ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ И ВОДЫ ОТ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕНИЙ Российский патент 2016 года по МПК C02F3/34 C12N1/20 B09C1/10 C12R1/38 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв и воды от нефтезагрязнений.

Предлагается препарат для очистки почв и воды от нефтезагрязнений, включающий твердый субстрат-носитель и иммобилизованные на его поверхность биодеструкторы нефтезагрязнений, отличающийся использованием в качестве биодеструкторов нефтезагрязнений штамма бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×10⁹ кл./см³ и в качестве субстрата-носителя вспученного вермикулита.

Известен биопрепарат «Путидойл» (1. Авторское свидетельство СССР № 1076446, Штамм Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. A1, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40. Заявка: 3474745, 22.07.1982. Опубликовано: 28.02.1984. Заявитель: Западно-Сибирский научно-исследовательский геологоразведочный нефтяной институт. Авторы: Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Морозова Т.Н.), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (2. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья//Почвоведение. - 1990, №9. - С. 148-151). Его недостатком является сложная технология приготовления препарата, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м³) до +18+28°С, перемешивание, аэрирование, и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.

Известен способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в котором в качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ку-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 мас. % каждого микроорганизма (3. Патент RU 2191643. Способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01. Заявка: 2001119562/13, 09.07.2001. Опубликовано: 27.10.2002. Заявитель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ", Автор(ы): Саксон В.М., Кузнецов С.А., Бойкова И.В., Новикова И.И. Патентообладатель: Закрытое акционерное общество "Полиинформ").

Недостатком является то, что совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин (землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов), в количестве 30-120 г/м², что усложняет процесс обработки нефтезагрязненного субстрата.

Известен способ очистки почвы с использованием биопрепарата "Деворойл", содержащего консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (4. Патент RU 2114071. Способ очистки почвы, природных и сточных вод, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием биопрепаратов. C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02. Заявка: 97107716/13, 22.05.1997. Опубликовано: 27.06.1998. Заявитель: Борзенков Игорь Анатольевич. Авторы: Борзенков И.А., Беляев С.С., Ибатуллин P.P., Поспелов М.Е., Свитнев А.И. Патентообладатель: Борзенков Игорь Анатольевич). Недостатком является то, что несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.

Известен бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий (Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0·10⁹ кл./г. В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с рН 6,8-7,0 в количестве 40-45 мас. % и воду в количестве 58,95-53,25 мас. %. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 мас. %) и нормальные парафины (1,0-1,5 мас. %). Срок годности биопрепарата - 6 месяцев при температуре 10-15°С с момента его изготовления (5. Патент RU 2053205. Биопрепарат для очистки почвы и воды от нефти и нефтепродуктов. C1, C02F 3/34, C09K 3/32, В09С 1/10, В09С 101:00. Заявка: 94034274/13, 29.09.1994. Опубликовано: 27.01.1996. Заявитель: Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт. Авторы: Белонин М.Д., Рогозина Е.А., Свечина P.M., Хотянович А.В., Орлова Н.А. Патентообладатель: Всероссийский нефтяной научно-исследовательский геологоразведочный институт).

Биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется рН среды 6.8-7.0 и большое количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени.

Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта - Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м³ почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (6. Патент RU 2193464. Способ биоремедиации почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. C1, В09С 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1:01. Заявка: 2001130686/13, 14.11.2001. Опубликовано: 27.11.2002. Заявители: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть". Авторы: Ившина И.Б., Костарев С.М., Куюкина М.С., Закшевская Л.В. Патентообладатели: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, Общество с ограниченной ответственностью "ПермНИПИнефть"). Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что неприменимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе, в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудновосстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.

