амид 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты аминированием 6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты аналогичным способом, который описан выше для получения амида 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты из 2-бром-6H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты.

Общий способ получения диарилдисульфидов и дигетероциклодисульфидов

К раствору незамещенного или соответствующим образом замещенного арилтиола (17,2 ммоль, 1,0 экв) и MeOH (30 мл) добавляют раствор пербората натрия (22 миллимоля) и воду (20 мл) при перемешивании, а затем выдерживают реакционную смесь при комнатной температуре в течение ночи. Твердый осадок отделяют фильтрацией и промывают метанолом, чтобы получить искомый диарилсульфид. Другие дисульфиды, в том числе дигетероциклодисульфиды (например, бис(2-тиенил)дисульфид), могут быть получены аналогичным способом, который описан для приготовления искомых диарилдисульфидов.

Способ тиоарилирования пиррольной группы

Способ 1: Амид 6-фенилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (Ia)

Амид 4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (75 мг, 0,45 ммоль) обрабатывают NaH (45 мг, 60% в масле, 1,12 ммоль, 2,5 экв.) в N,N-диметилформамиде (1,3 мл) при комнатной температуре в токе азота в течение 35 минут. Добавляют дифенилсульфид (137 мг, 1,4 экв) и нагревают смесь при 70°C в течение ночи. Разбавляют смесь соляным раствором (2 мл) и экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный раствор концентрируют до состояния масла и очищают хроматографией на силикагеле (ISCO картридж с силикагелем, 4 г, элюент метанол (0-10%) в метиленхлориде), чтобы получить искомое соединение (55 мг).

ЖХМС: время удерживания = 3,03 мин, (M⁺+Н) = 275,01)

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ м.д. 5,94 (с, 1H) 7,03 (д, J=5,25 Гц, 1Н) 7,14-7,27 (м, 6Н) 7,79 (уш. с, 1Н) 10,79 (уш. с, 1Н).

Способ 2: Амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (Ib)

Амид 4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (60 мг, 0,36 ммоль) добавляют к смеси бис(3-фторфенил)дисульфида, (150 мг, 0,51 ммоль) и карбоната цезия (120 мг, 1 экв.) в DMF (2,5 мл), а затем нагревают при 95°С в течение 3 ч. Следят за реакцией по ТСХ. После завершения реакции разбавляют реакционную смесь этилацетатом (15 мл) и промывают соляным раствором (25 мл). Органический раствор сушат, концентрируют до сырого масла и очищают масло хроматографией на силикагеле (ISCO картридж с силикагелем, 4 г, элюент метанол (0-10%) в метиленхлориде), чтобы получить искомое соединение (81 мг).

ЖХМС: время удерживания = 3,47 мин, (M⁺+Н)=293

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ м.д. 5,67 (с, 1Н), 6,82-6,90 (м, 2Н), 6,96 (ддд, J=7,87, 1,50, 1,37 Гц, 1Н), 7,03 (д, J=5,25 Гц, 1Н), 7,17-7,24 (м, 1Н), 7,31 (д, J=5,25 Гц, 1Н), 7,70 (с, 1Н), 9,96 (с, 1Н).

Способ 3: Амид 4-(пиридин-2-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (IIa)

Амид 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (57 мг, 0,34 ммоль) обрабатывают NaH (19 мг, 0,78 ммоль, 2,3 экв) в N,N-диметилформамиде (1 мл) при комнатной температуре в токе азота в течение 45 минут. Добавляют 2,2'-дипиридилдисульфид (106 мг, 1,4 экв.) и перемешивают смесь в течение ночи при комнатной температуре. Разбавляют смесь водой и экстрагируют этилацетатом. Этилацетатный раствор концентрируют до получения остатка, который очищают флеш-хроматографией (ISCO картридж с силикагелем, элюент метанол 5% в метиленхлориде (+1% 7N аммиака в метаноле)), чтобы получить искомое соединение (32 мг, 32%).

ЖХМС: время удерживания = 2,53 мин, (M⁺+Н) = 276,022

Способ 4: Амид 4-(фенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (IIb)

Амид 6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты (50 мг, 0,30 ммоль) в N,N-диметилформамиде (0,5 мл) обрабатывают NaH (29 мг, 60% в масле, 0,75 ммоль, 2,5 экв.) при комнатной температуре в токе азота в течение 45 минут. Добавляют дифенилдисульфид (92 мг, 0,4 ммоль, 1,4 экв.) и перемешивают смесь при 60°C в течение ночи. Повышают температуру до 100°C на период, равный 5 часам, а затем охлаждают до комнатной температуры. Разбавляют реакционную смесь водой и этилацетатом,^* при этом искомое соединение кристаллизуется из раствора. Продукт собирают фильтрацией и сушат под вакуумом, чтобы получить искомое соединение (28 мг).

