Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к полимерному производному антиметаболита цитидина, применению указанного вещества и способу его получения.
Уровень техники
Для лечения злокачественных опухолей или вирусных заболеваний были созданы разные антиметаболиты цитидина; цитарабин, гемцитабин и подобные средства применяются в клинических условиях в качестве противоопухолевых (противораковых) средств, и зальцитабин, ламивудин и подобные средства применяются в качестве противовирусных средств.
Однако многие из указанных антиметаболитов цитидина оказываются недостаточно эффективными или требуют введения в высоких дозах из-за их подверженности метаболизму и экскреции in vivo несмотря на проявление сильной активности in vitro. В качестве примера можно отметить, что гемцитабин обладает сильной активностью подавления роста клеток in vitro по сравнению с другими противораковыми средствами, такими как паклитаксель и доксорубицин, но требует введения в клинических условиях в высокой дозе, равной 1000 мг/м2 площади поверхности тела. Считается, что подобный эффект возникает вследствие того, что аминогруппа в положении 4 основания метаболизируется и инактивируется цитидиндезаминазой, ферментом, метаболизирующим 2'-дезоксицитидин, в результате чего снижается биологическая доступность данного средства in vivo (см. непатентный документ 1).
Связывание лекарственного средства с полимером иногда позволяет улучшить его фармакокинетику in vivo и усилить терапевтическое действие. В непатентном документе 2 описано полимерное производное, в котором цитарабин связан с полиглутаминовой кислотой со средней молекулярной массой около 30000. Однако полимерное производное лекарственного средства иногда вызывает аллергическую реакцию вследствие возникновения иммунной реакции, и в такой ситуации не может быть повторно введено в качестве лекарственного средства.
В патентном документе 1 описано полимерное производное, в котором производное цитидина связано с полиэтиленгликолем, и в непатентном документе 3 описано полимерное производное, в котором цитарабин связан с аспарагиновой кислотой в полиэтиленгликоле, при этом аспарагиновая кислота замещена у обоих концов разветвленной цепи. Однако существует также вероятность того, что на терапевтическое действие указанных полимерных производных в клинических условиях будут существенно влиять индивидуальные особенности подлежащих лечению субъектов, так как высвобождение лекарственного средства из указанных производных в значительной степени зависит от реакции гидролиза под воздействием фермента in vivo.
В патентом документе 2 указано, что молекулы, в которых лекарственное средство связано с блоксополимером, полученным путем конденсации полиэтиленгликоля с полиаспарагиновой кислотой, образуют мицеллы, необходимые для получения лекарственного средства. Кроме того, в патентном документе 3 описан полимер, в котором противораковое вещество связано с карбоксильными группами боковой цепи глутаминовой кислотой блоксополимера, полученного путем конденсации полиэтиленгликоля с полиглутаминовой кислотой. Однако в указанных патентных документах отсутствуют данные об использовании антиметаболитов цитидина в качестве связанных лекарственных средств.
Непатентный документ 1: Cancer Science, Japanese Cancer Association, Vol.95, p.105-111 (2004).
Непатентный документ 2: Cancer Research, American Association for Cancer Research, Vol.44, p.25-30 (1984).
Непатентный документ 3: Journal of Controlled Release (Elsevier, England), Vol.79, p.55-70 (2002).
Патентный документ 1: публикация заявки на патент Японии (KOHYO) № 2003-524028.
Патентный документ 2: патент Японии № 2694923.
Патентный документ 3: публикация заявки на патент Японии (KOKAI) № 05-000955.
Описание изобретения
Задачи, решаемые изобретением
Объектом настоящего изобретения является антиметаболит цитидина, обладающий более высокой эффективностью при низкой дозе и являющийся новым противораковым или противовирусным средством.
Средства решения указанных задач
В результате всестороннего исследования, направленного на решение вышеуказанных проблем, авторы настоящего изобретения создали полимерное производное антиметаболита цитидина, в частности соединение, в структуре которого аминогруппа в положении 4 антиметаболита цитидина связана амидной связью с карбоксильной группой полимерного соединения, состоящего из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях, что легло в основу настоящего изобретения.
В частности, настоящее изобретение относится к нижеследующим объектам (1)-(13).
(1) Полимерное производное антиметаболита цитидина, в структуре которого аминогруппа антиметаболита цитидина связана амидной связью с карбоксильной группой в боковой цепи полимерного соединения, состоящего из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях.
(2) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (1), в котором полимерная часть, содержащая карбоксильные группы в боковых цепях, включает цепь полиглутаминовой кислоты.
(3) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (1) или (2), которое является соединением, выраженным общей формулой (1):
Формула 1
где R означает атом водорода или С1-С6 алкильную группу; А означает атом водорода, С1-С6 ацильную группу или С1-С6 алкоксикарбонильную группу; m означает число от 3 до 200 в виде среднего значения; n означает число от 5 до 2000 в виде среднего значения; Х означает остаток антиметаболита цитидина, гироксильную группу или гидрофобный заместитель, причем Х означает остаток антиметаболита цитидина в количестве 3-100% m, гидроксильную группу в количестве 0-95% m и гидрофобный заместитель в количестве 0-80% m.
(4) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (3), в котором R означает С1-С3 алкильную группу; А означает С2-С4 ацильную группу; m означает число от 5 до 100 в виде среднего значения; n означает число от 50 до 1000 в виде среднего значения; и остаток антиметаболита цитидина означает группу, выраженную формулой (2):
Формула 2
где Z означает атом водорода или атом фтора; -Rf означает группу, выбираемую из группы, включающей заместители формулы (3):
Формула 3
(5) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (3), в котором R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; m означает число от 10 до 60 в виде среднего значения; n означает число от 100 до 300 в виде среднего значения; Х означает остаток антиметаболита цитидина или гидроксильную группу; и антиметаболит цитидина означает цитарабин, гемцитабин или 5'-дезокси-5-фторцитидин.
(6) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (3) или (4), в котором гидрофобный заместитель означает производное α-аминокислоты, выраженное формулой (4):
Формула 4
где Q означает боковую цепь нейтральной аминокислоты; W означает С1-С6 алкильную группу или бензильную группу.
(7) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (6), в котором Q означает изопропильную группу или бензильную группу и W означает бензильную группу.
(8) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (3) или (4), в котором гидрофобный заместитель означает группу, выраженную формулой (5):
Формула 5
О-Т (5)
где Т означает С1-С6 алкильную группу, необязательно замещенную фенильной группой.
(9) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (8), в котором Т означает бензильную группу, 3-фенилпропильную группу, 4-фенилбутильную группу или 5-фенилпентильную группу.
(10) Полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в приведенном выше пункте (3), в котором R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; m означает число от 10 до 60 в виде среднего значения; n означает число от 100 до 300 в виде среднего значения; антиметаболит цитидина означает цитарабин, гемцитабин или 5'-дезокси-5-фторцитидин; и гидрофобный заместитель означает бензилоксигруппу, 4-фенилбутоксильную группу, (1-бензилоксикарбонил-2-метил)пропиламиногруппу или (1-бензил-оксикарбонил-2-фенил)этиламиногруппу.
(11) Противоопухолевое средство, содержащее полимерное производное антиметаболита цитидита, описанное в любом из приведенных выше пунктов (1)-(10), в качестве лекарственного компонента.
(12) Противовирусное средство, содержащее полимерное производное антиметаболита цитидина, описанное в любом из приведенных выше пунктов (1)-(10), в качестве лекарственного компонента.
(13) Способ получения полимерного производного антиметаболита цитидина, описанного в любом из приведенных выше пунктов (1)-(10), который включает связывание амидной связью, с использованием агента для дегидроконденсации в органическом растворителе, аминогруппы антиметаболита цитидина с карбоксильной группой в боковой цепи полимерного соединения, состоящего из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях.
Эффект изобретения
Полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изобретению имеет структуру, в которой аминогруппа в положении 4 антиметаболита цитидина связана амидной связью с карбоксильной группой полимерного соединения, состоящего из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях. Указанное производное может медленно высвобождать антиметаболит цитидина in vivo и пригодно для использования в качестве противоракового или противовирусного средства, оказывающего великолепное терапевтическое действие при низкой дозе. Кроме того, благодаря медленному высвобождению лекарственного средства независимо от фермента на терапевтическое действие указанного производного в меньшей степени влияют индивидуальные особенности подлежащих лечению субъектов. Полимерное производное, образующее мицеллы, избирательно накапливается в пораженной части тела и характеризуется более высокой эффективностью при менее выраженных боковых эффектах.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 изображен график, показывающий время высвобождения лекарственного средства при отсутствии фермента.
