СПОСОБ ОГРАНИЧЕНИЯ СТРЕСС-РЕАКЦИИ ПРИ ОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ ГИПОКИНЕТИЧЕСКОМ СТРЕССЕ Российский патент 2011 года по МПК G09B23/28 A61K38/19 A61P43/00 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и физиологии, и касается предупреждения последствий и лечения нарушений при остром и хроническом стрессе вследствие длительной гипокинезии у лабораторных животных в специфических условиях эксперимента.

Гипокинезия как стресс-фактор активно исследовалась в 60-70-е годы в связи с развитием космической биологии. Ограничение двигательной активности рассматривается одним из наиболее грозных стрессоров. Гипокинезия способствует срыву адаптационных механизмов защиты организма.

В последние десятилетия активно изучаются механизмы регуляторных влияний (нервных и гуморальных) стресса на организм человека и животных, показана их роль в адаптационном процессе при участии цитокиновой сети и антиоксидантов на моделях эмоционального, болевого, травматического и др. стрессов. Однако при таком стресс-факторе, как гипокинезия закономерности молекулярно-клеточных адаптационных процессов в системе крови изучены недостаточно и отражены в единичных работах. (См., например: Архипенко Ю.В. Защитные эффекты адаптации к гипоксии и гипероксии. // XX съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Тезисы докладов. - М.: Изд. дом «Русский врач», 2007, с.12-13; Сазонтова Т.Г. HIF -1ά. HSPS резистентность мембранных структур при гипоксии // XX съезд Физиологического общества им. И.П.Павлова. Тезисы докладов. - М: Изд. дом «Русский врач», 2007, с.83.)

Работ, посвященных изучению взаимодействия системы мезенхимопоэза и цитокиновой сети при хроническом стрессе, также крайне мало. Имеются противоречивые сведения об уровнях содержания провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при хроническом стрессе, вызванном гипокинезией, а также противоречивые сведения об участии системы крови и регулирующих ее факторов в обеспечении резистентности организма к неблагоприятному действию гипокинезии. По-прежнему остаются открытыми вопросы коррекции повреждающего действия гипокинезии на организм человека и животных вообще и системы крови в частности.

В настоящее время накоплен опыт проведения реабилитационных мероприятий после длительной гипокинезии, вызывающей изменения реактивности к целому ряду внешних и внутренних факторов. При этом рекомендовано сочетанное применение следующих основных четырех мероприятий:

- рационального двигательного режима,

- постепенно увеличивающегося в объеме массажа,

- фармакологических и

- бальнеотерапевтических воздействий.

Одним из средств профилактики неблагоприятного воздействия ограничения двигательной активности на организм человека при гипокинетическом стрессе является применение нагрузочного костюма "Пингвин" (фирма "Звезда"), создающий постоянную нагрузку на скелет, мышцы ног и туловища. Чтобы избежать неблагоприятного воздействия ограничения двигательной активности на организм человека необходимо восемь часов в день носить "Пингвин" с осевой нагрузкой не менее 25 кг. (Трушева Т.С. Метаболизм человека в костюмах "пингвин" и "пингвин-м" в тесте со ступенчато повышающейся нагрузкой / Трушева Т.С., Гончарова С.А. // Физиология мышечной деятельности: Тез. докл. Междунар. конф. - М.: 2000. - С.149-150.)

Недостатком такого костюма является сложность методики работы с ним, что требует постоянного наблюдения за процессом врача вместе со специалистом по применению такого костюма.

Известен способ интенсификации восстановления скелетных мышц человека в условиях микрогравитации и/или гипокинезии, включающий ежедневные сеансы электромиостимуляции от 5 недель до 3-4 месяцев по 0,5-6 часов в день с подачей стимулирующих импульсов на электроды, установленные на поверхности кожи, и регуляцией значения амплитуды стимулирующего импульса до достижения одинаковой силы сокращения мышц на данной конечности при предотвращении ее движения в суставах, осуществляемый до и после выполнения дополнительно заданного комплекса физических упражнений (патент РФ №2227048 от 11.09.2002 г.).