ЖХМС: время удерживания = 3,068 мин, (M⁺+Н) = 275,024

^*В некоторых случаях (см. таблицы 1 и 2 столбец способов синтеза) при использовании способа 4 соединения не кристаллизуются. В такой ситуации отделяют этилацетатную фракцию и концентрируют ее, чтобы получить неочищенный остаток, который очищают флеш-хроматографией (ISCO картридж с силикагелем, элюент метанол 10% в метиленхлориде (+1% 7N аммиака в метаноле)), чтобы получить искомое соединение.

Способ 5: Амид 2,6-бис-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты (IIq)

Дифенилдисульфид (93 мг, 0,43 ммоль, 1,25 экв.) добавляют к смеси амида 2-бром-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты (85 мг, 0,34 ммоль) и карбоната цезия (140 мг, 1,25 экв.) в DMF (4 мл). Смесь нагревают при 100°С в течение 16 ч. Удаляют DMF при пониженном давлении, и разделяют остаток между водой и этилацетатом. Органическую фазу промывают соляным раствором, а затем сушат и фильтруют отделенную органическую фазу. Добавляют фильтрат в сосуд, содержащий небольшое количество силикагеля (примерно 0,5 г), и выпаривают растворитель, чтобы получить сырой продукт, адсорбированный на силикагеле. Помещают силикагель в верхнюю часть колонки, содержащей примерно 4 г силикагеля и элюируют 0-10% MeOH в DCM, чтобы получить 8 мг (6,5%) искомого соединения.

ЖХМС: время удерживания = 3,30 мин, (M⁺) = 383,02

Таблица 1
Соединения формулы (I)
(M представляет S)
№ примера R ₁ R ₂ R ₃ X R ₄ L Способ синтеза Ia H NH₂ C₆H₅S H CH 1 Ib H NH₂ 3-F-C₆H₄S H CH 1 Ic H NH₂ 4-Cl-C₆H₄S H CH 1 Id H NH₂ 2-NH₂-C₆H₄S H CH 1 Ie H NH₂ 2-пиридинилS H CH 1 If H NH₂ 4-CH₃-C₆H₄S H CH 1 Ig H NH₂ 2-тиенилS H CH 2 Ih H NH₂ 3,5-(Cl)₂-C₆H₃S H CH 2 Ii H NH₂ 4-пиридинилS H CH 2 Ij H NH₂ 3-CH₃-C₆H₄S H CH 2 Ik H NH₂ 2-CH₃-C₆H₄S H CH 2 Il H NH₂ 2,3-(Cl)₂-C₆H₃S H CH 2 Im H NH₂ 2,5-(Cl)₂-C₆H₃S H CH 2 In H NH₂ 2-C₂H₅-C₆H₄S H CH 2 Io H NH₂ 3-Br-C₆H₄S H CH 2 Ip H NH₂ 3,5-(CH₃)₂-C₆H₃S H CH 2 Iq H NH₂ 3-CH₃O-C₆H₄S H CH 2 Ir H NH₂ 2-CH₃O-C₆H₄S H CH   Is H NH₂ 2-CF₃-C₆H₄S H CH 2 It H NH₂ 2-F-C₆H₄S H CH 2 Iu H NH₂ 3-CF₃O-C₆H₄S H CH 2 Iv H NH₂ C₆H₅S H N 4 Iw H NH₂ 3-F-C₆H₄S H N 4^* Ix H NH₂ 2-пиридинилS H N 4 ^*См. примечание к способу 4.

Таблица 2
Соединения формулы (II)
(M представляет S)
№ примера R ₁ R ₂ R ₃ X R ₄ L Способ синтеза IIa H NH₂ 2-пиридинилS H CH 3 IIb H NH₂ C₆H₅S H CH 4 IIc H NH₂ 3-F-C₆H₄S H CH 4^* IId H NH₂ 4-пиридинилS H CH 1 IIe H NH₂ 3,5-(Cl)₂-C₆H₃S H CH 1 IIf H NH₂ 2-тиенилS H CH 1 IIg H NH₂ 3-Br-C₆H₄S H CH 2 IIh H NH₂ 3-CH₃O-C₆H₄S H CH 2 IIi H NH₂ 2-CH₃O-C₆H₄S H CH 2 IIj H NH₂ 3-Cl-C₆H₄S H CH 2 IIk H NH₂ 3-CH₃-C₆H₄S H CH 2 IIl H NH₂ C₆H₅S CH₃ N 2 IIm H NH₂ 3-CH₃O-C₆H₄S CH₃ N 2 IIn H NH₂ 3-F-C₆H₄S CH₃ N 2 IIo H NH₂ 3-Cl-C₆H₄S CH₃ N 2 IIp H NH₂ 3-CF₃O-C₆H₄S CH₃ N 2 IIq H NH₂ C₆H₅S C₆H₅S N 5 IIr H NH₂ 3-CH₃O-C₆H₄S 3-CH₃O-C₆H₄S N 5 IIs H NH₂ C₆H₅S H N 2 IIt H NH₂ 3-CH₃O-C₆H₄S H N 2 ^*См. примечание к методу 4.