Наиболее близкими аналогами к изобретению являются:

- в части применения биодеструкторов нефтезагрязнений - «Штамм Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 - деструктор нефти и нефтепродуктов», эффективно окисляющий нефть и нефтепродукты в широком диапазоне температур (от +8 до +41°С) и культивированный в простой минеральной среде следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06, нефть - 1,0 (7. Патент RU 2484130. Штамм бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В 10593 - деструктор нефти и нефтепродуктов. С1. C12N 1/20, В09С 1/10, C02F 3/34, C02F 101/32, C12R 1/38. Заявка №2012114908/10, от 16.04.2012 г. Опубликовано 10.06.2013 г. Бюллетень №16. Автор: Ерофеевская Л.А. Патентообладатель: ИПНГ СО РАН, стр. 4, пр. 2, источник D1)

- в части субстрата-носителя - «Способ получения биопрепарата для очистки морской воды от нефти», включающего вспученный вермикулит, на который предварительно проведена иммобилизация биомассы штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079, культивированного на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, последующее культивирование данного штамма на среде с кукурузным экстрактом сахарозой, источником фосфора, калия, магния, разведение полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; мелассу - 20,0; K₂HPO₄ - 1,5; KH₂PO₄ - 1,5; MgSO₄ - 1,5, и выдерживание в течение 3-5 дней при 20-25°С (8. Патент РФ №2404138. Способ получения биопрепарата для очистки морской воды от нефти (варианты). C1, C02F 3/34, C12N 1/26. Заявка: 2008-07.30. Опубликовано: 20.11.2010. Авторы: Куликова И.Ю., Дзержинская И.С. Патентообладатель: ООО «Лукойл-Нижневолжскнефть, ФГОУ ВПО АГТУ, источник D2).

Отличием заявленного изобретения от раскрытого источника D1 является то, что препарат включает в качестве субстрат-носителя вермикулит месторождения Инагли, вспученный по ГОСТ 12865-67 - Вермикулит вспученный.

Отличием заявленного изобретения от раскрытого источника D2 является использование штамма бактерий Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, составляющего основу биопрепарата, включающего более сложную технологию и состав питательной среды для культивирования штамма, чем таковые в заявленном изобретении, что усложняет и делает более дорогой технологию получения аналога биопрепарата. А также то, что аналог биопрепарата предусматривает только очистку морской воды и не позволяет оценить деструктирующую способность биопрепарата по отношению к почве. Кроме того, штамм бактерий Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 растет при температуре от 22 до 30°С, оптимум 28°С, и не способен развиваться при пониженных положительных температурах (от +5+8°С), что делает его неперспективным для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом (8. Патент РФ №2268934. Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 для деструкции нефтяных углеводородов солонцеватоводных экосистем. C1, C12N 1/20, C02F 3/34. Заявка: 2003-10-28. Опубликовано: 27.01.2006. Авторы: Дзержинская И.С., Куликова И.Ю. Патентообладатель: ООО «Лукойл-Нижневолжскнефть, ФГОУ ВПО АГТУ).

Задачей изобретения является расширение номенклатуры препаратов, включающих несложную и недорогую технологию их получения и эффективных не только для очистки воды, а также и для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащих в качестве биодеструкторов нефтезагрязнений углеводородокисляющие микроорганизмы, способные развиваться и деструктировать нефть и нефтепродукты в условиях широкого диапазона температур (от +8 до +37°С), что позволит применять препарат для очистки почв и воды в различных природно-климатических условиях.

Технический результат достигается созданием препарата для очистки почв и воды от нефтезагрязнений, включающего твердый субстрат-носитель и иммобилизованные на его поверхность биодеструкторы нефтезагрязнений, отличающегося от аналога D1 использованием вспученного вермикулита месторождения Инагли в качестве субстрата-носителя и отличающегося от аналога D2 использованием в качестве биодеструкторов нефтезагрязнений штамма бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×10⁹ кл./см³, культивированного в более простой по составу минеральной среде с нефтью, способного развиваться и деструктировать нефть в почве и воде в широком диапазоне температур (от +8 до +37°С), что позволит применять препарат для очистки почв и воды в различных природно-климатических условиях, а также отличающегося от аналога D2 более простой технологией приготовления биопрепарата, что экономически более выгодно.

Характеристика штамма Pseudomonas panipatensis ВКПМ В 10593.

Штамм Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 выделен из воды озера Халы-Балы (Амгинский район, Центральная Якутия), загрязненного арктическим дизельным топливом.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика (ВКПМ) (Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под регистрационным номером ВКПМ В-10593.

