СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ КОЛИБАКТЕРИОЗА, СТРЕПТОКОККОЗА И ВИРУСНОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ КРОЛИКОВ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A61K39/295 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к способу изготовления ассоциированной вакцины против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, и может быть использовано в научно-исследовательских и производственных учреждениях, занимающихся разработкой и конструированием вакцинных препаратов, а также на предприятиях биологической промышленности.

Известен способ получения поливалентной вакцины против кишечных инфекций (патент РФ на изобретение №2080875 от 18.03.92, МКИ А61K 39/125, 39/135). Данный способ получения поливалентной вакцины включает раздельное выращивание культур Salmonella typhi, Salmonella paratyphi В, Shigella Flexneria, Shigella Sonne, отделение биомассы от питательной среды, экстракцию антигенов проводят водно-солевым раствором при шуттелировании в присутствии антибиотика и мелкораздробленного стекла в течение 1-1,5 ч, полученные экстракты центрифугируют, очистке подвергают супернатанты и после смешивания получают целевой продукт в виде смеси клеточных стенок, содержащих О-антигены используемых культур, со жгутиками, содержащими Н-антигены, и растворимыми Vi-антигенами сальмонелл. Технология получения данной вакцины очень сложная и для профилактики инфекционных болезней кроликов не рекомендуется.

Известен способ получения вакцины против стрептококкоза и пастереллеза нутрий (патент РФ на изобретение №2099083 от 30.09.94, МКИ А61K 39/125, 39/135). Данный способ предусматривает раздельное выращивание в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы штаммы Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ № К-ДЕП, Pasteurella multosida ВГНКИ №2394 и Pasteurella multocida ВГНКИ №1015 в течение 18-24 часов, полученные культуральные среды подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3-0,4%-ным раствором формалина, объединяют их в равных соотношениях по объему и последовательно вносят гидроокись алюминия. Данный способ позволяет получать вакцину против стрептококкоза и пастереллеза нутрий. Технология получения данной вакцины сложная, после введения животным вызывает поствакцинальные осложнения (воспаление, абсцессы, хромату).

Известен способ изготовления бивалентной вакцины против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (патент РФ на изобретение №2064304 от 27.07.96, МКИ А61K 39/275). Данный способ предусматривает, что раздельно выращивают вакцинный вирус миксоматоза кроликов в культуре клеток куриных фибробластов с активностью не 10^4,0 ИД 50/см³, замораживают-оттаивают, смешивают с инактивированной суспензией печени кроликов, зараженной вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, в соотношении 1:1, стабилизируют полученную смесь защитной средой при соотношении 10:1, фасуют и лиофилизируют после замораживания при минус 55±5°С в течение 10±2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50±5°С до 0°С в течение 31±1 ч и затем от 0°С до плюс 20±1°С при вакууме 10±0,5 Па и досушивают в течение 3±1 ч.

Техническим результатом изобретения является получение безвредной, специфичной, высокоиммуногенной ассоциированной вакцины для защиты кроликов против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов путем введения новых возбудителей, компонентов, исключая отрицательное и побочное влияние.

Поставленная задача достигается тем, что способ изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий раздельное выращивание антигенов, смешивание культур в равных соотношениях, фасовку, согласно предлагаемому способу проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию и делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, отдельно выращивают культуру Е. coli, Str. pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, затем заражают кроликов вирусом геморрагической болезни с активностью не менее 10^3,0 ЛД ₅₀/см³ и из печени павших кроликов готовят 10-15%-ную суспензию, после этого раздельно инактивируют культуры возбудителей болезней формалином до конечной концентрации не более 0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°С, затем в смесь инактивированных культур вносят адъювант, в качестве которого используют гель гидроокиси алюминия, в количестве 20% к объему, перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт.

Новизна заявляемого предложения обусловлена тем, что в отличие от известных способов проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания, гибели их против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, приготавливают суспензию, выделяют чистые культуры возбудителей посевом на дифференциально-диагностические среды. Используют при раздельном выращивании чистой культуры Escherichia coli, Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2% и получают концентрацию микробных клеток не менее 4-5 млрд. в 1 см³. Для получения специфичного вирусного сырья кроликов заражают вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенного из местного эпизоотического очага, проводят экстрагирование вируса из 10-15%-ной суспензии печени павших кроликов при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов при периодическом перемешивании и освобождение от клеточного детрита фильтрованием через два слоя марли, что позволяет увеличить выход вирусного сырья в два-три раза. Инактивируют культуры возбудителей раздельно формалином до 0,1-0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 4 суток и смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, что позволяет полностью подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Добавление гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему культуры позволяет через 12-15 суток после однократного введения в дозе 1 см³ кроликов обеспечить у привитых формирование напряженного иммунитета против двух инфекционных болезней.

