СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОССТАНАВЛИВАЮЩИХ САХАРОВ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/15 G01N33/02 

Изобретение относится к способам количественного определения восстанавливающих сахаров и может найти применение в фармации, пищевой промышленности.

В литературе описаны различные способы определения количественного содержания восстанавливающих сахаров. Известен способ количественного определения углеводов методом Бертрана, основанный на образовании осадка оксида меди (I) при кипячении пробы сахара с раствором Фелинга с последующим гравиметрическим определением осадка (Жданов Ю.А. Практикум по химии углеводов. - М.: ВШ, 1973). Ввиду того что выделяющийся при определении сахаров оксид меди (I) легко окисляется кислородом воздуха, малейшее несоблюдение методики определения приводит к неточным результатам. Описана методика количественного определения альдоз методом Вильштеттера и Шеделя, заключающаяся в окислении альдоз до альдоновых кислот щелочным раствором гипойодита натрия (Жданов Ю.А., 1973). Определению альдоз указанным методом мешает присутствие в растворе сахарозы или фруктозы. Известно микрохимическое определение сахаров, основанное на окислении углеводов перйодатом натрия до муравьиной кислоты, которая затем определяется методом кислотно-основного титрования в присутствии индикатора метилового красного (Жданов Ю.А., 1973). Данная методика позволяет определить очень малые количества углеводов (0,2-3 мг). Наиболее часто для количественного определения используется метод осаждения полисахаридов спиртом 95% с последующим гравиметрическим определением выделившегося осадка (Государственная фармакопея СССР. - М.: Медицина, 1990, XI изд., вып.2, ст.83). При обработке водного экстракта спиртом 95% происходит разбавление последнего, в результате чего низкомолекулярные фракции, входящие в состав полисахаридных препаратов, не осаждаются.

Описана методика определения восстанавливающих сахаров в пересчете на глюкозу в лекарственном препарате «Ламинарид», полученном из морской капусты (Чушенко В.Н. Исследование в области анализа полисахаридных препаратов: автореф. дис. … канд. фармац. наук. - Харьков, 1980. - 23 с.). Определение основано на кислотном гидролизе ламинарида до глюкозы, взаимодействии глюкозы с пикриновой кислотой в щелочной среде с образованием пикраминовой кислоты и последующем фотометрическом определении продукта реакции при длине волны 460 нм на фоне раствора сравнения, содержащего все те же реагенты, кроме ламинарида. Методика определения восстанавливающих сахаров указанным методом заключается в следующем: к навеске ламинарида массой около 0,1 г (точная навеска) приливают 5,0 мл 10% раствора серной кислоты, проводят гидролиз в колбе, соединенной с обратным холодильником, в течение 2 часов. Затем гидролизат охлаждают, количественно переносят в мерную колбу объемом 10 мл, объем раствора доводят водой до метки (раствор А). Далее 5 мл полученного раствора А помещают в стакан и нейтрализуют по бумаге конго: сначала 30% раствором едкого натра, затем 10% раствором серной кислоты и, наконец, снова 30% раствором едкого натра. Нейтрализованный раствор фильтруют через бумажный фильтр, переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят водой до метки (раствор В). В плоскодонную колбу вносят 1 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3 мл 20% раствора карбоната натрия и 1 мл раствора В; колбу нагревают в кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждают, содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу емкостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 460 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне раствора сравнения, состоящего из 1 мл воды, 1 мл 1% раствора пикриновой кислоты, 3 мл 20% раствора карбоната натрия, обработанного аналогично испытуемому раствору. Параллельно измеряют оптическую плотность при длине волны 460 нм 1 мл раствора рабочего стандартного образца (РСО) глюкозы, обработанного аналогично испытуемому раствору. Для приготовления раствора РСО глюкозы 0,14 г (точная навеска) глюкозы помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки, затем 10 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки. Данный способ количественного определения восстанавливающих сахаров наиболее близок к заявляемому способу и выбран за прототип.

