НЕЙРОЭНДОКРИННЫЕ ФАКТОРЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Российский патент 2013 года по МПК C07K14/00 A61P19/02 

Настоящее изобретение имеет отношение к применению фактора и/или полипептида, изменяющего направление роста, в особенности белков нетрин1, SLIT3 или их фрагментов, для производства фармацевтической композиции для лечения или предупреждения дегенеративных заболеваний, в особенности повреждения хрящей. Изобретение дополнительно имеет отношение к фрагменту полипептида SLIT3, к фармацевтической композиции, включающей полипептид, и к его применению.

Восстановление и регенерация хряща при травматическом и дегенеративном поражении сустава остается по-прежнему основной проблемой в ортопедии. Повреждения хрящей и дегенеративные заболевания представляют собой основную причину возникновения сильных болей и постепенной потери функций суставов с потерей трудоспособности и ограничению подвижности во взрослой популяции. Собственная способность хряща к восстановлению ограничена низкой способностью хондроцитов к делению in vivo, и ткани взрослых обычно уступают по свойствам нормальному хрящу. Обычно считается, что поврежденный хрящ не получает достаточных стимулов для того, чтобы произошла стимуляция восстановления, поскольку, например, суставной хрящ не обладает системой сосудов. Хондроциты в хрящевой ткани в норме не подвергаются воздействию достаточного количества агентов, стимулирующих восстановление, таких как факторы роста и фибриновые сгустки, которые присутствуют в поврежденной ткани, обладающей системой сосудов.

Функциональная целостность суставов зависит от строгого разделения границ компартментов. Пересечение отделов хряща и разрушение хрящевого компартмента обнаруживают при воспалительном и дегенеративном поражении сустава, таком как ревматоидный артрит (RA) и остеоартрит (ОА).

Часто нарушения в хряще (например, ревматоидный артрит) характеризуются или усиливаются инвазивным и разрушительным поведением клеточных популяций в окружающих тканевых компартментах, таких как фибробласты синовиальной ткани (SF), которые мигрируют в хрящ из синовиальной ткани. Разрушение сочленовных структур сустава, таких как хрящ и кость, под действием синовиальных фибробластов (SF) представляет собой критическое событие в развитии RA и ОА (Рар, 2003; Pap, 2007; Yasuda, 2006; Huber, et al., 2006).

С разной степенью успеха было опробовано множество стратегий, направленных на ингибирование дальнейшего прогрессирования разрушительных структурных изменений, а также новых подходов, направленных на обращение заболевания с помощью восстановительного лечения пораженного хряща, включая поиск новых средств, способных восстанавливать разрушенный хрящ. Эти стратегии включают методики стимулирования костного мозга, аутологическую и аллогенную трансплантацию, аутологическую трансплантацию хондроцитов, имплантацию надкостницы, просверливание по Приди, абразивную хондропластику, включающую микроразрушение и мозаичную пластику. Однако эти процедуры не надежны и ограничены очаговыми хрящевыми и костно-хрящевыми нарушениями небольших и средних размеров. Мозаичная пластика ограничена тем, что приходится производить разрушения в области донорского участка, а также неудовлетворительным результатом восстановления и техническими трудностями, с которыми сталкиваются при восстановлении поверхности исходного изгиба сустава (Kuroda, et al., 2007). Методики аутологической трансплантации хондроцитов обладают несколькими недостатками, включая отсутствие достаточного числа хондроцитов, необходимости производить разрушения в области донорского участка, низкой эффективностью и высокой стоимостью лечения.

Было установлено, что несколько факторов роста, таких как TGF-β1, FGF-2, IGF-1, ТР-508, ОР-1 или другие BMP, включая GDF или их комбинации, индуцируют пролиферацию и дифференциацию клеток-предшественников в функционирующей кости и/или хрящевой ткани. В особенности, было показано, что TGF-R1 активирует хондрогенную дифференциацию клеток-предшественников и усиливает дифференциацию хондроцитов. IGF-1 исходно действует по анаболическому сценарию, увеличивая синтез протеогликана и коллагена II-го типа. Однако эти факторы роста довольно неспецифичны, и существует риск того, что они могут вызвать нежелательные побочные эффекты. Другие, такие как BMP, обладают возможностью индуцировать остеогенные гены и, следовательно, индуцировать нежелательное образование костной ткани. Другое ограничение применения этой методики с факторами роста заключается в относительно коротком времени биологической полужизни экзогенного фактора роста, который способен производить только временные биологические эффекты после доставки.

За некоторые признаки и симптомы, а также за структурные изменения, присутствующие у пациентов с ОА и RA, вероятно, ответственны провоспалительные цитокины, протеазы и металлопротеиназы. Ингибирование синтеза/активности этих ферментов, в качестве лечения ОА и RA, интенсивно изучается.

В настоящее время наиболее многообещающая стратегия по-прежнему заключается в применении небольших химических соединений, которые могут блокировать активность ММР. Однако ингибиторы ММР могут давать побочные эффекты, и пока не было продемонстрировано значительного снижения в прогрессировании заболевания.

Кроме того, ниже перечислены прочие новые стратегии, в настоящее время находящиеся в стадии разработки.

US2003068705 раскрывает триста пять последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды PRO, некоторые из которых (например, гомологичные или родственные IL-17 полипептидам) по непроверенным данным полезны для стимуляции пролиферации или дифференциации хондроцитов и, как таковые, могут быть полезны для лечения различных нарушений в кости и/или в хряще, таких как спортивные травмы или артрит.

WO20001090357 обеспечивает белки для лечения пороков развития, воспалительного заболевания или для модуляции иммунных ответов.

US2003044917 имеет отношение к полипептидам PRO человека для стимуляции пролиферации и дифференциации хондроцитов и к их применению для лечения различных заболеваний кости и/или хряща, таких как артрит и спортивные травмы. Однако только последовательность 6029 дала положительный результат.

Предполагается, что другой класс белков, такие как молекулы, управляющие направлением роста аксонов (например, нетрины, белки Slit), модулируют движение клеток при воспалении (WO0164837, WO05074556, WO00055321, WO0190357). WO0164837, WO03075860, WO06019904 и US 2006/0153840 раскрывают способы стимуляции ангиогенеза, пролиферации и/или стимуляции миграции клеток для лечения нейропатии и рака.

WO2002081745 раскрывает применение SLIT3 для диагностики остеопороза/заболевания кости, стимуляции остеогенеза и/или предупреждения остеопороза/заболевания кости.

WO99/23219, JP11164690 и JP11075846 раскрывают последовательность полипептида SLIT3 человека.

WO00/55321 раскрывает последовательности DNA SLIT позвоночных (т.е. Slit2 Xenopus и человека), белок и их применение.

Однако ни один из способов и композиций, раскрытых в этой области техники, не продемонстрировал значительного снижения в прогрессировании подвергаемого лечению заболевания без побочных эффектов или не привел к прекращению разрушительных процессов и фактическому восстановлению и восполнению хрящевой ткани.

Следовательно, существует необходимость в композициях и их применении для усовершенствования лечения и/или предупреждения прогрессирующего разрушения хряща, в особенности, после травмы и в случае хронических заболеваний, таких как полнослойные нарушения и поверхностные нарушения и артрит (например, остеоартрит, ревматоидный артрит), слезы мениска, (ACL)-повреждение передней крестообразной связки, которые позволяют преодолеть проблемы, связанные с доступными на данный момент способами и композициями.

Следовательно, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов восстановления или регенерации повреждений хрящей и/или ингибирования прогрессирования заболеваний или нарушений хряща, таких как артрит и спортивные травмы.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов ингибирования миграции синовиальных клеток и, следовательно, ингибирования разрушения хряща.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении способов, которые подходят для лечения заболеваний хряща, а точнее воспалительных заболеваний хряща, и заболеваний без вовлечения инвазии синовиальных фибробластов или образование паннуса.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиций и их применении для притяжения/хемотаксиса мезенхимальных стволовых клеток для регенерации хряща из его окружения.

Еще одна цель настоящего изобретения заключается в обеспечении композиций и их применении для индукции образования хряща и/или стимуляции пролиферации или дифференциации хондроцитов.

Проблему, лежащую в основе настоящего изобретения, решают путем применения фактора, изменяющего направление роста, производства фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения повреждений хряща. Изобретение, в особенности, имеет отношение к применению фактора, изменяющего направление роста, для производства фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения дегенеративного заболевания, предпочтительно дегенеративного заболевания хряща, а) связанного с инфильтрацией или миграцией синовиальных фибробластов предпочтительно в суставной или несуставной хрящ и/или связанного с образованием паннуса, или b) связанного с ослабленным прикреплением клеток, предпочтительно фибробластов или синовиальных фибробластов, к суставному или несуставному хрящу. В особенности, фактор, изменяющий направление роста, модулирует или ингибирует миграцию фибробласто-подобных клеток, таких как синовиальные фибробласты, торможение гиперплазии синовиальных клеток и/или усиливает миграцию, пролиферацию и/или дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток и/или хондроцитов для индукции и/или регенерации хряща и, таким образом, изменяет, ингибирует, предупреждает и/или лечит прогрессирование дегенеративного заболевания. В особенности, фактор, изменяющий направление роста, ингибирует, изменяет или предупреждает образование остеофитов, предпочтительно у пациента.

В особенности, изобретение имеет отношение к применению фактора, изменяющего направление роста, для производства фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения повреждений хряща, в которой фактор, изменяющий направление роста, представляет собой фрагмент белка SLIT3 (SEQ ID NO:1). Фрагмент предпочтительно имеет длину, равную <1523 АА, предпочтительно <1200 АА, более предпочтительно <1000 АА и наиболее предпочтительно ≤800 АА и, в особенности, >20 АА, предпочтительно >50 АА, более предпочтительно >100 АА. Предпочтительно, фрагмент белка SLIT3 включает последовательность SEQ ID NO:1 от 34 до 917 положения, от 47 до 863 положения, от 66 до 857 положения, от 279 до 863 положения, от 279 до 857 положения, от 279 до 724 положения, от 279 до 504 положения, от 311 до 432 положения, от 335 до 432 положения или от 312 до 437 положения. В соответствии с изобретением было обнаружено, что факторы, изменяющие направление роста, в особенности, SLIT3 экспрессируются на границах хрящевого компартмента, где они поддерживают целостность суставного хряща. Дополнительно, факторы, изменяющие направление роста, ингибируют миграцию фибробластов, нервных волокон и сосудов в суставной хрящ. Поскольку инвазия паннусной ткани в хрящ при хроническом заболевании сустава возможна только после измененной экспрессии фактора, изменяющего направление роста, эту инвазия можно модулировать с помощью факторов, изменяющих направление роста, в особенности, с помощью SLIT3, и, таким образом, становится возможным лечение связанных с этим дегенеративных заболеваний.