По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная заявляемой совокупность признаков, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.

Что касается критерия «промышленная применимость», то компоненты, входящие в состав вакцины, известны и широко применяются в ветеринарной практике при изготовлении инактивированных вакцин: инструкция по изготовлению и контролю формолвакцины поливалентной гидроокисьалюминиевой против колибактериоза (эшерихиоза) поросят, телят и ягнят, утвержденная ГУВ МСХ СССР 26.04.1984 г.; ассоциированная вакцина против миксоматоза и вирусной геморрагической болезни кроликов (СТО 00495549-0044-2007); ассоциированная вакцина против пастереллеза и вирусной геморрагической болезни кроликов (ТУ утверждены 30.09.94 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена 27.05.94 г.); ассоциированная вакцина против сальмонеллеза, пастереллеза и энтерококковой инфекции поросят ТУ 10.09-62-90, утверждено 01.08.90 г., инструкция по изготовлению и контролю данной вакцины утверждена Главным управлением ветеринарии 16.07.90 г.; вакцина против энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят ТУ 10.09-91-90, утверждено 15.12.90 г.; вакцина против геморрагической болезни кроликов тканевая инактивированная гидроокисьалюминиевая СТО 00495549-0005-2006.

Методы выделения чистой культуры возбудителя колибактериоза и ее характеристика описаны в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденных 27.07.2000 г. №13-7-2/2117 Департаментом ветеринарии МСХ РФ, описана характеристика эшерихий в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва - Колос, 1995, стр.196-201, а также в «Практикуме по ветеринарной микробиологии и иммунологии» авторы: Костенко Т.С., Родионова В.Б., Скородумов Д.И., М.: «Колос», 2001, на стр.219-222.

Методы выделения и характеристика стрептококков представлены в «Методических указаниях по лабораторной диагностике стрептококкоза животных», утвержденных 25.09.1990 г. Главным управлением ветеринарии с государственной инспекцией при Государственной комиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам, а также в справочнике «Определитель зоопатогенных микроорганизмов» под редакцией профессора Сидорова М.А., Москва. - Колос, 1995, стр.90-95.

Методы выделения и характеристика вирусной геморрагической болезни кроликов описаны в «Методических указаниях по лабораторной диагностике вирусной геморрагической болезни кроликов», утвержденных ГУВ Госагропрома СССР 28.12.88.г. в книге «Вирусная геморрагическая болезнь кроликов» авторы: Шевченко А.А., Вишняков И.О., Бакулов И.А., Власова Т.А. М.: «Две Короны», 1995, 48 с.; в книге «Болезни кроликов», авторы: Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Литвинов A.M., М.: «Аквариум», 2002, стр.42-57.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что проводят отбор пораженных органов от павших кроликов из местного эпизоотического очага, приготавливают суспензию, делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей инфекционных болезней колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, раздельно выращивают чистую культуру возбудителей Escherichia coli. Streptococcus pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, а вирусом геморрагической болезни кроликов заражают кроликов, которые погибают через 48-72 ч. Затем приготавливают 10-15%-ную суспензию из печени павших кроликов от зараженных вирусом геморрагической болезни кроликов, инактивируют раздельно путем внесения формалина до конечной концентрации 0,4%-ной, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов, смешивают инактивированные культуры в равных соотношениях, затем вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему, тщательно смешивают, фасуют и укупоривают.

Пример конкретного осуществления способа изготовления вакцины.

Для изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, проводят отбор пораженных органов от павших кроликов в период заболевания их колибактериозом, стрептококкозом и вирусной геморрагической болезнью, из которых приготавливают суспензию и проводят лабораторные исследования с целью выделения чистых культур возбудителей.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя колибактериоза готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших кроликов, путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, что характерно для Е.coli.

Для определения культуральных свойств возбудителя колибактериоза нутрий E.coli делают посевы выделенной культуры из патологического материала в мясо-пептонный бульон (МПБ), на среду Эндо, на мясо-пептонный агар (МПА) и инкубируют в термостате при 37°С в течение 16-24 часов. На чашках Петри с МПА вырастают влажные колонии с ровными краями и гладкой поверхностью серого цвета. В пробирках с МПБ наблюдали равномерное помутнение питательной среды с небольшим осадком, разбивающимся при встряхивании. В чашках Петри на среде Эндо наблюдают рост колоний малиново-красного цвета с розовым ободком диаметром 2-3 мм, характерные для E.coli.

При определении биохимической активности чистых баккультур проводят посевы на дифференциально-диагностические среды с различным набором компонентов. Для E.coli характерно расщепление глюкозы и лактозы с образованием кислоты и газа, выделение индола, отсутствие уреазы.