На фиг.2 изображен график, показывающий время высвобождения лекарственного средства в плазме мыши.
Лучший вариант осуществления изобретения
Полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изоретению имеет структуру, в которой аминогруппа антиметаболита цитидина связана амидной связью с карбоксильной группой в боковой цепи полимерного соединения, состоящего из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях.
В соответствии с целями настоящего изобретения термин “антиметаболит цитидина” не имеет конкретных ограничений при условии, что антиметаболит цитидина является производным 4-аминопиримидин-2-она, обладает противоопухолевой или противовирусной активностью и представляет собой соединение, выраженное формулой (2), в котором часть основания нуклеиновой кислоты является цитозином (где Z означает атом водорода) или 5-фторцитозином (где Z означает атом фтора); и связанная с ним группа (Rf) является группой, выбираемой из группы, включающей заместители приведенной выше формулы (3).
Конкретные примеры антиметаболита цитидина включают цитарабин, гемцитабин, 2'-дезокси-2'-метилиденцитидин (DMDC), тезацитабин, зальцитабин, ламивудин, 5'-дезокси-5-фторцитидин (5'-DFCR), троксацитабин, 2'-С-циано-2'-дезокси-1-β-D-арабинофуранозилцитозин (CNDAC), 3'-этинилцитидин и (-)-β-L-диоксоланцитидин.
В соответствии с настоящим изобретением примеры полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях, в термине “полимерное соединение, состоящее из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях”, включают привитой сополимер, в котором цепи карбоновой кислоты ответвляются от главной цепи полимера, или блоксополимер, в котором конденсированы полимеры поликарбоновой кислоты.
Примеры полимерного соединения, в котором полимерная часть, содержащая карбоксильные группы в боковых цепях, является привитым сополимером, включают полимер, полученный, например, в результате сополимеризации конденсата полиэтиленгликоля и акриловой кислоты с акриловой кислотой, малеиновым ангидридом или тому подобным, с последующим выполнением необязательного гидролиза, в соответствии с описанием, приведенным в публикации заявки на патент Японии (KOKAI) № 11-279083.
Примеры полимерного соединения, в котором полимерная часть, содержащая карбоксильные группы в боковых цепях, является блоксополимером, включают соединение, в котором полиэтиленгликоль, имеющий концевую функциональную группу, связан с поликарбоновой кислотой, имеющей концевую функциональную группу, или соединение, полученное в результате полимеризации соединения, активированного аминокислотой, в котором полимеризация начинается с полиэтиленгликоля, имеющего концевую аминогруппу, в соответствии с описанием, приведенным в патентном документе 3.
Примеры полимера, содержащего карбоксильные группы в боковых цепях, включают полиакриловую кислоту, полиметакриловую кислоту, полимер яблочной кислоты и полиглутаминовую кислоту; при этом предпочтительной кислотой является полиглутаминовая кислота.
В соответствии с целями настоящего изобретения “полиэтиленгликоль” может быть производным полиэтиленгликоля, у которого модифицированы оба или один конец, при этом группы, модифицирующие оба конца, могут быть одинаковыми или разными. Примеры концевой модифицирующей группы включают С1-С6 алкильную группу, необязательно имеющую заместитель; предпочтительной группой является С1-С4 алкильная группа, необязательно имеющая заместитель.
Примеры С1-С6 алкильной группы в С1-С6 алкильной группе, необязательно имеющей заместитель, включают С1-С6 алкильную группу с прямой или разветвленной цепью или циклической структурой. Конкретные примеры такой группы включают метильную группу, этильную группу, пропильную группу, изопропильную группу, бутильную группу, изобутильную группу, трет-бутильную группу, пентильную группу, изопентильную группу, 2-метилбутильную группу, неопентильную группу, 1-этилпропильную группу, гексильную группу, 4-метилпентильную группу, 3-метилпентильную группу, 2-метилпентильную группу, 1-метилпентильную группу, 3,3-диметилбутильную группу, 2,2-диметил-бутильную группу, 1,1-диметилбутильную группу, 1,2-диметилбутильную группу, 1,3-диметилбутильную группу, 2,3-диметилбутильную группу, 2-этилбутильную группу, циклопропильную группу, циклопентильную группу и циклогексильную группу. Предпочтительной группой является С1-С4 алкильная группа, конкретные примеры которой включают метильную группу, этильную группу, н-пропильную группу, изопропильную группу, н-бутильную группу, втор-бутильную группу и трет-бутильную группу. Особенно предпочтительной группой является метильная группа, этильная группа, н-пропильная группа или изопропильная группа.
Заместитель в С1-С6 алкильной группе, необязательно имеющей заместитель, не имеет конкретных ограничений, и его примеры включают аминогруппу, метиламиногруппу, диметиламиногруппу, этиламиногруппу и диэтиламиногруппу. Предпочтительной группой является аминогруппа.
В соответствии с настоящим изобретением предпочтительным является производное полиэтиленгликоля, у которого модифицированы оба конца. Конкретные примеры такого производного включают производное полиэтиленгликоля, содержащее С1-С6 алкильную группу у одного конца и амино-С1-С6 алкильную группу у другого конца. Предпочтительным производным является производное полиэтиленгликоля, содержащее С1-С3 алкильную группу у одного конца и амино-С1-С4 алкильную группу у другого конца. Особенно предпочтительным является производное полиэтиленгликоля, содержащее метильную группу у одного конца и аминопропильную группу у другого конца.
В соответствии с настоящим изобретением “полиэтиленгликоль” имеет среднюю молекулярную массу, равную примерно 200-500000, предпочтительно примерно 500-100000, более предпочтительно примерно 2000-50000.
В соответствии с настоящим изобретением “полимерное соединение, состоящее из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях”, предпочтительно является блоксополимером, более предпочтительно блоксополимером полиэтиленгликоля и полимера, содержащего карбоксильные группы в боковых цепях.
Примеры блоксополимера полиэтиленгликоля и полимера, содержащего карбоксильные группы в боковых цепях, включают блоксополимер алкоксиполиэтиленгликоля и полиакриловой кислоты, блоксополимер алкоксполиэтиленгликоля и полиметакриловой кислоты и блоксополимер алкоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты; предпочтительным блоксополимером является блоксополимер метоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты.
В соответствии с настоящим изобретением “полимерное соединение, состоящее из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях”, в среднем содержит в одной молекуле от около 3 до 200 карбоксильных групп, предпочтительно от около 5 до 100, более предпочтительно от около 10 до 60.
В соответствии с настоящим изобретением “полимерное соединение, состоящее из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях”, имеет среднюю молекулярная массу, равную примерно 500-500000 предпочтительно примерно 2000-100000, более предпочтительно примерно 3000-50000.
В соответствии с настоящим изобретением количество антиметаболита цитидина, связанного амидной связью с полимерным соединением, состоящим из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях, не имеет конкретных ограничений при условии, что указанное количество находится в пределах от одной до общего числа карбоксильных групп в каждом полимерном соединении и является достаточным для обеспечения действия лекарственного средства при введении in vivo. Предпочтительное количество равно 3-100%, более предпочтительно 5-70% от общего числа карбоксильных групп полимера.
Вышеуказанное связываемое количество можно определить на основании интенсивности ультрафиолетового спектра поглощения соединения по настоящему изобретению. Указанное количество можно также определить, подвергая полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изобретению щелочному гидролоизу для количественного определения высвободившегося антиметаболита цитидина, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Типичным полимерным производным антиметаболита цитидина по настоящему изобретению является соединение, выраженное приведенной выше общей формулой (1), в которой R означает атом водорода или С1-С6 алкильную группу; А означает атом водорода, С1-С6 ацильную группу или С1-С6 алкоксикарбонильную группу; m означает число от 3 до 200 в виде среднего значения; n означает число от 5 до 2000 в виде среднего значения; Х означает остаток антиметаболита цитидина, гидроксильную группу или гидрофобный заместитель, причем Х означает остаток антиметаболита цитидина в количестве 3-100% m, гидроксильную группу в количестве 0-95% m и гидрофобный заместитель в количестве 0-80% m.
В формуле (1) С1-С6 алкильная группа для R имеет такое же значение, что и вышеуказанная алкильная группа; предпочтительная группа также имеет вышеуказанное значение.