Штамм является перспективным для восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв и грунтов и очистки воды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур (от +8 до +37°С).

Штамм бактерий может быть получен в лаборатории №2 Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт проблем нефти и газа Сибирского отделения Российской академии наук (ИПНГ СО РАН).

Полученный штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Грамотрицательные подвижные палочки размером 2,0-3,0×0,6-0,8 мкм. Спор и капсул не образуют. В мазках располагаются беспорядочно, одиночно или короткими цепочками (по 2-3).

На питательном агаре (масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 7,1-7,5) и на мясопептонном агаре (масс. %: ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2) через 24 часа штамм формирует дискообразные, влажные, пастообразной консистенции S-колонии сероватого или грязно-голубоватого цвета диаметром 1,5-5 мм, легко снимающиеся с агара. При температуре выше +20°С штамм образует диффундирующий пигмент зеленого цвета, который при температуре +4°С может теряться и восстанавливаться при температуре от +20°С.

На среде Эндо (масс. %: панкреатический гидролизат рыбной муки - 1,2; экстракт пекарских дрожжей - 0,1; натрий хлористый - 0,34; сульфит натрия - 0,08; натрий фосфорнокислый двухзамещенный - 0,05; фуксин основной - 0,02; лактоза - 1,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное) при рН 7,4 образует круглые с голубым оттенком колонии 0,5-3,0 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, с более плотным центром и плоским краем, блестящие, полупрозрачные, со временем приобретающие матовую поверхность.

На среде Сабуро (масс. %: гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 6,0. Образует круглые с сероватым оттенком колонии 1,0-5,0 мм в диаметре, выпуклые, гладкие, блестящие, непрозрачные, через 24-72 ч приобретающие матовую поверхность и зеленый пигмент.

Штамм растет на минеральной среде Мюнца с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо) следующего состава (масс. %) KNO3 - 0,4; MgSO₄·7H₂O - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; агар - 2,0; нефть или дизельное топливо - 1,0; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2 (10. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки // Микробиология, - 1963, - №5. - С. 1024-1030), в виде влажных непрозрачных голубоватых колоний диаметром 1-2 мм.

В мясопептонном бульоне (масс. %: ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; рН 7,0-7,2) растет в виде диффузного помутнения.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм является аэробом. Растет при температуре от +8°С до +41°С. Оптимум роста +30+37°С. Растет при рН 6,0-8,0. Растет в солевой среде с добавлением 0,1-2,0% NaCl. Обладает оксидазной и каталазной активностью. В качестве источника углерода потребляет ацетат и цитрат. Восстанавливает нитраты. Денитрификационная активность отсутствует. Не гидролизует желатин. Обладает уреазной активностью. Не гидролизует крахмал. Лецитиназу не образует. Индолоотрицателен. Окисляет мальтозу и D-глюкозу. Не ферментирует глицерин, инозит, маннит, рамнозу, сорбит, раффинозу, арабинозу. Не окисляет сахарозу, маннит, ксилозу, арабинозу, фруктозу, галактозу. Не нуждается в дополнительных факторах роста.

Штамм обладает выраженной резистентностью к бензилпенициллину, фуразолидону, метронидазолу, амоксициллину, амоксиклаву, каотиму, пефлоксацину, амосину; слабо устойчив к оксациллину, полимиксину, левомицетину; чувствителен к мозивару, цефатоксиму, цефтриаксону.

Идентификация штамма до вида с помощью анализа 16S РНК

Скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Proteobacteria; Gammaproteobacteria; Pseudomonadales; Pseudomonadaceae; Pseudomonas, причем гомология с видом Pseudomonas panipatensis составляет 97%.

Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы (Ribosomal Database Project II) представлены в графическом виде:

Дальнейший анализ по RDP II16S рРНК базе данных показал гомологию с теми же видами бактерий.

При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:

Критерием отнесения микроорганизма к тому или иному виду считается гомология не менее 97%, по этому критерию исследуемый штамм был отнесен к виду Pseudomonas panipatensis.