Таблица 3
Спектральные характеристики соединений формулы (I)
(M представляет S) № примера Название соединения МС:
Набл. масса иона*
(атом. ед. масс.) МС:
Время удерживания (мин) Ia Амид 6-фенилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 275,011 3,034 Ib Амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 293 3,47 Ic Амид 6-(4-хлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 308,967 3,268 Id Амид 6-(2-аминофенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 290,025 2,668 Ie Амид 6-(пиридин-2-илсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 276 2,57 If Амид 6-п-толилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 289,024 3,218 Ig Амид 6-(тиофен-2-илсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 281,02 2,97 Ih Амид 6-(3,5-дихлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 342,96 3,55 Ii Амид 6-(пиридин-4-илсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 276 1,39 Ij Амид 6-м-толилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 287 2,71 Ik Амид 6-о-толилсульфанил-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 289 2,69 Il Амид 6-(2,3-дихлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 342,95 3,57 Im Амид 6-(2,5-дихлорфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 342,95 3,5 In Амид 6-(2-этилфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 303,06 3,45 Io Амид 6-(3-бромфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 352,932 3,4 Ip Амид 6-(3,5-диметилфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 303,05 3,47 Iq Амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 305,03 3,17 Ir Амид 6-(2-метоксифенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 305,36 3,13 Is Амид 6-(2-трифторметилфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 343,01 3,37 It Амид 6-(2-фторфенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 293,02 3,15 Iu Амид 6-(3-трифторметоксифенилсульфанил)-4H-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 359,008 3,47 Iv Амид 6-фенилсульфанил-4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 274 3,052 Iw Амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 294,013 2,851 Ix Амид 6-(пиридин-2-илсульфанил)-4H-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 277,035 2,334 ^*Если не указано иначе, тип иона - M+H.

Таблица 4
Спектральные характеристики соединений формулы (II)
(M представляет S) № примера Название соединения
ЯМР (CDCl ₃ ) МС:
Набл. масса иона*
(атом. ед. масс.) МС:
Время удерживания (мин) IIa Амид 4-(пиридин-2-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 276,022 2,53 IIb Амид 4-(фенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 275,024 3,068 IIc Амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 276 3,43 IId Амид 4-(пиридин-4-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 276,1 1,45 IIe Амид 4-(3,5-дихлорфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 325,9 2,98 IIf Амид 4-(тиофен-2-илсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 264 2,43 IIg Амид 4-(3-бромфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 352,9 4,31 IIh Амид 4-(3-метоксифенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 305 3,44 IIi Амид 4-(2-метоксифенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 305 3,56 IIj Амид 4-(3-хлорфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты
¹H ЯМР (300 МГц,) δ м.д. 2,30 (с, 3H), 5,70 (уш. с, 1H), 6,89 (д, J=5,25 Гц, 1H), 6,94-7,06 (м, 4H), 7,14 (т, J=7,62 Гц, 1H), 7,87 (уш. с, 1H), 10,28 (уш. с, 1H) 309,2 3,47 IIk Амид 4-(3-метилфенилсульфанил)-6H-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты 289 4,1 IIl Амид 2-метил-6-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 290,04 2,8 IIm Амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты
¹H ЯМР (300 МГц,) δ м.д. 2,75 (с, 3H), 3,71 (с, 3H), 5,69 (уш. с, 1H), 6,64-6,68 (м, 1H), 6,72-6,77 (м, 2H), 7,12 (т, J=7,66 Гц, 1H), 7,86 (уш. с, 1H), 10,35 (уш. с, 1H) 320,05 2,69 IIn Амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 308,04 2,72 IIo Амид 6-(3-хлорфенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты
¹H ЯМР (300 МГц) δ м.д. 2,77 (с, 3H), 5,72 (уш. с, 1H), 7,03-7,18 (м, 4H), 7,76 (уш. с, 1H), 10,41 (уш. с, 1H) 323,99 2,82 IIp Амид 6-(3-трифторметоксифенилсульфанил)-2-метил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 374,02 3 IIq Амид 2,6-бис-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 384,05 3,3 IIr Амид 2,6-бис-(3-метоксифенилсульфанил)-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 444,08 3,33 IIs Амид 6-фенилсульфанил-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты 275,98 2,77 IIt Амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-4H-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты
¹H ЯМР (300 МГц,) δ м.д. 3,71 (с, 3H), 5,83 (уш. с, 1H), 6,66-6,70 (м, 1H), 6,77-6,81 (м, 2H), 7,13 (т, J=8,00 Гц, 1H), 7,96 (уш. с, 1H), 8,55 (уш. с, 1H), 10,63 (уш. с, 1H) 306 2,77 ^*Если не указано иначе, тип иона - M+H. Для IIc, IIe, IIf наблюдаемым типом ионов был (M+H)-NH₃

Биологические примеры

Анализ фильтрации казеинкиназы эпсилон ³³ P-АТФ для скрининга ингибиторов CK1ε

Цель: В ходе данного анализа измеряется способность соединений ингибировать фосфорилирование субстрата казеина ферментом казеинкиназой 1ε с использованием анализа фильтрации «in vitro» ³³P-АТФ. Проводят параллельный анализ соединений в пяти концентрациях с тем, чтобы определить значения IC₅₀ или % ингибирования при 10-микромолярной концентрации, которые приводятся в таблице 5.