Недостатком известного способа является значительная длительность восстановительного периода. Кроме того, недостатком является возможность возникновения болевых ощущений, что является дополнительным стрессорным фактором как для людей, так и для животных. Еще одним недостатком является применение разных режимов для разных мышечных волокон и разных задач. Фазические мышцы (те, что отвечают за передвижение, ношение тяжестей) раздражаются высокочастотными и высокоинтенсивными стимулами - выше 100 Гц. А тоническая (позная) мускулатура реагирует на низкие частоты (15-20 Гц) и низкую амплитуду. При использовании высокочастотной и высокоинтенсивной стимуляции невозможно раздражать одновременно долго большое число мышечных групп, потому что высокая мышечная активность требует высокого уровня обеспечения кислородом, кровью и т.д. Высокочастотная стимуляция противопоказана при любых острых состояниях потому, что интенсивные мышечные сокращения небезопасны для организма со сниженными резервами.

Наиболее близкими к предлагаемому способу являются способы с применением лекарственных препаратов.

Известен способ профилактики иммунодефицитных состояний у человека, вызванных длительной гипокинезией, с использованием анаболических препаратов, поливитаминных комплексов типа "Декамевит" или "Ундевит", а также использования растительных адаптогенов: элеутерококка, лимонника, маньчжурской аралии и т.д. (Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н. Гипокинезия. - М.: Медицина, 1980. - с.308).

В качестве прототипа выбран способ профилактики иммунодефицитных состояний, вызванных длительной гипокинезией, в котором применяется комбинация анаболических препаратов, поливитаминных комплексов и растительных адаптогенов в сочетании с оротатом калия и инозином. Данные препараты являются предшественниками соответственно пиримидиновых и пуриновых оснований нуклеиновых кислот и принимают активное участие в биосинтезе белка, нуклеиновых кислот и энергетических субстратов - гликогена, АМД, АДФ и АТФ, т.е. веществ, обеспечивающих повышенный уровень пластического и энергетического обменов (Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н. Гипокинезия. - М.: Медицина, 1980. - с.308).

Недостатком прототипа является низкая эффективность способа при остром и хроническом гипокинетическом стрессе за счет того, что эти препараты не оказывают существенного воздействия на систему крови, учитывая, что при гипокинетическом стрессе происходит опустошение мезенхимальных стволовых клеток, что приводит к нарушению функционирования всех клеточных элементов крови. Применение указанных выше препаратов не оказывает эффективного воздействия на мезенхимопоэз.

Задачей заявляемого способа является ограничение стресс-реакции при остром и хроническом гипокинетическом стрессе путем увеличения пролиферации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, усиления мезенхимопоэза, образования стволовых клеток костного мозга, что, в свою очередь, предупреждает истощение костного мозга при действии острого и хронического гипокинетического стресса.

Поставленная задача для экспериментальных животных решается путем введения лекарственного препарата «Граноцит», содержащего гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), который вводят в течение трех суток до наступления стрессовой ситуации один раз в сутки подкожно в дозе 10 мкг/кг веса.

Опытным путем определено, что предложенные доза и режим введения препарата «Граноцит» (по 10 мкг/кг в течение 3-х дней) являются эффективными для увеличения пролиферации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, усиления мезенхимопоэза, образования стволовых клеток костного мозга, что, в свою очередь, предупреждает истощение костного мозга при действии острого и хронического гипокинетического стресса.

На сегодняшний день не изучена возможность увеличения пролиферации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, усиления мезенхимопоэза, образования стволовых клеток костного мозга как эффекта от применения препарата «Граноцит» при длительном гипокинетическом остром и хроническом стрессе, что подтверждает тот факт, что сущность заявленного способа и полученный результат не вытекают явным образом из уровня развития техники.

