ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ЛЮЦЕРНЫ Sinorhizobium meliloti - СИМБИОТИЧЕСКИЙ АЗОТОФИКСАТОР ДЛЯ НОРМАЛЬНЫХ И ЗАСОЛЁННЫХ ПОЧВ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, а именно к новым штаммам клубеньковых бактерий, оказывающим стимулирующее воздействие на рост бобовых культур, в частности на рост люцерны в условиях нормального и избыточного засоления.

В связи с большим дефицитом растительного белка все большее внимание зарубежных и отечественных ученых привлекают проблемы, связанные с повышением эффективности почв, обогащения их азотсодержащими веществами. При этом важное значение имеет фиксация азота, поскольку она преобразовывает атмосферный азот в форму, которая может использоваться растениями. В растениях семейства бобовых (Leguminoseae), симбиотическое взаимодействие между растениями и азотфиксирующими бактериями семейства Rhizobiaceae усиливает рост растений и урожайность сельскохозяйственных культур (RU 2508631, 2009; Ferguson и Mathesius, J. Plant Growth Regulation 22: 47-72, 2003).

В целях использования дешевого биологического азота в настоящее время во многих странах наблюдается тенденция увеличения посевных площадей бобовых культур; большое внимание уделяется практике применения бактериальных удобрений. Среди зернобобовых культур люцерна занимает особое место, как повсеместно распространенная и в большинстве областей страны культивируемая дважды в год. Однако несмотря на большое значение люцерны ее урожайность относительно невысока. В этой связи значительный объем исследований посвящен разработке оптимальной технологии культивирования таких культур, как люцерна, в рамках которой одной из важных стадий является обработка семян люцерны препаратами, содержащими азотфиксирующие бактерии (RU 2025484, 2012; RU 2514217, 2014; CN 104025865, 2014; CN 102845204, 2013; CN 102755991, 2012; CN 104068293, 2014). Эффективность обработки, как правило, зависит от свойств используемого штамма бактерий, что делает проблему создания новых штаммов клубеньковых бактерий достаточно актуальной.

В настоящее время существует более 200 видов микроорганизмов, способных к симбиотической фиксации азота. В частности, для повышения урожайности люцерны предлагается использовать штаммы Agrobacterium rhizogenes D32 (SU 1822883, 1993), Rhizobium meliloti 421a (RU 549454, 1977), Rhizobium meliloti 425a (RU 549454, 1977), Rhizobium meliloti 441 (RU 629204, 1978), Rhizobium meliloti 443a (RU 745887, 1980), Rhizobium meliloti 450a (RU 881095, 1981). Однако азотфиксирующая способность известных штаммов недостаточно высока, особенно при сильном засолении почв.

Наиболее близким по достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является штамм Rhizobium meliloti 415^b, разработанный ВНИИСХМ и показавший лучшие результаты при культивировании люцерны изменчивой (Т.Н. Троян, Ю.Н. Бургардт. Аэроэкологическая оценка продуктивности люцерны изменчивой при инокуляции семян производственными штаммами (http://www.rusnauka.com/13NPT2008/Biologia/31476.doc.htm)). Однако продуктивность данного штамма не достаточно высока, особенно на полях с высоким содержанием солей.

Технической задачей, решаемой авторами, являлось получение симбиотического штамма с повышенной эффективностью симбиоза, обеспечивающего более высокий урожай люцерны как в условиях нормального, так и избыточного засоления.

Технический результат достигался созданием нового штамма Sinorhizobium meliloti AK130, депонированного 01.06.2015 в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ, № RCAM03363.

Штамм характеризуется следующими показателями.

Родовое, видовое название, номер. Sinorhizobium meliloti AK130.

Происхождение. Штамм выделен из клубеньков люцерны Medicago falcata, собранной в Челкарской обл. (Мугоджары), Казахстан.

По какому определителю, руководству идентифицирован. Определитель бактерий Берджи. Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльямса. Девятое издание. В двух томах. - М.: Мир, 1997.

Свойства, практическая ценность культуры. Штамм представляет практическую ценность. Образует эффективный симбиоз с люцерной изменчивой в обычных условиях и в условиях засоления.

Культурально-морфологические, физико-биохимические особенности культуры.

- Форма колоний - на среде TY образуют округлые слизистые колонии беловатого цвета.

- Форма клеток и подвижность - подвижные, палочки, 0,5-0,9×1,2-3,0 мкм.

- Окраска по Грамму - грам-отрицательные.

