Изобретение относится к области восстановительной медицины, онкологии и неврологии, а более конкретно, к биомедицинскому клеточному продукту (БМКП) под торговым названием «ГемаКомб», способу получения этого продукта и его применениям. БМКП может быть использован для цитотоксической противоопухолевой терапии рака и других злокачественных новообразований, для восстановительного и реабилитационного лечения онкологических больных после проведения хирургического конвенционального противоопухолевого лечения (хирургических циторедуктивных операций, стереотаксической радиохирургии, фокусированного ультразвука, фотодинамической терапии, термоабляции опухолей и т.д.), для терапии широкого круга тяжелых осложнений, возникающих от ятрогенных повреждений органов и тканей человека после лекарственной химиотерапии и лучевой терапии, для профилактики прогрессии/рецидивов рака и злокачественных новообразований и повышения качества жизни онкологических больных, а также для клеточной терапии и тканевой инженерии органических нервных заболеваний и повреждений нервной ткани центральной нервной системы.
Современное противоопухолевое лечение рака и других злокачественных новообразований включает в себя широкий спектр циторедуктивных лечебных воздействий (радикальное хирургическое удаление опухоли и прилежащих лимфатических узлов) и комплекс цитостатического и цитотоксического воздействия (лучевую терапию, лекарственную химиотерапию, иммунотерапию) на новообразование. Эта терапия достаточно эффективна в отношении опухолей и системно агрессивна в отношении не вовлеченных в патологический процесс органов и тканей онкологического пациента. Успехи современной клинической онкологии очевидны, так как они существенно увеличили пятилетнюю выживаемость раковых больных и продлили продолжительность жизни населения высокоразвитых стран Европы и Америки на 15-20 лет. Однако кроме успехов и достижений в современной клинической онкологии есть и серьезные проблемы, связанные с коррекцией серьезных осложнений и побочных эффектов стандартного противоопухолевого лечения рака и профилактики рецидивов и метастазирования злокачественных новообразований, которые требуют своего неотложного решения.
Современные высокотехнологичные хирургические и микрохирургические подходы к лечению опухолей с использованием интраоперационных флюоресцентных красителей способны обеспечить почти тотальное удаление опухолевого очага. Однако, зачастую радикальные жизнеспасающие операции по удалению опухолей являются калечащими и становятся основной причиной нетрудоспособности и инвалидизации онкологических больных. Известно, что использование химиотерапевтических противоопухолевых препаратов в лечении рака и злокачественных новообразований часто сопровождается тяжелыми осложнениями и побочными эффектами, также приводящими к инвалидизации и зачастую к гибели больных. Среди таких осложнений преобладают реакции, обусловленные поражением быстро обновляющихся (с высоким темпом пролиферации) клеток кроветворных и иммуннокомпетентных органов, в первую очередь, костного мозга.
Токсическое действие на гемопоэз и иммунопоэз - наиболее частое осложнение современной химиотерапии и лучевой терапии. Воздействуя непосредственно на пролиферирующие клетки костного мозга, противоопухолевые препараты способны вызывать угнетение любого ростка кроветворения. Наиболее сильное миелосупрессивное действие оказывают алкилирующие вещества, антрациклиновые антибиотики, циторабин, производные мочевины и таксаны. Преимущественно красный росток гемопоэза поражают препараты платины, метотрексат, хлорамбуцил, флударабин. Генез развития анемии проявляется от прямого угнетающего действия (хлорамбуцила) на гемопоэз до полного гемолиза (флорамбуцил) клеток крови. Кроме того, противоопухолевые агенты способны с разной частотой повреждать практически все нормальные структуры и ткани организма больного в зависимости от степени токсичности препарата. Частота различных видов токсичности неодинакова. Наиболее часто встречаются гастроинстециональная (до 90% токсичности) и гематологическая (85-90%) токсичность, в 40% случаев отмечается гепатонефротропная токсичность, а в 45-50% - кардиоваскулярная токсичность. Поражение нервно-мышечной и респираторных систем отмечается у 20-25% онкологических пациентов (Поддубная И.В., Орел Н.Ф., 2015).
В последние годы в практике клинической онкологии стали использоваться препараты принципиально новой группы целенаправленного действия - таргетные препараты, имеющие отличный от цитотоксической терапии профиль безопасности. Они в меньшей мере угнетают кроветворение, но вызывают специфические побочные явления, такие как кожные поражения, типичные для ингибиторов EGF, повышение АД и сосудистые изменения (ингибиторы ангиогенеза), кардиотоксическое действие (трастузумаб) (Поддубная И.В., Орел Н.Ф., 2015).