Примеры С1-С6 ацильной группы для А в формуле (1) включают формильную группу, ацетильную группу, пропионильную группу, бутирильную группу, изобутирильную группу, валерильную группу, изовалерильную группу, пивалоильную группу и гексаноильную группу. Предпочтительной группой является С2-С4 ацильная группа, например ацетильная или пропионильная группа; более предпочтительной группой является ацетильная группа.
Примеры С1-С6 алкоксикарбонильной группы для А в формуле (1) включают метоксикарбонильную группу, этоксикарбонильную группу, пропоксикарбонильную группу, изопропоксикарбонильную группу, н-бутоксикарбонильную группу, трет-бутоксикарбонильную группу, пентоксикарбонильную группу, гексилоксикарбонильную группу, циклопропоксикарбонильную группу, циклопентилоксикарбонильную группу и циклогексилоксикарбонильную группу. Предпочтительной группой является метоксикарбонильная группа, этоксикарбонильная группа, пропоксикарбонильная группа, изопропоксикарбонильная группа, бутоксикарбонильная группа или трет-бутоксикарбонильная группа; более предпочтительной группой является этоксикарбонильная группа или трет-бутоксикарбонильная группа.
В формуле (1) m означает в виде среднего значения число, равное 3-200, предпочтительно 5-100, более предпочтительно 10-60.
В формуле (1) n означает в виде среднего значения число, равное 5-2000, предпочтительно 50-1000, более предпочтительно 100-300.
В общей формуле (1) полимерного производного антиметаболита цитидина по настоящему изобретению производные глутаминовой кислоты, в которых Х означает остаток антиметаболита цитидина, гидроксильную группу или гидрофобный заместитель, могут быть связаны произвольно или путем образования блоков.
В формуле (1) остаток антиметаболита цитидина для Х означает остаток вышеуказанного антиметаболита цитидина; особенно предпочтительные примеры антиметаболита цитидина включают цитарабин, гемцитабин и 5'-дезокси-5-фторцитидин.
В формуле (1) примеры гидрофобного заместителя для Х включают разные заместители; указанный заместитель не имеет конкретных ограничений при условии, что он не ухудшает лечебное действие полимерного производного антиметаболита цитидина. Однако предпочтительные примеры указанного заместителя включают производное α-аминокислоты, выраженное приведенной выше формулой (4), где Q означает боковую цепь нейтральной аминокислоты; W означает С1-С6 алкильную группу или бензильную группу и группу, выраженную приведенной выше формулой (5), где Т означает С1-С6 алкильную группу, необязательно замещенную фенильной группой.
Примеры боковой цепи нейтральной аминокислоты для Q в формуле (4) включают остатки природных аминокислот, такие как атом водорода, метильная группа, изопропильная группа, изобутильная группа, втор-бутильная группа, бензильная группа, гидроксиметильная группа, 1-гидроксиэтильная группа, карбамоилметильная группа и 2-карбамоилэтильная группа, и производные остатков аминокислот, такие как трет-бутоксиметильная группа, бензилоксиметильная группа, бензилоксикарбонилметильная группа и 2-бензилоксикарбонилэтильная группа. Предпочтительные примеры указанных групп включают изопропильную группу, изобутильную группу, втор-бутильную группу, бензильную группу, бензилоксиметильную группу, бензилоксикарбонилметильную группу и 2-бензилоксикарбонилэтильную группу; более предпочтительной группой является изопропильная группа, бензильная группа, бензилоксиметильная группа или 2-бензилоксикарбонилэтильная группа; особенно предпочтительной группой является изопропильная группа или бензильная группа.
Примеры С1-С6 алкильной группы для W в формуле (4) включают такие же группы, что и вышеуказанная алкильная группа; предпочтительная группа аналогична вышеуказанной группе.
С1-С6 алкильная группа для Т в формуле (5) имеет такие же значения, что и вышеуказанная алкильная группа; предпочтительная группа также аналогична вышеуказанной группе. Примеры группы, выраженной формулой (5), включают метоксильную группу, этоксильную группу, н-пропоксильную группу, изопропоксильную группу, н-бутоксильную группу, трет-бутоксильную группу, н-пентилоксигруппу, н-гексилоксигруппу, циклопропилоксигруппу, циклопентилоксигруппу, циклогексилоксигруппу, циклогексилметоксильную группу, бензилоксигруппу, 2-фенетилоксигруппу, 3-фенилпропоксильную группу, 4-фенилбутоксильную группу, 5-фенилпентилоксигруппу и дифенилметоксильную группу.
Примеры гидрофобного заместителя включают также аминогруппы, такие как метиламиногруппа, этиламиногруппа, н-пропиламиногруппа, изопропиламиногруппа, н-бутиламиногруппа, изобутиламиногруппа, н-пентиламиногруппа, н-гексиламиногруппа, циклопропиламиногруппа, циклопентиламиногруппа, циклогексиламиногруппа, циклогексилметиламиногруппа, дицилогексилметиламиногруппа, анилиновая группа, бензиламиногруппа, 2-фенетиламиногруппа, 3-фенилпропиламиногруппа, 4-фенилбутиламиногруппа и дифенилметиламиногруппа.
Гидрофобный заместитель для Х в формуле (1) особенно предпочтительно является бензилоксигруппой, 3-фенилпропоксильной группой, 4-фенилбутоксильной группой, 5-фенилпентоксильной группой, (1-бензилоксикарбонил-2-метил)пропиламиногруппой или (1-бензилоксикарбонил-2-фенил)этиламиногруппой и более предпочтительно является бензилоксигруппой, 4-фенилбутоксильной группой, (1-бензилоксикарбонил-2-метил)пропиламиногруппой или (1-бензилоксикарбонил-2-фенил)этиламиногруппой.
В формуле (1) доля остатка антиметаболита цитидина для Х составляет 3-100%, предпочтително 5-70% в пересчете на общее число карбоксильных групп (m) полимера; доля гидроксильной группы для Х составляет 0-95%, предпочтительно 5-70% в пересчете на m; и доля гирофобного заместителя для Х составляет 0-80%, предпочтительно 20-70% в пересчете на m.
В полимерном производном антиметаболита цитидина по настоящему изобретению при наличии карбоксильной группы в боковой цепи, с которой не связан антиметаболит цитидина, указанная карбоксильная группа может находиться в свободной форме или в форме соли щелочного металла. Карбоксильная группа, полученная в свободной форме, может быть превращена в требуемую соль методом, известным в данной области, или методом на его основе. И наоборот, карбоксильная группа, полученная в форме соли, может быть превращена в свободную форму или другую требуемую соль методом, известным в данной области, или методом на его основе.
Примеры соли щелочного металла включают соли лития, натрия, калия, магния, аммония и триэтиламмония.
В полимерном производном антиметаболита цитидина по настоящему изобретению структурные единицы, образующие полимерную часть, содержащую карбоксильные группы в боковых цепях, могут быть при наличии оптических изомеров оптически активными веществами, рацематом или их смесью в любой пропорции. Например, когда полимерная часть, содержащая карбоксильные группы в боковых цепях, является производным полиглутаминовой кислоты, указанное производное может быть полимером, в котором поли-L-глутаминовая кислота, поли-D-глутаминовая кислота и L-глутаминовая кислота, замещенная в боковой цепи, или D-глутаминовая кислота, замещенная в боковой цепи, связаны в любом порядке и в любой пропорции.
Особенно предпочтительные примеры полимерного производного антиметаболита цитидина по настоящему изобретению включают соединения, показанные в приведенной ниже таблице 1.
В таблице 1 Bzl означает бензильную группу; Val означает валин; Phe означает фенилаланин и C4H8Ph означает 4-фенилбутильную группу. В графе Х процентные значения замещения являются приблизительными величинами; остальные остатки и группы за исключением остатков и групп, приведенных в таблице, являются гидроксильными группами. В качестве антиметаболитов цитидина для Х использованы нижеследующие соединения: цитарабин, гемцитабин, 5'-дезокси-5-фторцитидин, 2'-дезокси-2'-метилиденцитидин (DMDC), 3'-этинилцитидин, 2'-С-циано-2'-дезокси-1-β-D-арабинофуранозилцитозин (CNDAC) и (-)-β-L-диоксоланцитидин.
Формула 6
(среднее значение)
(среднее значение)
(50%)
(50%)
В качестве конкретного неограничивающего примера можно отметить, что полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изобретению может быть получен конденсацией, с использованием агента для дегидроконденсации в органическом растворителе, антиметаболита цитидина с блоксополимером метоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, полученным способом, описанным в патентном документе 3.