Недостатками указанного способа являются:

- измерение оптической плотности анализируемого конечного раствора при длине волны 460 нм соответствует поглощению не продукта взаимодействия - пикраминовой кислоты, а той избыточной части пикриновой кислоты, которая не вступила в реакцию с глюкозой, т.е. измеренная при 460 нм оптическая плотность анализируемого раствора соответствует равновесной концентрации пикриновой кислоты, а не концентрации пикриновой кислоты, вступившей во взаимодействие с глюкозой, поэтому спектр поглощения имеет вид практически вертикальной прямой с последующим плавным убыванием плотности (фиг.1);

- величина оптической плотности анализируемого раствора, измеренная на фоне раствора сравнения, содержащего различные реагенты, в т.ч. и окрашенную пикриновую кислоту, находится в зависимости от концентрации, объема растворов пикриновой кислоты, в результате чего максимум поглощения анализируемых растворов не постоянен (варьирование максимума достигает до ±5,2 нм);

- использование очень маленькой навески препарата (0,1 г), мерных колб вместимостью 10 мл, точной навески глюкозы (0,1400 г) при приготовлении раствора РСО глюкозы, а также применение бумажного индикатора конго при нейтрализации гидролизатов существенно повышают погрешность анализа (2,22%).

Цель изобретения - количественное определение восстанавливающих сахаров методом спектрофотометрии при четко фиксированном максимуме поглощения для достижения высокой точности и хорошей воспроизводимости результатов анализа.

Поставленная цель достигается тем, что для количественного определения восстанавливающих сахаров методом спектрофотометрии навеску ламинарида или гранул ламинарида массой около 0,3 г (точная навеска) помещают в колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 15 мл 10% раствора кислоты серной, проводят гидролиз в колбе, соединенной с обратным холодильником, в течение 2 ч. Затем гидролизат охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, объем раствора доводят водой до метки. Далее 10 мл полученного раствора помещают в стакан и нейтрализуют сначала 30% раствором натра едкого до рН~9,7, затем 10% раствором кислоты серной до рН~3,5 и затем 30% раствором натра едкого до рН~8,9. Измерение рН растворов осуществляют с использованием рН-метра, в качестве ионоселективного электрода применяют стеклянный электрод, электродом сравнения служит хлорсеребряный электрод (Государственная фармакопея РФ. - М.: Научный центр экспертизы средств мед. применения, 2007, XII изд., часть 1, с.89-91). Нейтрализованный раствор фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл полученного раствора, 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой и 3 мл 20% раствора карбоната натрия; колбу с содержимым погружают в кипящую водяную баню на 10 мин, затем охлаждают и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 356 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне воды. Параллельно измеряют на фоне воды оптические плотности при длине волны 356 нм 1 мл раствора РСО глюкозы и 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой, обработанных аналогично испытуемому раствору. Для приготовления раствора PCO глюкозы навеску глюкозы массой около 0,14 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 60 мл воды, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают, затем 10 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Содержание восстанавливающих сахаров (С, %) вычисляют по формуле:

где a₁ - навеска глюкозы, в г;

а₂ - навеска полисахаридного препарата, в г;

D₁ - оптическая плотность раствора кислоты пикриновой;

D₂ - оптическая плотность раствора глюкозы;

D₃ - оптическая плотность испытуемого раствора;

W - потеря глюкозы в массе при высушивании навески, в %;

5000 - коэффициент, учитывающий разведения растворов при анализе.

В качестве анализируемых объектов использованы: ламинарид, содержащий полисахариды (ламинаран, альгиновую кислоту, ее кальциевые, натриевые соли), аминокислоты, спирт (маннит) (Кайшева Н.Ш. Исследование природных полиуронидов и получение лекарственных средств на их основе: автореф. дис. … докт. фармац. наук. - Пятигорск, 2004. - 46 с.), и гранулы ламинарида, содержащие 20% ламинарида и 80% сахарозы (ФС 42-2466-87 «Гранулы ламинарида»).