Патогенность чистых выделенных культур определяют путем внутрибрюшинного заражения белых мышей массой 14-18 г. Через 2-4 суток наблюдения все зараженные лабораторные животные погибают при 100% сохранности в контроле. Для подтверждения специфичности гибели мышей из паренхиматозных органов павших мышей приготавливают мазки - отпечатки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопировании под иммерсионной системой микроскопа в препаратах видны толстые палочки с закругленными концами красного цвета, расположенные одиночно, характерные для E.coli. Серологическую типизацию кишечной палочки проводят в реакции агглютинации с набором типоспецифических сывороток по общепринятой методике в пробирках.

В реакции агглютинации исследуемая культура кишечной палочки реагирует с колисывороткой, и виден хлопьевидный осадок (положительный результат) при отрицательном контроле.

Для определения морфологии и тинкториальных свойств возбудителя стрептококкоза готовят мазки - отпечатки из пораженных органов павших кроликов, путем прикосновения обезжиренным стеклом к свежему разрезу пораженной ткани и последующей фиксацией над пламенем спиртовки, окрашивают их по методу Грама. При микроскопии препаратов под иммерсионной системой микроскопа наблюдают мелкие кокки в виде цепочек, окрашенные в фиолетовый цвет, характерные для рода Streptococcus. Для определения культуральных свойств возбудителя делают посевы выделенной культуры из патматериала в мясо-пептонный бульон с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 10% инактивированной сыворотки лошади (МПБ), в чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА) с добавлением глюкозы до 0,2%-ной конечной концентрации и 5% дефибринированной крови кролика. Через 18-20 часов инкубирования в термостате при температуре 37°С наблюдают в МПБ рост в виде диффузного помутнения среды. В чашках Петри с кровяным МПА наблюдают рост мелких росинчатых, слегка мутноватых с ровными краями колоний, окруженных зеленоватой зоной гемолиза, что характерно для Str.pneumoniae.

Для дифференциации стрептококков от стафилококков используют каталазную пробу. При постановке каталазной пробы на предметное стекло наносят каплю свежеприготовленного 3%-ного раствора перекиси водорода. Бактериологической петлей снимают одну колонию исследуемой культуры и растирают ее в капле перекиси водорода. Стафилококки, в отличие от стрептококков, образуют каталазу и вызывают пенообразование. Для предварительной идентификации стрептококков и энтерококков баккультуру высевают в пробирки с 10%, 40% желчи, с 6,5% хлористого натрия, с углеводами (раффинозой, сорбитом, маннитом), учитывают рост в жидкой среде и гемолиз на МПА с кровью.

В результате в пробирках с желчью наблюдают диффузный рост баккультуры, отмечают ферментацию маннита. На МПА с кровью наблюдают неполный гемолиз эритроцитов с образованием вокруг колоний зеленоватой зоны, что характерно для стрептококков группы D.

Для установления серогрупповой принадлежности стрептококков используют стрептококковые групповые преципитирующие сыворотки. Серогрупповую принадлежность стрептококков определяют в реакции преципитации (РП) в капиллярах. Патогенность подтверждают биопробой на молодых белых мышках.

Выращивание чистой культуры возбудителя проводят в мясо-пептонном бульоне. Для заражения берут 1-2 см³ культуру Streptococcus pneumoniae и засевают 80-100 мл жидкой питательной среды и выращивают при 37°С в течение 12-14 часов. Концентрацию микробных клеток в бактериальной массе определяют по стандарту мутности и разводят стерильной дистиллированной водой до концентрации 4-5 млрд. в 1 см³.

Для получения вирусного сырья при изготовлении вакцины используют не привитых против вирусной геморрагической болезни кроликов, массой не менее 1,5 кг, заражают их вирулентным вирусом геморрагической болезни кроликов, выделенным из эпизоотического очага с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл. Через 48-72 часа кролики погибают, от павших берут печень в целлофановые пакеты, замораживают, измельчают ножницами и на гомогенизаторе. Полученное сырье доводят физраствором (рН 7,2) до 10-15%-ной суспензии, затем экстрагируют вирус при температуре 4-6°С в течение 10-12 часов, периодически перемешивая, декантируют надосадочную жидкость, к осадку добавляют физраствор в соотношении 1:1, перемешивают. Для освобождения от клеточного детрита проводили фильтрование через два слоя стерильной марли. Затем отфильтрованное вирусное сырье, баксырье сливают в емкость и проводят инактивацию внесением формалина 0,1-0,4%-ной конечной концентрации, выдерживают при температуре 37°С в течение 48-96 часов при периодическом перемешивании, затем смешивают инактивированные антигены в равных соотношениях, вносят раствор гидроокиси алюминия в количестве 20% к объему и тщательно перемешивают, фасуют и укупоривают.