Авторы изобретения продемонстрировали, что факторы, изменяющие направление роста, и их рецепторы избирательно экспрессируются в синовиальных фибробластах пациентов, страдающих дегенеративными заболеваниями, такими как остеоартрит и артрит. Наблюдение было проанализировано методом количественной RT-PCR генов, выполненной с помощью cDNA компании «Lightcycler», изолированной из культуры первичных синовиальных фибробластов человека. Белки ROBO и SLIT сходным образом экспрессируются в синовиальных фибробластах пациентов с остеоартритом (OASF) и в синовиальных фибробластах пациентов с ревматоидным артритом (RASF), за исключением экспрессии mRNA ROBO3, которая поразительно увеличивается в RASF по сравнению с очень слабой экспрессией в OASF. Уровень mRNA SLIT1 явно снижается по сравнению с SLIT2 или SLIT3, но, похоже, что экспрессия всех белков SLIT в OASF бывает обычно выше, чем в RASF.

ROBO1 и ROBO2 экспрессируются как в дифференцированных, так и в ОА хондроцитах, но экспрессия в ОА хондроцитах в 10 раз (ROBO1) и даже в 100 раз (ROBO2) выше по сравнению с экспрессией в дифференцированных хондроцитах. В обоих типах клеток не удалось зарегистрировать никакой экспрессии ROBO3. Все три белка SLIT экспрессируются в дифференцированных и ОА хондроцитах, обнаруживая снова более высокие уровни в ОА, по сравнению с уровнем в дифференцированных хондроцитах.

UNC5B и UNC5C подвержены значительной стимулирующей регуляции в синовиальных фибробластах пациентов с ОА и RA.

Дополнительно было обнаружено, что значительная потеря в экспрессии ROBO3 в RASF на более поздних пассажах синовиальных фибробластов может быть важной стадией в процессе утраты активности, изменяющей направление роста, в отношении SLIT3. Эти данные, полученные авторами изобретения, позволяют предположить, что нарушение в регуляции рецептора ROBO3 в синовиальных фибробластах у RA (и ОА) коррелирует с агрессивностью фибробластов.

Кроме того, изобретение основано на обнаружении того, что факторы, изменяющие направление роста, такие как нетрин1, SLIT3, а также их фрагменты вовлечены в регуляцию агрессивного поведения клеток, таких как синовиальные фибробласты, и миграции этих клеток к хрящу или в него, что представляет собой основную проблему при дегенеративных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит. Не будучи ограниченными специфическими молекулами, изобретение основано на обнаружении того, что факторы, изменяющие направление роста, такие как нетрин1 и SLIT3 и их фрагменты, ингибируют миграцию клеток OASF и RASF. Благодаря этому удивительному открытию, факторы, изменяющие направление роста, могут быть применены для лечения различных заболеваний, которые возникают в результате миграции и инфильтрации клеток, включая измененную миграцию фибробласто-подобных клеток, таких как синовиальные фибробласты и/или образование паннуса, которые не могут в дальнейшем вызвать разрушение или изменить функцию ткани, такой как суставной или несуставной хрящ. Принимая во внимание раскрытое в этом документе удивительное открытие, факторы, изменяющие направление роста, могут быть применены в качестве лекарственного средства для предупреждения и/или лечения различных заболеваний и болезненных состояний, описанных в этом документе. Соответствующие заболевания, среди прочих, представляют собой предпочтительно дегенеративные заболевания хряща, такие как дегенеративные заболевания сустава и/или межпозвоночного диска, включая те, что дополнительно описаны выше. В особенности, в соответствии с изобретением, заболевание выбирают из дегенеративного заболевания дисков, слез мениска, повреждения передней крестообразной связки (ACL), артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, юношеского хронического артрита, псевдоартрита тазобедренного или плечевого сустава, ревматоидного полиартрита, синовита или виллезонодулярного синовита.

В соответствии с изобретением повреждения хрящей или заболевания хряща можно предупредить или лечить.

Авторы изобретения обнаружили также влияние факторов, изменяющих направление роста на миграционное поведение мезенхимальных стволовых клеток человека, о которых известно, что они способны дифференцировать в хондроциты. За индукцией миграции наблюдают, применяя анализ в камере Бойдена после добавления таких факторов, как нетрин1, в нижнюю камеру, что указывает на то, что факторы, изменяющие направление роста, могут действовать как хемоаттрактанты для мезенхимальных стволовых клеток, таких как клетки синовиальной мембраны или выстилающие клетки. В свете этого открытия может быть заторможено не только разрушительное поведение мигрирующих клеток, но также могут быть вовлечены клетки, способные к регенерации разрушенной ткани. Факторы, изменяющие направление роста, следовательно, дополнительно улучшают лечение дегенеративных заболеваний.

Дополнительно, была обнаружена индукция дифференциации мезенхимальных стволовых клеток человека в сторону линии хондрогенных клеток, следовательно, факторы, изменяющие направление роста, такие как SLIT3, могут индуцировать хондрогенез и, следовательно, полезны для регенерации и лечения заболеваний хряща.

Следовательно, изобретение охватывает применение факторов, изменяющих направление роста, для производства фармацевтической композиции для лечения повреждений хряща, в особенности дегенеративного заболевания у пациента, вызываемого агрессивными фибробластами, путем введения эффективного количества фактора, изменяющего направление роста, который модулирует миграцию, пролиферацию и/или прикрепление клеток к хрящу.

Предпочтительно, эффективное количество фактора, изменяющего направление роста, которое вводят пациенту, равно от 0,001 мг/кг массы тела пациента до 100 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно 0,01 мг/кг массы тела пациента до 20 мг/кг массы тела пациента, более предпочтительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела пациента, наиболее предпочтительно 0,1 мг/кг до 1 мг/кг массы тела пациента.

Для цели настоящего изобретения термин «фактор, изменяющий направление роста» означает активное средство, которое в определенной концентрации или диапазоне концентраций способно ингибировать миграцию клеток через границу ткани, например границу хряща. По этой причине, например, миграция агрессивных синовиальных фибробластов в хрящ и/или кость может быть заторможена или изменена. Это также включает ингибирование дальнейшего прогрессирования в образовании паннуса или инвазии паннуса в хрящ. Факторы, изменяющие направление роста, могут влиять на процесс прорастания нервных волокон в качестве стимулов, определяющих направление роста аксона, например, с помощью отталкивающего или привлекающего действия.

Факторы, изменяющие направление роста, включают большое число молекул, также известных как молекулы, определяющих направление роста аксона, которые модулируют аксональный рост в нервной системе. Они включают белки нетрин, белки SLIT, SEMAPHORE и ЭФРИН и их рецепторы НЕЙРОФИЛИН, ROUNDABOUT (ROBO) и членов семейств UNC5 и DCC (Klagsbrun и Eichmann, 2005).

Белки NETRIN представляют собой семейство секретируемых белков, обладающих гомологией к ламининовому домену. Это семейство состоит из нетрина 1, 2, 3 и 4. Они содержат домен ламинина-VI, EGF-подобные повторы и гепарин-связывающий С-концевой домен. Рецепторы нетрина представляют собой семейство рецепторов, удаленных в колоректальном раке (DCC), которое состоит из DCC и неогенина, или семейство некоординированных-5 (UNC5), которое включает UNC5A, 5В, 5С, 5D. Нетрины вовлечены в ангиогенез и в ход морфогенеза, такого как ветвление легких, развитие молочных желез и образование опухоли. Показано, что связывание нетрина с DCC и неогенином приводит к привлечению клеток, тогда как связывание с UNC-рецептором модулирует отталкивание.

Белки SLIT исходно были обнаружены в Drosophila как молекулы, направляющие рост аксона. Ортологи SLIT1, SLIT2 и SLIT3 у млекопитающих представляют собой более крупные секретируемые белки с четырьмя обогащенными лейцином повторяющимися (LRR) доменами, девятью EGF-доменами, доменом ламинина G (LamG) и С-концевым цистеиновым узлом. mRNA SLIT1 экспрессируется в мозге, анапластической олигодендроглиоме и Т-клетках линии Jwkat. mRNA SLIT2 и SLIT3 соэкспрессируются в эмбриональных стволовых клетках (ES) с образованием эмбриоидного тельца (Katoh и Katoh, 2005; Vargesson, et al., 2001). Slit3, но не Slit2, локализован внутри митохондрий, что позволяет предположить, что Slit3 потенциально обладает уникальными функциями, не свойственными другим Slit-белкам (Little, et al., 2001). Белок Slits действует посредством связывания с рецепторами Roundabout. Существует четыре трансмембранных рецептора Robo человека (Robo1, Robo2, Robo3 и Robo4), которым свойственны домены фибронектинового типа III и иммуноглобулин-подобные домены (Ig), но которые различаются по своим цитоплазматическим доменам (Itoh, et al., 1998; Howitt, et al., 2004; Hohenester, et al., 2006). Исходно было известно, что Slit-белки вовлечены в регуляцию взаимодействий по типу клетка-клетка и взаимодействий по типу клетка-подложка в мигрирующих клетках в ходе эмбрионального развития и регулируют направление роста аксона путем привлечения или отталкивания конуса роста. В последнее десятилетие было также описано, что система Robo-/Slit вовлечена в адгезию клеток и индуцирует опухолевый ангиогенез. Белки Slits также вовлечены в другие процессы развития, такие как миграция предшественников мышечных клеток у дрозофилы, направленная миграция лейкоцитов и индукция почки (Klagsbrun и Eichmann, 2005).

Семафорины представляют собой поверхностно или локально секретируемые факторы, изменяющие направление роста нервов, со специфическим отталкивающим действие на нервные волокна через определенные поверхностные рецепторы, такие как нейрофилин 1 и нейрофилин 2. Семафорины класса III включают SEMA А, В, С и F. Эфрины и их рецепторы Eph представляют собой лиганды и тирозинкиназные рецепторы, вовлеченные во множество процессов развития, включая развитие нервной системы и ангиогенез. Лиганды эфрина А (Эфрин A1, А2, A3, А4, А5) представляют собой заякоренные через GPI молекулы, которые связываются с рецепторами EphA, тогда как белки эфрина В (Эфрин В 1-3) связываются с рецепторами Eph В. Эфрины могут также, наоборот, функционировать в качестве рецепторов, которые связываются с помощью Ephs как лиганды.

В некоторых воплощениях фактор, изменяющий направление роста, настоящего изобретения представляет собой агониста или антагониста рецептора ROUNDABOUT (например, ROBO1, 2, 3), рецептор, отсутствующий при колоректальной карциноме (например, DCC) или UNC-рецептор (например, UNC5A-D). Так как применен в этом документе, агонист или антагонист активирует или ингибирует активность рецептора ROUNDABOUT, DCC- или UNC-рецептора, который предпочтительно представляет собой сигнал, передаваемый путем взаимодействия между рецептором и лигандом, или ингибирование сигнала, который передается с помощью рецептора, не занятого лигандом.