- Жгутикование - полярное.

- Спорообразование - спор не образует.

- Наличие пигмента - нет.

- Дыхание, форма усвоения углеводов - аэроб, рост на среде с углеводами сопровождается обильным образованием внеклеточной слизи полисахаридной природы.

- Отношение к источникам азота - источниками азота могут служить соли аммония, нитрат, нитрит и большинство аминокислот.

- Образование индола, сероводорода - нет.

- Кислотоустойчивость - некислотоустойчивый.

- Анаэробный тест - строгий аэроб.

- Восстановление нитратов - восстанавливает.

- Разжижение желатины - не разжижает.

- Молоко с лакмусом - подщелачивает.

Способы и условия хранения: Выращивание на средах: TY, 79, бобовый агар в течение 2-3 суток. Суспензию замораживают при температуре при температуре 25-26°С, высушивают при температуре 45-50°С и закрывают в пенициллиновые флаконы. Флаконы с лиофильно-высушенными клетками сохраняют при температуре 4-6°

Диссоциация культуры: не диссоциирует.

Проведенные испытания показали, что заявляемый штамм обеспечивает более высокую эффективность симбиоза по сравнению с аналогами на различных сортах люцерны как в условиях нормальной, так и повышенной засоленности почв. Промышленная применимость штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Исследования проводились в 2014 г на полях Узбекского НИИ селекции и семеноводства (Ташкентская обл.). Эффективность биопрепарата на посевах сельскохозяйственных культур проводилась в соответствии с «Программой и методикой исследовательских испытаний микробных препаратов», разработанной в соответствии с ГОСТ 19.301-79.

Экспериментальный участок посевной площади 5,2 соток был разделен на 4 части. В каждой части по 17 повторностей по 1 кв.м; между повторностями оставлено по 50 см. Тип почвы - серо-бурые пустынные почвы разной степени засоления (салончаковатости) и плодородности.

В качестве штаммов инокулянтов использовали производственные штаммы 404б, 415б, природные штаммы клубеньковых бактерий люцерны, выделенных в различных эколого-географических районах, подверженных засушливости, включая заявляемый штамм АК 130.

Таблица 1 Агрохимическая характеристика почвы посевного поля Варианты почв Гумус (%) Перед посевной анализ общий % (валковый) P₂O₅ K₂O N Контроль 0,98 0,14 1,33 0,06 Слабозасоленная 1,02 0,13 1,30 0,07 Сильнозасоленная 0,53 1,09 1,18 0,08

Первый учет роста биомассы растений был сделан 6 июня, а второй - через месяц 6 июля.

Был проведен учет зеленой и сухой массы растений по результатам первого и второго укосов (табл. 2) по отношению к производственному штамму 404б.

Таблица 2 Влияние инокуляции клубеньковыми бактериями люцерны на продуктивность зеленой и сухой массы растений, выращенных на незасоленных и слабозасоленных почвах по сравнению с производственным штаммом 404б (%) Штамм Нормальная почва Слабозасоленная почва Зеленная масса Сухая масса Зеленная масса Сухая масса Аналог 415б 121 122 110 110 А4 140 132 122 121 Заявляемый штамм А130 205 185 125 122 UZ3 70 70 90 85 UZ10 158 150 100 100 UZ14 195 182 75 55 UZ18 143 153 98 70 UZ31 145 128 97 95

Прибавки по сухой и зеленой массе растений коррелировали между собой в вариантах опыта на незасоленной почве r=0,986 и на слабозасоленных почвах r=0,843. Также оценили корреляцию данных между прибавками зеленой массы, полученной в I и во II укосах, и аналогично между прибавками сухой массы в I и во II укосах. Значения корреляций составили между прибавками зеленой и сухой массы, полученной в I и во II укосах 0,778 и 0,822 соответственно.

В бессолевых условиях ряд симбиозов, сформированных природными штаммами, превосходили по накоплению зеленой и сухой массы растения, инокулированные 404б. В условиях засоления существенные прибавки зеленой и сухой массы получены при инокуляции штаммами А-4, АК-130 и UZ3, которые формировали эффективный симбиоз в засоленных условиях. Последние два симбиоза особенно интересны, поскольку прибавки по массе растений получены в солевых условиях. Симбиотические системы, сформированные остальными штаммами, давали существенные прибавки по массе, которые превосходили производственный штамм 415б в бессолевых условиях и формировали неэффективный симбиоз в условиях засоления.