В основе количественного определения восстанавливающих сахаров в способе-прототипе и в заявляемом способе лежит окислительно-восстановительная реакция взаимодействия пикриновой кислоты с глюкозой в щелочной среде (Коренман И.М. Методы определения органических соединений. / Под ред. А.К.Бабко. - М.: Химия, 1970. - С.231-232):

В данной реакции глюкоза является восстановителем, пикриновая кислота - окислителем. В результате гидролиза ламинарида образуется глюкоза, которая реагирует с пикриновой кислотой. Для пикраминовой кислоты Е^1% _{1 см}=427,14; ε=8,5·10³ (Коренман И.М., 1970), для пикриновой кислоты Е^1% _{1 см}=611,35; ε=1,4·10⁴.

Спектры поглощения продуктов взаимодействия пикриновой кислоты с РСО глюкозы (кривая 1) и с гидролизатом ламинарида (кривая 2) на фоне раствора сравнения (по способу-прототипу) приведены на фиг.1. Как видно из этой фигуры, увеличение оптической плотности растворов происходит строго по вертикали, а снижение плотности происходит плавно по наклонной кривой. Поскольку фотометрируемые растворы не имеют фиксированного максимума поглощения при 460 нм (он может варьировать на несколько нм в каждом конкретном случае), то определение плотности при 460 нм, не всегда соответствующей максимуму поглощения, может дать низкое значение плотности, а соответственно, и концентрации определяемых растворов. Если бы спектральные кривые имели вид плавных кривых, то измерение плотности вблизи (а не точно) максимума поглощения незначительно сказалось бы на результатах анализа. Варьирование максимума поглощения около 460 нм в дифференциальных спектрах связано с концентрацией, объемом растворов пикриновой кислоты и др. факторами. Подтверждением этому являются результаты, полученные по способу-прототипу и приведенные в табл.1 для различных серий ламинарида и гранул ламинарида. Как показывают данные табл.1, растворы, фотометрируемые на фоне растворов сравнения, имеют относительно непостоянные максимумы светопоглощения (Δλ для ламинарида составляет в среднем 5,22 нм, для гранул ламинарида 3,74 нм, для РСО глюкозы 4,34-4,94 нм), что сказывается на величине оптической плотности (ΔD соответственно 0,09147; 0,03027; 0,02990-0,03804) и, следовательно, на количественном содержании восстанавливающих сахаров (в среднем содержание сахаров колеблется в пределах 1,88% для ламинарида, 0,60% для гранул ламинарида). Если учесть, что нормативное содержание восстанавливающих сахаров в ламинариде должно быть не менее 18%, в гранулах ламинарида - не менее 3,2%, то варьирование содержания сахаров в зависимости от выбранной длины волны составляет для ламинарида 10,4%, для гранул ламинарида - 18,75%. При этом изменение добавляемых объемов растворов пикриновой кислоты, гидролизатов ламинарида, растворов глюкозы существенно влияет на сдвиг максимумов поглощения, а выявление максимумов поглощения для количественного анализа каждого фотометрируемого раствора недопустимо. Поэтому целесообразнее проводить измерение оптической плотности анализируемых растворов на фоне воды (постоянного компонента), а не раствора, содержащего пикриновую кислоту. Кроме того, использование большого избытка окрашенного раствора пикриновой кислоты ухудшает компенсацию в приборе, повышая нагрузку на него (фиг.2), что не позволяет получить сопоставимые результаты.