В некоторых предпочтительных воплощениях агонист, антагонист и/или фактор, изменяющий направление роста, настоящего изобретения выбирают из группы нетринов (такие как нетрин1, нетрин2, нетрин4, нетринG1), белков SLIT (таких как SLIT1, SLIT2, SLIT3), белков эфринов (таких как ЭФРИН А2, А4, А5) и белков SEMAPHRIN (таких как семафорим 3А, 3В, 3С и 3F), их фрагментов и аминокислотных последовательностей.

Термин «излечение или лечение», так как применен в этом документе, означает смягчение нарушения или заболевания или смягчение симптомов, связанных с нарушением или заболеванием, прекращение дополнительной прогрессии или нарастания выраженности симптомов.

Термин «предупреждение» включает предупреждение или профилактику заболевания или нарушения.

Термин «нарушение хряща» имеет отношение к любому отклонению от нормы в хряще, включая заболевания хряща, изменения в хряще, вызванные, например, травмой или дегенеративным процессом.

Термин «дегенеративные заболевания» означает заболевания или нарушения в пораженной структуре хряща, такие как деградация или разрушение хряща с вовлечением костной структуры или без этого. Предпочтительно, дегенеративные заболевания представляют собой дегенеративные заболевания хряща. Эти заболевания включают нарушения височно-челюстного сустава (TMD), нарушения хрящевого кольца сустава, артрит, остеоартрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, юношеский хронический артрит, псевдоартрит тазобедренного или плечевого сустава, ревматоидный полиартрит, дегенеративные заболевания межпозвоночных дисков, костно-хрящевые нарушения, поверхностные хрящевые нарушения, рассекающий остеохондрит, глубокие хрящевые нарушения, хрящевые нарушения средней глубины, слезы мениска, повреждение передней крестообразной связки, синовиальный остеохондроматоз, анкилозирующий спондилит, синовит, виллонодулярный синовит.

Термины нарушение хряща и дегенеративные заболевания, так как применены в этом документе, в частности, не включают остеопороз.

«Дегенеративные заболевания межпозвоночных дисков (DDD)» представляют собой хронический процесс, характеризующийся частично прогрессирующей потерей протеогликана и воды в студенистом ядре одного или нескольких межпозвоночных дисков, что впоследствии может проявиться во множественных нарушениях, таких как идиопатическая боль в нижней части спины, образование грыжи межпозвоночного диска, разрушение внутренних межпозвоночных дисков или растрескивание межпозвоночных дисков, радикулопатия, стеноз спинномозгового канала, индуцированное грыжей межпозвоночного диска воспаление седалищного нерва, воспаление седалищного нерва, идиопатический сколиоз и/или миелопатия. Степень деградации межпозвоночного диска может быть оценена с помощью дооперационного MRI-анализа.

Термин «суставной хрящ» означает ту поверхность части кости в суставах, которая функционирует как упругая прокладка между двумя костями и которая дает возможность суставам двигаться. Нормальный здоровый хрящ описывают как гиалиновый хрящ. Суставной хрящ состоит из специализированных клеток (хондроцитов), встроенных в подложку из внутриклеточного вещества, обогащенного протеогликанами, главным образом, аггреканом, волокнами коллагена типа II, другими белками и водой. Хондроциты, встроенные внутрь матрикса, создаются и поддерживаются его. Хрящевая ткань представляет собой ткань, лишенную нервов и сосудов, и ее питание осуществляется с помощью лежащей ниже ткани.

Несуставной хрящ не покрывает шарнирно-сочлененные поверхности и включает соединительнотканный хрящ (включая межсуставной соединительнотканный хрящ, например, мениск и соединительнотканный хрящ межпозвоночных дисков) и эластический хрящ.

Термин «синовиальный клетки», «синовиальный слой» или «синовиальные фибробласты», так как применен в этом документе, имеет отношение к клетке, физиологически связанной с синовиальной мембраной или присутствующей в синовиальном пространстве; к клетке, полученной из синовиальной мембраны сустава или синовиальной жидкости. Он также имеет отношение к клеточной выстилке, покрывающей нехрящевые поверхности синовиальных суставов. Синовиальный слой состоит из синовиальных выстилающих клеток и синовиальной подвыстилки (субсиновиального слоя), которая сливается с суставной капсулой.

Термин «паннусная ткань» означает пролиферацию синовиальных клеток и/или эрозию ткани, такой как отложение клеток или вещества внутри хряща (например, суставного хряща), инвазию или разрушение суставного хряща с вовлечением субхрящевой области или без нее. Термин также включает инвазию клеток в подхрящевой костный мозг.

В предпочтительном воплощении проблему, лежащую в основе настоящего изобретения, решают путем применения фактора, изменяющего направление роста, для производства фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения дегенеративного заболевания, которое, предпочтительно, не представляет собой остеопороз, в котором фактор, изменяющий направление роста, выбирают из группы, состоящей из полипептидов, имеющих последовательность, которая а) имеет, по меньшей мере, 85% гомологии, предпочтительно 90%, 95% гомологии, более предпочтительно, идентична аминокислотной последовательности белка SLIT3 (SEQ ID NO:1) или нетрина1 (SEQ ID NO:10), b) представляет собой активный фрагмент белка SLIT3 или нетрина1 или с) имеет, по меньшей мере, 85%, 90%, 95% гомологии с аминокислотной последовательностью активного фрагмента b).

Термин «активный фрагмент» предпочтительно означает активность полипептида, который связывается с тем же рецептором или партнером по связыванию, как и зрелый полноразмерный полипептид, например зрелый полипептид SLIT3. Связывание, например, может активировать или ингибировать рецептор и расположенный ниже каскад. Активность фрагмента SLIT3 может, например, быть определена с помощью связывания с его ROBO рецептором с помощью способов, известных в этой области техники, таких как анализ связывания методом «Biacore», in vitro методом «pulldown assay», как описано в работе (Mar-lot et al., 2007), исследование связывания белка методом ELISA или иммунопреципитации. Активность фрагмента также может быть определена с помощью анализов, описанных в примерах 2, 3, 4, 6, 7 или 9 изобретения, например, анализ миграции в камере Бойдена, анализ пролиферации или функциональный анализ in vivo, такие как описаны в примерах 6 и 7.

Для определения процента гомологии двух аминокислотных последовательностей последовательности выравнивают для оптимизации сравнения (например, в последовательность одного белка или нуклеиновой кислоты для оптимального сравнительного анализа первичной структуры с другим белком или нуклеиновой кислотой могут быть введены разрывы). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих позициях аминокислот. Если позиция в одной из последовательности занята тем же аминокислотным остатком, что и соответствующая позиция в другой последовательности, то молекулы гомологичны по этой позиции.

Процент гомологии между двумя последовательностями представляет собой функцию числа идентичных позиций, являющихся общими для двух последовательностей (т.е. % гомологии = число идентичных позиций / общее число позиций × 100).

Кроме вышеописанных способов, определение процента гомологии между двумя последовательностями может быть завершено с помощью математического алгоритма. Предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения двух последовательностей, представляет собой алгоритм, приведенный в работе Karlin и Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST, предложенные Altschul, et al. (1990 J. Mol. Biol. 215:403-410).

Поиски белка BLAST могут быть выполнены с помощью программы XBLAST, счет = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных последовательностям CCSRP настоящего изобретения. Для получения выравниваний с пропусками для сравнения первичных структур можно применить программу Gapped BLAST такую, как описана в работе Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). При применении программ BLAST и Gapped BLAST можно воспользоваться параметрами, используемыми по умолчанию, в соответствующих программах (например, XBLAST и NBLAST). Другой предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм, предложенный Myers и Miller (CABIOS 1989). Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая представляет собой часть пакета программ сравнительного анализа первичной структуры последовательности GCG. При применении программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть применены таблица массы остатков РАМ 120, ограничение на длину пропуска, равное 12, и штраф за пропуск в последовательности, равный 4, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных последовательностям CCSRP настоящего изобретения. При выравнивании с пропусками для сравнения может быть применена программа Gapped BLAST так, как описано в работе Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). При применении программ BLAST и Gapped BLAST могут быть применены параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST). Другой предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, применяемого для сравнения последовательностей, представляет собой алгоритм, предложенный Myers и Miller (CABIOS 1989). Такой алгоритм включен в программу ALIGN (версия 2.0), которая представляет собой часть пакета программ GCG сравнительного анализа первичной структуры последовательностей. При применении программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть применены таблица массы остатков РАМ 120, ограничение на длину пропуска, равное 12, и штраф за пропуск в последовательности, равный 4.

Фрагменты предпочтительно имеют длину, равную менее чем 1523 или 1522 аминокислоты, предпочтительно равную менее чем 1491, 900, 500, 400, 300, 200 аминокислот, предпочтительно, по меньшей мере, 20, 50, 100 аминокислот и вплоть до 100, 200, 300, 400, 500 аминокислот. В предпочтительном воплощении фактор, изменяющий направление роста, в соответствии с изобретением включает аминокислотную последовательность, которую выбирают из последовательностей SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 и 9, и предпочтительно полипептида, аминокислотная последовательность которого короче, чем зрелый белок SLIT3. Предпочтительно аминокислотная последовательность короче, чем 1523 или 1522, предпочтительно короче, чем 1491 или короче, чем 900 аминокислот в длину, предпочтительно от 200 до 900 аминокислот в длину или более предпочтительно от 220 до 760, от 240 до 520, от 250 до 300 аминокислот в длину. В дополнительном предпочтительном воплощении фактор, изменяющий направление роста, в соответствии с изобретением включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, 7, 8 или 9 и аминокислотную последовательность короче, чем зрелый белок SLIT3.

Термин «зрелый белок SLIT3» имеет отношение к белку SLIT3 человека без сигнальной пептидной последовательности. Предпочтительно зрелый белок SLIT3 начинается с позиции 33 или 34 в последовательности SEQ ID NO:1 или начинается с позиции 1 или 2 в последовательности SEQ ID NO:2.

В некоторых воплощениях фактор, изменяющий направление роста, включает аминокислотную последовательность, которую выбирают из последовательностей SEQ ID NO: от 1 до 9 или которая имеет, по меньшей мере, 85% гомологии в аминокислотной последовательности с последовательностями SEQ ID NO: от 1 до 9, в которой аминокислотная последовательность предпочтительно короче, чем зрелый белок SLIT3.