Материалы:

Оборудование:

Лабораторный робот для жидкостей Beckman Biomek 2000

Автоматизированная 96-канальная пипетка Beckman Multimek 96

Вакуумный коллектор Millipore базовый комплект # MAVM0960R

Дозатор жидкостей Titertek Multidrop

Жидкостный сцинтилляционный счетчик Packard TopCount NXT

Планшеты:

Планшета Costar EIA/RIA #9018

Полистирольная планшета с 96 ячейками с U-образным дном Falcon #353910

Фильтрационные планшеты с 96 ячейками Millipore Multiscreen #MAPHNOB50

Адаптерные планшеты Millipore Multiscreen TopCount #SE3M203V6

Химические реактивы:

EGTA, поставщик SIGMA #E-3889

Казеин (дефосфорилированный), поставщик SIGMA #C-4032

АТФ, поставщик SIGMA #A-7699

DTT, поставщик Fisher Biotech #BP1725

Трихлоруксусная кислота, поставщик SIGMA #T-6399

γ-³³P-АФТ 1 мКи/37 МБк, поставщик Perkin Elmer Life Sciences #NEG-602H

Ферменты:

Казеинкиназа 1ε в конечной концентрации 0,58 мг/мл, полученная в процессе ферментации и очистки, применяемом специалистами в данной области. Хранится в виде 100 мкл аликвот при температуре минус 80°C.

Соединения:

Исходные соединения для тестирования в виде замороженного исходного 10 мМ раствора вещества, растворенного в 100% DMSO.

Условия анализа:

Конечный полный анализируемый объем на ячейку равен 50 мкл; состав готовится следующим образом:

5 мкл разбавленного исходного раствора соединения (10, 1, 0,1, 0,01 или 0,001 мкМ),

5 мкл дефосфорилированного казеина с конечной концентрацией 0,2 мкг/мкл,

20 мкл CK1ε с конечной концентрацией 3 нг/мкл, и

20 мкл γ-³³P-АТФ с конечной концентрацией 0,02 мкКи/мкл, смешанной с нерадиоактивной АТФ (конечная концентрация 10 мкМ).

Методология:

1. Готовят 500 мл свежего аналитического буфера: 50 мМ Tris pH 7,5, 10 мМ MgCl_2, 2 мМ DTT и 1 мМ EGTA.

2. Готовят соединения для анализа, растворяя 10 мкл 10 мМ исходного раствора в 100% DMSO. С помощью робота для жидкостей Biomek 2000 готовят последовательные разбавления, чтобы получить конечные разбавления вещества 10, 1, 0,1, 0,01 и 0,001 мкМ, добавляемые по 5 мкл в планшеты с U-образным дном Falcon. Обычно тестируют по 8 соединений на одну 96-ячеечную планшету, причем столбцы 1 и 12 используются в качестве контрольных ячеек. Стандартный скрининговый анализ должен включать 32 соединения, что соответствует 4 аналитическим планшетам.

3. Карты аналитических планшет составляются в соответствии со следующей структурой CK1ePlateMap.xls.

Карта планшет анализа фильтрации CK1ε   1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A   Соединение 1         Соединение 5           B   Соединение 1         Соединение 5           C   Соединение 2         Соединение 6           D ИТОГО Соединение 2         Соединение 6         Неспециф E   Соединение 3         Соединение 7           F   Соединение 3         Соединение 7           G   Соединение 4         Соединение 8           H   Соединение 4         Соединение 8               10 1 0,1 0,01 0,001 мкМ 10 1 0,1 0,01 0,001 мкМ       ИТОГО Фермент+Казеин+Буфер+33P-АТФ Неспециф. Казеин+Буфер+33P-АТФ           Тест Фермент+Соединение+Казеин+33P-АТФ        

4. Добавляют 5 мкл соединения в соответствии с указанием, затем добавляют 5 мкл дефосфорилированного казеина (растворенного в дистиллированной H₂O) (0,2 мкг/мкл) и 20 мкл CK1ε (3 нг/мкл) в соответствующие ячейки.

5. В конце добавляют 20 мкл γ-³³P-АТФ (0,02 мкКи/мкл)/10 мкМ нерадиоактивной АТФ (достигает примерно 2×10⁶ счетов в минуту на ячейку).

6. Встряхивают аналитическую планшету Falcon с U-образным дном, содержащую указанные 50 мкл реакционного объема, а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.

7. Через 2 часа реакцию останавливают путем добавления 65 мкл ледяной 2 мМ нерадиоактивной АТФ (приготовленной в аналитическом буфере) в аналитические планшеты с помощью Beckman Multimek.

