ОЛИГОПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФОЛЛИКУЛЯРНЫХ КЛЕТОК ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2010 года по МПК C07K5/04 A61P5/16 

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, модулирующим активность некоторых факторов роста по отношению к стимуляции пролиферации тироксинпродуцирующих фолликулярных клеток щитовидной железы, и может найти применение в медицине и экспериментальной биохимии.

Щитовидная железа производит два тироидных гормона, отличающихся лишь наличием или отсутствием одного дополнительного атома йода в молекуле - тироксин (T₄) и трийодтиронин (Т₃). При этом тироксин является, фактически, прогормоном, так как перед тем как оказать действие на клетки органов-мишеней, большая часть тироксина непосредственно в клетках конвертируется в биологически активную форму - трийодтиронин. При недостаточной секреции тироксина развивается гипотериоз - заболевание, связанное с недостаточностью гормонов щитовидной железы в организме, которое ведет к тяжелым функциональным нарушениям центральной нервной системы, эндокринной, сердечно-сосудистой, пищеварительной и других систем, а также к дистрофии и своеобразному слизистому отеку различных тканей и органов.

В зрелой щитовидной железе среди гормонопродуцирующих клеток наибольшее количество принадлежит Т₄-продуцирующим фолликулярным клеткам, которые происходят преимущественно из небольшого участка энтодермальных клеток, расположенных в основании языка [1]. Так как в щитовидной железе эпителиальные клетки составляют 70%, то их миграцию, пролиферацию и дифференцировку стимулируют соответствующие факторы роста, основными из которых являются фактор роста фибробластов, трансформирующий фактор роста и эпидермальный фактор роста, в то время как пролиферацию тироидных фолликулярных клеток стимулирует специфический регулятор - тиротропный гормон, или тиротропин [2].

Тиротропный гормон (ТТГ) представляет собой гликопротеин с альфа-, бета-димерной структурой и молекулярной массой около 30 кДа. Подобно другим гормонам данной группы он связывается с рецепторами плазматических мембран и стимулирует пролиферацию тироцитов через аденилатциклазный путь [2]. Кроме того, ТТГ активирует аденилатциклазу и фосфорилазу С. Активация фосфорилазы С приводит к образованию диацилглицерина (ДАГ) и инозитол-трифосфата. ДАГ активирует протеинкиназу С, а инозитол-трифосфат увеличивает внутриклеточную концентрацию ионизированного кальция, стимулируя тем самым клеточную пролиферацию [2]. Сам ТТГ достаточно большой белок, выделение которого представляет достаточные трудности.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала биологически активных веществ пептидной природы.

Основной технический результат, который может быть получен при осуществлении настоящего изобретения, заключается в создании нового олигопептида, модулирующего активность тиротропного гормона по отношению к стимуляции пролиферации тироксинпродуцирующих фолликулярных клеток щитовидной железы

Данный результат достигается за счет создания олигопептида общей формулы

где Х1 представляет собой Тrp или Тyr;

Х2 представляет собой Gly, или Gln, или Glu, или Asp;

Х3 представляет собой Тyr или Тrp.

В формуле: Тrp - триптофан, Тyr - тирозин, Gly - глицин, Gln - глутамин, Glu - глутаминовая кислота, Asp - аспарагиновая кислота.

Полученные низкомолекулярные синтетические олигопептиды имеют высокую чистоту и доступны в синтезе. Их активность несколько ниже целого ТТГ, но последний недостаток компенсируется вводимой концентрацией олигопептида.

Формула заявляемого олигопептида была выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания (β2 адренорецептора с его антителами, которые высокогомологичны рецептору тиротропного гормона (гомология 46%). Выравнивание первичных структур рецептора тиротропного гормона и β2 адренорецептора проводили с использованием общедоступной программной реализации стандартных алгоритмов BLAST и ALIGN консорциума UniProt [3]. Данные первичных структур белков, подвергаемых скринингу, импортировали из общедоступной базы данных GenomNet [4]. Компьютерное конструирование участков связывания β2 адренорецептора с его антителами проводили с помощью программного комплекса [5], осуществляющего компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.

