ШТАММ БАКТЕРИЙ KURTHIA ZOPFII, ОБЛАДАЮЩИЙ СВОЙСТВОМ УТИЛИЗИРОВАТЬ НЕФТЬ, НЕФТЕПРОДУКТЫ И АРОМАТИЧЕСКИЕ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИЕ УГЛЕВОДОРОДЫ Российский патент 2006 года по МПК B09C1/10 C02F3/34 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к штамму, способному окислять нефть, нефтепродукты и ароматические полициклические углеводороды в широком диапазоне рН среды 5,0-10,0 единиц с целью использования для очистки почвы, воды и поверхностей.

Известны аэробные нефтеокисляющие бактерии Micobacterium flavescens ВКПМ-В-6000, Micobacterium sp. ИЖ-4, Rhodococcus sp. 56д, Acinetobacter sp. HB-1 (БИ №30, 2002 г., патенты РФ №2191752 и №2191753, класс 7 С 02 F 3/34, C 09 С 1/10, С 12 N 1/26). Недостатком этих культур является узкий диапазон рН среды (6,8-8,0), неспособность к окислению ароматических полициклических углеводородов.

Известны штаммы бактерий Pseudomonas alcaligents B-1, Pseudomonas putida и Pseudomonas alcaligents E-7, используемые для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (БИ №21, 23 - 1999 г., патенты RU №2133770, класс 6 С 12 N 1/20, С 02 F 3/34, В 09 С 1/10, БИ №23, 1999 г., патенты RU №2134722 и №2134723, класс 6 С 12 N 1/20, C 02 F 3/34, В 09 С 1/10).

Эти штаммы бактерий также неспособны к окислению полициклических ароматических углеводородов и имеют узкий спектр рН среды ферментации 6,8-7,2 до 7,5-8,0 единиц.

Наиболее близким по техническому решению к предлагаемому изобретению является консорциум штаммов бактерий Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ-В-7179, Pseudomonas fluorescens ВКПМ-В-7152, Alcaligenes faccalis ВКПМ-В-7180 (БИ №9, 1998 г., патент РФ №2107722, класс 6 С 12 N 1/20, С 02 F 3/34, С 12 R 1/27, 1/01), предназначенный для очистки почвы, воды, емкостей и сточных вод промышленных предприятий от загрязнения нефтепродуктами. Недостатком известного консорциума бактерий является низкий уровень (5-8%) утилизации парафинов с высоким содержанием ароматических углеводородов при узком значении рН среды 6,8-7,0 единиц, низкой температуре 6-15°С ферментации, а также неспособность к окислению полициклических ароматических углеводородов.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является более широкий диапазон рН среды ферментации 5,0-10,0 единиц, способность к окислению ароматических полициклических углеводородов, более высокая скорость окисления углеводородных загрязнений. Для этого предлагается использовать новый активный природный бактериальный штамм Kurthia zopfii 7-204, выращиваемый в минеральной среде следующего состава (в г/л): (NH₄)₂SO₄ - 3,0; KH₂PO₄ - 6,5; MgSO₄ - 0,7 и микроэлементы (по 12,5 мг/л): FeSO₄×7H₂O; MnSO₄×5H₂O; ZnSO₄×7H₂O и 3 мг/л CuSO₄×5Н₂O.

Происхождение штамма

Предлагаемый штамм Kurthia zopfii 7-204 выделен из образцов почв Нижневартовского месторождения в 1999 году, не токсичен, не патогенен. Штамм идентифицирован по «Определителю бактерий» Берджи (перевод под редакцией академика РАН Г.А.Заварзина, 1997 г.).

Родовое и видовое название штамма

Выделенный штамм относится к роду Kurthia и к виду Zopfii.

Культурально-морфологические особенности штамма

На мясо-пептонном агаре (МПА) образует круглые, блестящие, белые с кремовым оттенком колонии, край гладкий, структура однородная, консистенция пастообразная. Диаметр молодой колонии 2-2,5 мм, старой - 4-5 мм. Бактерии грамположительные, некислотоустойчивые, неспорообразующие короткие толстые палочки размером 0,8-1,2×2,0-3,0 мкм, одиночные, иногда - в парах V-образной конфигурации, встречаются кокки размером 0,7×0,8-1,4×1,6 мкм. Старые культуры обычно состоят из кокковидных клеток, мицелий не образуют. Клетки неподвижные или слабо подвижные.

Физиолого-биохимические и биотехнологические характеристики

В качестве единственного источника углерода используют н-парафины, полученные карбамидной депарафицизацией, с высоким содержанием ароматических углеводородов; нефти разных регионов страны; полициклические ароматические углеводороды; нафталин, фенантрен. Аэробы. Метаболизм дыхательного типа с образованием небольшого количества кислоты при росте на глюкозе, ксилозе, глицерине, маннозе. Газ не образует. Бактерии каталазоположительные, желатину не разжижают, молоко не свертывают, на 12 сутки наблюдается его пептонизация (слабая). Нитраты не восстанавливают. Нитратный азот не потребляется. На ломтике картофеля - обильный рост культуры (бежевого цвета). При росте в МПБ - умеренная муть, осадок рыхлый. Бактерии хорошо растут в широком диапазоне рН среды 5,0-10,0 единиц, при рН среды 5,0-6,0 окисление н-парафинов, полученных карбамидной депарафинизацией, находится на уровне 30-33%, при рН среды 7,0-8,0 единиц - 88,4-95,0%, при рН среды 8,0-10,0 единиц биодеградация равна 95,0-85,5%. Таким образом, предлагаемый штамм относится к алкалофильным культурам.