Характеристика субстрата-носителя.

По мнению многих авторов, для иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов предпочтительны естественные минеральные материалы. При этом сорбент-носитель, используемый для иммобилизации клеток УОБ, должен обладать следующими основными свойствами: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью.

Наиболее полно этим требованиям отвечает вермикулит вспученный (ГОСТ 12865-67).

Вермикулит - это природно-гидратированная слюда. Представляет собой слоистые плиты золотисто-желтого или бурого цвета с объемной массой 100-200 кг/м³.

Гидратация первичного флогопита начинается с глубины 100-115 м и завершается образованием вермикулита. Минералы наилучшего технологического качества развиты на поверхностях. Мировая добыча вермикулита составляет около 500-600 тысяч тонн в год, в том числе в России - около 35-40 тысяч тонн [11. Зедгенизов В.Г. Эффективность использования многомодульных модификаций электрических печей для обжига вермикулита / В.Г. Зедгенизов, А.И. Нижегородов // Строительные материалы, 2009. - №12. С. 51-53; 10. Островский Г.М. Пневматический транспорт сыпучих материалов в химической промышленности / Г.М. Островский Д.: Химия, 1984. - 104 с.; 12. Рыбьев И.А. Строительное материаловедение: учеб. пособие для строительных специальностей вузов. / И.А. Рыбьев. М.: Высш. шк., 2003. - 701 с.]. В России наиболее известными месторождениями вермикулитовых руд являются: Ковдорское (Мурманская область), Татарское (Красноярский край), Кокшаровское (Приморский край), Булдымское и Потанинское (Челябинская обл.), Улунтуйское и Слюдянинское (Иркутская обл.), Инаглинское (Республика Саха (Якутия)) и др. Однако из-за слабой оснащенности спецоборудованием производство вермикулита и материалов на его основе в России только начинает развиваться и носит пока ограниченный характер [13. Нижегородов А.И. Вермикулит и вермикулитовые технологии: исследования, производство, применение / А.И. Нижегородов. Иркутск: Изд-во БизнесСтрой, - 2008. - 96 с.].

Вспученный вермикулит имеет многофункциональное значение и применяется в строительной индустрии в качестве плиточного утеплителя, тепло-звукоизоляционного материала, пористого наполнителя для легких бетонов и штукатурных растворов, для фильтрационной очистки стоков электростанций и предприятий; в сельском хозяйстве - в качестве мелиоранта при рекультивации земельных участков и т.д.

В Якутии, в качестве сорбента-носителя для иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов возможно использование вермикулита месторождения Инагли.

Вермикулит месторождения Инагли (Алданский район, Южная Якутия) связан с корой выветривания хромдиопсид-слюдяных метасоматитов, образовавшихся по дунитам Инаглинского плутона [14. Корчагин A.M. Инаглинский плутон и его полезные ископаемые. - М., Недра, 1996. - 160 с.].

Химический состав вермикулита месторождения Инагли представлен в таблице 1.

Нефтеемкость вспученного вермикулита месторождения Инагли к нефти и нефтепродуктам представлена в таблице 2 (15. Кондратьева Н.И., Габышева Р.И., Новгородов П.Г. Вермикулиты месторождения Инагли (Якутия) для очистки водной поверхности и почвы от нефтезагрязнений // Материалы I-й международной конференции: Значение промышленных минералов в мировой экономике: месторождения, технология, экономические оценки - Москва, 31 января - 3 февраля 2006 г. - М., ГЕОС, 2006. - С. 101).

Таким образом, вермикулит вспученный является перспективным сорбентом-носителем, используемым для иммобилизации клеток УОБ, так как обладает перечисленными выше основными свойствами, а именно: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью; сочетает в себе свойства носителя для микроорганизмов и сорбента для нефти, что обеспечивает высокую эффективность и пролонгированность реакций деструкции нефтяных углеводородов.

На основании вышеизложенных результатов исследований был составлен препарат для очистки почв и воды от нефтезагрязнений.