В другом предпочтительном воплощении фактор, изменяющий направление роста, в соответствии с изобретением включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность последовательностей SEQ ID NO:1 от 34 до 917 положения, от 47 до 863 положения, от 66 до 857 положения, от 279 до 863 положения, от 279 до 857 положения, от 279 до 724 положения, от 279 до 504 положения, от 311 до 432 положения, от 335 до 432 положения или от 312 до 437 положения. Более предпочтительно, фактор, изменяющий направление роста, в соответствии с изобретением включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность последовательностей SEQ ID NO:1 от 308 до 413 положения, от 308 до 317 положения, от 331 до 340 положения, от 344 до 352 положения, от 357 до 366 положения, от 380 до 389 положения, от 394 до 402 положения или от 404 до 413 положения или их комбинации.

Дополнительно, факторы, изменяющие направление роста, в которых один или несколько Cys заменены другой аминокислотой, в особенности Ala, представляют собой предпочтительные факторы, изменяющие направление роста. Факторы, изменяющие направление роста, включающие последовательность, которую выбирают из последовательностей SEQ ID NO: от 1 до 9, в особенности из последовательностей SEQ ID NO: от 2 до 9, в которых один или несколько Cys заменены другой аминокислотой, в особенности Ala, представляют собой предпочтительные факторы, изменяющие направление роста. Последовательность SEQ ID NO:21, которая получена из последовательности SEQ ID NO:9 путем замещения Cys в положении 85 на Ala, представляет собой предпочтительный пример такого фактора, изменяющего направление роста.

В предпочтительном воплощении фактор, изменяющий направление роста, негликозилирован, по меньшей мере, во втором обогащенном лейцином повторяющемся домене или в гомологичном обогащенном лейцином повторяющемся домене.

Термин «второй обогащенный лейцином повторяющийся домен» настоящего изобретения имеет отношение к консервативной обогащенной лейцином аминокислотной последовательности, присутствующей в белках SLIT. Обогащенный лейцином повторяющийся (LRR) домен белка SLIT3 состоит из четырех LRR (LRR1-4), фланкированных амино- и карбокси-концевыми консервативными участками (LRJR-NR и LRR-CR) (Itoh, et al., 1998; Howitt, et al., 2004; Hohenester, et al., 2006). Второй обогащенный лейцином домен охватывает аминокислотную последовательность от 248 до 467 положения последовательности SEQ ID 1. Гомологичный обогащенный лейцином повторяющийся домен имеет отношение к аминокислотной последовательности с консервативными аминокислотными заменами во втором обогащенном лейцином повторяющемся домене, гомологичному участку членов другого семейства SLIT, таких как белки SLIT1 и SLIT2, и/или имеет 80%, 85%, 90%, 95% гомологии к аминокислотной последовательности от 248 до 467 положения последовательности SEQ ID 1.

В дополнительном предпочтительном воплощении фактор, изменяющий направление роста, в соответствии с настоящим изобретением не гликозилирован, более предпочтительно фактор, изменяющий направление роста, представляет собой рекомбинантный белок, полученный в Е.coli.

В дополнительном предпочтительном воплощении дегенеративные заболевания, предпочтительно дегенеративные заболевания хряща выбирают из группы, состоящей из дегенеративного заболевания межпозвоночного диска, слез мениска, повреждения передней крестообразной связки (ACL), артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, юношеского хронического артрита, псевдоартрита тазобедренного или плечевого сустава, ревматоидного полиартрита, виллезонодулярного синовита или синовита.

В другом предпочтительном воплощении суставной хрящ представляет собой гиалиновый суставной хрящ.

В предпочтительном воплощении несуставной хрящ выбирают из группы, состоящей из мениска и межпозвоночного диска.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция настоящего изобретения и/или фармацевтическая композиция, включающая изолированный полипептид по любому из воплощений изобретения, представляет собой композицию, которую вводят с помощью инъекции, которую предпочтительно локально вводят с помощью инъекции рядом с повреждением или несистематично, или даже более предпочтительно вводят внутрисуставно, в синовию и/или в синовиальную жидкость.

В дополнительном предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция настоящего изобретения и/или фармацевтическая композиция, включающая изолированный полипептид по любому из воплощений изобретения, представляет собой композицию, которую вводят с помощью инъекции, которую вводят систематически, например, с помощью внутривенного введения.

В специальном воплощении, фармацевтическую композицию вводят местно в область, нуждающуюся в лечении. Этого можно достигнуть, например, с помощью местной инфузии в ходе хирургического вмешательства, местного нанесения, с помощью инъекции, с помощью катетера или с помощью имплантата, указанного имплантата, пористого или непористого.

Другие способы введения фармацевтической композиции, охваченные настоящим изобретением, представляют собой внутрикожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный, интраназальный или пероральный пути введения. Адаптированный диапазон доз будет зависеть, среди прочего, от способов введения и возраста, массы и состояния пациента, которого лечат.

Подходящее количество полипептида, вводимого пациенту, предпочтительно равно от 0,001 мг/кг массы тела пациента до 100 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно от 0,01 мг/кг массы тела пациента до 20 мг/кг массы тела пациента, более предпочтительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела пациента, наиболее предпочтительно от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг массы тела пациента.

Фармацевтическая композиция, включающая факторы, изменяющие направление роста, настоящего изобретения, и/или фармацевтическая композиция, включающая изолированный полипептид по любому из воплощений, описанных ниже и выше, может быть в форме разнообразных композиций, например включать фармацевтически приемлемые носители. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в руководстве «Remington's Pharmaceutical Sciences», (18th Ed., 1990, ISBN #: 0912734027, Mack Pub Co). Композиция может доставлять фактор, изменяющий направление роста, быстро или может быть композицией с замедленным высвобождением. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество фактора, изменяющего направление роста, вместе с подходящим количеством носителя, обеспечивая, таким образом, формы для правильного введения пациенту. Композиция должна подходить для способа введения. Независимо от способа введения фактор, изменяющий направление роста, входит в состав композиции в приемлемых стандартных лекарственных формах с помощью общепринятых способов, известные специалистам в фармацевтической области техники. В предпочтительном воплощении фактор, изменяющий направление роста, вводят в состав в соответствии с рутинными процедурами для фармацевтической композиции для внутривенного введения людям. Обычно фармацевтические композиции для внутривенного введения включают солюбилизирующее средство, например стерильный изотонический водный буфер с местным анестетиком, таким как лигнокаин, или без него. В общем, ингредиенты поставляются или по отдельности, или смешанными в стандартных лекарственных формах, например, в виде высушенного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически закрытых контейнерах, таких как ампула или пакетик. В случае если фармацевтическую композицию вводят с помощью инфузии, то она может быть распылена с помощью бутылочки для инфузии, содержащей солюбилизирующее средство.

В предпочтительном воплощении композиция включает водный раствор, солевой раствор, твердое вещество, полутвердое вещество, жидкость, пастообразную массу, лекарственные формы в виде пластического материала, дисперсии, суспензии, гели, липосомы, подложку, материал, сохраняющий форму, материалы, создаваемые in situ, биоматериал, представляющий собой тканевой клей, которые можно вводить с помощью инъекции, и представляют собой минимально инвазивные, а также пригодная для имплантации формы нанесения.

В некоторых других воплощениях фармацевтическую композицию настоящего изобретения выбирают из группы, состоящей из водного раствора, твердого вещества, полутвердого вещества, пасты, пластического материала, липосом, материала, сохраняющего форму, подложки, материалов, создаваемых in situ, биоматериала, представляющего собой тканевой клей.

В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция включает фактор, изменяющий направление роста, и/или изолированный полипептид фактора, изменяющего направление роста, заключенный в липосомы. Композиции в виде липосом имеют по сравнению с растворами то преимущество, что белок защищен от деградации в биологическом окружении, кроме того, удлиняется срок действия терапевтического средства и замедляется клиренс в месте применения.

Липосомы обычно включают замкнутую липидную каплю, имеющую ядро, обычно содержащее соединение в водной среде. В некоторых воплощениях соединение химически связано с липидным компонентом или просто содержится во внутреннем водном компартменте липосомы.

Фармацевтические композиции, обеспечиваемые в соответствии с настоящим изобретением, предпочтительно обеспечивают в виде высушенной липосомной композиции, которая может быть реконструирована для получения липосом, в которые заключен фактор и/или полипептид, изменяющий направление роста, предпочтительно липосомный препарат представляет собой высушенные реконструируемые везикулы (DRV), которые после реконструкции в водном растворе образуют липосомы, в которые заключен белок. Липосомная композиция, примененная в этом документе, представляет собой, например, сухие гранулированные изделия, которые после добавления воды диспергируют для образования многослойных липосомных композиций, включающих биологически активный компонент. Предпочтительно проблем со стабильностью, таких как агрегация или окисление, удается избежать путем применения высушенных липосом.

Липиды, подходящие для применения в композициях, присутствующие индивидуально или в смесях, включают нейтральные или положительно заряженные липиды, такие как холестерин, фосфатидилхолин, тидрогенизированный фосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин, сфингомиелин, диолеилфосфатидилхолин, диолеилфосфатидилглицерин, фосфатидилглицерин, димиристоилфосфатидилхолин, дипальмитоилхолин, ганглиозиды, церамиды, фосфатидилинозитол, фосфатидные кислоты, диацетилфосфат, димиристоилфосфатидилхолин, стеариламин, дипальмитоилфосфатидилглицерин и другие похожие липиды. Предпочтительно липидная смесь представляет собой смесь заряженных липидов. Липосомная композиция обычно представляет собой смесь, по меньшей мере, из двух липидов, таких как холестерин и фосфатидилхолин, и чаще из трех или более липидов.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает изолированный полипептид, имеющий, по меньшей мере, 85%-ную гомологию аминокислотной последовательности, предпочтительно 90%-ную, более предпочтительно 95%-ную гомологию аминокислотной последовательности последовательностям SEQ ID NO: от 1 до 9, и в которой аминокислотная последовательность короче, чем зрелый белок SLIT3, предпочтительно в которой изолированный полипептид короче, чем 1523, предпочтительно короче, чем 1491, или короче, чем 900 аминокислот в длину, предпочтительно от 200 до 900 аминокислот в длину или более предпочтительно от 200 до 760, от 200 до 520, от 200 до 300 аминокислот в длину. В предпочтительном воплощении изолированный полипептид включает аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID NO: от 1 до 9, более предпочтительно изолированный полипептид содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9, и в которых аминокислотная последовательность короче, чем зрелый белок SLIT3, предпочтительно в которых изолированный полипептид короче, чем 1523, предпочтительно короче, чем 1491, или короче, чем 900 аминокислот в длину, предпочтительно от 200 до 900 аминокислот в длину или более предпочтительно от 220 до 760, от 240 до 520, от 250 до 300 аминокислот в длину.