Оптимальной температурой культивирования является 20-30°С, при снижении температуры ниже 15°С и повышении выше 35°С рост замедляется, а при температуре ниже 5°С и выше 40°С рост прекращается полностью. Чувствительность к антибиотикам изучена с использованием бумажных дисков, содержащих стандартные концентрации (см. табл.1).

Таблица 1
Устойчивость штамма к антибиотикамАнтибиотикСодержание антибиотика в диске, мкгДиаметр зоны подавления роста, ммИнтерпретация результатовАмпициллин1032Устойчиво чувствителенКарбенициллин2516Умеренно чувствителенОксациллин1017Умеренно чувствителенСтрептомицин3018ЧувствителенКанамицин3020ЧувствителенЛевомицетин3016Умеренно чувствителенРифампицин516ЧувствителенТетрациклин3030Устойчиво чувствителенЭритромицин1530Устойчиво чувствителен

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру Kurthia zopfii 7-204 выращивают периодическим способом в качалочных колбах объемом 750 мл при температуре 20-25°С, рН 7,5-8,0 на минеральной среде №10 следующего состава (г/л): (NH₄)₂SO₄ - 3,0; KH₂PO₄ - 6,5; MgSO₄ - 0,7 и микроэлементы (по 12,5 мг/л): FeSO₄×7H₂O; MnSO₄×5H₂O; ZnSO₄×7Н₂О и 3 мг/л CuSO₄×5Н₂O. В качестве единственного источника углерода используют нефть с содержанием суммы углеводородов 59,2%, в том числе ароматических углеводородов - 31,3%, летучих углеводородов - 18,6%, смол - 1,3%, асфальтенов - 0,6%. Концентрация сырой нефти в питательной среде составляет 1% (по весу). Засев производится по оптической плотности, которая равна 0,2 при длине волны 540 нм. После 10 дней культивирования утилизация нефти составляет 40%.

Пример 2. Культуру Kurthia zopfii 7-204 выращивают периодическим способом в течение 72 часов в качалочных колбах объемом 750 мл на указанной в примере 1 минеральной среде №10, засев по оптической плотности = 0,1 единице при длине волны 540 нм и рН среды 5,0-6,0 и оптимальной температуре 25-30°С. В качестве источника углерода используют парафин широкой фракции в концентрации 1% вес. следующего состава: С₁₀-С₁₂=12%, C₁₄-C₁₈=50,4%, C₁₉-C₂₈=31,4%, ароматических углеводородов 6,2%. Через 72 часа утилизация карбамидного парафина составила 30-33%.

Пример 3. Культуру Kurthia zopfii 7-204 выращивают периодическим способом в аналогичных условиях примера 2 - утилизация при рН среды 7,5 единиц составила 91,8%.

Пример 4. Штамм Kurthia zopfii 7-204 выращивают в аналогичных условиях как в примере 2 при рН среды 8,0-9,0 единиц. Утилизация через 72 часа ферментации составила 91,8-95,0%.

Пример 5. Штамм Kurthia zopfii 7-204 выращивают в аналогичных условиях примера 2 при рН среды 9,0-10,0 единиц, через 72 часа ферментации утилизация составила 91,1-85,5%.

Пример 6. Штамм Kurthia zopfii 7-204 выращивали периодическим способом в качалочных колбах объемом 750 мл на минеральной среде №10 (см. пример №1). В качестве источника углерода использовали фенантрен в концентрации 0,1%. Культивирование вели 15 суток при температуре 25-30°С, рН среды - 7,5 единиц, засев культуры по оптической плотности составил 0,1 единицы при длине волны 540 нм. Утилизация химически чистого полициклического ароматического углеводорода - фенантрена - составила 39,0%.

Таким образом, предлагаемая алкалофильная культура Kurthia zopfii 7-204 растет в широком диапазоне рН среды: от 5,0 до 10,0 единиц, оптимум 7,5-10,0 единиц и способна окислять трудно окисляемые ароматические углеводороды, содержащиеся в парафинах широкой фракции, тяжелых нефтях и химически чистые соединения полициклической природы при оптимальной температуре культивирования 20-30°С. Штамм стабилен и устойчив в периодическом и непрерывном процессе.

Депонирование и хранение штамма. Штамм депонирован в коллекции культур ООО ПКФ «БИГОР» за номером 7-204. Культура поддерживается на мясо-пептонном агаре (МПА), пересевается 1 раз в 2 месяца. Кроме того, культура хранится в лиофилизированном состоянии на среде Файбич при температуре +4°С.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для очистки почвы, воды и поверхностей. Новый штамм Kurthia zopfii 7-204, выделенный из почвы, устойчив в длительном непрерывном процессе очистки от нефти, растет в широком диапазоне рН от 5,0 до 10 единиц. Штамм Kurthia zopfii 7-204 способен окислять высокий процент трудно окисляемых ароматических углеводородов, содержащихся в парафинах широкой фракции и тяжелых нефтях, а также химически чистые соединения полициклической природы при 20-30°С. Штамм стабилен и устойчив в условиях использования при непрерывном и периодическом процессе очистки и обеспечивает высокую степень очистки. 1 табл.

Штамм бактерий Kurthia zopfii 7-204, обладающий свойством утилизировать нефть, нефтепродукты и ароматические полициклические углеводороды.