Дальнейшие исследования проводили в условиях деляночного опыта на слабозасоленных и сильнозасоленных почвах. Полученные результаты по сравнению со штаммом 404б приведены в таблице 3.

Таблица 3 Относительные прибавки сухой массы растений, выращенных на незасоленных, слабозасоленных и сильнозасоленных почвах в полевом опыте по сравнению с производственным штаммом 404б Штамм Характеристика почвы Нормальная Слабозасоленная Сильнозасоленная Аналог 415б 121 110 105 А4 150 165 160 Заявляемый штамм А130 155 230 180 UZ3 90 140 100 UZ10 105 127 130 UZ14 99 110 150 UZ18 130 150 165 UZ31 125 145 155

Пример 2. В 2014 году в ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса», г. Лобня, проводили изучение эффективности различных штаммов клубеньковых бактерий с перспективным селекционным номером люцерны изменчивой Л10-2 для получения семян. Предпосевная инокуляция семян проводилась методом их опудривания препаратом на основе данного штамма.

Характеристика участка. Почва дерново-подзолистая, среднеокультуренная. Площадь делянки: длина: 4,0 м, ширина: 0,45 м.

Таблица 4 Агрохимическая характеристика почвы опытного участка Образец № Горизонт, см рН солевой выт. Hr, мг.экв/100 г V, % S, мг.экв/100 г Гумус, % Нитрификационная способность N общий, % Р₂О₅ по методу Кирсанова К₂О по методу Масловой 8 ярус 0-20 5,03 2,74     1,22   0,140 25,23 18,75

Погодные условия. Май 2014 г. был теплый и засушливый: средняя температура воздуха превысила среднемноголетние значения на +9,4°С, а осадков выпало 72% от нормы. Июнь был прохладным и влажным. Температура воздуха бала в среднем на 3,1°С ниже нормы, осадков выпало 122% нормы. Температура воздуха в июле-октябре была близкой к среднемноголетним значениям, однако осадков за этот период выпало 54% от нормы.

Время и способ уборки урожая. 10 сентября 2014 г. срезание серпом всей надземной биомассы семенного травостоя с последующим определением структуры урожая и обмолота семян.

В табл. 5 приведены данные по сбору надземной биомассы травостоя в день уборки семян (бобы с семенами, небольшое количество сохранившихся на стеблях сухих листьев и стебли) в пересчете на 1 квадратный метр делянки при использовании различных штаммов ризобий.

Пример 3. В 2014 году в ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса», г. Лобня, проводили изучение эффективности различных штаммов клубеньковых бактерий с перспективным селекционным номером люцерны изменчивой Таисия для получения семян. Предпосевная инокуляция семян проводилась методом их опудривания препаратом на основе данного штамма.

Характеристика участка. Почва дерново-подзолистая, среднеокультуренная. Площадь делянки: длина: 4,0 м, ширина: 0,45 м.

Таблица 6 Агрохимическая характеристика почвы опытного участка Образец № Горизонт, см рН солевой выт. Hr, мг.экв/100 г V, % S, мг.экв/100 г Гумус, % Нитрификационная способность N общий, % Р₂О₅ по методу Кирсанова К₂О по методу Масловой 9 ярус 0-20 4,63 3,41     1,19   0,161 23,69 18,75

Погодные условия. В 2013 г. (год посева) в сентябре-ноябре выпало более 2-х норм осадков, в отдельные периоды дождевая вода в течение 3-5 дней находилась на поверхности почвы, не впитываясь. Устойчивый снеговой покров сформировался на избыточно переувлажненной, не замершей почве. Весной после схода снежного покрова возврат заморозков вызвал выпирание растений люцерны. В результате перечисленных стрессовых факторов сохранность растений люцерны составила 5,8-9,5%. Май 2014 г. был теплый и засушливый: средняя температура воздуха превысила среднемноголетние значения на +9,4°С, а осадков выпало 72% от нормы. Июнь был прохладным и влажным. Температура воздуха бала в среднем на 3,1°С ниже нормы, осадков выпало 122% нормы. Температура воздуха в июле-октябре была близкой к среднемноголетним значениям, однако осадков за этот период выпало 54% от нормы.

Время и способ уборки урожая. 11 сентября 2014 г. срезание серпом всей надземной биомассы семенного травостоя с последующим определением структуры урожая и обмолота семян.

В табл. 7 приведены данные по сбору надземной биомассы травостоя в день уборки семян (бобы с семенами, небольшое количество сохранившихся на стеблях сухих листьев и стебли) в пересчете на 1 квадратный метр делянки.