По способу-прототипу к 1 мл раствора глюкозы (5,6·10^-4 г или 3,111·10^-6 моль) добавляется 1 мл 1% раствора пикриновой кислоты (0,01 г или 4,367·10^-5 моль), т.е. молярное соотношение между глюкозой и пикриновой кислотой составляет 1:14, в то время как по уравнению реакции это соотношение должно быть 3:1 или 1:0,33. Такой 42-кратный избыток пикриновой кислоты недопустим, т.к., с одной стороны, это приводит к смещению максимума светопоглощения фотометрируемого раствора при измерении дифференциальных спектров (по прототипу) и, с другой стороны, повышает нагрузку на спектрофотометр, не позволяя получить точные результаты. В заявляемом способе предлагается использовать реагенты - глюкозу и пикриновую кислоту в молярном соотношении 1:2,8. Для достижения такого соотношения берется 1 мл раствора ламинарида (содержащего примерно 7·10^-6 моль глюкозы) и 0,2 мл 1% раствора пикриновой кислоты (в 1 мл раствора 8,734·10^-6 моль кислоты). При этом 8-кратный избыток пикриновой кислоты по сравнению с требуемым соотношением по уравнению реакции достаточен при анализе препаратов, содержащих около или более 50% восстанавливающих сахаров. Применение меньших объемов растворов пикриновой кислоты улучшает компенсацию в приборе, в результате чего независимо от марки прибора можно получить сопоставимые или достаточно воспроизводимые результаты. Использование большого избытка растворов пикриновой кислоты приводит к снижению показателей поглощения пикриновой кислоты (Е^1% _{1 см}=27,24; ε=623,8), а значит, и к снижению чувствительности определений.

Водный раствор пикриновой кислоты имеет максимум поглощения при 356 нм - максимум, характерный для хромофорных групп (трех нитрогрупп) пикриновой кислоты (Коренман И.М. Методы определения органических соединений. - М.: Химия, 1970. - С.126, 315). Глюкоза в водном растворе не имеет максимумов поглощения. После взаимодействия пикриновой кислоты с глюкозой или гидролизатом ламинарида концентрация пикриновой кислоты в растворе уменьшается, в результате чего оптическая плотность при максимуме 356 нм соответственно снижается. Эта разница оптической плотности соответствует той концентрации пикриновой кислоты, которая вступила в реакцию. При этом для пикриновой кислоты и продуктов ее взаимодействия по предлагаемому способу анализа на фоне воды наблюдаются четко фиксированные максимумы поглощения (фиг.3). В области спектра около 460 нм наблюдается незначительное расхождение кривых 1 и 2, 3 (отмечено стрелками), и именно на этом участке фактически происходит измерение оптической плотности в способе-прототипе, т.е. находится разница между поглощением пикриновой кислоты (кривая 1) и продуктом взаимодействия пикриновой кислоты с глюкозой или ламинаридом (кривые 2 и 3 соответственно), что соответствует равновесной концентрации пикриновой кислоты. В заявляемом способе количественное определение проводится за счет снижения оптической плотности исходной пикриновой кислоты в результате ее взаимодействия с глюкозой или ламинаридом. Учитывая потерю в массе при высушивании исследуемого образца ламинарида (9,52%), количественное содержание восстанавливающих сахаров составило 49,23%. Как видно из фиг.3, положение максимумов поглощения исследованных веществ на фоне воды практически совпадает. Аналогичные результаты получены при анализе других серий ламинарида и гранул ламинарида (табл.2).

Как показывают данные табл.2, фотометрируемые растворы на фоне воды, приготовленные по предлагаемой методике, имеют относительно постоянные максимумы светопоглощения.

Авторами определены метрологические характеристики по установлению максимума светопоглощения фотометрируемых растворов по способу, принятому за прототип, и предлагаемому способу (табл.3). Как показывают данные табл.3, отклонение максимума поглощения от среднего значения в способе-прототипе составляет 1,98 нм, а в заявляемом способе 0,19 нм. Поскольку в дифференциальных спектрах (способ-прототип) наблюдается крутой, практически вертикальный подъем оптической плотности (фиг.1), а в спектрах, полученных по абсолютному поглощению (заявляемый способ, фиг.3), - плавное изменение кривой, то даже незначительное отклонение от максимума в сторону длинноволновой части спектра покажет очень низкое значение плотности и, соответственно, концентрации растворов в способе-прототипе и практически не скажется при использовании спектрофотометрии.

Использование меньшего избытка растворов пикриновой кислоты и более разбавленных растворов в предлагаемом способе приводит к увеличению показателей поглощения пикриновой кислоты (Е^1% _{1 см}=82,48; ε=1888,8), а значит, и к повышению чувствительности определений в 3 раза по сравнению со способом-прототипом.