Растворитель, используемый при выполнении вышеуказанной реакции, не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление реакции; однако примеры указанного растворителя включают ароматический углеводород, такой как толуол и ксилол, галогенированный углеводород, такой как метиленхлорид, хлороформ и 1,2-дихлорэтан, простой эфир, такой как тетрагидрофуран, диоксан, диметоксиэтан и диметиловый эфир диэтиленгликоля, нитрил, такой как ацетонитрил и пропионитрил, амид, такой как диметилформамид, диметилацетамид и N-метилпирролидон, мочевину, такую как 1,3-диметилимидазолидинон, и смеси указанных растворителей. Предпочтительным растворителем является амид или мочевина; более предпочтительным растворителем является диметилформамид или 1,3-диметилимидазолидинон.
Агент для дегидроконденсации, используемый в вышеуказанной реакции, не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление реакции конденсации аминогруппы в положении 4 антиметаболита цитидина с карбоксильной группой; однако предпочтительные примеры указанного агента включают DMT-MM (хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния) и 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин.
Температура вышеуказанной реакции обычно равна 4-60°С, предпочтительно 15-50°С.
После выполнения вышеуказанной реакции можно произвести разделение продуктов методами, известными в данной области, такими как, например, концентрирование в вакууме, экстракция растворителем, кристаллизация, диализ и хроматография, при этом при желании выделяют и очищают требуемое соединение.
При помощи вышеуказанного метода можно получить полимерное производное, в котором Х означает только остаток антиметаболита цитидина или остаток антиметаболита цитидина и гидроксильную группу.
Когда полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изобретению имеет гидрофобный заместитель, указанное производное может быть получено конденсацией, с использованием агента для дегидроконденсации в органическом растворителе, аминогруппы антиметаболита цитидина с незамещенной карбоксильной группой в боковой цепи полимерного соединения, состоящего из нижеследующей полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях, которое получают путем введения гидрофобного заместителя в часть карбоксильных групп блоксополимера метоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты, например, способом, описанным в патентном документе 3.
Гидрофобный заместитель вводят следующим образом. Например, когда гидрофобный заместитель является алкоксильной группой, введение осуществляют путем конденсации соответствующего спирта с карбоксильной группой (этерификация) с использованием агента для дегидроконденсации в растворителе или выполнения реакции нуклеофильного замещения соответствующего алкилгалогенида или подобного вещества и карбоксильной группы в присутствии основания в растворителе. Например, когда гидрофобный заместитель является замещенной аминогруппой, производное, имеющее заместитель, можно получить путем конденсации соответствующего амина с карбоксильной группой (амидирование) с использованием агента для дегидроконденсации в растворителе.
Растворитель, используемый в вышеуказанной дегидроконденсации (этерификация), не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление реакции. Однако указанный растворитель может быть аналогичен растворителю, используемому при выполнении дегидроконденсации вышеуказанного блоксополимера метоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты с антиметаболитом цитидина; предпочтительный растворитель также аналогичен вышеуказанному растворителю. Агент для дегидроконденсации не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление дегидроконденсации спирта с карбоксильной группой; однако предпочтительным агентом является дициклогексилкарбодиимид, диизопропилкарбодиимид, 1-диметиламинопропил-3-этилкарбодиимид, карбонилдиимидазол, изобутилхлорформиат или хлорид пивалиновой кислоты.
При выполнении реакции дегидроконденсации может быть использовано вспомогательное вещество; примеры такого вещества включают N-гидроксисукцинимид, 1-гидроксибензотриазол, 4-диметиламинопиридин и 2,6-ди-трет-бутил-4-метилпиридин.
Температура реакции дегидроконденсации обычно равна 4-60°С, предпочтительно 15-50°С. Время реакции составляет от 2 часов до нескольких дней, предпочтительно 4-48 часов.
Растворитель, используемый в вышеуказанной реакции нуклеофильного замещения, не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление реакции. Однако указанный растворитель может быть аналогичен растворителю, используемому при выполнении дегидроконденсации вышеуказанного блоксополимера метоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты с антиметаболитом цитидина; предпочтительный растворитель также аналогичен вышеуказанному растворителю. Примеры основания включают карбонат щелочного металла, такой как карбонат лития, карбонат натрия и карбонат калия; гидрид щелочного металла, такой как гидрид лития, гидрид натрия и гидрид калия; гидроксид щелочного металла, такой как гидроксид лития, гидроксид натрия и гидроксид калия; алкоксид щелочного металла, такой как метоксид лития, метоксид натрия, этоксид натрия и трет-бутоксид калия; и органический амин, такой как триэтиламин, трибутиламин, N,N-диизопропилэтиламин, N-метилморфолин, пиридин, 4-(N,N-диметиламино)пиридин, N,N-диметиланилин, N,N-диэтиланилин, 1,5-диазабицикло[4.3.0]нона-5-ен, 1,4-диаза-бицикло[2.2.2]октан (DABCO) и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен (DBU); предпочтительным амином является органический амин.
Температура вышеуказанной реакции нуклеофильного замещения обычно равна 4-60°С и предпочтительно находится в пределах от комнатной температуры до 50°С. Время реакции составляет от одного часа до нескольких дней, предпочтительно 4-48 часов.
Растворитель, используемый в вышеуказанной реакции дегидроконденсации (реакция амидирования), не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление реакции. Однако указанный растворитель может быть аналогичен растворителю, используемому при выполнении дегидроконденсации вышеуказанного блоксополимера метоксиполиэтиленгликоля и полиглутаминовой кислоты с антиметаболитом цитидина; предпочтительный растворитель также аналогичен вышеуказанному растворителю. Агент для дегидроконденсации не имеет конкретных ограничений при условии, что он делает возможным осуществление дегидроконденсации амина с карбоксильной группой; однако предпочтительным агентом является дициклогексилкарбодиимид, диизопропилкарбодиимид, 1-диметиламинопропил-3-этилкарбодиимид, карбонилдиимидазол, изобутилхлорформиат, хлорид пивалиновой кислоты, DMT-MM (хлорид 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния), TFFH (гексафторфосфат тетраметилфторформамидиния) или ВОР (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония).
При выполнении реакции дегидроконденсации может быть использовано вспомогательное вещество; примеры вспомогательного вещества включают N-гидроксисукцинимид, 1-гидроксибензотриазол, 4-диметиламинопиридин и 2,6-ди-трет-бутил-4-метилпиридин.
Температура реакции дегидроконденсации обычно равна 4-60°С и предпочтительно находится в пределах от комнатной температуры до 50°С. Время реакции составляет от одного часа до нескольких дней, предпочтительно 4-48 часов.
Так как последовательность реакций связывания гидрофобного заместителя и антиметаболита цитидина с полимерным соединением не имеет значения, указанные вещества могут быть смешаны для осуществления взаимодействия. Однако гидрофобный заместитель предпочтительно вводят в полимерный носитель до связывания с ним антиметаболита цитидина во избежание взаимодействия и разложения антиметаболита в качестве объекта активности, содержащего многофункциональную группу.
Полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изобретению может образовывать в воде мицеллы с оболочкой из полиэтиленгликолевой части. Образование мицелл можно идентифицировать, например, при помощи гель-хроматографии (GPC) или динамического рассеяния света.
В соответствии с настоящим изобретением образование мицелл облегчается в результате связывания карбоксильной группы, которая не связана с антиметаболитом цитидина, с гидрофобным заместителем.
В объем настоящего изобретения входит противоопухолевое или противовирусное средство, содержащее вышеописанное полимерное производное антиметаболита цитидина в качестве лекарственного компонента. Полимерное производное антиметаболита цитидина можно вводить в том виде, как оно есть, или в форме фармацевтической композиции, в которой антиметаболит цитидина смешан с фармацевтически приемлемыми веществами. Лекарственная форма фармацевтической композиции может быть любой лекарственной формой, такой как инъекционный раствор, порошок, гранулы, таблетки и суппозитории. Указанные препараты могут также содержать разные вспомогательные вещества для фармацевтического применения, то есть носитель и другие вспомогательные вещества, включающие добавки, такие как стабилизатор, консервант, успокаивающее средство и эмульгатор.
Содержание полимерного производного антиметаболита цитидина в препарате может быть различным в зависимости от препарата; однако указанное количество обычно составляет 0,1-100 мас.%, предпочтительно 1-98 мас.%.
