БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ МОРСКОЙ ВОДЫ ОТ НЕФТИ Российский патент 2010 года по МПК C02F3/34 C12N1/26 

Изобретение относится к средствам борьбы с нефтяным загрязнением и может быть использовано для очистки морской воды от нефти. Биопрепарат представлен в жидкой и сухой формах, создан на основе углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 с титром клеток 10⁹ / мл/г. В состав жидкого препарата входят биомасса штамма и жидкая питательная среда, содержащая источники азота, калия, фосфора и магния. Сухая форма биопрепарата содержит штамм, иммобилизованный в поры носителя, в качестве которого используют стерильный адсорбент вермикулитовый вспученный. Биопрепарат эффективно и в короткий срок утилизирует нефтяные углеводороды, в том числе полиядерные ароматические.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предлагаемое изобретение относится к средствам борьбы с нефтяным загрязнением и может быть использовано для очистки морской воды от нефти.

Известны разнообразные биопрепараты на основе нефтеокисляющих микроорганизмов и их ассоциаций, предназначенные для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов (а.с. СССР №1076446, 1982; патенты РФ 2023686, 1994; 2122980, 1998; 2174496, 2001; 2191753, 2002; 2191752, 2002).

Наиболее близким к предлагаемому биопрепарату является биопрепарат «Авалон» (патент РФ №2181701, кл. C02F 3/34, С12Р 39/00, В09С 1/20, C12N 1/20, 2002), который содержит пористый носитель в виде вспененных стеклообразных метафосфатов переменного состава и штаммы микроорганизмов-деструкторов нефти (Serratia marcescens PL-1, Pseudomonas fluorescens biovar II 10-1, Acidovorax delafieldii 3-1), взятый нами за прототип.

Его недостатком является то, что предлагаемые микроорганизмы могут быть патогенными и применение биопрепарата может представлять опасность в медицинском и санитарно-гигиеническом отношении. Кроме того прототип предлагает к использованию коллекционные штаммы, а с точки зрения экологической безопасности и эффективности в состав биопрепаратов должны входить аборигенные микроорганизмы, свойственные конкретному очищаемому от нефти объекту.

Задачей изобретения является разработка такого биопрепарата для очистки морской воды от нефти, который позволил бы обеспечить экологическую, медицинскую и санитарно-гигиеническую безопасность его применения.

Это достигается за счет того, что в качестве биодеструктора используют углеводородокисляющий бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выделенный из вод Северного Каспия, отобранных в районе разведочного бурения нефтяных скважин. Филогенетическое положение штамма проведено на основании секвенирования гена 16S рРНК 6 Центре "Биоинженерия" РАН и ИНМИ РАН.

Данный штамм защищен патентом (2268934) и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер ВКПМ В-9079).

Штамм не токсичен, не обладает вирулентными и токсигенными свойствами, не диссеминирует во внутренних органах лабораторных животных.

Анализ литературных данных и известных технических решений показывает, что не имеется сведений о биопрепаратах для очистки объектов окружающей среды от нефтяного загрязнения с использованием бактерий рода Phyllobacterium. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условиям патентоспособности "новизна", "изобретательский уровень".

В качестве деструктора нефти используют бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Хранение штамма осуществляют на агаризованной питательной среде (МПА) с Периодическими пересевами (3-4 раза в год). Инкубирование после пересева ведут при температуре 28°С в течение 3-4 дней, затем культуру хранят в холодильнике при температуре 4°С, а также в лиофилизированном состоянии в ампулах.

Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками: Грамвариабельные прямые подвижные палочки, спор не образуют. Образуют на МПА круглые, выпуклые, блестящие, слизистые, 1-2 мм в диаметре колонии с ровными краями от светло-розового до красного цвета. Оксидазоположительный, каталазоположительный, галотолерантный (рост в интервале солености 0,05-20% NaCl), не гидролизует крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижает желатин, не образует сероводород и индол, восстанавливает нитраты в нитриты, образует кислоту из глюкозы, не окисляет лактозу. Не имеет аргининдегидролазы, лизин- и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, β-галактозидазы, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Способен к росту на средах Чапека, Миллса, Кинга, магниево-калиево-дрожжевой (МКД), Маккланга, на средах, приготовленных на основе отрубей, мелассы, кукурузного, мясного или дрожжевого экстрактов, картофельного или горохового отваров как с добавлением дизельного топлива и нефти, так и без добавления.

Бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, выращиваемый на стандартных средах и средах с добавлением морской соли, способен размножаться и деградировать до 96% углеводородов за 30 суток в диапазоне солености 0,05-20,0%.

В первом примере биопрепарат представлен в жидкой форме, в состав которого входят биомасса углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 и жидкая питательная среда.

Для получения посевного материала указанного штамма используют жидкую питательную среду следующего состава, г/л воды: пептон - 10,0; сахароза - 10,0; KH₂PO₄ - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,3.

Приготовленную жидкую среду разливают в качалочные колбы по 100 мл, при этом объем качалочной колбы - 750 мл. Среду засевают смывом с одного косяка и колбу помещают на качалку при 220 об/мин с температурой 28-30°С на 72 часа. Получают титр 0,5-1,0 млрд/мл. Для достижения титра около 1-2×10⁹ КОЕ/мл время культивирования - 96 часов.

Посевной материал можно хранить в холодильнике до 1 месяца при температуре плюс 4-6°С.

Посевной материал вносят в ферментер и проводят глубинное культивирование в аэробных условиях при температуре 28-30°С с постоянно работающей мешалкой при коэффициенте заполнения 0,8 на среде следующего состава (г/л воды): кукурузный экстракт - 10,0; сахароза - 10,0; KH₂PO₄ - 0,5; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄×7H₂O - 0,3; рН=7,5.

Полученный в ферментерах концентрат суспензии штамма разводят стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; меласса - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5; pH=7,5.

Сухая форма биопрепарата включает стерильный субстрат - носитель адсорбент вермикулитовый вспученный, в поры которого искусственно иммобилизован штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1. Для этого субстрат-носитель в пакетах инокулируют смесью концентрата суспензии штамма, 15% стерильного раствора мелассы и воды, взятых в соотношении 1:1:1. Исходный титр инокулированного субстрата-носителя составляет 20×10⁶ КОЕ/г. Осуществляют дополнительное поверхностное культивирование штамма на субстрате-носителе в течение 3-5 дней при 18-20°С.

Для испытания эффективности очистки от нефтяного загрязнения при помощи различных форм биопрепарата были созданы модельные экосистемы с имитацией аварийного разлива нефти в море. Для этого были использованы 20-литровые сосуды, содержащие 15 литров морской воды, отобранной на лицензионном участке ООО «Лукойл-Нижневолжскнефть» Северного Каспия, в которые вносили 1% (по объему) сырой каспийской нефти. В результате была создана модель нефтяного разлива на поверхности морской воды.

Пример 1. Очистка жидкой формой биопрепарата

На поверхность нефтяного разлива в созданных модельных экосистемах с морской водой распыляли жидкий биопрепарат на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 в количестве 20 мл/л (титр клеток 10⁹ /мл).

Контроль моделировал процесс естественного самоочищения за счет физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры воды. Для этого в модельные системы с морской водой и нефтью биопрепарат не вносили.

Экспериментальные системы выдерживали при естественном освещении и свободном газообмене с постоянным перемешиванием в течение 15 суток.

Для испытания деструкционных способностей биопрепарата определяли содержание суммарных нефтяных углеводородов в воде флуориметрическим методом, а также уровень полиядерных ароматических углеводородов.

Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех вариантах опыта составило 9,36 г/л.

Через 15 суток очистки жидким биопрепаратом убыль суммарных нефтяных углеводородов составила 84,1%, что на 49,4% превышает аналогичный показатель в сравнении с контролем, где разрушение нефтяных углеводородов происходит в результате физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры морской воды. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1 Убыль углеводородов в ходе испытаний биопрепарата, % Варианты модельных систем Продолжительность эксперимента, сутки 3 7 15 Контроль 23,6 27,1 34,7 С внесением жидкого биопрепарата 49,5 51,7 84,1

К числу наиболее токсичных и канцерогенных компонентов нефти относятся полиядерные ароматические углеводороды (ПАУ), уровень суммарного содержания которых в начале эксперимента составил 260,2 мкг/л.