Краткая характеристика биопрепарата для очистки почв и воды от нефтезагрязнений

Компонентами препарата являются твердый субстрат-носитель и иммобилизованные на его поверхность биодеструкторы нефтезагрязнений, отличающиеся от аналогов тем, что:

- в качестве биодеструкторов нефтезагрязнений содержит биомассу углеводородокисляющих бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×10⁹ кл./см³, выделенных из воды озера Халы-Балы (Амгинский район, Центральная Якутия), загрязненного арктическим дизельным топливом;

- в качестве твердого субстрата-носителя содержит вермикулит месторождения Инагли, вспученный и измельченный до фракции 0,6-20 мм.

Применение препарата актуально в следующих направлениях:

- интродукция активно деградирующих нефть селектированных штаммов УОБ (в загрязненную экосистему) и управление данным процессом;

- стимуляция естественной углеводородокисляющей микрофлоры нефтезагрязненных субстратов, участвующей в биодеградации нефтяных загрязнений;

- оптимизация процессов биологической деградации нефтезагрязнений с целью достижения высокого эффекта в очистке и доочистке нефтезагрязненных субстратов.

Технология приготовления препарата для очистки почв от нефтезагрязнений

- Получение маточной культуры

Для получения маточных культур используют агаровые культуры штамма Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593. Эта культура является посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.

Для получения маточной культуры используют минеральную среду следующего состава (масс. %): KNO₃ - 0,4; MgSO₄·7Н₂О - 0,08; NaCl - 0,1; K₂HPO₄ - 0,14; KH₂PO₄ - 0,06; нефть - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.

Культуры изолята, выращенные на скошенном ГРМ-агаре промышленного производства, основой которого является гидролизат рыбной муки либо мясо-пептонный агар (МПА) промышленного производства, смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять 1×10⁹ кл./см³ по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича; объем - не менее 25-50 см³.

- Культивирование посевного материала в колбах

Питательную минеральную среду того же состава разливают по 150 см³ в колбы вместимостью 500 см³, в среду засевают 15-25 см³ бактериальной суспензии, приготовленной методом смыва. Туда же вносят 1,5 см³ стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в «УВМТ 12-250» в течение 72 часов при 180-200 об/мин, температуре выращивания 29+1°С.

- Получение посевного материала для иммобилизации

Выращивание бактерий, составляющих основу препарата, проводят на той же среде; в качестве единственного источника углерода используют стерильную сырую нефть, концентрация углеводородсодержащих продуктов в ферментационной жидкости составляет не менее 1% (по объему). Процесс ферментации осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре 29+1°С в течение 36-48 часов.

По окончании процесса культивирования наработанную жидкость сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации сорбента-носителя (вермикулита месторождения Инагли, вспученного по ГОСТ 12865-67.

- Иммобилизация штаммов на сорбент-носитель

Посевной материал для иммобилизации смешивают в аппарате с мешалкой с сорбентом-носителем (вермикулитом вспученным) фракции 0,6-20 мм, в соотношении 1:1. После пропитки вермикулита вспученного посевным материалом для иммобилизации его высушивают контактным способом при температуре 37°С до постоянной массы или при комнатной температуре в течение 2-х суток. Биопрепарат готов к использованию. Сухой биопрепарат помещают в кеги или двухслойные полиэтиленовые мешки и запаивают. Параметры и характеристики биопрепарата должны соответствовать значениям таблицы 3.

Указания по применению препарата.

- Для очистки почв от нефтезагрязнений

При использовании препарата необходимо учитывать содержание микроэлементов в почве (местный геохимический фон) согласно нормативам (16. ГН 2.1.7.2041 Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве).

Препарат вносят в почву без предварительной подготовки (в том виде, в котором он поступил на объект) с помощью специальной техники (сеялки, навозоразбрасыватели, машины для внесения удобрений и др.) при больших объемах работ;

- вручную при небольших площадях нефтезагрязнений.

Нормы расхода препарата представлены в таблице 4.

Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах почвы +4+40°С. Допустимый уровень кислотности рН 4,5-9,0. Влажность почвы в пределах 40-60%. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата в почву - 30-45 суток.

Через 30-45 суток проводится повторный отбор почвенных проб на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.