Противоопухолевая лучевая терапия онкологических больных также имеет серьезные осложнения и побочные эффекты. Поражение органов и тканей у онкологического больного после лучевой терапии заключается в выраженном локальном поражении генома клеток как самих органов и тканей, подвергшихся непосредственному облучению ионизирующей радиацией, так и в общем системном лучевом воздействии облучения на весь организм онкобольного. В результате развития у онкологического пациента острой или хронической лучевой болезни различной степени выраженности (Медведев С.В., 2016) весь симптомокомплекс лучевой болезни требует незамедлительной коррекции и активной терапии. При этом, частое возникновение лучевых некрозов и лучевого отека тканей (легких, мозга и т.д.) является самой частой причиной смерти пациентов с опухолями при проведении лучевой терапии.
Таким образом, как правило, в результате проведенного успешного комплексного стандартного противоопухолевого высокотехнологичного лечения рака или других злокачественных новообразований онкологическому пациенту в большинстве случае предоставляется возможность временно остановить болезнь, добиться ее ремиссии и минимальных остаточных проявлений и сохранить на определенное время жизнь. Сегодня в онкологии даже введен термин - минимальная остаточная болезнь (J.-F. Rossi, 2017; Ж.Ф-Росси, 2018). Однако за полученную временную победу над опухолью онкологический пациент «платит» очень дорогую цену, в виде системных или микроочаговых ишемических, геморрагических, дистрофических, воспалительных, дегенеративных повреждений в органах и железах внутренней секреции, а также несет невосполнимые потери системы иммунитета, необратимое снижение собственного потенциала здоровья и резервов регенерации. Лучевая болезнь, лекарственная болезнь, ишемическая болезнь органов и тканей, травматическая болезнь тканей внутренних органов - лишь небольшой набор реальных синдромальных осложнений и нежелательных побочных явлений от проведения классической противоопухолевой терапии, которая приводит к необратимым изменениям и органическим микро- и макродефектам в тканях и органах. После успешной противораковой терапии опухоли у онкологического пациента формируется острая или хроническая болезнь поврежденных органов и тканей. Несмотря на то, что такой самостоятельной нозологической единицы, как ятрогенная «болезнь поврежденных органов и тканей» после противоопухолевого лечения в современных классификаторах болезней не существует, о ее существовании в онкологической клинике знает каждый практикующий врач - онколог-хирург, лучевой терапевт, химиотерапевт, врач-онкогенетик, врач-иммунолог и т.д. Эта болезнь маскируется под флагом осложнений и побочных эффектов стандартной циторедуктивной, цитостатической и цитостатической противоопухолевой терапии. Морфологическими проявлениями этой болезни в пострадавших органах являются локальные острые и хронические воспалительные рубцово-спаечные, кистозно-рубцовые, дегенеративно-дистрофические слипчивые процессы. Иногда ее исходом являются локальные и системные воспаления и токсические или лучевые (постлучевые) повреждения органов и тканей организма (дисметаболические, электролитные и гормональные нарушения, неустойчивость витальных функций, некротические изменения и т.д.) онкологического пациента. В результате этой болезни формируется острая или хроническая (сердечно-сосудистая, почечная, печеночная, полиорганная, полигландулярная, цереброваскулярная и т.д.) недостаточность функций, пострадавших от стандартного противоопухолевого лечения органов и тканей организма пациента. Острая и хроническая функциональная и морфологическая недостаточность пострадавшего от противоопухолевого лечения органа способна привести к полной некурабельности онкопациента, невозможности провести повторный успешный курс оперативного лечения, лучевой терапии или химиотерапии и может стать основной причиной смерти это больного в ближайшем будущем.