Показание к применению противоопухолевого средства по настоящему изобретению, содержащего полимерное производное антиметаболита цитидина в качестве лекарственного компонента, не имеет конкретных ограничений; однако указанное средство может быть использовано для лечения рака разных типов, таких как, например, немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, рак желудка, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак молочной железы, рак яичника, рак мочевого пузыря и СПИД-ассоциированная саркома Капоши.
Показание к применению противовирусного средства по настоящему изобретению, содержащего полимерное производное антиметаболита цитидина в качестве лекарственного компонента, не имеет конкретных ограничений; однако указанное средство может быть использовано, например, для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), опоясывающего герпеса, инфекционных заболеваний, обусловленных вирусом простого герпеса, и тому подобных, а также для профилактики инфекций.
Полимерное производное антиметаболита цитидина по настоящему изобретению можно вводить любым способом, включающим пероральное введение, инъекции, ректальное введение, интрапортальное введение, введение в составе перфузата и местное введение в пораженный орган. Однако предпочтительным способом введения является парентеральное введение; более предпочтительным способом является внутривенное или внутриартериальное введение в виде инъекции или местное введение в пораженный орган. Доза полимерного производного антиметаболита цитидина по настоящему изобретению может быть различной в зависимости от тяжести заболевания, способа введения, состояния здоровья, возраста, массы тела субъекта и подобных факторов; однако приемлемая доза обычно составляет от 1 мг до 5000 мг, предпочтительно от 10 мг до 2000 мг/м2 площади поверхности тела, и может быть введена один раз в день или отдельными порциями несколько раз в день. Введение можно производить ежедневно или повторять с интервалами от нескольких дней до нескольких месяцев. При необходимости можно использовать способ введения, дозирование и схему введения, отличные от вышеуказанных.
Полимерное производное по настоящему изобретению также включает вещество, в котором связано пролекарство. Пролекарством является химическое производное биологически активного исходного соединения, которое при введении высвобождает исходное соединение in vivo.
Примеры
Настоящее изобретение более подробно описано ниже со ссылкой на примеры, справочные примеры и испытательные примеры. Однако объем настоящего изобретения не ограничивается указанными примерами.
Справочный пример 1. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26
Полиэтиленгликоль, содержащий метоксильную группу у одного конца и 3-аминопропильную группу у другого конца (SUNBRIGHT MEPA-12T корпорации NOF, средняя молекулярная масса 12000, 16 г), растворяли в диметилсульфоксиде (320 мл), добавляли ангидрид N-карбоновой кислоты γ-бензил-L-глутамата (BLG-NCA, 9,48 г; 27 эквивалентов в пересчете на полиэтиленгликоль) и перемешивали при 30°С в течение ночи. Реакционный раствор при перемешивании по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из изопропилового эфира и этанола (4:1, 6,4 л), и перемешивали еще 3 часа. Образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из изопропилового эфира и этанола (4:1, 400 мл). Полученный продукт (22,78 г) растворяли в N,N-диметилформамиде (370 мл), добавляли ангидрид уксусной кислоты (6,83 мл) и перемешивали при 20°С в течение ночи. Полученный раствор при перемешивании по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из изопропилового эфира и этилацетата (4:1, 3,7 л), и перемешивали еще 3 часа. Образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из изопропилового эфира и этилацетата (4:1, 300 мл). Полученный продукт (22,92 г) растворяли в N,N-диметилформамиде (370 мл), добавляли 5% палладий на угле (содержащий 55% воды, 2,50 г) и перемешивали при 30°С в атмосфере водорода в течение 4 часов и затем при комнатной температуре в течение ночи. Палладий на угле отфильтровывали, фильтрат при перемешивании по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из изопропилового эфира и этилацетата (4:1, 5 л), и перемешивали в течение еще одного часа. Образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из изопропилового эфира и этилацетата (4:1, 300 мл). Полученный продукт (16 г) растворяли в дистиллированной воде (800 мл), добавляли 1 М водный раствор гидроксида натрия и доводили рН раствора до 11. Добавляли дистиллированную воду до достижения конечного объема раствора, равного 1600 мл, после чего добавляли хлорид натрия (80 г). Полученный раствор пропускали через колонку с адсорбирующей смолой НР-20ss (корпорации Mitsubishi Chemical Corporation, 500 мл); колонку промывали 5% водным раствором хлорида натрия (2000 мл) и дистиллированной водой (20000 мл) и элюировали 50% водным раствором ацетонитрила (2500 мл). Элюированную фракцию, содержащую требуемое соединение, пропускали через колонку с катионообменной смолой Dowex 50W (компании Dow Chemical Company, протонного типа, 10 мл); колонку элюировали 50% водным раствором ацетонитрила (150 мл). Элюированную фракцию, содержащую требуемое соединение, концентрировали при пониженном давлении до достижения объема раствора около 300 мл и сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (15,84 г).
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 26,22 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 2. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 41
В соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, для получения указанного в заголовке соединения было использовано 45 эквивалентов BLG-NCA в пересчете на полиэтиленгликоль.
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 41,45 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 3. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 24
В соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, для получения указанного в заголовке соединения было использовано 25 эквивалентов BLG-NCA в пересчете на полиэтиленгликоль.
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 23,70 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 4. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 32
В соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, для получения указанного в заголовке соединения было использовано 35 эквивалентов BLG-NCA в пересчете на полиэтиленгликоль.
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 31,71 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 5. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 36
В соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, для получения указанного в заголовке соединения было использовано 40 эквивалентов BLG-NCA в пересчете на полиэтиленгликоль.
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 35,90 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 6. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 21
В соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, для получения указанного в заголовке соединения было использовано 23 эквивалента BLG-NCA в пересчете на полиэтиленгликоль.
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 21,38 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 7. Синтез N-ацетилированного блоксополимера монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26
В соответствии со способом, описанным в справочном примере 1, для получения указанного в заголовке соединения было использовано 30 эквивалентов BLG-NCA в пересчете на полиэтиленгликоль.
Средний показатель полимеризации глутаминовой кислоты (количество карбоновых кислот) в одной молекуле соединения был равен 26,48 на основании показателя титрования, полученного при использовании водного раствора гидроксида натрия.
Справочный пример 8. Синтез амидного конъюгата сложного бензилового эфира L-фенилаланина с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 24
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 24 (1,533 г), описанный в справочном примере 3, растворяли в N,N-диметилформамиде (32 мл), добавляли 4-толуолсульфонат сложного бензилового эфира L-фенилаланина (0,464 г), TFFH (0,286 г), N,N-диизопропилэтиламин (0,672 мл) и 2,6-ди-трет-бутил-4-метилпиридин (0,495 г) и перемешивали смесь при 37°С в течение 20 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (64 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (256 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 30% водном растворе ацетонитрила (45 мл), диализировали дистиллированной водой (2 л × 3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). К диализированному раствору добавляли ацетонитрил (15 мл), смесь пропускали через катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа) и элюировали 50% водным раствором ацетонитрила. Элюированную фракцию, содержащую требуемое соединение, концентрировали при пониженном давлении до 1/2 объема и сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (1,689 г).
Полученное соединение гидролизовали и производили количественное определение высвобожденного бензилового спирта при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для измерения степени связывания амидной связью группы Phe-OBzl в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 32,8% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Метод гидролиза
Указанное в заголовке соединение (34,48 мг) растворяли в метаноле (1 мл), добавляли 0,5 М водный раствор гидроксида натрия (1 мл) и перемешивали при 40°С в течение одного часа. Раствор нейтрализовали уксусной кислотой и разбавляли дистиллированной водой, получая точно 5 мл раствора.
Условия выполнения анализа методом ВЭЖХ (анализ бензилового спирта):
колонка: Inertsil ODS-3 (размер частиц: 5 мкм), диаметр 4,6 х 150 мм;
температура колонки: 40°С;
элюент: раствор А: 1% водный раствор фосфорной кислоты, раствор В: ацетонитрил;
градиент: % раствора В (время: минуты) 30 (0), 80 (10);
скорость потока: 1 мл/мин;
детектор (длина волны обнаружения): УФ (260 нм).