Качество очистки почв от нефтезагрязнений контролируется гравиметрическим методом (17. РД 52.18.647-2003 Определение массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом).

- Для очистки воды от нефтезагрязнений

Препарат вносят в водные объекты без предварительной подготовки (в том виде, в котором он поступил на объект) с помощью

- специальной техники (сеялки, навозоразбрасыватели, машины для внесения удобрений и др.) при больших объемах работ;

- вручную при небольших площадях нефтезагрязнений, из расчета 1-2 л препарата на 1 м² водной поверхности.

Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах воды выше +4+37°С. Допустимый уровень кислотности рН 4,5-9,0. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата - 30-45 суток.

Через 30-45 суток проводится повторный отбор проб воды на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.

Качество очистки воды от нефтезагрязнений контролируется ИК-фотометрическим методом [18. ФР.1.31.2010.07127 МВИ01.02.161 «Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера нефтепродуктов ИКН-025»; 19. РД 52.24.476-2007 Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометрическим методом].

Утилизация.

Утилизация некондиционных отходов и отсевов сырья осуществляется в соответствии с указаниями СанПиН 2.1.7.1322-03, требованиями по защите окружающей среды и действующего законодательства, а также органов местной власти (19. СанПиН 2.1.7.1322-03 Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию отходов производства и потребления). По возможности следует избегать образования отходов или минимизировать их количество. Утилизация неотработанного препарата проводится по требованиям, предъявляемым к веществам 4 класса опасности.

Требования к условиям производства и техники безопасности.

Помещения для работы с микроорганизмами должны отвечать Санитарно-эпидемиологическим правилам (20. СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней).

К работам на оборудовании при работе с микроорганизмами и изготовлении сорбента-носителя должны допускаться лица, достигшие 18-летнего возраста, прошедшие обучение.

Все работающие должны проходить периодические медицинские осмотры в порядке, установленном органами здравоохранения (21. Приказ Минздравмедпрома России от 14.03.96 №90 О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров работников и медицинских регламентах допуска к профессии; 22. Приказ Минздравсоцразвития России от 16.08.04 №83 «Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования), и порядка проведения этих осмотров (обследований)» (с изменениями от 16 мая 2005 г.)).

Выполнение требований техники безопасности должно обеспечиваться соблюдением соответствующих утвержденных инструкций и правил по технике безопасности при осуществлении соответствующих работ.

Ускорение сроков восстановления (рекультивации почв)

Процесс самовосстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем в регионах с благоприятными климатическими условиями занимает 10-25 лет, в то время как деструкция нефти и ее производных в условиях Севера составляет минимум 50 лет (23. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Масливец Т.А. и др., Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. Тр. М.: Наука, 1988. - С. 140-159).

Для ускоренной рекультивации нефтезагрязненных почв необходимо соблюдение следующих мероприятий:

1) нефтезагрязненные почвы необходимо смешать с чистым плодородным почвенным слоем или торфом;

2) по результатам агрохимических исследований (при необходимости) - внесение в расчетных дозах недостающих в почве минеральных компонентов в виде удобрений. Обычно в сельском хозяйстве для основного, предпосевного и местного внесения при посеве или для подкормки растений применяют азотно-фосфорно-калийные удобрения (нитроаммофорску, аммофоску или азофоску). Данные удобрения универсальны и используются на всех типах почв и под все сельскохозяйственные культуры. При основном внесении на черноземных и тяжелых глинистых почвах удобрения целесообразно вносить осенью, а на легких почвах - весной. Нормы внесения зависят от плодородия почвы и в среднем составляют 35-45 кг на гектар;

3) увеличение кратности обработки почв препаратом до 3-4 раз за 1 вегетационный сезон;

4) рыхление почвы не реже 1 раза в неделю;

5) поддержание оптимальной влажности и рН почвы;

6) посев многолетних нефтетолерантных трав (овсяница, пырей ползучий, пырейник сибирский, тимофеевка луговая, осот полевой, костер безостый, клевер луговой).

Использование предлагаемого препарата для очистки почв и воды от нефтезагрязнений подтверждается конкретными примерами.