Пример 4. В 2014 году в ФГБНУ «ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса», г. Лобня, проводили изучение эффективности различных штаммов клубеньковых бактерий с перспективным селекционным номером люцерны изменчивой Л10-2 (Medicago sativa L., nothosubsp. varia Mart.) для получения семян. Предпосевная инокуляция семян проводилась методом их опудривания препаратом на основе данного штамма.

Характеристика участка. Почва дерново-подзолистая, тяжелосуглинистая, слабоокультуренная. Площадь делянки: длина: 4,0 м, ширина: 0,45 м.

Таблица 8 Агрохимическая характеристика почвы опытного участка Образец № Горизонт, см рН KCl Hr, мг.экв/100 г V, % S, мг.экв/100 г Гумус, по Тюрину (%) Нитрификационная способность N общий, % Р₂О₅ по методу Кирсанова, мг/100 К₂О по методу Масловой 1 0-20 5,08 2,62     1,67   0,137 34,31 14,9 2 0-20 4,96 2,62     1,45   0,133 26,93 12,78

Погодные условия. Май 2014 г. был теплый и засушливый: средняя температура воздуха превысила среднемноголетние значения на +9,4°С, а осадков выпало 72% от нормы. Июнь был прохладным и влажным. Температура воздуха бала в среднем на 3,1°С ниже нормы, осадков выпало 122% нормы. Температура воздуха в июле-октябре была близкой к среднемноголетним значениям, однако осадков за этот период выпало 54% от нормы.

Время и способ уборки урожая. 12 сентября 2014 г. срезание серпом всей надземной биомассы семенного травостоя с последующим определением структуры урожая и обмолота семян.

В табл. 9 приведены данные по сбору надземной биомассы травостоя в день уборки семян (бобы с семенами, небольшое количество сохранившихся на стеблях сухих листьев и стебли) в пересчете на 1 квадратный метр делянки при использовании различных штаммов ризобий.

Таблица 9 Урожайность перспективного селекционного номера люцерны изменчивой Л10-2, сухое вещество, сумма за 2 укоса, 2013 г., посев 2011 г. № п/п № штамма бактерий Урожайность, сухое вещество, кг/м² Эффективность симбиоза, % Повторность Среднее 1 2 3 4 1 Без инокуляции 1,12 1,74 1,50 1,78 1,54 - 2 АК-120 1,80 2,15 1,84 2,10 1,97 144 3 Заявляемый штамм АК-130 2,73 2,89 2,87 2,66 2,79 204 4 Аналог 415^b 1,76 1,88 1,90 1,64 1,80 131 5 А2 1,98 2,79 2,34 2,16 2,32 169   Контроль (среднее) 1,37 100   НСР 05 0,31  

Таблица 10 Накопление общего азота в сухом веществе перспективного селекционного номера люцерны изменчивой Л10-2, сумма за 2 укоса № п/п № штамма бактерий Сбор общего азота, г/м² Отклонение от контроля, ±г/м² Повторность Среднее 1 2 3 4 1 Без инокуляции 23,2 36,0 31,1 36,9 31,8 - 2 АК120 43,4 51,8 44,3 50,6 47,5 19,2 3 А2 54,4 76,6 64,3 59,3 63,7 35,4 4 АК87 71,1 74,2 78,9 62,7 71,7 43,4 5 Аналог 415^b 51,8 55,3 55,9 48,2 52,8 24,5 6 Заявляемый штамм АК-130 77,8 82,3 81,8 75,8 79,4 51,1   Контроль 28,3     НСР 05 8,0  

Вышеприведенные данные экспериментов показали, что заявляемый штамм более эффективно по сравнению с аналогами стимулирует рост биомассы и обеспечивает сбор азота различных сортов люцерны как на нормальных, так и на засоленных почвах.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии. Штамм клубеньковых бактерий люцерны Sinorhizobium meliloti АК130, обладающий способностью образовывать эффективный симбиоз с люцерной изменчивой, депонирован в ФГБНУ ВНИИСХМ под регистрационным номером RCAM03363. Изобретение позволяет повысить урожайность и азотофиксацию люцерны изменчивой при выращивании на нормальных и засоленных почвах. 10 табл., 4 пр.

Штамм клубеньковых бактерий люцерны Sinorhizobium meliloti, депонированный в коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ № RCAM03363 - симбиотический азотофиксатор для нормальных и засоленных почв.