Справочный пример 9. Синтез амидного конъюгата сложного бензилового эфира L-фенилаланина с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 41
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля c молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 41 (176,5 мг), описанный в справочном примере 2, растворяли в N,N-диметилформамиде (5,3 мл), добавляли 4-толуолсульфонат сложного бензилового эфира L-фенилаланина (63,0 мг), TFFH (38,9 мг), N,N-диизопропилэтиламин (117,3 мкл) и 2,5-ди-трет-бутил-4-метилпиридин (87,0 мг) и перемешивали смесь при 37°С в течение 22 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (10,6 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (42,4 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 20% водном растворе ацетонитрила (16 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л × 3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор пропускали через катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа, 9 мл) и элюировали 50% водным раствором ацетонитрила. Элюированную фракцию, содержащую требуемое соединение, сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (194,0 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в справочном примере 8, и производили количественное определение высвободившегося бензилового спирта при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в справочном примере 8, для измерения степени связывания амидной связью группы Phe-OBzl в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 32,6% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Справочный пример 10. Синтез амидного конъюгата сложного бензилового эфира L-фенилаланина с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 32
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 32 (668 мг), описанный в справочном примере 4, растворяли в N,N-диметилформамиде (13 мл), добавляли 4-толуолсульфонат сложного бензилового эфира L-фенилаланина (282 мг), TFFH (175 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (345 мкл) и перемешивали смесь при 40°С в течение 20 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (26 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (104 мл). Образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 50% водном растворе ацетонитрила (16 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л × 3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор пропускали через катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа, 10 мл) и элюировали 50% водным раствором ацетонитрила. Элюированную фракцию, содержащую требуемое соединение, сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (762 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в справочном примере 8, и производили количественное определение высвободившегося бензилового спирта при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в справочном примере 8, для измерения степени связывания амидной связью группы Phe-OBzl в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 41,9% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Справочный пример 11. Синтез амидного конъюгата сложного бензилового эфира L-валина с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 36
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 36 (531 мг), описанный в справочном примере 5, растворяли в N,N-диметилформамиде (10,6 мл), добавляли 4-толуолсульфонат сложного бензилового эфира L-валина (195 мг), TFFH (135 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (288 мкл) и перемешивали смесь при 40°С в течение 30 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (20 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (80 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 30% водном растворе ацетонитрила (25 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). К диализированному раствору добавляли катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа, 3 мл), перемешивали в течение 30 минут и отфильтровывали смолу. Фильтрат, содержащий требуемое соединение, сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (559 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в справочном примере 8, и производили количественное определение высвободившегося бензилового спирта при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в справочном примере 8, для измерения степени связывания амидной связью группы Val-OBzl в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 41,3% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Справочный пример 12. Синтез амидного конъюгата сложного бензилового эфира L-фенилаланина с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26 (6,00 мг), описанный в справочном примере 1, растворяли в N,N-диметилформамиде (150 мл), добавляли гидрохлорид сложного бензилового эфира L-фенилаланина (2,08 мг), DMT-MM (2,37 мг) и N,N-диизопропилэтиламин (1,24 мкл) и перемешивали смесь при 40°С в течение ночи. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из диизопропилового эфира и этанола (4:1, 1500 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 97 мас.% водном растворе ДМФА (150 мл), добавляли катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа, 15 мл), смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов, смолу отфильтровывали и промывали ДМФА (75 мл). Полученный фильтрат по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из диизопропилового эфира и этанола (4:1) (2400 мл), перемешивали в течение 30 минут и собирали образовавшийся остаток фильтрованием, получая при этом указанное в заголовке соединение (6,88 г).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в справочном примере 8, и производили количественное определение высвободившегося бензилового спирта при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в справочном примере 8, для измерения степени связывания амидной связью группы Phe-OBzl в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 62,4% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Справочный пример 13. Синтез сложноэфирного конъюгата бензилбромида с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26 (342 мг), описанный в справочном примере 1, растворяли в N,N-диметилформамиде (6,8 мл), добавляли бензилбромид (29,0 мкл) и N,N-диизопропилэтиламин (53,1 мкл) и перемешивали смесь при 37°С в течение ночи. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (13,6 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (54,4 мл). Смесь перемешивали в течение одного часа, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 50% водном растворе ацетонитрила (20 мл), раствор пропускали через катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа, 4 мл) и элюировали 50% водным раствором ацетонитрила. Элюированную фракцию, содержащую требуемое соединение, концентрировали при пониженном давлении до 1/2 объема и сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (352 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в справочном примере 8, и производили количественное определение высвободившегося бензилового спирта при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в справочном примере 8, для измерения степени связывания амидной связью группы OBzl в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 25,0% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Справочный пример 14. Синтез сложноэфирного конъюгата 4-фенил-бутилбромида с N-ацетилированным блоксополимером монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 26 (2,33 г), описанный в справочном примере 7, растворяли в N,N-диметилформамиде (50 мл), добавляли 4-фенилбутилбромид (682 мг) и 1,8-диазабицикло[5.4.0]-7-ундецен (DBU, 598 мкл) и перемешивали смесь при 38°С в течение ночи. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из диизопропилового эфира и этанола (4:1, 500 мл). Смесь перемешивали в течение одного часа, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 50% водном растворе ацетонитрила, добавляли катионообменную смолу Dowex 50W (протонного типа, 5 мл), смесь перемешивали в течение 2 часов, смолу отфильтровывали и фильтрат сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (2,54 г).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в справочном примере 8, и производили количественное определение высвободившегося 4-фенилбутанола при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для измерения степени связывания 4-фенилбутоксильной группы в соединении. В результате выполненного измерения степень связывания была определена равной 65,7% в пересчете на карбоксильные группы полиглутаминовой кислоты.
Пример 1. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 21 и Х означает гемцитабин или гидроксильную группу
N,N-Диметилформамид (15 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (192 мкл) добавляли к N-ацетилированному блоксополимеру монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 21 (759 г), описанному в справочном примере 6, и гидрохлориду гемцитабина (330 мг) и перемешивали при 37°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 300 мг) и перемешивали при 37°С в течение 20 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (30 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (120 мл). Смесь перемешивали в течение одного часа, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 25% водном растворе ацетонитрила (40 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (1,078 мг).
Полученное соединение гидролизовали и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для измерения содержания гемцитабина в соединении. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 20,8% (мас/мас) (58,0% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 0,3% или меньше.
Метод гидролиза
Указанное в заголовке соединение (3,60 мг) растворяли в метаноле (0,5 мл), добавляли концентрированную аммиачную воду (0,5 мл), герметизировали и перемешивали при 37°С в течение одного часа. Раствор нейтрализовали уксусной кислотой и разбавляли дистиллированной водой, получая точно 10 мл раствора.
Условия выполнения анализа методом ВЭЖХ (анализ гемцитабина):
колонка: Inertsil ODS-3 (размер частиц: 5 мкм), диаметр 4,6 х 150 мм;
температура колонки: 40°С;
элюент: 95% фосфатного буфера (10 мМ, рН 6,9) - 5% ацетонитрила;
скорость потока: 1 мл/мин;
детектор (длина волны обнаружения): УФ (275 нм).
Пример 2. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 24 и Х означает гемцитабин, гидроксильную группу или остаток сложного бензилового эфира L-фенилаланина
N,N-Диметилформамид (26 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (0,213 мл) добавляли к соединению (1,298 г), описанному в справочном примере 8, и гидрохлориду гемцитабина (0,366 г) и перемешивали при 37°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 0,362 г) и перемешивали при 37°С в течение ночи. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (52 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (208 мл). Смесь перемешивали в течение одного часа, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 25% водном растворе ацетонитрила (40 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (1,330 г).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 1, и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 1, для измерения содержания гемцитабина в соединении. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 10,7% (мас/мас) (28,1% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 0,3% или меньше.
Пример 3. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 41 и Х означает гемцитабин, гидроксильную группу или остаток сложного бензилового эфира L-фенилаланина
N,N-Диметилформамид (3,3 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (39,2 мкл) добавляли к соединению (165 г), описанному в справочном примере 9, и гидрохлориду гемцитабина (67,4 мг) и перемешивали при 37°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 56,0 мг) и перемешивали при 37°С в течение 23 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (6,6 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (26,4 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 10% водном растворе ацетонитрила (16 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (183 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 1, и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 1, для измерения содержания гемцитабина в соединении по настоящему изобретению. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 21,2% (мас/мас) (42,6% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 0,3% или меньше.