8. Одновременно добавляют 25 мкл 100% ледяной TCA (трихлоруксусной кислоты), растворенной в дистиллированной воде, в соответствующее число фильтрационных планшет Millipore MAPH.

9. С помощью ручного 8-канального дозатора переносят 100 мкл реакционной смеси из планшеты Falcon с U-образным дном в фильтрационные планшеты Millipore MAPH, предварительно обработанные TCA.

10. Осторожно перемешивают фильтрационные планшеты Millipore MAPH и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 30 минут для осаждения белков.

11. Через 30 минут фильтрационные планшеты помещают в вакуумный коллектор Millipore и фильтруют при давлении не выше 8 мм рт.ст., поскольку при более высоком вакууме в фильтрах MAPH возникает воздушная пробка.

12. Фильтрационные планшеты последовательно промывают и фильтруют с 2×150 мкл 20% TCA, 2×150 мкл 10% TCA и 2×150 мкл 5% TCA (всего 6 промывок на планшету/900 мкл на ячейку).

13. Планшеты высушивают в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день добавляют 40 мкл сцинтилляционной жидкости Packard Microscint-20 на ячейку с помощью дозатора Titertek Multidrop; запечатывают ячейки и ведут счет в течение 2 минут на ячейку на сцинтилляционном счетчике Packard Topcount NXT (чтобы получить значения счетов в минуту на ячейку).

Расчеты:

1. Заносят данные счетов в минуту в специализированную базу расчета и архивации данных (Activity Base, поставляемая IDBS, версия 5.0).

2. Столбец 1 в каждой планшете отражает общую активность фосфорилирования фермента в отсутствие любого ингибирующего соединения, а потому соответствует 100%. Колонка 12 воспроизводит любую неспецифическую активность фосфорилирования/остаточную радиоактивность в отсутствие ингибирующего соединения и фермента. Как правило, наблюдается около 1% от полного числа счетов в минуту, которые являются неспецифическими.

3. Определяя «полное» и «неспецифическое» число счетов в минуту для каждой планшеты, можно установить % ингибирования способности фермента фосфорилировать субстрат при каждой концентрации тестового соединения. Такой % данных ингибирования используют для расчета величины IC₅₀ (концентрация, при которой соединение в состоянии ингибировать активность фермента на 50%) для соединения, используя программу моделирования нелинейных зависимостей, включенную в протокол расчетов Activitybase (DG0027-CK1-D-BL).

4. Кинетические исследования в данной аналитической системе показали, что значение K_m для АТФ составляет 21 мкМ.

Анализ активности казеинкиназы 1δ в отношении мембранной аффинности стрептавидина для CKIδ ингибиторов

Цель: Оценка тестовых соединений для активности CKIδ в планшетах для анализа стрептавидин-биотиновой мембранной аффинности (SAM) (Promega V7542).

Материалы и реактивы

HEPES Sigma # H3375 м.в. = 238,3; β-глицерофосфат Sigma # G-9891 м.в. = 216,0; EDTA 0,5 M, pH 8,0 GibcoBRL; ортованадат натрия ACROS # 205330500 м.в. = 183,9; DTT (DL-дитиотреитол) Sigma # D-5545 м.в. = 154,2; хлорид магния ACROS # 41341-5000 м.в. = 203,3; АТФ Sigma # A-7699 м.в. = 551,1; γ³³P АТФ NEN # NEG602H; казеинкиназа 1δ Sigma # C4455; субстрат казеинкиназы 1 New England Peptide Biotin-RRKDLHDDEEDEAMSITA м.в. = 2470

Буфер для киназы (КВ, 100 мл) готовится следующим образом.

50 мМ HEPES, pH 8,0 5 мл 1M исходного раствора 10 мМ MgCl 1 мл 1M исходного раствора 10 мМ β-глицерофосфата 1 мл 1M исходного раствора 2,5 мМ EDTA 500 мкл 500 мМ исходного раствора 1 мМ ортованадата натрия 100 мкл 1M исходного раствора 1 мМ DTT 100 мкл 1M исходного раствора вода 92,3 мл

Основную смесь АТФ готовят следующим образом.

Готовят 1 мл 1М раствора АТФ в воде (1М исходный раствор АТФ).

К 12 мл КВ:

добавляют 12 мкл 1M раствора АТФ, затем

добавляют 12 мкл ³³P АТФ (10 мкКи/мкл), NEG602H, Perkin Elmer

Готовят реакционную планшету и проводят анализ следующим образом:

1. Добавляют 10 мкл KB на ячейку вместе с тестовым ингибирующим соединением или без него в ячейки реакционной планшеты.

2. Добавляют 60 мкл KB на ячейку.

3. Добавляют 10 мкл 500 мкМ пептидного субстрата на ячейку.

4. Доводят температуру планшеты до 37°C.

5. Добавляют 10 мкл разбавленной 1:10 CK1δ на ячейку = 0,42 мкг или 0,68 единиц.

6. Инициируют реакцию добавлением 10 мкл основной смеси АТФ на ячейку.