В предлагаемой методике введены, кроме указанных выше изменений, и некоторые другие изменения:

1. навеска субстанции ламинарида увеличена от 0,1 г (прототип) до 0,3 г (предлагаемый способ), т.к. при количественных определениях целесообразно использовать большую навеску для повышения точности анализа (Государственная фармакопея СССР. - М.: Медицина, 1968. - Х издание); соответственно в 3 раза увеличен объем 10% раствора серной кислоты для гидролиза;

2. мерные колбы емкостью 10 мл (прототип) заменены мерными колбами вместимостью 50 мл (предлагаемый способ); объем аликвотной части раствора увеличен с 5 мл до 10 мл; измерение рН растворов осуществлено не по бумаге конго (во время нейтрализации она ветшает, и переход окраски размыт), а с помощью рН-метра; точное взвешивание навески РСО глюкозы массой 0,1400 г заменено взятием навески около 0,14 г (точная навеска), масса которой учитывается в расчетной формуле.

Эти изменения существенно облегчают работу аналитика и способствуют снижению погрешности анализа (табл.4). Как показывают данные табл.4, погрешность известного способа превышает таковую заявляемого способа в 3 раза.

Способ количественного определения восстанавливающих сахаров поясняется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Около 0,3 г ламинарида (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 15 мл 10% раствора кислоты серной, доводят раствор до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры и содержимое ее количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают. Далее 10 мл полученного раствора помещают в стакан и нейтрализуют сначала 30% раствором натра едкого до рН 9,69, затем 10% раствором кислоты серной до рН 3,49 и, наконец, 30% раствором натра едкого до рН 8,85. Измерение рН растворов осуществляют с использованием рН-метра, в качестве ионоселективного электрода применяют стеклянный электрод, электродом сравнения служит хлорсеребряный электрод (Гос. фармакопея РФ, 2007. - XII изд., часть 1. - С.89-91). Нейтрализованный раствор фильтруют через складчатый бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл полученного раствора, 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой и 3 мл 20% раствора карбоната натрия; колбу с содержимым погружают в кипящую водяную баню на 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре марки «Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 20» при длине волны 356 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне воды.

Параллельно измеряют на фоне воды оптические плотности при длине волны 356 нм 1 мл раствора РСО глюкозы и 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой, обработанных аналогично испытуемому раствору. Для приготовления раствора РСО глюкозы навеску глюкозы (высушенной до постоянной массы при температуре 100±5°С) массой около 0,14 г (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 60 мл воды, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают, затем 10 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят водой до метки.

Результаты анализа:

а₁=0,1700 г, а₂=0,3047 г, W=9,52%, D₁=0,97988, D₂=0,94610, D₃=0,92594. Содержание восстанавливающих сахаров в ламинариде:

Для пикриновой кислоты: E^1% _{1 см}=115,74; ε=2650,4.

Пример 2. Около 0,3 г (точная навеска) порошка растертых гранул ламинарида помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 15 мл 10% раствора кислоты серной, доводят раствор до кипения и кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры и содержимое ее количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и тщательно перемешивают. Далее 10 мл полученного раствора помещают в стакан и нейтрализуют сначала 30% раствором натра едкого до рН 9,69, затем 10% раствором кислоты серной до рН 3,49 и, наконец, 30% раствором натра едкого до рН 8,85. Измерение рН растворов осуществляют с использованием рН-метра, в качестве ионоселективного электрода применяют стеклянный электрод, электродом сравнения служит хлорсеребряный электрод (Гос. фармакопея РФ, 2007, XII изд., часть 1, с.89-91). Нейтрализованный раствор фильтруют через складчатый бумажный фильтр «синяя лента» в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора водой до метки. В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл полученного раствора, 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой и 3 мл 20% раствора карбоната натрия; колбу с содержимым погружают в кипящую водяную баню на 10 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят объем раствора водой до метки. Измеряют оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре марки «Perkin Elmer UV/VIS Spectrometer Lambda 20» при длине волны 356 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне воды.