Пример 4. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 26 и Х означает гемцитабин, гидроксильную группу или бензилоксигруппу
N,N-Диметилформамид (6 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (63,1 мкл) добавляли к соединению (295 г), описанному в справочном примере 13, и гидрохлориду гемцитабина (108,5 мг) и перемешивали при 37°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 98,2 мг) и перемешивали при 37°С в течение 23 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (12 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (48 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 10% водном растворе ацетонитрила (16 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (334 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 1, и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 1, для измерения содержания гемцитабина в соединении по настоящему изобретению. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 20,5% (мас/мас) (49,9% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 5,1%.
Пример 5. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 36 и Х означает гемцитабин, гидроксильную группу или остаток сложного бензилового эфира L-валина
N,N-Диметилформамид (10,3 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (77,9 мкл) добавляли к соединению (515 мг), описанному в справочном примере 11, и гидрохлориду гемцитабина (134 мг) и перемешивали при 40°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 166 мг) и перемешивали при 40°С в течение 20 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (20,6 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (82,4 мл). Образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 30% водном растворе ацетонитрила (20 мл) и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (574 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 1, и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 1, для измерения содержания гемцитабина в соединении по настоящему изобретению. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 14,1% (мас/мас) (28,8% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 0,2% или меньше.
Пример 6. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 26 и Х означает гемцитабин, гидроксильную группу или остаток сложного бензилового эфира L-фенилаланина
N,N-Диметилформамид (75 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (286 мкл) добавляли к соединению (3,0 г), описанному в справочном примере 12, и гидрохлориду гемцитабина (492 мг) и перемешивали при 40°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 508 мг) и перемешивали при 40°С в течение 24 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из диизопропилового эфира и этанола (4:1) (750 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 50% водном растворе ацетонитрила (50 мл) и диализировали дистиллированной водой (3 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (2,94 г).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 1, и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 1, для измерения содержания гемцитабина в соединении. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 4,67% (мас/мас) (11,9% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 0,2% или меньше.
Пример 7. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 26 и Х означает гемцитабин, гидроксильную группу или остаток 4-фенилбутилового спирта
N,N-Диметилформамид (50 мл) и N,N-диизопропилэтиламин (218 мкл) добавляли к соединению (2,07 г), описанному в справочном примере 14, и гидрохлориду гемцитабина (375 мг) и перемешивали при 40°С. После растворения смеси добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 386 мг) и перемешивали при 40°С в течение 24 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры и по каплям добавляли к смешанному растворителю, состоящему из диизопропилового эфира и этанола (4:1, 750 мл). Смесь перемешивали в течение одного часа, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 50% водном растворе ацетонитрила (25 мл) и диализировали дистиллированной водой (3 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (2,05 г).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 1, и производили количественное определение высвободившегося гемцитабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 1, для измерения содержания гемцитабина в соединении по настоящему изобретению. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 7,35% (мас/мас) (17,5% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде гидрохлорида гемцитабина. Кроме того, когда соединение по настоящему изобретению подвергали анализу ВЭЖХ, содержание свободного гемцитабина было равно 0,2% или меньше.
Пример 8. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 32 и Х означает цитарабин или гидроксильную группу
N-ацетилированный блоксополимер монометоксиполиэтиленгликоля с молекулярной массой около 12000 и полиглутаминовой кислоты с показателем полимеризации, равным примерно 32 (130 мг), описанный в справочном примере 4, и цитарабин (50,0 мг) растворяли в N,N-диметилформамиде (2,6 мл), добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 63,6 мг) и перемешивали при 40°С в течение 24 часов. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (5,2 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (20,8 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 20% водном растворе ацетонитрила и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (143 мг).
Полученное соединение гидролизовали и производили количественное определение высвободившегося цитарабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для измерения содержания цитарабина в соединении. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 22,5% (мас/мас) (59,2% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде цитарабина.
Метод гидролиза
Указанное в заголовке соединение (3,20 мг) растворяли в метаноле (0,5 мл), добавляли концентрированную аммиачную воду (0,5 мл), герметизировали и перемешивали при 37°С в течение одного часа. Раствор нейтрализовали уксусной кислотой и разбавляли дистиллированной водой, получая точно 10 мл раствора.
Условия выполнения анализа методом ВЭЖХ (анализ цитарабина):
колонка: SUPELCO Discovery HS F5 (размер частиц: 5 мкм), диаметр 4,6 × 250 мм;
температура колонки: 40°С;
элюент: фосфатный буфер (10 мМ, рН 6,9);
скорость потока: 1 мл/мин;
детектор (длина волны обнаружения): УФ (275 нм).
Пример 9. Полимерное производное антиметаболита цитидина формулы (1), в которой R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; среднее значение n равно 272; среднее значение m равно 32 и Х означает цитарабин, гидроксильную группу или остаток сложного бензилового эфира L-фенилаланина
Соединение (267 мг), описанное в справочном примере 10, и цитарабин (50,0 мг) растворяли в N,N-диметилформамиде (5,3 мл), добавляли 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолин (EEDQ, 63,6 мг) и перемешивали при 40°С в течение 21 часа. Реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, разбавляли этанолом (10,6 мл) и при перемешивании по каплям добавляли диизопропиловый эфир (42,4 мл). Смесь перемешивали в течение 30 минут, образовавшийся осадок собирали фильтрованием и промывали смешанным растворителем, состоящим из диизопропилового эфира и этанола (4:1). Полученный продукт растворяли в 30% водном растворе ацетонитрила и диализировали дистиллированной водой (2 л ×3) через диализирующую мембрану (отсекающую молекулярную массу от 12000 до 14000). Диализированный раствор сушили вымораживанием, получая при этом указанное в заголовке соединение (290 мг).
Полученное соединение гидролизовали так же, как в примере 8, и производили количественное определение высвободившегося цитарабина при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в условиях, аналогичных указанным в примере 8, для измерения содержания цитарабина в соединении. В результате выполненного измерения указанное количество было определено равным 11,3% (мас/мас) (31,5% в пересчете на карбоксильные группы поликарбоновой кислоты) в виде цитарабина.
Испытательный пример 1. Исследование высвобождения лекарственного средства при отсутствии фермента
Соединение по примеру 1 (указано как соединение 1 на фиг.1), соединение по примеру 2 (указано как соединение 2 на фиг.1) или соединение по примеру 7 (указано как соединение 7 на фиг.1) растворяли в физиологическом растворе с фосфатным буфером (рН 7,4) до достижения концентрации, равной 1,0 мг/мл, и оставляли выстаиваться при постоянной температуре, равной 37°С. Количество высвободившегося гемцитабина измеряли в зависимости от времени при помощи ВЭЖХ для определения процентного значения количества высвободившегося гемцитабина в пересчете на общее количество гемцитабина в использованном соединении. Полученные результаты показаны на фиг.1. В результате выполненного исследования было установлено, что соединения по настоящему изобретению медленно высвобождают лекарственные средства независимо от фермента.
Испытательный пример 2. Исследование высвобождение лекарственного средства в плазме мыши
Соединение по примеру 1 (2,3 мг; указано как соединение 1 на фиг.2) или соединение по примеру 2 (3,7 мг; указано как соединение 2 на фиг.2) растворяли в физиологическом растворе с фосфатным буфером (0,1 мл, рН 7,4), добавляли 4-кратное количество (об/об) плазмы (0,4 мл), полученной у мышей, и оставляли смесь выстаиваться при постоянной температуре, равной 37°С. В течение определенного периода времени отбирали аликвоты в количестве пятидесяти микролитров и разбавляли 50% водным раствором метанола (450 мкл). Раствор депротеинизировали, используя мембранный фильтр (размер пор: 0,45 мкм), и измеряли количество высвободившегося гемцитабина при помощи ВЭЖХ для определения процентного значения количества высвободившегося гемцитабина в пересчете на общее количество гемцитабина в использованном соединении. Полученные результаты показаны на фиг.2. Было установлено, что соединения по настоящему изобретению также медленно высвобождают лекарственные средства в плазме.
Испытательный пример 3. Противоопухолевое действие, оказываемое на мышей, страдающих раком (1)
У мышей вызывали карциному ободочной кишки путем серийной подкожной имплантации опухоли мышей Colon 26. Опухоль Colon 26 разрезали на квадратные фрагменты размером около 2 мм и полученные фрагменты опухоли подкожно имплантировали мышам при помощи троакара. Через семь дней после имплантации опухоли соединение по примеру 1 (указано как соединение 1 в таблице 2), соединение по примеру 2 (указано как соединение 2 в таблице 2), соединение по примеру 4 (указано как соединение 4 в таблице 2) и гидрохлорид гемцитабина в качестве контрольного средства растворяли в 5% инъекционном растворе глюкозы, после чего каждое соединение или контрольное средство вводили внутривенно один раз в дозах, указанных в таблице 2. Размер опухоли измеряли в день введения и на 7-й день после введения лекарственного средства и высчитывали объемы опухоли, используя нижеследующее уравнение. Относительные объемы опухолей определяли через 7 дней после введения по сравнению с первым днем введения. Результаты приведены в таблице 2.