В предпочтительном воплощении настоящее изобретение дополнительно обеспечивает изолированный полипептид, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 от 34 до 917 положения, от 47 до 863 положения, от 66 до 857 положения, от 279 до 863 положения, от 279 до 857 положения, от 279 до 724 положения, от 279 до 504 положения, от 311 до 432 положения, от 335 до 432 положения или от 312 до 437 положения.

Более предпочтительно, настоящее изобретение обеспечивает изолированный полипептид, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность последовательности SEQ ID NO:1 от 308 до 413 положения, от 308 до 317 положения, от 331 до 340 положения, от 344 до 352 положения, от 357 до 366 положения, от 380 до 389 положения, от 394 до 402 или от 404 до 413 или их комбинации.

В предпочтительном воплощении изолированный полипептид и/или фактор, изменяющий направление роста, настоящего изобретения пегилирован. Таким образом, модифицированный полипептид и/или фактор, изменяющий направление роста, имеет более продолжительный период биологического полураспада, по сравнению с немодифицированным средством, и, следовательно, улучшает эффективность средства для медицинского лечения дегенеративных заболеваний. Дополнительно снижается тенденция белка к агрегации.

Пегелирования достигают через стабильные ковалентные связи между амино- или сульфгидрильной группой в белке и химически реакционноспособной группой (карбонат, сложный эфир, альдегид или трезилат) на полиэтиленгликоле (PEG). Полученная структура может быть линейной или разветвленной. PEG реагенты, например, описаны в работе Roberts et al. (Roberts, et al., 2002). Другие средства для пегелирования представляют собой, но не ограничиваются, метоксиполи(этиленгликоль) (mPEG), метил-PEO12-малеинимид-РЕО, блокированные метилом полиэтиленоксид-(PEO)-содержащие модифицирующие средства с реакционноспособным амином (метил-PEOn-NHS сложные эфиры, n=4, 8, 12).

Могут быть также применены модифицированные и/или стабилизированные пептиды, такие как стабилизированные пептиды, имеющие модифицированные соединения для предотвращения деградации пептидов.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую изолированный полипептид или фактор, изменяющий направление роста, по любому из описанных выше воплощений.

В другом предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию по любому из воплощений, в которых белок объединяют с основой, имплантом или системой доставки.

Носитель, имплантат или устройство для доставки, примененное в изобретении, предпочтительно биологически совместимы, в том смысле, что они не токсичны и не вызывает воспалительных реакций в организме. Они могут включать подложку или трехмерную подложку-носитель и могут быть твердыми, жидкими, гелем, пастой или другими лекарственными формами, вводимыми с помощью инъекции. Предпочтительно, основа, имплантат или устройство для доставки включают гидрогель, такой, например, как описан в WO2005/113032, в особенности гидрогели, вводимые с помощью инъекции, сульфатированная гиалуроновая кислота, высокозамещенная карбоксиметилцеллюлоза и их соли, альгинат, гидроксипропилальгинат, хитозан, гидроксиэтилкрахмал, коллаген, желатин, обратные термальные гели (например, Pluronic F128), термочувствительный сополимер на основе хитозана (например, хитозан-Pluronic® гидрогель), пористый шелковый каркас, разнообразные микросферы, липосомная композиция и гидроксиапатитные пористые волокна.

В предпочтительном воплощении основа в соответствии с настоящим изобретением включает фибриновый гель, составленный из обогащенной тромбоцитами плазмы, обогащенная тромбоцитами плазма с поддающимся биологическому разложению желатиновым гидрогелем, композиты фибрин/гиалуроновая кислота, фактор, заключенный в микросферы из желатинового гидрогеля, вводимые с помощью инъекции поддающийся биологическому разложению гидрогелевые композиты, включающие, например, полимеры, такие как олиго(поли(этиленгликоль)фумарат, полилактид-(PLA) /полигликолевая кислота (PGA) и поли(эпсилон-капронолактон).

Предпочтительно основа включает хитозан-глицеролфосфат или стабилизированные in situ сгустки крови с хитозан-глицеролфосфатным раствором.

В еще одном воплощении система доставки включает поддающийся разложению гидрогелевый каркас, такой как желатиновые микрочастицы, полимер, основанный на поддающихся биологическому разложению и биологически совместимых гидрогелях, укрепленный полимером гибридный сгусток или другой полимер, основанный на поддающихся биологическому разложению и биологически совместимых имплантатах, или системами доставки для доставки фактора, изменяющего направление роста, и/или изолированного полипептида настоящего изобретения.

Предпочтительные полимеры изобретения включают коллаген, хондроитина сульфат, гиалуроновую кислоту, гиалуронат, гиалуроновый эфир, бензиловый эфир гиалуроновой кислоты, олиго(поли)(этиленгликоль)фумарат, хитозан, хитозана глицеролфосфат, включая тройные сополимеры, такие как тойной сополимер желатин/хондроитин-6-сульфат/гиалуронат, или любые их комбинации.

В дополнительном воплощении фармацевтическую композицию составляют как композицию с замедленным высвобождением. В еще одном воплощении фармацевтическую композицию составляют как композицию с замедленным высвобождением, которая обеспечивает периодическое высвобождение.

Лечение дегенеративного заболевания может быть дополнительно улучшено путем стабилизации сгустка крови, сформированного при повреждении дегенерированной ткани полимером, который обладает тромбообразующей активностью и способен стимулировать процесс заживления раны. Следовательно, в дополнительном предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция дополнительно включает, по меньшей мере, одно вещество, добавку или подложку с тромбообразующей активностью.

В дополнительном предпочтительном воплощении полимер представляет собой тромбообразующий полимер, и/или он стимулирует агрегацию и дегрануляцию тромбоцитов.

В другом предпочтительном воплощении полимер представляет собой кровоостанавливающее средство, более предпочтительно полимер представляет собой кровоостанавливающее средство и стимулирует реваскуляризацию тканей раны и/или восстановление соединительной ткани.

В еще одном воплощении полимер солюбилизируется в физиологических условиях и формирует твердый имплантат после смешивания с кровью. Эти имплантаты имеют то преимущество, что они лучше срастаются с тканевыми нарушениями, по сравнению с нормальными сгустками, и, следовательно, улучшают регенерацию хряща.

В некоторых воплощениях фармацевтическая композиция по любому из воплощений настоящего изобретения дополнительно включает клетки хряща, предпочтительно клетки в них хряща представляют собой хондроциты.

Совместное заключение в капсулу хондроцитов человека, полученных из различных тканей, например, из клеток уха, носа, ребра, клеток внутреннего мениска (IMC), клеток жирового тела (FPC), клеток синовиальной мембраны (SMC), хондроцитов суставов или хондроцитов других тканей, мезенхимальных стволовых клеток (MSC) и/или клеток костномозговой стромы человека, как в упомянутых выше воплощениях, так и в их комбинации, также представляет собой воплощение изобретения. В частности, эти клетки растут с факторами роста или без него для усиления хондрогенеза различных типов хондроцитов и затем индуцируют формирование хрящевой ткани после имплантации.

«Мезенхимальные стволовые клетки (MSC)» в соответствии с настоящим изобретением представляют собой популяцию примитивных или покоящихся клеток, которые свойственны многим зрелым тканям скелетам как некоммитированные мезенхимальные клетки-предшественники. MSC представляют собой лабильные клетки, обладающие способностью дифференцировать в некоторые типы зрелых тканей, включая хрящ, кость, жир и другие ткани, в зависимости от окружения и биологических сигналов, получаемых этими покоящимися клетками. MSC доступны из многих аутологических источников, включая костный мозг, кровь, мышечную ткань и жир, из которые эти клетки могут быть получены и изолированы без существенных осложнений в области, из которой была получена ткань, или без иммунных осложнений.

Кроме того, проблему, лежащую в основе настоящего изобретения, решают с помощью применения полипептида по любому из описанных выше воплощений для производства фармацевтической композиции для предупреждения и/или лечения заболевания, такого как дегенеративное заболевание. В предпочтительном воплощении дегенеративные заболевания представляют собой такие дегенеративные заболевания, как приведены в любом из описанных выше воплощений. Предпочтительно дегенеративное заболевание представляет собой артрит, такое как остеоартрит или ревматоидный артрит, включая хронический или острый ревматоидный артрит.

В еще одном воплощении изобретение имеет отношение к применению фактора, изменяющего направление роста, по любому из упомянутых выше воплощений для воздействия на миграционное поведение мезенхимальных стволовых клеток.

Кроме того, изобретение охватывает применение фактора, изменяющего направление роста, по любому из упомянутых выше воплощений для индукции миграции или привлечения мезенхимальных стволовых клеток.

Предпочтительно, изобретение имеет отношение к применению фактора, изменяющего направление роста, по любому из упомянутых выше воплощений для индукции образования хряща и/или для стимуляции пролиферации или дифференциации хондроцитов.

Изобретение дополнительно включает изолированный полипептид, включающий консенсусную последовательность C(Y)₃CYC(Y)₆C(Y)₉₉C(Y)₄₇CYC(Y)₂₀C(Y)₂₀C(Y)₂₀C(Y)_13-22C.

Изолированный полипептид, включающий консенсусную последовательность C(Y)₃CYC(Y)₆C(Y)₉₉C(Y)₄₇CYC(Y)₂₀C(Y)₂₀C(Y)₂₀C(Y)_13-22C, в которой С обозначает цистеин и Y обозначает любую аминокислоту, в которой, по меньшей мере, один цистеин замещен любой другой аминокислотой за исключением цистеина, дополнительно представляет собой предпочтительный полипептид. Путем замещения, по меньшей мере, одного цистеина другой аминокислотой можно повлиять на фолдинг последовательности и/или образование димера этой последовательностью.

Изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию для генной терапии для предупреждения и/или лечения дегенеративного заболевания, включающей DNA гена фактора, изменяющего направление роста, или ее части, кодирующие фактор, изменяющий направление роста, или его активный фрагмент, который обладает терапевтическим влиянием на дегенеративное заболевание, такое как одно из заболеваний, описанных в рамках изобретения.

В соответствии с фармацевтической композицией настоящего изобретения DNA гена фактора, изменяющего направление роста, или ее части могут быть обеспечены предпочтительно с помощью ретровирусного вектора, аденовирусного вектора, ассоциированного с аденовирусом вирусного вектора (AAV), вирусного вектора простого герпеса (HSV), вирусного вектора лейкоза мышей (MLV), лентивирусного вектора или с помощью плазмиды, которая может быть экспрессирована в клетках человека или в рекомбинантной клетке, которую трансформировали или трансфицировали рекомбинантным вектором, включающим DNA, которая кодирует фактор, изменяющий направление роста, или его активный фрагмент, с целью нанесения фактора, изменяющего направление роста, местно на пораженную ткань (местное введение), систематически или непрерывно.