Параллельно измеряют на фоне воды оптические плотности при длине волны 356 нм 1 мл раствора РСО глюкозы и 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой, обработанных аналогично испытуемому раствору. Раствор РСО глюкозы готовят, как описано в примере 1.

Результаты анализа:

а₁=0,1538 г, а₂=0,3106 г, W=6,63%, D₁=0,58438, D₂=0,55899, D₃=0,54885. Содержание восстанавливающих сахаров в гранулах ламинарида:

Для пикриновой кислоты: Е^1% _{1 см}=70,8; ε=1621,4.

Таким образом, положительный эффект предлагаемого способа заключается в следующем.

1. Применение спектрофотометрии при измерении оптической плотности фотометрируемых растворов, т.е. измерение плотности на фоне воды, позволяет получить четко фиксированный максимум поглощения при длине волны 356±0,19 нм, в то время как при использовании дифференциальной спектрофотометрии (измерение оптической плотности на фоне раствора, содержащего все те же реагенты, кроме анализируемого) наблюдается варьирование максимума при 463±1,98 нм. Отклонение положения максимума в способе-прототипе в 10 раз превосходит отклонение в заявляемом способе. Поскольку в дифференциальном спектре наблюдается крутой, практически вертикальный подъем плотности, то даже незначительное отклонение от максимума в сторону длинноволновой части спектра резко скажется на величине плотности и, следовательно, концентрации. В случае получения спектров по заявляемому способу спектральная кривая имеет вид плавной кривой, и отклонения положения максимума незначительно влияют на определение концентрации растворов. Варьирование максимумов в способе-прототипе объясняется использованием в составе раствора сравнения окрашенного вещества - пикриновой кислоты, в то время как в предлагаемом способе применяется относительно постоянное (независимо от концентрации, объема и др.) вещество - вода. В среднем количественное содержание восстанавливающих сахаров в зависимости от измерения при истинном и среднем максимуме поглощения по известному способу колеблется для ламинарида и гранул ламинарида соответственно на 1,88 и 0,60%; это составляет 10,40 и 18,75% соответственно от нормативного содержания сахаров. Выявление максимума поглощения в каждом конкретном растворе при количественном определении недопустимо. Предлагаемый способ позволяет проводить измерение плотности при четко фиксированном максимуме.

2. Заявляемый способ позволяет проводить определение сахаров по концентрации пикриновой кислоты, вступившей в реакцию с сахарами (по убыли концентрации пикриновой кислоты) при 356 нм, в то время как известный способ предполагает определение равновесной концентрации пикриновой кислоты, т.е. той концентрации, которая не вступила в реакцию, на незначительном участке расхождения кривых (фиг.3).

3. Заявляемый способ предлагает использование 8-кратного избытка пикриновой кислоты (а не 42-кратного, как по способу-прототипу), что достаточно для анализа углеводов и приводит к лучшей компенсации в приборе, снижая на него нагрузку. При этом достигается удовлетворительная воспроизводимость и сопоставимость результатов.

4. Введенные в предлагаемую методику анализа коррективы (увеличение навески ламинарида; замена мерных колб вместимостью 10 мл колбами емкостью 50 мл; контроль рН растворов не по бумаге конго, а с помощью рН-метра; взятие навески глюкозы около 0,14 г по точной массе; увеличение объемов растворов кислоты серной для гидролиза и аликвотных частей гидролизата) позволяют не только снизить погрешность определений, но и облегчить работу аналитика. Если по способу-прототипу ε пикриновой кислоты составляет 623,8, то по предлагаемому способу он составляет 1888,8, что свидетельствует о повышении чувствительности анализа.

5. Погрешность заявляемого способа определения в 3 раза ниже погрешности известного способа (соответственно ±0,74 и 2,22%).