Уравнение 1
Из полученных результатов следует, что соединения по настоящему изобретению обладают эквивалентным или более высоким противоопухолевым действием при более низких дозах по сравнению с гидрохлоридом гемцитабина, используемым в качестве контрольного средства. Кроме того, было установлено, что соединение по настоящему изобретению, содержащее гидрофобный заместитель (соединение по примеру 2 или 4), оказывает сравнимое действие при еще более низких дозах по сравнению с соединением, не имеющим гидрофобного заместителя (соединение по примеру 1).
Испытательный пример 4. Противоопухолевое действие, оказываемое на мышей, страдающих раком (2)
У мышей вызывали карциному ободочной кишки путем серийной подкожной имплантации опухоли мышей Colon 26. Опухоль Colon 26 разрезали на квадратные фрагменты размером около 2 мм и полученные фрагменты опухоли подкожно имплантировали мышам при помощи троакара. Через семь дней после имплантации опухоли соединение по примеру 7 (указано как соединение 7 в таблице 3) и гемцитабин в качестве контрольного средства растворяли в 5% инъекционном растворе глюкозы и вводили внутривенно один раз в дозах, указанных в таблице 3. Объемы опухолей высчитывали в день введения и на 10-й день после введения лекарственного средства в соответствии с описанием, приведенным в испытательном примере 3. Относительные объемы опухолей определяли через 10 дней после введения по сравнению с первым днем введения. Результаты приведены в таблице 3.
Из полученных результатов следует, что соединение по настоящему изобретению обладает эквивалентным или более высоким противоопухолевым действием при более низких дозах по сравнению с гидрохлоридом гемцитабина, используемым в качестве контрольного средства.
Испытательный пример 5. Противоопухолевое действие, оказываемое на мышей, страдающих раком (3)
У мышей вызывали карциному ободочной кишки путем серийной подкожной имплантации опухоли мышей Colon 26. Опухоль Colon 26 разрезали на квадратные фрагменты размером около 2 мм и полученные фрагменты опухоли подкожно имплантировали мышам при помощи троакара. Через семь дней после имплантации опухоли соединение по примеру 8 (указано как соединение 8 в таблице 4), соединение по примеру 9 (указано как соединение 9 в таблице 4) и цитарабин в качестве контрольного средства растворяли в 5% инъекционном растворе глюкозы, после чего каждое соединение или контрольное средство вводили внутривенно один раз в дозах, указанных в таблице 4. Объемы опухолей высчитывали в день введения и на 10-й день после введения лекарственного средства в соответствии с описанием, приведенным в испытательном примере 3. Относительные объемы опухолей определяли через 10 дней после введения по сравнению с первым днем введения. Результаты приведены в таблице 4.
** Постоянное введение в течение пяти дней в дозе, равной 100 мг/кг
Из полученных результатов следует, что соединения по настоящему изобретению обладают более сильным противоопухолевым действием при более низких дозах по сравнению с цитарабином, используемым в качестве контрольного средства. Кроме того, было установлено, что соединение, содержащее гидрофобный заместитель (соединение по примеру 9), оказывает сравнимое действие при еще более низких дозах по сравнению с соединением, не имеющим гидрофобного заместителя (соединение по примеру 8).
Настоящее изобретение относится к полимерному производному антиметаболита цитидина формулы (1), которое может быть использовано в качестве противоопухолевого средства:
где R - водород или алкил; А - водород, ацил или алкоксикарбонил; m - от 3 до 200; n - от 5 до 2000; Х - остаток антиметаболита цитидина, гидроксил или гидрофобный заместитель, причем Х означает остаток антиметаболита цитидина в количестве 3-100% m, гидроксил - в количестве 0-95% m и гидрофобный заместитель - в количестве 0-80% m. Технический результат - получение новых противоопухолевых соединений. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.
1. Полимерное производное антиметаболита цитидина, в структуре которого аминогруппа антиметаболита цитидина связана амидной связью с карбоксильной группой в боковой цепи полимерного соединения, состоящего из полиэтиленгликолевой части и цепи полиглутаминовой кислоты, при этом вышеуказанное производное является соединением, выраженным общей формулой (1):
Формула 1
где R означает атом водорода или С1-С6 алкильную группу; А означает атом водорода, С1-С6 ацильную группу или С1-С6 алкоксикарбонильную группу; m означает число от 3 до 200 в виде среднего значения; n означает число от 5 до 2000 в виде среднего значения; Х означает остаток антиметаболита цитидина, гидроксильную группу или гидрофобный заместитель, причем Х означает остаток антиметаболита цитидина в количестве 3-100% m, гидроксильную группу в количестве 0-95% m и гидрофобный заместитель в количестве 0-80% m, и где остаток антиметаболита цитидина означает группу, выраженную формулой (2):
Формула 2
где Z означает атом водорода или атом фтора; Rf означает группу, выбранную из группы, состоящей из заместителей формулы (3):
Формула 3
и где гидрофобный заместитель означает производное α-аминокислоты, выраженное формулой (4):
Формула 4
где Q означает боковую цепь нейтральной аминокислоты; W означает С1-С6 алкильную группу или бензильную группу; или группу, выраженную формулой (5):
Формула 5
где Т означает С1-С6 алкильную группу, необязательно замещенную фенильной группой.
2. Полимерное производное антиметаболита цитидина по п.1, в котором R означает С1-С3 алкильную группу; А означает С2-С4 ацильную группу; m означает число от 5 до 100 в виде среднего значения; n означает число от 50 до 1000 в виде среднего значения.
3. Полимерное производное антиметаболита цитидина по п.1, в котором R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; m означает число от 10 до 60 в виде среднего значения; n означает число от 100 до 300 в виде среднего значения; Х означает остаток антиметаболита цитидина или гидроксильную группу; и антиметаболит цитидина означает цитарабин, гемцитабин или 5'-дезокси-5-фторцитидин.
4. Полимерное производное антиметаболита цитидина по п.1 или 2, в котором Q означает изопропильную группу или бензильную группу, и W означает бензильную группу.
5. Полимерное производное антиметаболита цитидина по п.1 или 2, в котором Т означает бензильную группу, 3-фенилпропильную группу, 4-фенилбутильную группу или 5-фенилпентильную группу.
6. Полимерное производное антиметаболита цитидина по п.1, в котором R означает метильную группу; А означает ацетильную группу; m означает число от 10 до 60 в виде среднего значения; n означает число от 100 до 300 в виде среднего значения; антиметаболит цитидина означает цитарабин, гемцитабин или 5'-дезокси-5-фторцитидин и гидрофобный заместитель означает бензилоксигруппу, 4-фенилбутоксильную группу, (1-бензилоксикарбонил-2-метил)пропиламиногруппу или (1-бензилоксикарбонил-2-фенил)этиламиногруппу.
7. Противоопухолевое средство, содержащее полимерное производное антиметаболита цитидина по любому из пп.1-6, в качестве лекарственного компонента.
8. Способ получения полимерного производного антиметаболита цитидина по любому из пп.1-6, который включает связывание амидной связью с использованием агента для дегидроконденсации, выбранного из группы, состоящей из (хлорида 4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиния) и 2-этокси-1-этоксикарбонил-1,2-дигидрохинолина, в органическом растворителе аминогруппы антиметаболита цитидина, остаток которого охарактеризован в п.1, с карбоксильной группой в боковой цепи полимерного соединения формулы (1) по п.1, где Х означает гидроксильную группу, состоящего из полиэтиленгликолевой части и полимерной части, содержащей карбоксильные группы в боковых цепях.
| ПИРИМИДИН-НУКЛЕОЗИДЫ, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1991 |
|
RU2116306C1 |
| JP 2004532289 A, 21.10.2004 | |||
| JP 2003524028 Т, 12.08.2003 | |||
| УСТРОЙСТВО СЕЛЕКЦИИ МИНИМАЛЬНОГО ИЗ ДВУХ ДВОИЧНЫХ ЧИСЕЛ | 2005 |
|
RU2300133C1 |
| JP 08048766 А, 20.02.1996 | |||
| JP 06206832 А, 26.07.1994. | |||