Заявляемые доза и режим введения препарата «Граноцит» являются оптимальными для получения заявленного технического результата. Уменьшение дозы и режима введения препарата значительно снижают эффективность способа. Повышение дозы и режима введения препарата не приводят к возрастанию эффективности способа, но приводят к развитию ряда побочных эффектов и осложнений.

Предлагаемый способ поясняется таблицами, в которых отражены результаты экспериментов:

Таблица 1 - «Влияние препарата «Граноцит» на лейкоцитарную формулу при действии хронического гипокинетического стресса на крыс линии «Вистар» (M±m)».

Таблица 2 - «Влияние препарата «Граноцит» на динамику содержания кариоцитов и мезенхимальных стромальных стволовых клеток в костном мозге у крыс линии «Вистар» при действии острого и хронического стресса (M±m)».

Сокращения и обозначения, принятые в таблицах:

n - количество животных в опыте;

ГК - гипокинезия;

ОКК - общее количество кариоцитов;

МССК - мезенхимальные стромальные стволовые клетки.

Предлагаемый способ проверялся в эксперименте.

Исследования были выполнены на 630 белых крысах-самцах линии Вистар массой 150-200 г. Все животные содержались в одном помещении при температуре воздуха 23-24°C и были разделены на две группы.

Животные опытной и контрольной групп получали стандартный брикетированный корм с добавлением растительного масла, рыбьего жира, свежих овощей и воды в неограниченном количестве. В опыт отбирались здоровые животные, прошедшие двухнедельный карантин в виварии. В процессе эксперимента проводилось постоянное наблюдение за поведением и питанием животных, после завершения эксперимента животных декапитировали под эфирным наркозом.

Гипокинезию моделировали путем помещения животных в клетки-пеналы из органического стекла, соответствующие размерам животного, на 1, 3, 5, 7, 10, 15, 30 суток. Контрольных животных содержали в обычных клетках.

Препарат «Граноцит» фирмы «Авентус», содержащий рекомбинантный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), вводили до наступления гипокинезии в течение 3 суток однократно подкожно в дозе 10 мкг/кг/сут с подсчетом общего количества лейкоцитов в периферической крови по общепризнанной технологии. В контрольной группе все животные получали эквивалентное количество растворителя данного препарата - физиологического раствора. Анализ качественного и количественного состава клеток крови, костного мозга осуществляли с помощью общепринятых гематологических и цитологических методов с окраской препаратов азур-II эозином.

Культивирование мезенхимальных стволовых клеток в системе in vitro осуществляли по модифицированному методу А.Я.Фриденштейна в течение 10-14 суток в полной питательной среде: 79% среды D-MEM с низким содержанием глюкозы, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% 100х концентрата L-глютамина, стрептомицина и пенициллина при 37°C, 100% влажности и 5% CO₂ в CO₂-инкубаторе в 50-мл пластиковых флаконах фирмы «Falcon». Все использованные среды и реактивы произведены фирмой «Sigma», США.

Данные по влиянию острого и хронического гипокинетического стрессора на общее количество лейкоцитов представлены в табл. 1. Так, через 6 часов и 1-е сутки наблюдалось увеличение общего количества лейкоцитов на 25% (U) и на 36% соответственно, а при введении препарата «Граноцит» на тех же сроках произошло увеличение общего количества лейкоцитов еще на 40,5% и 124,63%; через 3; 5; 7 и 15 суток действия гипокинезии количество лейкоцитов в периферической крови увеличилось соответственно на 38% (р<0,01); 30% (р<0,01); 127,45% (р<0,05) и на 15% (U). Препарат граноцит повышает общее количество лейкоцитов через трое суток действия гипокинезии (ГК) на 389,5% (р<0,001); через 5 суток - на 260,30%; через 7 суток - на 268,76% по сравнению с фоновыми величинами. Через 10, 15, 30 суток эксперимента количество клеток при применении препарата «Граноцит» увеличилось соответственно на 47,58% (р<0,05), 30% (р<0,05) и 15% (U) по сравнению с фоном.