Таблица 1 Данные о максимумах поглощения растворов и содержании восстанавливающих сахаров с помощью дифференциальных спектров на различных сериях ламинарида по способу-прототипу № Препарат Масса, г Потеря в массе при высушива-
нии, % Определение при λmax Определение при λ=460 нм Разность определений λmax, нм D при λmax C, % D₄₆₀ С, % Δλ, нм ΔD ΔC, % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 I Ламинарид 0,3047 9,52 466,03 0,95871 51,23 0,8445 48,88 6,03 0,11421 2,35 Глюкоза 0,1700   466,08 0,57703   0,53266   6,08 0,04437   II Ламинарид 0,2947 9,52 467,06 1,00470 50,72 0,80715 45,68 7,06 0,19755 5,04 Глюкоза 0,1538   465,10 0,57130   0,50960   5,10 0,06170   III Ламинарид 0,3021 6,1 466,89 0,62320 30,54 0,56910 30,42 6,89 0,0541 0,12 Глюкоза 0,1538   465,40 0,55319   0,50710   5,40 0,04609   IV * Ламинарид 0,3021 6,1 459,11 0,42761 26,51 0,42761 26,51 0,89 - - * Глюкоза 0,1538   459,23 0,43720   0,43720   0,77 -   V Гранулы ламинарида 0,3167 2,69 463,17 0,40710 8,16 0,38678 10,32 3,17 0,02032 2,16 Глюкоза 0,1600   474,03 0,40669   0,30563   14,03 0,10106   VII *** Гранулы ламинарида 0,3167 2,69 452,98 0,02374 5,39 0,02299 5,38 7,02 0,00075 0,01 *** Глюкоза 0,1600   466,07 0,03590   0,03486   6,07 0,00104   VIII Гранулы ламинарида 0,3167 2,69 465,64 0,43082 6,66 0,39193 6,87 5,64 0,03889 0,21 Глюкоза 0,1538   465,58 0,50729   0,44696   5,58 0,06033  

Продолжение таблицы 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 IX * Гранулы ламинарида 0,3167 2,69 456,32 0,36519 6,47 0,26318 4,67 3,68 0,10201 1,80 * Глюкоза 0,1538   461,08 0,44207   0,44145   1,08 0,00062   X Гранулы ламинарида 0,3155 6,63 465,25 0,59315 8,19 0,54320 8,19 5,25 0,04995 - Глюкоза 0,1538   465,40 0,55319   0,50710   5,40 0,04609   XI * Гранулы ламинарида 0,3155 6,63 461,06 0,38872 6,79 0,38872 6,79 1,06 - - * Глюкоза 0,1538   459,23 0,43720   0,43720   0,77 -   Примечание: * - в опыте использовано по 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой ** - в опыте использовано по 0,1 мл 1% раствора кислоты пикриновой и по 2 мл раствора ламинарида и глюкозы *** - в опыте использовано по 0,1 мл 1% раствора кислоты пикриновой и по 0,1 мл раствора ламинарида и глюкозы

Таблица 2 Данные о положении максимумов поглощения фотометрируемых растворов и содержании восстанавливающих сахаров на различных сериях ламинарида по предлагаемому способу № Препарат Масса, г Потеря в массе при высушивании, % λmax, нм D C, % I Ламинарид 0,3047 9,52 356,15 0,92594 49,23 Глюкоза 0,1700   355,98 0,94610   Пикриновая кислота     355,97 0,97988   II Ламинарид 0,2947 9,52 356,65 0,59894 47,32 Глюкоза 0,1538   355,89 0,61388   Пикриновая кислота     355,50 0,63719   III Ламинарид 0,3021 6,1 356,85 0,55890 27,20 Глюкоза 0,1538   356,11 0,55899   Пикриновая кислота     355,93 0,58438   IV Ламинарид 0,3022 6,1 356,02 0,55558 31,15 Глюкоза 0,1538   355,73 0,55948   Пикриновая кислота     355,90 0,58561   V Гранулы ламинарида 0,3155 6,63 356,72 0,55683 8,29 Глюкоза 0,1538   356,11 0,55899   Пикриновая кислота     355,93 0,58438   VI Гранулы ламинарида 0,3017 2,69 356,81 0,56642 5,93 Глюкоза 0,1600   355,89 0,55881   Пикриновая кислота     355,92 0,58673  