Термин «DNA гена фактора, изменяющего направление роста», означает DNA, которая кодирует фактор, изменяющий направление роста, или его активный фрагмент. Термин не ограничен природной изолированной DNA, но также включает любую форму модификации природной нуклеотидной последовательности, которая после трансляции формирует полипептид по любому из воплощений настоящего изобретения или которая формирует полипептид, который сохраняет активность фактора, изменяющего направление роста, предпочтительно дополнительно к элементам для экспрессии регуляции, функционально связанной с нуклеиновыми кислотами (например, элементы индуцируемого промотора и/или элемент(элементы) энхансера), подходящие для цели настоящего изобретения. Рекомбинантный вектор также может включать нуклеотидную последовательность для сигнального пептида, необходимого для секреции полипептида из клетки. Вектор может дополнительно включать один или несколько избранных генов-маркеров или генов-репортеров.

DNA может быть получена из фактора, изменяющего направление роста, человека, мыши, крысы или другого позвоночного. Нуклеотидные последовательности, кодирующие эти белки, доступны специалистам. Предпочтительно, чтобы DNA была получена из фактора, изменяющего направление роста, человека. Последовательности могут быть, например, найдены в базах данных GenBank, SwissProt и в других базах данных. Они могут представлять собой cDNA или геномную DNA и клоны, включающие нуклеиновые последовательности, которые могут быть получены из банков клеток, таких как АТСС, или могут быть клонированы с помощью PCR-подходов, или могут быть синтезированы химически. Последовательность DNA может быть дополнительно оптимизирована для частоты использования кодона. Примеры DNA последовательностей для факторов, изменяющих направление роста, представляют собой GI4507060 (Slit1), GI4759145 (Slit2), GM 1321570 (Slit3), GM48613883 (Netrini) или нуклеиновые кислоты, представляющие собой их фрагменты.

Предпочтительно рекомбинантные клетки представляют собой аутологические фибробласты синовиального слоя, клетки кожи, костного мозга, лимфоциты или дендритные клетки. Наиболее предпочтительно, рекомбинантные клетки представляют собой аутологические фибробласты синовиального слоя, клетки кожи или дендритные клетки.

В одном из воплощений настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию и ее применение для местной доставки молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих фактор, изменяющий направление роста, или его активный фрагмент в пораженную ткань, такую как пораженные артритом суставы, в особенности в ревматоидный синовиальный слой. В особенности, фармацевтическая композиция и ее применение облегчают эффективную трансфекцию или трансформацию молекул нуклеиновой кислотой, кодирующих фактор, изменяющий направление роста, в клетки ткани, такие как синовиальные клетки, в терапевтически эффективном количестве и в течение достаточного периода времени с предпочтительно высокой экспрессией терапевтического белка клетки-мишени.

Предпочтительно вектор или плазмиду не интегрируют в геном трансформированной клетки, например, для экспрессии белка по внехромосомному типу.

Предпочтительно вектор или плазмиду стабильно интегрируют в геном трансформированной клетки и предпочтительно обеспечивают долговременное и/или замедленное высвобождение терапевтического белка.

Местное введение фармацевтической композиции в пораженную ткань, такую как пораженный артритом сустав, предпочтительно имеет отношение к введению in vivo или ex vivo в пораженный артритом синовиальный слой. Доставка нуклеиновой кислоты ех vivo включает трансформацию аутологической или неаутологической синовиальной клетки вирусным вектором или трансфекцию плазмидой, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор, изменяющий направление роста, или ее части, отбор трансформированных клеток и введение трансформированных клеток в ревматоидный сустав субъекта, например, с помощью реимплантации, инъекции или реинфузии клеток в сустав субъекта. Введение in vivo имеет отношение к прямому введению вектора или плазмиды, включающей нуклеиновую кислоту, кодирующую фактор, изменяющий направление роста, или ее части в сустав субъекта, например, с помощью внутрисуставной инъекции. Преимущество местного введения заключается в том, что можно применять меньшее количество генного продукта, и, таким образом, меньшее количество вектора требуется для лечения индивидуальных суставов.

Для систематической доставки вектор предпочтительно вводить во внесуставную область, например, с помощью внутримышечной, подкожной или внутривенной инъекции с помощью единственной инъекции или повторных инъекций или инфузии.

Предпочтительно фармацевтическая композиция описанных выше воплощений дополнительно включает дополнительные фармацевтически приемлемые эксипиенты, такие как, но не ограничиваясь, физиологические жидкости, вода, солевые растворы, буферы, эмульгаторы, стабилизаторы, лиофилизирующие средства и им подобные.

Альтернативно, фармацевтическая композиция для генной терапии для предупреждения и/или лечения дегенеративного заболевания, включающая DNA гена фактора, изменяющего направление роста, или ее части, которые кодируют фактор, изменяющий направление роста или его активный фрагмент, вводят внутрь липосом и вводят с помощью инъекции непосредственно в область сустава, в которой липосомы сливаются с синовиальными клетками, что приводит к in vivo экспрессии фактора, изменяющего направление роста, по любому из приведенных выше воплощений.

Предпочтительно фармацевтическую композицию по любому из описанных выше воплощений вводят с помощью инъекции в виде оголенной DNA.

Изобретение дополнительно проиллюстрировано с помощью фигур и примеров, которые предназначены только для иллюстративных целей, а не для ограничения объема настоящего изобретения.

Фиг.1 показывает ингибиторный эффект нетрина1 на миграцию синовиальных фибробластов. Влияние нетрина1 на ОА (А) и RA (В) синовиальные фибробласты на 3-ем пассаже и 10-ом пассаже определяют с помощью анализа в камере Бойдена. NETRIN 1 наносят в верхнюю или в нижнюю ячейку, соответственно.

Фиг.2 показывает миграцию OASF и RASF после добавления белка SLIT3, определяемую с помощью анализа миграции в камере Бойдена.

Инкубация с белком Slit3 (0,1 мкг/мл) снижает миграцию OASF на ранних пассажах (Р3 и Р4) до примерно 60% (Slit3 в верхнюю ячейку вместе с OASF) по сравнению с контролем и до примерно 40% (Slit3 в нижнюю ячейку). В эксперименте с RASF (P3/P4) Slit3 снижает миграцию до примерно 45% (Slit 3 в верхнюю ячейку) и 50% (Slit3 в нижнюю ячейку), соответственно.

Фиг.3 показывает влияние белка SLIT3 на пролиферацию синовиальных фибробластов у пациентов с остеоартритом (OASF) и у пациентов ревматоидным артритом (RASF). Инкубация с белком Slit3 (0,1 мкг/мл) вместе с OASF и RASF слабо снижает рост OASF и RASF.

Фиг.4 показывает дифференциацию мезенхимальных стволовых клеток человека (HMSC) после добавления Slit3.

А Slit3 увеличивает экспрессию аггрекана после 7 дней лечения.

В TGFβ-индуцированная дифференциация HMSC в направлении хондроцитов дополнительно усиливается обработкой Slit3, согласно анализу экспрессии MIA.

Фиг.5 показывает анализ с помощью SDS PAGE экспрессии конструкта LRR2, экспрессированного с системой RTS 500 (Roche Molecular Biochemicals).

Дорожка 1: рекомбинантный белок RTS 500 (без His-Tag) в качестве контроля, 10 мкл.

Дорожка 2: рекомбинантный фрагмент LRR2 белка SLIT3, 10 мкл.

Дорожка 3: рекомбинантный фрагмент LRR2 белка SLIT3, 1 мкл.

Дорожка 4: рекомбинантный мышиный Slit3 (250 нг; R&D Systems).

Фиг.6 показывает опосредуемое белком SLIT3 ингибирование миграции MeI Im (R&D Systems) и клеток А 375 с помощью Slit3 (R&D Systems), LRR2, LRR2 dNC.

Фиг.7 и 8 показывают сниженную миграцию OASF и RASF при анализе миграции в камере Бойдена (в соответствии с примерами 2 и 5) на ранних пассажах при лечении с помощью Slit3 (R&D Systems, фиг.7, фиг.8, дорожка 2, LRR2 (фиг.7, фиг.8, дорожка 3), LRR2 dNC (фиг.7, фиг.8, дорожка 4), LRR 2dNCmut (фиг.8, дорожка 5) и LRR3 (фиг.8, дорожка 6). Дорожка 1: контроль.

Фиг.9 показывает ингибирование разрушения хряща, определяемое как уровень белка GAG в супернатанте ОА синовиальных фибробластов после совместного культивирования с различными белками, изменяющими направление роста.

Дорожка 1: хрящ, контроль (без ОА синовиальных фибробластов).

Дорожка 2: ОА синовиальные фибробласты.

Дорожка 3: ОА синовиальные фибробласты + нетрин1.

Дорожка 4: ОА синовиальные фибробласты + mSlit3.

Дорожка 5: ОА синовиальные фибробласты + LRR2 dNCmut.

Пример 1. Выделение первичных синовиальных фибробластов человека

Образцы синовиальной ткани получают путем синовэктомии и артропластической хирургии от четырех пациентов с RA и четырех пациентов с ОА (Клиника ортопедической хирургии, Schulthess Clinics, Zuerich, Switzerland) после согласования с местным комитетом по этике и с его одобрения. Диагноз ОА ставят в соответствии с клиническими и радиологическими критериями. Все RA пациенты отвечали критерию Американской коллегии ревматологии от 1987 в отношении диагноза RA. У ОА пациентов синовиальную ткань получают из бедренного и коленного суставов, демонстрирующих сужение щели сустава на последней стадии, тогда как у RA пациентов образцы материала получают из запястья или проксимальных межфаланговых суставов, из суставов, демонстрирующих багровый синовит и/или артритные разрушения. Синовиальную ткань измельчают механически, многократно промывают в стерильном солевом растворе с фосфатным буфером (PBS) и подвергают энзиматическому разрушению в присутствии 150 мг/мл Диспазы II (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) в течение 1-го часа при 37°С при постоянном перемешивании. Полученную суспензию клеток высевают на чашки для культуры тканей и культивируют в среде Игла в модификации Дальбекко (DMEM; Gibco Life Technologies, Basel, Switzerland), содержащей 10%-ную фетальную сыворотку теленка и 100 Ед./мл пенициллина на 100 мкг/мл стрептомицина во влажной атмосфере при 37°С, с последующим добавлением 5%-ного CO₂. На третьем, пятом и десятом пассаже прикрепленные фибробласты промывают, трипсинизируют и применяют для выделения RNA или для исследований. В качестве контроля применяют фибробласты кожи.