7. Помещают реакционную планшету в инкубатор при 37°C на 10 минут.

8. Останавливают реакцию с помощью 10 мкл 1M АТФ. Переносят 20 мкл в планшету SAM и выдерживают 10 минут при комнатной температуре.

9. Трижды промывают 100 мкл 2M раствором NaCl, затем три раза 100 мкл 2M NaCl и 1% H₃PO₄, после чего три раза 100 мкл воды на вакуумном коллекторе.

10. Сушат фильтрационную планшету под лампой в течение 30 минут.

11. Герметизируют дно планшеты и добавляют 20 мкл MicroScint 20.

12. Считывают с помощью TOPCOUNT.

Экспериментальная методика клеточного анализа циркадного ритма

Клеточная культура: Наносят культуры фибробластов Mper1-luc Rat-1 (P2C4) каждые 3-4 дня (конфлюентность ~10-20%) на вентилируемые полистирольные флаконы для культивирования тканей размером 150 см² (Falcon # 35-5001) и выдерживают в культуральной среде [EMEM (Cellgro #10-010-CV); 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS; Gibco #16000-044); и 50 ед. акт./мл пенициллин-стрептомицина (Cellgro #30-001-C1)] при 37°C и 5% CO₂.

Стабильная трансфекция: Проводят совместную трансфекцию культур фибробластов с конфлюентностью 30-50% вместе с векторами, содержащими селективный маркер на устойчивость к зеоцину для стабильной трансфекции и промотируемый репортерный ген люциферазы mPer-1. Через 24-48 часов культуры переносят в 96-ячеечные планшеты и выдерживают в культуральной среде с добавлением 50-100 мкг/мл зеоцина (Invitrogen #45-0430) в течение 10-14 дней. Оценивают репортерную экспрессию устойчивых к зеоцину стабильных трансфектантов путем добавления в культуральную среду 100 мкМ люциферина (Promega #E1603) и анализа активности люциферазы на сцинтилляционном счетчике TopCount (Packard Model #C384V00). Синхронизируют клоны Rat-1, демонстрирующие устойчивость к зеоцину и активность люциферазы, определяемую mPer1, посредством анафилактического шока, добавляя 50% лошадиной сыворотки [HS (Gibco #16050-122)] и оценивая активность циркадного репортера. Для тестирования соединений выбирают фибробласты Mper1-luc Rat-1 клона P2C4.

Протокол синхронизации: Переносят фибробласты Mper1-luc Rat-1 (P2C4) (конфлюентность 40-50%) на непрозрачные 96-ячеечные планшеты для культур тканей (PerkinElmer #6005680) и выдерживают в культуральной среде с добавлением 100 мкг/мл зеоцина (Invitrogen #45-0430) до тех пор, пока культуры не достигнут 100% конфлюентности (48-72 ч). Синхронизуют культуры с помощью 100 мкл синхронизирующей среды [EMEM (Cellgro #10-010-CV); 100 ед. акт./мл пенициллина-стрептомицина (Cellgro #30-001-C1); 50% HS (Gibco #16050-122)] в течение 2 часов при 37°C и 5% CO₂. После синхронизации культуры промывают 100 мкл EMEM (Cellgro #10-010-CV) в течение 10 минут при комнатной температуре. После промывания заменяют среду 300 мкл CO₂-независимой средой [CO2I (Gibco #18045-088); 2 мМ L-глутамина (Cellgro #25-005-C1); 100 ед. акт./мл пенициллина-стрептомицина (Cellgro #30-001-C1); 100 мкМ люциферина (Promega #E1603)]. После этого соединения, тестируемые на предмет циркадного эффекта, добавляют к CO₂-независимой среде в 0,3% DMSO (конечная концентрация). Сразу же запечатывают культуры пленкой TopSeal-A (Packard #6005185) и переносят для измерения активности люциферазы.

Автоматизированные измерения циркадного репортера: После синхронизации хранят аналитические планшеты при 37°C в инкубаторе тканевых культур (Forma Scientific Model #3914). Оценивают активность люциферазы «in vivo», измеряя относительный выход света по сцинтилляционному счетчику TopCount (Packard Model #C384V00). Переносят планшеты из инкубатора в считыватель с помощью роботизированного манипулятора ORCA (Beckman Instruments) и программного обеспечения автоматизированного регламента SAMI-NT (версия 3.3; SAGIAN/Beckman Instruments).

Анализ данных: Используют Microsoft Excel и XLfit (версия 2.0.9; IDBS) для импорта, обработки и графического отображения данных. Проводят анализ периодов либо путем определения интервала между соответствующими минимумами выхода света в течение нескольких дней, либо посредством преобразования Фурье. Оба метода позволяют получить практические одинаковые оценки для всего диапазона циркадных периодов. Описывают активность по формуле EC_Δt+1h, которая представляет эффективную микромолярную концентрацию, вызывающую удлинение периода на один час. Анализируют данные, аппроксимируя гиперболическую кривую к данным, выраженным как изменение периода (ось y) в сопоставлении с концентрацией тестового соединения (ось x) в XLfit, и интерполируя EC_Δt+1h из этой кривой.