Применение жидкой формы биопрепарата снизило суммарное содержание ПАУ на 75,2%, что на 33,7% эффективнее по сравнению с контролем. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Убыль полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ) через 15 сут эксперимента, % показатели контроль с внесением жидкого биопрепарата Нафталин 63,3 97,6 2-метилнафталин 59,6 97,5 Бифенил 17,1 68,5 Аценафтилен 28,9 54,0 Аценафтен 11,8 71,0 Флуорен 13,3 55,6 Фенантрен 26,0 37,3 Антрацен 22,4 47,2 Флуорантен 26,9 60,0 Пирен 27,8 57,5 Хризен 19,1 52,4 Бенз(а)антрацен 20,3 53,6 Бенз(а)пирен 7,3 56,0 Дибенз(а,h)антрацен 42,0 64,5 Сумма 41,5 75,2

В ходе испытаний биопрепарата были отмечены такие эффекты его действия, как исчезновение радужной пленки, присутствующей в начале эксперимента, образование хлопьевидных скоплений деструктированной нефти, более половины площади воды, свободной от загрязнения. В контрольных вариантах без внесения биопрепарата подобных эффектов не наблюдалось.

Пример 2. Очистка сухой формой биопрепарата

На поверхность нефтяного разлива в созданных модельных экосистемах с морской водой распыляли стерильный адсорбент вермикулитовый вспученный в количестве 1 г/л для моделирования физико-химической адсорбции нефти. На поверхность других экспериментальных сосудов с нефтяной пленкой наносили сухой биопрепарат на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 на субстрате-носителе (адсорбенте вермикулитовом вспученном) в количестве 1 г/л (титр клеток 10⁹/г).

Контроль моделировал процесс естественного самоочищения за счет физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры воды. Для этого в модельные системы с морской водой и нефтью биопрепарат не вносили.

Экспериментальные системы выдерживали при естественном освещении и свободном газообмене с постоянным перемешиванием в течение 15 суток.

Для испытания деструкционных способностей биопрепарата определяли содержание в воде суммарных нефтяных углеводородов флуориметрическим методом, а также уровень полиядерных ароматических углеводородов.

Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех вариантах опыта составило 9,36 г/л.

При внесении сухого биопрепарата на поверхность воды он некоторое время не тонет, адсорбирует на себе нефтяную пленку, но не насыщается при этом водой. Через сутки часть препарата оседает на дно и функционирует как деструктор нефтяного загрязнения, эмульгированного в водной толще.

Через 3 суток после нанесения биопрепарата на водную поверхность, загрязненную нефтью, вокруг частиц биопрепарата образовалась бактериальная пленка, что свидетельствует о том, что он является для микроорганизмов источником питания. Через 15 суток на поверхности воды полностью отсутствовала радужная пленка.

Испытания показали, что использование адсорбента лишь на 1,2% ускорило процесс естественного самоочищения морской воды от нефтяных углеводородов. Применение сухого биопрепарата на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 на субстрате-носителе было более эффективно, и убыль нефтяных углеводородов в течение 15 суток составила 78,1%, что на 43,4% превышала аналогичный показатель в контроле, где деструкция происходит в результате физико-химических процессов и деятельности аборигенной микрофлоры морской воды. Использование сухого биопрепарата на 42,2% эффективнее, чем очистка адсорбентом. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Убыль углеводородов в ходе испытаний биопрепарата, % Варианты модельных систем Продолжительность эксперимента, сутки 3 7 15 Контроль 23,6 27,1 34,7 С внесением адсорбента 23,4 32,2 35,9 С внесением сухого биопрепарата 45,4 47,4 78,1

Уровень суммарного содержания полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ) в начале эксперимента составлял 260,2 мкг/л.