Пример 2. Ингибирование миграции первичных синовиальных фибробластов человека из RA- и ОА-пациентов

Способность факторов, изменяющих направление роста, ингибировать миграцию синовиальных фибробластов, полученных от пациентов с остеоартритом и ревматоидным артритом, исследуют в миграционном анализе.

Влияние факторов, изменяющих направление роста, на миграцию клеток исследуют с помощью анализа в камере Бойдена, содержащей поликарбонатные фильтры с размером пор, равным 8 мкм (Costar, Bodenheim, Germany), в точности так, как было описано ранее (Jacob, et al., 1995). Фильтры покрывают желатином. Нижнюю ячейку заполняют средой, подходящей для фибробластов, применяемых в качестве хемоатрактантов. Клетки собирают с помощью трипсинизации в течение 2 мин, ресуспендируют в DMEM без FCS до плотности, равной 2×10⁵ клеток/мл, и помещают в верхнюю ячейку камеры. После инкубация при 37°С в течение 4 часов фильтры собирают и клетки, прикрепившиеся к нижней поверхности, фиксируют, окрашивают и подсчитывают. Фактор, изменяющий направление роста, например рекомбинантный нетрин1 (рекомбинантный белок нетрин1 человека, полученных из клеток HEK293, аминокислоты 28-604, с N-концевой Flag-меткой, Alexis Biochemicals), Slit3 (рекомбинантный белок SLIT3 мыши, Ser27-His901, R&D Systems) добавляют как в верхнюю, так и в нижнюю ячейку систему в концентрации, равной 0,1 мкг/мл.

Известно, что фенотипические изменения в синовиальных фибробластах имеют место при культивировании in vitro и что эти клетки постепенно теряют свой агрессивный фенотип за время роста in vitro (Zimmermann et al., 2001). Следовательно, авторы изобретения хотели получить свежеизолированные синовиальные фибробласты с фенотипическими характеристиками, как можно более близкими к конфигурации, наблюдаемой in vivo, и проанализировать влияние факторов, изменяющих направление роста на миграцию, применяя клетки на ранних и поздних пассажах.

Эти эксперименты ясно продемонстрировали ингибирующее влияние этих факторов на миграцию свежеизолированных синовиальных фибробластов синовиальной ткани человека, полученных от пациентов с RA и ОА.

Результаты представлены на фиг.1 и 2.

Как показано на фиг.1 (А) и фиг.1 (В), наблюдается сильное ингибирование миграции RA и ОА синовиальных фибробластов на ранних пассажах (пассаж 3), тогда как фибробласты, полученных из здоровых доноров или из более высоких пассажей, не подвержены воздействию. Эффекты видны после добавления рекомбинантного нетрина1 в верхнюю и нижнюю ячейку, соответственно, следовательно, нетрин1 оказывает воздействие не на хемотаксис, а на молекулярные процессы миграции.

Эти результаты, представленные здесь, подтверждают тот факт, что нетрин снижает миграционную способность клеток, потенциально, за счет отталкивания клеток.

На фиг.2 представлены результаты анализа миграции OASF и RASF и влияние направляющего фактора Slit3 на клетки. На ранних пассажах (Р3 и Р4) зарегистрировано сильное ингибирующее влияние белка SLIT3 как на OASF, так и на RASF (n=2) по сравнению с необработанными клетками. Этот эффект виден не только в присутствии белка SLIT3 в верхней ячейке вместе с SF, но также при комбинации белка SLIT3 с подходящей для фибробластов средой, применяемой в качестве хемоатрактанта, в нижней ячейке.

Пример 3. Влияние рекомбинантных белков Slit 3 и нетрина1 на пролиферацию OASF и RASF

Пролиферация измеряют с помощью набора II для изучения пролиферации клеток (Cell Proliferation Kit II (Roche)) в соответствии с инструкциями производителя. Методика основана на нерадиоактивном, основанном на колориметрических измерениях, количественном анализе (ХТТ) пролиферации клеток, который выполняется в течение четырех дней. Рекомбинантный Slit3 или нетрин1 добавляют в концентрации, равной 0,1 мкг/мл. Исследования пролиферации клеток показали, что рассчитанное время удвоения равно примерно 4,5 дням (d) для OASF и 3,5 дням для RASF. Обработка с помощью Slit3 приводит к слабому ингибированию пролиферации, клеточный рост замедляется до примерно 1 дня для OASF и RASF после обработки в присутствии Slit3 (фиг.3). Слабое ингибирование клеточного роста также видно после обработки в присутствии NETRIN1; однако влияние не существенно.

Пример 4. Дифференциация мезенхимальных стволовых клеток человека (HMSC)

Для оценки влияния белка SLIT3 на дифференциацию клетки HMSC поддерживают в культуре в виде осадка и обрабатывают с помощью Slit3, TGFβ или Slit3fTGFβ, соответственно. Slit3 увеличивает экспрессию аггрекана после 7-дневной обработки и MIA после 21-дневной обработки без индукции с помощью TGFβ (фиг.4). TGFβ-индцуцированная дифференциация HMSC в направлении хондроциты слабо усиливается обработкой Slit3 согласно анализу экспрессии MIA (фиг.4 В).

Пример 5. Экспрессия конструктов SLIT3 в системе RTS

Для анализа того, могут ли быть применены также фрагменты белка SLIT3 в качестве фармацевтически активного ингредиента для производства фармацевтического изделия для лечения RA, были созданы различные SLIT3-конструкты человека и протестированы в функциональных анализах в соответствии с примерами 1-4, применяя клетки MeI Im, первичные клетки А375 человека, клетки RASF и OASF и HMSC и пример 9. Все конструкты были созданы с помощью PCR амплификации cDNA, полученной из RNA, изолированной из хондроцитов человека или фибробластов синовии от множества доноров. Конструкт LRR1-4 (SEQ ID NO:7) амплифицируют, применяя праймеры 5' GAC CAT ATG GCC CCT GCC CCA CCA AGT GTA CC 3' и 5' GAC CCC GGG ATT GCA TTT GGC CAC AAT G 3', конструкт LRR2 (SEQ ID NO:8), применяя праймеры 5'GAC CAT ATG АТС TCC TGC CCT TCG CCC TGC 3' и 5' GAC CCC GGG GAA GCA CTC GCT GCT GAA CC 3', конструкт LRR2 dNC (SEQ ID NO:9), применяя праймеры 5' GAC CAT ATG АТС GTC GAA ATA CGC СТА GAA С 3' и 5' GAC CCC GGG TGG GTT TTG GGC TAA GTG GAG 3', и конструкт LRR3, применяя праймеры 5' GAC CAT ATG GAC CTC GTG TGC CCC GAG AAG 3' и 5' GAC CCC GGG GCT CAG CTG GCA GCT ACT CTC 3'. LRR2 dNCmut (SEQ ID NO:21), в котором оставшийся Cys заменяют на Ala (Cys85Ala), клонируют с помощью сайт-специфического мутагенеза, с помощью набора для выполнения сайт-направленного мутагенеза (QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, Amsterdam, Netherlands)) и праймеры 5' ССА АСА AGA TCA ACG CCC TGC GGG ТТА АСА CGT TTC AGG 3' и 5' ССТ GAA ACG TGT TAA CCC GCA GGG CGT TGA ТСТ TGT TGG 3'. Фрагменты клонируют в участок NdeI и SmaI вектора экспрессии plVEX2. 3-MSC и инсерционные последовательности проверяют с помощью секвенирования. С-концевые HIS-меченые SLIT3 белки экспрессируют в систему RTS 500 system (Roche Molecular Biochemicals). In vitro транскрипцию и трансляцию проводят в соответствии с инструкцией производителя. Экспрессию белка анализируют с помощью Вестерн-блоттинга (SDS PAGE), применяя различное количество белка (1 мкл, 10 мкл), полученного с помощью системы экспрессии RTS 500 (фиг.5). Активность фрагментов белка, полученного с помощью системы RTS 500, исследуют в анализе миграции а) применяя клетки MeI Im (описанные Jacob, et al., 1995), b) клетки А375 (CRL1619, АТСС) и с) клетки OASF и RASF по примеру 2, с помощью анализа в камере Бойдена, как описано в примере 2, за исключением того, что 1 мкл полученного белка в соответствии с системой RTS 500 добавляют или в верхнюю, или в нижнюю ячейку системы. Как показано на фиг.6А и В, фиг.7 и фиг.8, при применении Slit3, LRR2, LRR2 dNC и LRR2 dNCmut наблюдали ингибирование миграции всех клеточных линий. Удивительно, но белок LRR2 dNC, который утратил N- и С-концевые стабилизирующие части последовательности белка SLIT3, как и белок LRR2 dNCmut (вариант с заменой Cys85Ala), также ингибирует миграцию синовиальных фибробластов, следовательно, только минимальный связывающий домен белка, включающий часть вторичной структуры, достаточен для проявления ингибиторного эффекта.

Пример 6. Экспериментальные модели на животных для лечения ревматоидного артрита (RA)

Миграция, разрушительное поведение синовиальных фибробластов и влияние факторов, изменяющих направление роста, настоящего изобретения могут быть проанализированы с помощью различных моделей на животных. Хорошо разработанная модель для анализа новых биологических лекарственных средств для лечения ревматоидного артрита (RA) представляет собой модель индуцированного коллагеном артрита (CIA) у грызунов, например у крыс или мышей (Bendele et al., 2000). RA индуцируют у самок крыс с помощью внутрикожной/подкожной инъекции бычьего коллагена типа II в неполном адъюванте Фрейнда. После развития заболевания крысам вводят фактор, изменяющий направление роста, с помощью системы доставки с замедленным высвобождением, такой, например, как липосомы, или в солевом растворе (PBS) или подкожно, или внутрибрюшинно. Лечение может быть проанализировано путем определения опухания голеностопного сустава и регистрации воспалительного процесса, а также путем гистологической оценки суставов в баллах после декальцификации.

Альтернативная модель представляет собой модель совместной имплантации на мышах с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID). RASF человека и свежеизолированный хрящ человека совместно имплантируют вместе с инертной губкой (например, коллагеновой губкой) под почечную капсулу мышей SCID, и этих мышей содержат в течение 60 дней (Huber, et al., 2006). Клетки RASF захватывают и разрушают суставной хрящ человека.

Третья примененная модель представляет собой индуцированную антителами модель артрита, в которой внутрибрюшинная инъекция смеси моноклональных антител к коллагену типа II в LPS/PBS индуцирует RA у мышей, например у Balb/c мышей (Terato, et al., 1992).