Анализ циркадного цикла крыс

Данный анализ позволяет оценить воздействие тестового соединения на циркадный цикл «in vivo». Исследование предполагает использование самцов крыс линии Wistar (Charles River) с начальной массой тела 200-250 г. Прежде чем приступить к тестированию в контролируемой среде, каждое животное размещают индивидуально, после чего поддерживают термонейтральную температуру окружающей среды в пределах 24-28°C в течение 12/12 часов (ч) цикла день/ночь (с включением света в 06:00 ч) и дают неограниченное количество стандартного лабораторного корма и воды. Каждой крысе имплантируют внутрибрюшинный биотелеметрический передатчик (Minnimitter-VMFH, серия 4000, Sunriver, OR) для мониторинга базовой температуры тела и общей активности. Каждый передатчик имплантируют в соответствии с рекомендациями изготовителя под общим наркозом кетамин/ксилазин (78/13 мг кг^-1, внутрибрюшинно) и дают животным восстановиться в течение 7-10 дней. Для определения внутреннего циркадного цикла каждой особи после периода восстановления животных переводят на постоянный ночной цикл (цикл 0/24 ч, день/ночь) и дают животным возможность свободно перемещаться в течение 7-10 дней до введения тестового соединения. В соответствии со схемой дозирования животные получают либо носитель, либо соединение (внутрибрюшинно, подкожно или перорально) в определенные моменты ЦВ (циркадного времени) в течение 48-часового периода. После реализации схемы дозирования за животными устанавливается наблюдение в течение 5-7 дней при постоянном ночном цикле (0/24-часовой цикл день/ночь). Для каждого эксперимента регистрируют брюшную температуру и данные по общей активности через 5-минутные интервалы. Для анализа используют программное обеспечение VitalView и Actiview, поставляемое Minimitter. Строят график регистрируемых брюшинных температур, измеряемых для каждой крысы в первый день на горизонтальной линии. Совмещают линию наблюдаемых брюшинных температур с абсциссой циркадного времени (ось x). Откладывают регистрируемые брюшинные температуры для каждого последующего дня как отдельные линии аналогичным образом, чтобы получить ординату (ось y, дни). Соединяют начальный рост базовой температуры тела, который наблюдается ежедневно, прямой линией, что позволяет использовать сразу несколько дней для оценки циркадной фазы в любой заданный день для любой отдельно взятой особи. Определяют эффект от введения препарата для фазы, проводя прямую линию через несколько дней для оценки фазы до и после введения дозы. Лечение активным соединением будет вызывать более заметное смещение прямой линии, соединяющей ежедневный начальный рост базовой температуры тела до введения соединения, и прямой линии, соединяющей начальный рост базовой температуры тела после введения соединения, относительно линий контрольного введения носителя до и после введения. Для опытных животных вычисляют разницу между такими фазами, экстраполированную на день до введения. Используют тест ANOVA наряду с t-критерием Стьюдента, для того чтобы сравнить средние циркадные сдвиги температуры тела (в минутах) между группами.

Таблица 5
Биологические данные № соединения Анализ фильтрации казеинкиназы Iε ³³ P-ATP K _i (нМ) Анализ клеток
EC _Δτ+1h (мкМ) Ia 544   Ib 157,35   Ic >10⁴   Id 110 >30 Ie 159   If 3090   Ig 915,49   Ih 70,95   Ii 1677,81   Ij 116,26   Ik 468,28   Il 324,03   Im 1266,59   In 237,97   Io 78,65   Ip 356,87   Iq 37,99   Ir 331,34   Is 481,08   It 425,30   lu 562   Iv 4550,66   Iw 2025,39   Ix 1750,71   IIa 64,04   IIb 811 0,874 IIc 256,88   IId 1067,73   IIe 109,11   IIf 1448,84   IIg 30,64 2,492 IIh 24,73   IIi -----   IIj 112,37   IIk 70,56   IIl 184,63   IIm 68   IIn 15,90 0,998 IIo 9,60 0,662 IIp 4030   IIq 334   IIr 333   IIs 47,00 1,155 IIt 22,00 1,974

Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I) и формулы (II), их таутомерам и фармацевтически приемлемым солям. Соединения настоящего изобретения обладают свойствами ингибитора казеинкиназы Iε. В формуле (I) и в формуле (II)

Х - S; R₁ - Н; R₂ - NR₅R₆; R₃ - 5-6-членный гетероарил с 1 гетероатомом, выбранным из N и S, или фенил, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из галогена, амино, C₁-С₆-алкила, C₁-С₆-алкокси, C₁-С₆-галогеналкила и C₁-С₆-галогеналкокси; R₄ - Н, C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси или XR₃, где Х и R₃ определены выше; R₅ - Н; R₆ - Н; L - N или CR₇, где R₇ - Н; М - S. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента соединение изобретения, к способу ингибирования активности казеинкиназы I ε и к способу получения соединений формулы (I) или формулы (II). 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 5 табл.