Нижеследующие чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.1 представлена пространственная структура комплекса β2 адренорецептор/антитела к β2 адренорецептору [8].

На фиг.2 представлена пространственная структура комплекса β2 адренорецептор/антитела к β2 адренорецептору с идентифицированным функциональным сайтом белка Г-КСФ (функциональный сайт выделен зеленым цветом).

Пример 1. Поиск белков, высокогомологичных тиротропному гормону

Для поиска соединений, высокогомологичных рецептору тиротропного гормона, использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные структуры белков, импортированные из общедоступной базы данных GenomNet [4]. В базе данных банка осуществляли скрининг первичных структур белков и их клеточных рецепторов, используя общедоступную программную реализацию стандартных алгоритмов BLAST и ALIGN консорциума UniProt [3]. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса β2 адренорецептор/антитела к β2 адренорецептору [6] (фиг.1), в котором β2 адренорецептор имеет с рецептором тиротропного гормона гомологию 46%.

Пример 2. In silico конструирование функционального сайта ТТГ на основе пространственной структуры комплекса β2 адренорецептор/антитела к β2 адренорецептору с учетом гомологии ТТГ и антител к β2 адренорецептору

Для осуществления конструирования функционального сайта ТТГ использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [7]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры комплекса β2 адренорецептор/антитела к β2 адренорецептору. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса Г-КСФ/рецептор [6] (фиг.1).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать аминокислотные остатки антител к β2 адренорецептору, принимающие участие в их взаимодействии с β2 адренорецептором (фиг.2).

Из представленных на фиг.2 данных, по результатам компьютерного моделирования можно сделать вывод, что заявляемый олигопептид представляет собой функциональный сайт тиротропного гормона, принимающий участие в связывании с его клеточными рецепторами и стимулирующий пролиферацию пролиферации фолликулярных клеток щитовидной железы. Данное соединение может найти применение в медицине и в экспериментальной биохимии.

Пример 3. Химический синтез заявляемых соединений

Всего было получено методами классической пептидной химии в растворе последовательным наращиванием с N-конца аналогично методикам, описанным в [8, 9, 10], 16 трипептидов:

1. W-G-Y

2. W-Q-Y

3. W-E-Y

4. W-D-Y

5. W-G-W

6. W-Q-W

7. W-E-W

8. W-D-W

9. Y-G-Y

10. Y-Q-Y

11. Y-E-Y

12. Y-D-Y

13. Y-G-W

14. Y-Q-W

15. Y-E-W

16. Y-D-W

Пример 4. Биологические испытания заявляемых олигопептидов

В соответствии с методиками, описанными в работе [11], были исследованы синтезированные вещества 1-16. Выбраны были 16 опытных групп и одна контрольная. В каждой группе находилось по 5 беспородных белых крыс весом от 225-250 г. Эксперимент проводился в течение 21 дня. Пептидные соединения вводились в объеме 3 мл внутрибрюшинно в концентрации 10 мг/мл в первый день начала эксперимента. Контрольная группа - водился физиологический раствор в таком же объеме. Животные содержались в типовых условиях вивария. На 3, 7, 14 и 21 сутки у них производился забор венозной крови. С помощью РИА наборов, производства ХОП ИБОХ РБ, исследовалось содержание тироксин (Т₄) и трийодтиронин (Т₃), а методом, описанным в [11], определяли количество пролиферации фолликулярных клеток щитовидной железы.

В результате было установлено, что полученные аналоги природного гормона стимулировали достоверно (p<0,05) рост 150-200% исследуемых параметров - тироксин (Т₄) и трийодтиронин (Т₃), а пролиферации фолликулярных клеток на 450-500%.

Результаты биологических испытаний представлены в таблице.