Использование адсорбента снизило их содержание через 15 суток на 62,8%, что на 21,3% больше, чем в контроле за счет процесса естественного самоочищения морской воды. Эффективность очистки от ПАУ через 15 суток с применением сухой формы биопрепарата на основе штамма Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 на субстрате-носителе составила 76,9%, что на 35,4% и 14,1% результативнее по сравнению с контролем и применением адсорбента соответственно. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 Убыль полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ) через 15 сут эксперимента, % Показатели Контроль С внесением адсорбента С внесением сухого биопрепарата Нафталин 63,3 69,7 98,3 2-метилнафталин 59,6 91,3 98,1 Бифенил 17,1 58,5 74,0 Аценафтилен 28,9 46,1 59,4 Аценафтен 11,8 26,2 40,8 Флуорен 13,3 52,6 55,1 Фенантрен 26,0 27,6 49,1 Антрацен 22,4 38,4 42,3 Флуорантен 26,9 52,0 59,4 Пирен 27,8 55,9 71,8 Хризен 19,1 50,8 69,0 Бенз(а)антрацен 20,3 53,2 75,2 Бенз(а)пирен 7,3 15,7 35,6 Дибенз(а,h)антрацен 42,0 48,2 58,9 Сумма 41,5 62,8 76,9

Через 15 суток применения биопрепарата отмечено исчезновение радужной пленки, присутствующей в начале эксперимента, образование хлопьевидных скоплений деструктированной нефти, более половины площади воды, свободной от загрязнения. В контрольных вариантах без внесения биопрепарата, а также лишь адсорбента подобных эффектов не наблюдалось.

Таким образом, проведенные испытания предлагаемого биопрепарата показали, что он эффективно и в короткий срок утилизирует нефтяные углеводороды, в том числе полиядерные ароматические, которые более токсичны для живой природы. Бактериальный штамм Phyllobacterium myrsinacearum, входящий в состав биопрепарата, экологически безопасен, не обладает патогенными свойствами для теплокровных животных и удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам. На основании этого его можно рекомендовать для очистки морской воды от нефти.

Источники информации

1. Авторское свидетельство СССР №1076446, кл. C02F 3/34, 1982.

2. Патент РФ №2023685, кл. C02F 3/34, Е02В 15/04, С12Р 39/00, 1994.

3. Патент РФ №2122980, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, С12Р 39/00, 1998.

4. Патент РФ №2174496, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26, C12R1:01, 2001.

5. Патент РФ №2191753, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26, C12R1:01, C12R1:32, 2002.

6. Патент РФ №2191752, кл. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/26, C12R1:01, C12R1:32, 2002.

7. Патент РФ №2181701, кл. C02F 3/34, С12Р 39/00, В09С 1/20, C12N 1/20, 2002.

Изобретение относится к средствам борьбы с нефтяным загрязнением и может быть использовано при ликвидации последствий аварийных нефтяных разливов в море. Биопрепарат на основе углеводородокисляющего штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 получен путем последовательного культивирования штамма на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, и на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой, источником фосфора, калия, магния. С последующим разведением полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; меласса - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5, или смешивание полученного концентрата с 15% раствором мелассы и водой в соотношении 1:1:1, инокулирование полученной смесью стерильного вермикулита, вспученного с последующим поверхностным культивированием в течение 3-5 дней при 18-20°С. Биопрепарат эффективно и в короткий срок утилизирует нефтяные углеводороды, в том числе полиядерные ароматические. Убыль суммарных нефтяных углеводородов через 15 суток очистки жидким биопрепаратом составила 84,1%, сухим биопрепаратом - 78,1%. Применение жидкой формы биопрепарата снизило суммарное содержание ПАУ на 75,2%, сухой формы - на 76,9%. 4 табл.

Биопрепарат для очистки морской воды от нефти, полученный путем последовательного культивирования штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079 на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния и на среде с кукурузным экстрактом, сахарозой, источником фосфора, калия, магния и разведение полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; мелассу - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5, или смешивание полученного концентрата с 15%-ным раствором мелассы и водой в соотношении 1:1:1, инокулирование полученной смесью стерильного вермикулита вспученного с последующим поверхностным культивированием в течение 3-5 дней при 18-20°С.