Количество лимфоцитов в лейкоцитарной формуле при действии острого и хронического стрессора под влиянием препарата «Граноцит» увеличивается по сравнению с действием стресса на этих же сроках без препарата, на которых зафиксировано было достоверное снижение. Так, через 6 часов и одни сутки действия острого стрессора количество лимфоцитов увеличилось на 8% (U) и 15,07% (U) соответственно по сравнению с фоновыми величинами; через трое и пять суток эксперимента - на 44,85% (р<0,001); 30% (р<0,01) по сравнению с опытом без препарата.

На 7, 10 сутки действия гипокинезии и применения препарата «Граноцит» увеличивается количество лимфоцитов на 26,75% (р<0,02) и 16,53% (р<0,05) по сравнению с фоном и на 13,83% (р<0,01); 140% (р<0,001) по сравнению с опытом без препарата.

Через 15, 30 суток опыта препарата «Граноцит» увеличивает количество лимфоцитов на 9% и 5% (U) по сравнению с фоновыми величинами и на 71,40% (р<0,001) (ГК₁₅), 50% (р<0,01) (ГК₃₀). Количество эозинофилов в лейкоцитарной формуле на всех сроках острого и хронического стрессора снижается, причем на 10, 15, 30 сутки действия гипокинезии эозинофилов вообще не обнаружили в периферической крови.

При введении препарата «Граноцит» через 3, 5, 7 суток опыта количество эозинофилов увеличилось на 46% (р<0,001), 45,34% (р<0,001) и 37,43% (р<0,01) по сравнению с фоном.

На 10-е, 15-е, 30-е сутки действия хронического стресса и введения препарата «Граноцит» количество эозинофилов в лейкоцитарной формуле увеличились на 42,78% (р<0,01) (ГК₁₀); 50,80% (р<0,01) (ГК₁₅ и на 82,23% (U) по сравнению с фоновым контролем.

Таким образом, введение препарата «Граноцит» почти нормализовало количество эозинофилов через 30 суток действия хронического гипокинетического стресса.

Количество сегментоядерных нейтрофилов (НФ) в лейкоцитарной формуле крови было повышено на всех сроках опыта. Введение препарата Г-КСФ дополнительно повысило количество этих клеток. Так, через 6 часов и сутки действия острого стрессора количество клеток увеличилось на 70% (р<0,02) и на 98,04% (р<0,01) по сравнению с фоновым контролем (табл.1). Через 15 суток опыта количество НФ увеличилось на 70% (р<0,001) по сравнению с фоновым контролем и на 14,70% (р<0,05) по сравнению с ГК₁₅ без препарата. И через 30 суток действия ГК препарат «Граноцит» нормализирует количество сегментоядерных клеток в лейкоцитарной формуле.

После введения препарата «Граноцит» количество моноцитов возросло на всех сроках действия хронического стресса (ГК). Так, через 6 часов и сутки действия острого стрессора количество клеток увеличилось на 50% (р<0,01) и 18% (р<0,01) по сравнению с фоном и на 12,50% (U); 77,63% (р<0,05) соответственно по сравнению с гипокинезией без лечения. Через 3, 5, 7, 10 суток опыта количество моноцитов увеличилось на 245,83% (р<0,001) соответственно по сравнению с фоновым контролем, а по сравнению с ГК без препарата соответственно на 27,70% (U); 57% (U); 70,65% (р<0,001); 59,37% (р<0,001).

Через 15, 30 суток опыта количество моноцитов увеличилось соответственно на 95% (р<0,001) и 30% (U) по сравнению с фоновым контролем, а по сравнению с опытом без лечения на 39,28% (р<0,05) и 9% (U) соответственно.

Кроме того, нами было отмечено увеличение стимуляции центрального органа мезенхимопоэза, реализующегося на уровне мультипотентных стромальных стволовых клеток (МССК) в костном мозге (табл.2).