№ соед-я Результаты введения пептидных аналогов по отношению к контролю, % Начало Эксперимента 3 сутки, Т₃/T₄ 7 сутки, Т₃/T₄ 14 сутки, Т₃/Т₄ 21 сутки, Т₃/T₄ Пролиферации фолликулярных клеток 1 100 100/100 100/100 115/150 145/200 450 2 100 100/100 100/100 120/170 150/210 460 3 100 100/100 105/110 125/190 150/250 500 4 100 100/100 105/110 125/190 150/250 495 5 100 100/100 105/110 125/190 150/250 450 6 100 100/100 105/110 115/150 145/240 460 7 100 100/100 105/110 135/180 150/250 460 8 100 100/100 105/110 115/150 145/215 460 9 100 100/100 100/100 115/150 145/215 480 10 100 100/100 100/100 110/150 145/215 475 11 100 100/100 100/100 105/150 145/240 455 12 100 100/100 100/100 115/150 145/240 500 13 100 100/100 105/110 125/190 145/200 495 14 100 100/100 105/110 115/150 150/210 460 15 100 100/100 105/110 115/160 150/250 500 16 100 100/100 105/110 115/160 150/250 495

Статистический разброс данных по Т₃ и Т₄ составлял +/- 5-8%, а для количества фолликулярных клеток +/- 10-12%.

Источники информации

1. Vliet, Van G. Development of the thyroid gland: lessons from congenitally hypothyroid mice and men / Van G. Vliet // Clin. Genet. - 2003. - Vol.63, №6. - P.445-455.

2. Дедов И.И. Молекулярно-генетические аспекты новообразований щитовидной железы / И.И.Дедов [и др.] // Проблемы эндокринологии. - 2000. - Т.46, N2. - С.22-30.

3. The UniProt Consortium // Nucleic Acids Research. 2008. Vol.36. P. D190-D195.

4. Kanehisa M. // Trends Biochem. Sci. 1997. Vol.22. P.442-444.

5. Шутова И.В. Компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул / И.В. Шутова, Л.М. Чемитова, В.П. Голубович // Химия, структура и функция биомолекул: Тез. докл. - Мн., 2006. - С.PR-162.

6. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=2R4R.

7. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.

8. Гринштейн Дж. Химия аминокислот и пептидов / Дж.Гринштейн, M.Винниц; под ред. М.М.Шемякина. - Москва: Мир, 1965. - 882 с.

9. Гершкович А.А. Синтез пептидов. Реагенты и методы / А.А.Гершкович, В.К.Киберев. - Киев: Наук. Думка, 1987. - 264 с.

10. Шредер Э. Пептиды./ Э.Шредер, К.Любке; под ред. М.М.Шемякина, Ю.А.Овчинникова. - Москва: Мир, 1967.

11. Hood A., Liu Ya Ping, Gattone II V., Klaassen C.D. //Toxicological Sci. 1999, Vol.49. - P.263-271.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, модулирующим активность некоторых факторов роста по отношению к стимуляции пролиферации тироксинпродуцирующих фолликулярных клеток щитовидной железы. Представленное изобретение может найти применение в медицине и экспериментальной биохимии. Производят поиск белков, высокогомологичных тиротропному гормону. После чего in silico конструируют функциональный сайт ТТГ на основе пространственной структуры комплекса β2 адренорецептор/антитела к β2 адренорецептору с учетом гомологии ТТГ и антител к β2 адренорецептору. Затем проводят химический синтез идентифицированных аминокислотных остатков антител к β2 адренорецептору. Далее осуществляют биологические испытания синтезированных олигопептидов. Указанный олигопептид имеет общую формулу Х1-Х2-Х3 (I), где X1 представляет собой Тrp или Тyr, Х2 представляет собой Gly, или Gln, или Glu, или Asp, X3 представляет собой Тyr или Тrp. Предлагаемое изобретение позволяет расширить арсенал биологически активных веществ пептидной природы. 2 ил., 1 табл.

Олигопептид общей формулы I:

где X1 представляет собой Trp или Tyr;
Х2 представляет собой Gly или Gln, или Glu, или Asp,
Х3 представляет собой Tyr или Trp,
стимулирующий пролиферацию фолликулярных клеток щитовидной железы.