Четвертая модель представляет собой модель хронического OVA-индуцированного или индуцированного антигеном артрита у кроликов (Podolin, et al., 2002). Животных сенсибилизируют с помощью подкожной инъекции 10 мг OVA в 2 мл CFA и поддерживают путем внутрикапсулярного введения OVA в IFA через каждые 3-4 недели. Животным с положительным кожным тестом вводят OVA в PBS внутрь коленного сустава. Кролики получают перорально фактор, изменяющий направление роста, например, фрагмент SLIT3, или носитель. Для измерения эффекта соединения проводят определение синовиальных жидкостей для всех подсчитанных клеток, анализ дифференциации клеток, измерения уровня эйкозаноид/цитокина и измерения диаметра колена с помощью кронциркулей. Образцы крови отбирают перед введением и после введения соединения.

В случае, когда соединение тестируют на его участие в изменении миграции синовиальных фибробластов и способность лечить артрит, указанное соединение может быть добавлено в систему необязательно в солевом растворе или в виде фармацевтической композиции, такой как липосомный препарат.

Пример 7. Экспериментальная модель на животном для лечения остеоартрита (ОА)

Модель на животном для лечения остеоартрита представляет собой модель рассечения передней крестообразной связки кролика. Под общим наркозом и в стерильных условиях коленный сустав кроликов достигают посредством медиального парапателлярного разреза (между медиальной коллатеральной связкой и связкой надколенника). Надколенник смещают латерально и расположенное под коленной чашкой жировое тело освобождают и оттягивают, для того чтобы открыть неповрежденную переднюю крестообразную связку.

Хирургическое вмешательство и инъекции проводят по следующему протоколу: по 6 животных на группу (симуляция, основа и фактор, изменяющий направление роста). Животному вводят 1 или несколько (например, 5) инъекций, предпочтительно, каждые 10 дней. Животных забивают через 10 дней после последней инъекции и получают рентгенограммы.

Следующим шагом готовят образцы для гистологических исследований путем окрашивания сафранином О прочным зеленым и гематоксилином и эозином (например, фиксация 10%-ным нейтральным формалином в буферном растворе, декальцинирование с EDTA и заливка в парафин).

Пример 8. Доставка гена in vivo

Векторы для генной терапии могут быть сконструированы с помощью общепринятых в молекулярной биологии способов. Невирусная и вирусная трансформация синовиальных фибробластов описана, например, в работе Meinecke et al., 2007, включенной в настоящий документ путем отсылки. Местная внутрисуставная генная терапия может быть проанализирована с помощью различных моделей ревматоидного артрита и остеоартрита на животных, таких как, но не ограничиваясь, модели, описанные в примерах 6 и 7.

Каждая патентная заявка и патент, процитированные в этом тексте, а также каждый документ или ссылка, процитированные в этом тексте, недвусмысленным образом включены этим в настоящий документ путем отсылок и могут быть применены при практическом применении изобретения («ссылки, процитированные в настоящем документе»). Каждый из процитированных документов или ссылок, а также патентные заявки и патенты, и патенты, процитированные в процитированных ссылках, недвусмысленным образом включены этим в настоящий документ путем отсылок.

Поскольку предпочтительные воплощения были проиллюстрированы и описаны, следует понимать, что специалистом этой области техники могут быть внесены модификации без отклонения от изобретения в его более широком аспекте, как определено в формуле изобретения.

Пример 9. Ингибирование высвобождения GAG

Образцы хряща человека (кубик с длиной грани, равной 5 мм, 4 кубика для каждой обработки (50 мг)) инкубируют с ОА синовиальными фибробластами (50000 клеток) или без них. Образцы с ОА SF дополнительно обрабатывают или нетрином1, белком mSlit3 или LRR2 dNCmut, соответственно. Супернатант отбирают через 6 дней культивирования и концентрацию GAG измеряют с помощью коммерчески доступного набора для количественного измерения GAG-ELISA (Euro-Diagnostica, Maimo, Sweden; Wieslab sGAG quantitative Kit). Результаты показаны на фиг.9.

Список литературы

Bendele AM, Chlipala ES, Scherrer J, Frazier J, Sennello G, Rich WJ and Edwards CK, III (2000) Combination benefit of treatment with the cytokine inhibitors interleukin-1 receptor antagonist and PEGylated soluble tumor necrosis factor receptor type I in animal models of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 43(12):2648-2659.

Hohenester E, Hussain S and Howitt JA (2006) Interaction of the guidance molecule Slit with cellular receptors. Biochem Soc Trans 34:418-421.

Howitt JA, Clout NJ and Hohenester E (2004) Binding site for Robo receptors revealed by dissection of the leucine-rich repeat region of Slit. Embo J 23:4406-4412.

Huber LC, Distler O, Tamer I, Gay RE, Gay S and Pap Т (2006) Synovial fibroblasts: key players in rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford) 45:669-675.

Itoh A, Miyabayashi T, Ohno M and Sakano S (1998) Cloning and expressions of three mammalian homologues of Drosophila slit suggest possible roles for Slit in the formation and maintenance of the nervous system. Brain Res Mol Brain Res 62: 175-186.

Jacob K, Bosserhoff AK, Wach F, Knuchel R, Klein EC, Hein R and Buettner R (1995) Characterization of selected strongly and weakly invasive sublines of a primary human melanoma cell line and isolation of subtractive cDNA clones, Int J Cancer 60(5):668-675.

Katoh Y and Katoh M (2005) Comparative genomics on SLIT1, SLIT2 and SLIT3 orthologs. OncolRep 14(5):1351-1355.

Klagsbrun M and Eichmann A (2005) A role for axon guidance receptors and ligands in blood vessel development and tumor angiogenesis. Cytokine Growth Factor Rev 16:535-548.

Kuroda R, Ishida K, Matsumoto T, Akisue T, Fujioka H, Mizuno K, Ohgushi H, Wakitani S and Kurosaka M (2007) Treatment of a full-thickness articular cartilage defect in the femoral condyle of an athlete with autologous bone-marrow stromal cells. Osteoarthritis Cartilage 15(2):226-231.

Little MH, Wilkinson L, Brown DL, Piper M, Yamada T and Stow JL (2001) Dual trafficking of Slit3 to mitochondria and cell surface demonstrates novel localization for Slit protein. Am J Physiol Cell Physiol 281: C486-C495.

Meinecke, I., Rutkauskaite, E., Cinski, A., Muller-Ladner, U., Gay, S., and Pap, T. (2007). Gene transfer to synovial fibroblast: methods and evaluation in the SCID mouse model. Methods Mol. Med. 135: 393-412.

Morlot, C., Hemrika, W., Romijn, R.A., Gros, P., Cusack, S., and McCarthy, A.A. (2007). Production of Slit2 LRR domains in mammalian cells for structural studies and the structure of human Slit2 domain 3. Acta Crystallogr. D. Biol Crystallogr. 63: 961-968.

Pap T (2003) New insights into integrin signalling: implications for rheumatoid arthritis synovial fibroblasts. Arthritis Res Ther 5: 154-155;

Pap T (2007) [Regulation of apoptosis in aggressive fibroblasts.]. Z Rheumatol 66: 239-242.

Podolin PL, Bolognese BJ, Foley JJ, Schmidt DB, Buckley PT, Widdowson KL, Jin Q, White JR, Lee JM, Goodman RB1 Hagen TR, Kajikawa O, Marshall LA, Hay DW and Sarau HM (2002) A potent and selective nonpeptide antagonist of CXCR2 inhibits acute and chronic models of arthritis in the rabbit. J Immunol 169: 6435-6444.

Roberts MJ, Bentley MD and Harris JM (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv Drug Deliv Rev 54:459-476.

Terato K, Hasty KA, Reife RA, Cremer MA, Kang AH and Stuart JM (1992) Induction of arthritis with monoclonal antibodies to collagen. J Immunol 148(7):2103-2108.

Vargesson N, Luria V, Messina I, Erskine L and Laufer E (2001) Expression patterns of Slit and Robo familly members during vertebrate limb development. Mech Dev 106:175-180.

Yasuda T (2006) Cartilage destruction by matrix degradation products. Mod Rheumatol 16:197-205.

Zimmermann T, Kunisch E, Pfeiffer R, Hirth A, Stahl HD, Sack U, Laube A, Liesaus E, Roth A, Palombo-Kinne E, Emmrich F and Kinne RW (2001) Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Res 3: 72-76.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине. Белок SLIT применяется при производстве фармацевтической композиции для предупреждения или лечения повреждений хряща. Предложенное изобретение позволяет эффективно предупреждать или лечить повреждения хряща. 14 з.п. ф-лы, 9 ил., 9 пр.

1. Применение белка SLIT при производстве фармацевтической композиции для предупреждения или лечения повреждений хряща.

2. Применение по п.1, где белок SLIT представляет собой а) фрагмент SLIT3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, b) активный фрагмент SLIT3 с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 7, 8, 9 или 21.

3. Применение по п.1, где белок SLIT является агонистом или антагонистом ROBO-рецептора.

4. Применение по п.1 при производстве фармацевтической композиции для предупреждения или лечения повреждений хряща, где повреждения хряща связаны с инфильтрацией или миграцией синовиальных фибробластов внутрь суставного или несуставного хряща или связаны с образованием паннуса.

5. Применение по п.1, где повреждения хряща представляют собой дегенеративные заболевания, связанные с ослабленным прикреплением клеток к суставному или несуставному хрящу.

6. Применение по п.1, где заболевание выбирают из группы, состоящей из дегенеративного заболевания межпозвоночного диска, слез мениска, повреждения передней крестообразной связки (ACL), артрита, остеоартрита, ревматоидного артрита, псориатического артрита, юношеского хронического артрита, псевдоартрита тазобедренного или плечевого сустава, ревматоидного полиартрита, синовита или виллезонодулярного синовита.

7. Применение по п.1, где белок SLIT не гликозилирован, по меньшей мере, во втором обогащенном лейцином повторяющемся домене или гомологичном обогащенном лейцином повторяющемся домене.

8. Применение по п.1, где фармацевтическую композицию вводят инъекцией.

9. Применение по п.8, где фармацевтическую композицию вводят инъекцией для внутрисуставного введения или для введения в синовию.

10. Применение по любому из пп.1-9, где фармацевтическую композицию выбирают из группы, состоящей из водного раствора, твердого вещества, полутвердого вещества, пасты, пластического материала, липосом, материала, сохраняющего форму, подложки, материала, образующегося in situ, или биоматериала, представляющего собой тканевой клей.

11. Применение по любому из пп.1-9, где фармацевтическая композиция дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.

12. Применение по любому из пп.1-9, где белок SLIT комбинируют с носителем, имплантатом или системой доставки.

13. Применение по любому из пп.1-9, где фармацевтическая композиция дополнительно включает, по меньшей мере, одно вещество, добавку или подложку с тромбообразующей активностью.

14. Применение по любому из пп.1-9, где фармацевтическая композиция дополнительно включает клетки хряща.

15. Применение по п.14, где клетки хряща представляют собой хондроциты.