Так, содержание общего количества кариоцитов (ОКК) в течение моделирования стресса увеличилось на 15,07% (р<0,01) и на 32,08% (р<0,01) по сравнению с фоновыми величинами на первые и третьи сутки ГК. Через 5, 7 суток действия хронического стресса содержание ОКК увеличилось на 29,19% (р<0,001) и на 18,40% (р<0,02) соответственно по сравнению с фоном.

Этому адаптационному процессу предшествовал рост числа МССК через 3, 5, 7 суток действия хронического стрессора соответственно на 18,58% (р<0,05) 28,28% (р<0,01) и 25,25% (р<0,02) этих стволовых клеток, ответственных за построение гемопоэза, индуцирующиего микроокружения костного мозга и стромальных «ниш», где происходят процессы пролиферации и дифференцировки миелоидных прекурсоров. Следует отметить, что в процессе культивирования МССК приобретают все черты, характерные для фибробластоподобных стволовых клеток, т.е. округлую и отростчатую форму и дают положительную реакцию на остепоэтин - специфического маркера мезенхимальных элементов.

Следует отметить, что препарат «Граноцит» приводит к достоверному увеличению числа ОКК и МССК костного мозга при действии острого и хронического стрессора. Так, уже через 6 часов и 1 сутки действия гипокинетического стрессора количество МССК увеличилось достоверно на 21,50% (U) и 28,28% (р<0,001). Через 3, 5, 7 суток действия хронического стресса количество стволовых клеток увеличилось соответственно на 126,60% (р<0,0 1), 117,37% (р<0,001) и 106,46% (р<0,001). Через 10, 15 суток действия гипокинезии количество стволовых клеток нормализовалось (табл.2).

Результатом действия препарата «Граноцит» происходит увеличение стволовых клеток и, как следствие, увеличение кариоцитов в костном мозге при действии острого и хронического стресса (табл.2). Так, через 6 часов действия острого стресса на организм количество ОКК увеличивается достоверно на 16% (р<0,001), через 1 сутки действия ГК - на 26,90% (р<0,001).

Через 3, 5, 7 суток действия хронического стресса количество ОКК увеличилось достоверно на 242,88% (р<0,001), 170% (р<0,001) и 84,36% (р<0,001).

Через 10, 15 суток действия хронического стрессора количество ОКК снизилось на 30% (р<0,001) 32,36% (р<0,01), введение же препарата «Граноцит» достоверно увеличило количество этих клеток на 14,24% (р<0,05) через ГК₁₀ и нормализовало через ГК₁₅ суток.

Таким образом, анализ гемограммы животных, получавших препарат «Граноцит», показал увеличение общего количества лейкоцитов, лимфоцитов и эозинофилов на всех сроках действия острого и хронического гипокинетического стресса. Введение препарата повысило количество сегментоядерных нейтрофилов и моноцитов. Кроме того, введение «Граноцита» на сроках действия стресса сопровождалось повышением массы тимуса и селезенки.

Действие «Граноцита» на пул мезенхимальных стволовых клеток носило неспецифический характер, что подтверждается достоверным увеличением числа общего количества кариоцитов и МССК костного мозга при действии острого и хронического стресса, при отсутствии такой реакции в условиях in vitro.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине и физиологии, и касается предупреждения последствий и лечения нарушений при остром и хроническом стрессе вследствие длительной гипокинезии у лабораторных животных в условиях эксперимента. Для этого животным подкожно вводят лекарственный препарат «Граноцит», содержащий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, в дозе 10 мкг/кг веса. Введение осуществляют в течение трех суток до наступления стрессовой ситуации один раз в сутки. Способ обеспечивает уменьшение стресс-реакции при гипокинезии за счет стимуляции мезенхимопоэза и предупреждения вследствие этого нарушений функционирования всех клеточных элементов крови. 2 табл.

Способ ограничения стресс-реакции при остром и хроническом гипокинетическом стрессе у экспериментальных животных путем введения лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата применяют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор в виде препарата «Граноцит», который вводят в течение трех суток до наступления стрессовой ситуации один раз в сутки подкожно в дозе 10 мкг/кг веса.