Таблица 3 Метрологические характеристики по установлению максимума светопоглощения (х, нм) Способ-прототип Заявляемый способ P=95% Р=95% n=22 n=18 t=2,08 t=2,11 ε=0,43% ε=0,05% Примечание: - среднее значение максимума светопоглощения раствора, - стандартная ошибка определений, Р - вероятность, n - число испытаний в серии, t - критерий Стьюдента, ε - относительная точность результата испытания, - доверительный интервал.

Таблица 4 Метрологические характеристики известного и заявляемого способов количественного определения восстанавливающих сахаров (X, %) в ламинариде Способ-прототип Заявляемый способ P=95% P=95% n=10 n=10 t=2,26 t=2,26 ε=4,64% ε=1,53%

Изобретение относится к фармацевтике и пищевой промышленности. Проводят кислотный гидролиз 0,3 г ламинарида или гранул ламинарида 15 мл 10% серной кислотой, объем гидролизата доводят до 50 мл. Берут объем аликвотной части раствора 10 мл и нейтрализуют его сначала едким натром до рН 9,7, затем раствором серной кислоты до рН 3,5, затем раствором едкого натра до рН 8,9, рН растворов контролируют потенциометрически. Проводят фильтрацию, объем фильтрата доводят водой до 25 мл, 1 мл полученного раствора обрабатывают 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой в присутствии 3 мл 20% раствора карбоната натрия при нагревании. Объем раствора доводят до 25 мл и измеряют оптическую плотность на фоне воды спектрофотометрически при длине волны 356 нм с одновременным измерением оптической плотности в этих же условиях 0,2 мл 1% раствора кислоты пикриновой и раствора глюкозы. Содержание восстанавливающих сахаров (С,%) вычисляют по формуле:

где a₁ - навеска глюкозы, в г;

а₂ - навеска полисахаридного препарата, в г;

D₁- оптическая плотность раствора кислоты пикриновой;

D₂ - оптическая плотность раствора глюкозы;

D₃ - оптическая плотность испытуемого раствора;

W - потеря глюкозы в массе при высушивании, в %;

5000 - коэффициент, учитывающий разведения растворов при анализе.

Изобретение позволяет повысить точность и воспроизводимость результатов. 3 ил., 4 табл.

Способ количественного определения восстанавливающих сахаров, отличающийся тем, что проводят кислотный гидролиз 0,3 г ламинарида или гранул ламинарида 15 мл 10%-ной серной кислотой, объем гидролизата доводят до 50 мл, берут объем аликвотной части раствора 10 мл и нейтрализуют его сначала едким натром до рН 9,7, затем раствором серной кислоты до рН 3,5, затем раствором едкого натра до рН 8,9, рН растворов контролируют потенциометрически, проводят фильтрацию, объем фильтрата доводят водой до 25 мл, 1 мл полученного раствора обрабатывают 0,2 мл 1%-ного раствора кислоты пикриновой в присутствии 3 мл 20%-ного раствора карбоната натрия при нагревании, объем раствора доводят до 25 мл и измеряют оптическую плотность на фоне воды спектрофотометрически при длине волны 356 нм с одновременным измерением оптической плотности в этих же условиях 0,2 мл 1%-ного раствора кислоты пикриновой и раствора глюкозы, при этом содержание восстанавливающих сахаров (С, %) вычисляют по формуле
,
где a₁ - навеска глюкозы, г;
а₂ - навеска полисахаридного препарата, г;
D₁ - оптическая плотность раствора кислоты пикриновой;
D₂ - оптическая плотность раствора глюкозы;
D₃ - оптическая плотность испытуемого раствора;
W - потеря глюкозы в массе при высушивании, %;
5000 - коэффициент, учитывающий разведения растворов при анализе.