1. Соединение формулы (I) или формулы (II)

где X - S;
R₁ - H;
R₂ - NR₅R₆;
R₃ - 5-6-членный гетероарил с 1 гетероатомом, выбранным из N и S, или фенил, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из галогена, амино, C₁-С₆-алкила, C₁-С₆-алкокси, C₁-С₆-галогеналкила и C₁-С₆-галогеналкокси;
R₄ - Н, C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси или XR₃, где Х и R₃ определены выше;
R₅ - H;
R₆ - Н;
L - N или CR₇, где R₇ - Н;
М - S,
или его таутомер,
или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1 формулы (I), где L - СН.

3. Соединение по п.2, выбранное из группы, в которую входят:
амид 6-фенилсульфанил-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(4-хлорфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2-аминофенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(пиридин-2-илсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-п-толилсульфанил-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(тиофен-2-илсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3,5-дихлорфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(пиридин-4-илсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-м-толилсульфанил-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-о-толилсульфанил-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2,3-дихлорфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2,5-дихлорфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2-этилфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-бромфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3,5-диметилфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2-метоксифенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2-трифторметилфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(2-фторфенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-трифторметоксифенилсульфанил)-4Н-тиено[3,2-b]пиррол-5-карбоновой кислоты.

4. Соединение по п.1 формулы (I), где L - N.

5. Соединение по п.4, выбранное из группы, в которую входят:
амид 6-фенилсульфанил-4Н-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-4Н-пирроло[2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и
амид 6-(пиридин-2-илсульфанил)-4Н-пирроло [2,3-d]тиазол-5-карбоновой кислоты.

6. Соединение по п.1 формулы (II), где L - СН.

7. Соединение по п.6, выбранное из группы, в которую входят:
амид 4-(пиридин-2-илсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(фенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(пиридин-4-илсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(3,5-дихлорфенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(тиофен-2-илсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(3-бромфенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(3-метоксифенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(2-метоксифенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты,
амид 4-(3-хлорфенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты и
амид 4-(3-метилфенилсульфанил)-6Н-тиено[2,3-b]пиррол-5-карбоновой кислоты.

8. Соединение по п.1 формулы (II), где L - N.

9. Соединение по п.8, выбранное из группы, в которую входят:
амид 2-метил-6-фенилсульфанил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-2-метил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-фторфенилсульфанил)-2-метил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-хлорфенилсульфанил)-2-метил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-(3-трифторметоксифенилсульфанил)-2-метил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 2,6-бис-фенилсульфанил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 2,6-бис-(3-метоксифенилсульфанил)-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты,
амид 6-фенилсульфанил-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты и
амид 6-(3-метоксифенилсульфанил)-4Н-пирроло[3,2-d]тиазол-5-карбоновой кислоты.

10. Фармацевтическая композиция, обладающая свойствами ингибитора казеинкиназы Iε, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и в качестве активного компонента соединение формулы (I) или формулы (II) по п.1, или таутомер указанного соединения или их фармацевтически приемлемую соль.

11. Способ ингибирования активности казеинкиназы Iε у пациента, включающий введение упомянутому пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы (I) или формулы (II)

где X - S;
R₁ - H;
R₂ - NR₅R₆;
R₃ - 5-6-членный гетероарил с 1 гетероатомом, выбранным из N и S, или фенил, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из галогена, амино, C₁-С₆-алкила, C₁-С₆-алкокси, C₁-С₆-галогеналкила и C₁-С₆-галогеналкокси;
R₄ - Н, C₁-С₆ алкил, C₁-С₆ алкокси или XR₃, где Х и R₃ определены выше;
R₅ - H;
R₆ - Н;
L - N или CR₇, где R₇ - Н;
М - S,
или их таутомера, или
их фармацевтически приемлемой соли.

12. Способ получения соединения формулы (I) или (II)

где Х - S;
R₁ - H;
R₂ - NR₅R₆;
R₃ - 5-6-членный гетероарил с 1 гетероатомом, выбранным из N и S, или фенил, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из галогена, амино, C₁-С₆-алкила, C₁-С₆-алкокси, C₁-С₆-галогеналкила и C₁-С₆-галогеналкокси;
R₄ - XR₃, где Х и R₃ определены выше;
R₅ - H;
R₆ - Н;
L - N;
M - S,
включающий взаимодействие соединения формулы 10 или формулы 13

где R₄ - галоген, a R₂ определен выше,
с соответствующим дифенилдисульфидом или дигетероарилдисульфидом в присутствии подходящего основания в подходящем полярном растворителе и
выделение соединения формулы (I) или формулы (II), как указано выше, где R₄ - XR₃.

13. Способ по п.12, где R₄ соединения формулы 10 или формулы 13 является бромом, в качестве основания используется карбонат цезия, полярным растворителем является диметилформамид, а указанное взаимодействие проводится при температуре 80-120°С в течение от 1 до 6 ч.