Таким образом, использование для изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов чистых культур возбудителей E.coli, Str. pneumoniae и вирусной геморрагической болезни кроликов, выделенных из местного эпизоотического очага, позволяет получать специфичную, высокоиммуногенную ассоциированную вакцину для защиты от этих трех опасных инфекционных болезней колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов. Раздельное выращивание возбудителей позволяет получать концентрацию Str. pneumoniae не менее 4 млрд. в 1 см³ в течение 12-14 часов инкубирования и вируса геморрагической болезни кроликов с инфекционной активностью 10³ ЛД₅₀/мл. Использование формалина для инактивации в 0,1-0,4%-ной конечной концентрации позволяет в течение 48-96 часов при температуре 37°С подавить патогенность и сохранить высокую иммуногенность в течение 12 месяцев хранения. Вакцина, полученная заявляемым способом, прошла апробацию. Кроликам вводили однократно в дозе 1 см³ полученную ассоциированную вакцину, и через 12-15 суток у привитых кроликов обеспечивается формирование напряженного иммунитета против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, продолжительностью не менее 9 месяцев (срок наблюдения). После однократного введения кроликам внутримышечно не вызывает у них поствакцинальных осложнений.

Таблица 1 Сравнительная характеристика изготовления вакцины по предлагаемому способу и прототипу № п/п Отличительные признаки Прототип Предлагаемый способ 1 Возбудители Вирус миксомы штамм «В-87» вируса вирусной геморрагической болезни кроликов Е. coli и Str. pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации и вирус геморрагической болезни кроликов, выделенный из эпизоотического очага 2 Сырье Вирус миксомы с активностью не менее 10^4,0 ИД 50/см³ и 10-20% суспензия печени с вирусом геморрагической болезни кроликов с активностью не менее 10^3,0 ЛД₅₀/см³ Е. coli, Str. pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³ и вирус геморрагической болезни кроликов, выделенный из эпизоотического очага в виде 10-15%-ной суспензии печени с активностью не менее 10^3,0 ЛД₅₀/см³ 3 Стабилизация Полученную смесь стабилизируют защитной средой при соотношении 10:1 Нет 4 Инактивация Формальдегид 0,1-0,14% в течение 3-4 суток при 27-28°С Формалин 0,1-0,4% в течение при температуре 37°С 2-4 суток 5 Лиофилизация После замораживания при минус 55±5°С в течение 10±2 ч путем выдерживания материала при температуре от минус 50±5°С до 0°С в течение 31±1 ч и затем от 0°С до плюс 20±1°С при вакууме 10±0,5 Па и досушивают в течение 3±1 ч Нет 6 Адъювант Нет Гель гидроокиси алюминия 20% 7 Длительность иммунитета 9 мес 12 мес

Предложенный способ прост в исполнении, доступен и является промышленно применимым.

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарной медицине и касается способа изготовления вакцины ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни. Представленное изобретение реализуется следующим образом: проводят отбор пораженных органов павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых готовят суспензию и делают посев на дифференциально-диагностические среды, далее выделяют чистые культуры возбудителей болезни; отдельно выращивают культуру Е. coli, Str. pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³; затем заражают кроликов вирусом геморрагической болезни с активностью не менее 10^3,0 ЛД₅₀/см³ и из печени павших кроликов готовят 10-15%-ную суспензию; после этого раздельно инактивируют культуры возбудителей болезней формалином до конечной концентрации не более 0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение не более 4 суток, затем в смесь инактивированных культур вносят адъювант, в качестве которого используют гель гидроокиси алюминия, в количестве 20% к объему, перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт. Представленное изобретение позволяет получать безвредную, высокоиммуногенную вакцину, стабильную при хранении. 1 табл.

Способ изготовления вакцины, ассоциированной против колибактериоза, стрептококкоза и вирусной геморрагической болезни кроликов, включающий раздельное выращивание антигенов, смешивание культур в равных соотношениях, инактивацию формальдегидом, фасовку, отличающийся тем, что проводят отбор пораженных органов павших кроликов из местного эпизоотического очага, из которых приготавливают суспензию и делают посев на дифференциально-диагностические среды, выделяют чистые культуры возбудителей, отдельно выращивают культуру E.coli, Str.pneumoniae в мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы до 0,2%-ной концентрации с титром 4-5 млрд. микробных клеток в 1 см³, затем заражают кроликов вирусом геморрагической болезни с активностью не менее 10^3,0 ЛД₅₀/см³ и из печени павших кроликов готовят 10-15%-ную суспензию, после этого раздельно инактивируют культуры возбудителей болезней формалином до конечной концентрации не более 0,4%-ной конечной концентрации при температуре 37°С в течение 48-96 ч, затем в смесь инактивированных культур вносят адъювант, в качестве которого используют гель гидроокиси алюминия, в количестве 20% к объему, перед фасовкой тщательно перемешивают конечный продукт.