Пример 1. Очистка почвы от нефтезагрязнений с применением препарата

Полевые опыты с применением препарата проведены на тяжелосуглинистой почве, загрязненной нефтью. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве опытного участка до внесения препарата составило 44319 мг/кг. Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения, динамике численности основных групп почвенных микроорганизмов и фитотоксичности почвы.

Содержание нефти в почве определялось гравиметрическим методом согласно инструкции РД 52.18.647-2003.

Установлено, что степень биодеградации нефтепродуктов в экспериментальном участке за 1 вегетационный период после внесения в почву препарата составила 76,7% (таблица 5).

Динамика биодеградации нефтезагрязнения согласовывалась с динамикой накопления почвенных микроорганизмов, в том числе нефтедеструкторов численность которых после внесения биопрепарата в почву увеличилась в среднем на 2 порядка (таблица 6).

Биотестирование показало, что в процессе очистки от нефтезагрязнения в почве опытного участка снизилась фитотоксичность, о чем свидетельствовало увеличение процента прорастаемости семян тест-растений с 30 до 68%.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности препарата для очистки почв от нефтезагрязнений.

Пример 2. Очистка воды от нефтезагрязнений с применением препарата

Для опыта в эксикатор объемом 5,0 дм³ вносили 3,0 дм³ водопроводной воды, отстоявшейся в течение суток, и 0,03 л препарата. Для создания нефтяной пленки в емкости добавили 30 г сырой неочищенной нефти. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм³ с добавлением 30 г нефти и без внесения препарата.

Эксперимент проводили в течение 2-х месяцев, поддерживая температуру воды в интервале +15+20°С. Полученные результаты показали, что деструкция нефти за 2 месяца под действием препарата составила (таблица 7)

Качество очистки воды от нефти контролировали ИК-фотометрическим методом (ФР.1.31.2010.07127 МВИ01.02.161; РД 52.24.476-2007).

Таким образом, преимуществом препарата является то, что он благодаря совокупности уникальных свойств субстрата-носителя (вспученного вермикулита) и иммобилизованного на него штамма бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593, способного развиваться и деструктировать нефть и нефтепродукты в условиях широкого диапазона температур (от +8 до +37°С), обладает способностью стимулировать как в почве, так и воде биологическую деградацию нефтезагрязнений.

Способ приготовления и использования предлагаемого препарата экономически выгоден, так как для своего осуществления не требует сложного технологического оборудования. А вермикулит, служащий в данном способе субстратом-носителем, является одновременно и доступным, и дешевым сырьем, поскольку вермикулиты имеют поверхностное залегание и разрабатываются открытым способом. В России наиболее известными месторождениями вермикулитовых руд являются: Ковдорское (Мурманская область), Татарское (Красноярский край), Кокшаровское (Приморский край), Булдымское и Потанинское (Челябинская обл.), Улунтуйское и Слюдянинское (Иркутская обл.), Инаглинское (Республика Саха (Якутия)) и др.

Очистка почвы и воды от нефтезагрязнений предлагаемым препаратом позволяет предотвратить распространение веществ-загрязнителей на сопряженные ландшафты и добиться устранения пятен загрязненного грунта, что значительно улучшает санитарно-экологическое состояние нарушенной территории.

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв и воды от нефтезагрязнений. Препарат содержит твердый субстрат-носитель и иммобилизованную на его поверхности биомассу бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×10⁹ клеток/см³. В качестве твердого субстрата-носителя используют вспученный вермикулит. Изобретение позволяет сократить сроки очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений в широком диапазоне температур (от +8 до 37°С). 7 табл., 2 пр.

Препарат для очистки почв и воды от нефтезагрязнений, включающий твердый субстрат-носитель и иммобилизованные на его поверхность биодеструкторы нефтезагрязнений, отличающийся использованием в качестве биодеструкторов нефтезагрязнений штамма бактерий Pseudomonas panipatensis ВКПМ В-10593 в концентрации 1×10⁹ клеток/см³ и вспученного вермикулита в качестве субстрата-носителя.