Препаратов для лечения острой и хронической болезни поврежденных органов и систем, обусловленной лечением онкологического заболевания, не существует. Предлагается симптоматическая терапия или паллиативный подход к коррекции осложнений после лучевой терапии и химиотерапии, борьба с отеком ткани или последствиями облучения или постлучевым некрозом в зоне повреждения, проведение реабилитационно-восстановительных мероприятий типа лечебной физкультуры и суставной гимнастики. Физиотерапия этим больным противопоказана, так как якобы может способствовать усилению неопластического процесса. Онкологическим больным, как «прокаженным», запрещено санаторно-курортное и восстановительное лечение в местах общего оздоровления населения, хотя на фоне современной химиотерапии стимуляционные эффекты воздействия на злокачественную опухоль в результате реабилитационно-восстановительного лечения очень сомнительны. При этом токсическое действие лучевой и химиотерапии на кроветворение (анемии, миелосупрессия, гипоплазии костного мозга, нейтропения, цитостатическая тромбоцитопения и т.д., тканевое воспаление, грибковая инфекция, активация вирусной инфекции - герпес, ЦМВ, Эпштейн-Бар и т.д.) очевидны и абсолютно реальны, и это действие может быть только частично скорректировано эритроцитарными смесями, тромбоконцентратами, свежезамороженной плазмой крови, Г-КСФ (нейпоген, граноцид, неуластин и т.д.), ИЛ-11 (опрелвикин или неумега), применение эритропоэтина (ЭПО) (рекормон, эпрекс, аранесп), препараты железа (Феррум-Лек, мальтофер, фенюльс).
Аналогичная ситуация сложилась и в клинической неврологии. Огромное количество больных, перенесших острые неврологические заболевания (травмы головного и спинного мозга, геморрагический и ишемический инсульт, демиелинизирующие заболевания и нейроинфекции, нейрохирургические операции по удалению опухолей головного и спинного мозга и другие), имеют разной степени тяжести последствия перенесенного органического неврологического дефекта в форме моторных расстройств, манифестирующих конечностей в виде парезов и параличей, нарушений различных видов чувствительности, когнитивных и интеллектуально-мнестических нарушений, расстройств координации и других серьезных органических неврологических синдромов и симптомокомплексов. При этом доказано, что через три года после воздействия этиопатогенетического фактора (инфекция, нарушение мозгового кровообращения, удар по голове и т.д.) уже не играет роли тот агент, который конкретно привел к формированию органического дефекта в головном и спинном мозге человека (травма, ишемия, геморрагия, демиелинизация опухоль или воспаление и другое). За три года первичный очаг в головном и (или) спинном мозге пострадавшего разрешится с исходом в кисту или рубец в нервной ткани, а также атрофию или дегенеративно-дистрофический процесс клеток нервной ткани. Возможна еще неопластическая трансформация поврежденной нервной ткани с формированием опухолевого роста. Чаще это комбинации рубцово-спаечного или кистозно-рубцового, атрофического и спаечного процесса. Это закономерный итог физиологического саногенеза репаративных и регенеративных процессов гомеостаза в центральной нервной системе (ЦНС) человека. Степень выраженности этих органических повреждений в ЦНС зависит от объема и тяжести поврежденной нервной ткани в ЦНС, эффективности проведенной терапии основного неврологического заболевания и объема проведенной нейрореабилитации и восстановительного лечения. Тем не менее, в этом случае, через три года после этиопатогенетического повреждающего воздействия анатомо-структурные изменения в нервной ткани ЦНС завершаются, и весь комплекс наступивших морфофункциональных повреждений следует расценивать как болезнь поврежденного мозга. Клинически она может проявляться как в виде хронического вегетативного состояния (апаллический синдром, акинетический мутизм и т.д.) с глобальным выпадением основных функций ЦНС, так и в форме незначительных или умеренно выраженных моторных, чувствительных, координаторных и интеллектуально-мнестических и других нарушений функций ЦНС. В отличии от онкологов, неврологи и нейрохирурги классифицируют эти клинические проявления в течении года после травмы как остаточные явления перенесенного повреждения (травмы, инфекции ишемии и т.д.), через год - как последствия перенесенного повреждения, а через 3 года - как отдаленные последствия перенесенного повреждения нервной ткани головного и спинного мозга. Через 10 и более лет эти изменения трактуются как резидуальные органические изменения нервной ткани в ЦНС. Реального лечения этой патологии в неврологии, психиатрии и нейрохирургии пока нет. Лечение симптоматическое и посиндромное.
Для борьбы с подобными состояниями острого и хронического повреждения органов в 2016 году впервые в мире американская комиссия по надзору за качеством продуктов питания и фармпрепаратов (FDA USA) зарегистрировала и лицензировала инновационный препарат "HEMACORD®", состоящий из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), получаемых из пуповинной крови. Препарат разрешен к клиническому применению для восстановления нарушенного гемопоэза и коррекции осложнений после химиотерапии и лучевой терапии опухолей (http://www.prnewswire.com/). Показано, что за счет содержания ГСК и мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) в этом препарате он эффективен при терапии токсических стоматитов, гепатотоксичности, кардиотоксичности, желудочно-кишечных нарушениях (токсических энтеритах и энтероколитов) легочной токсичности и нейротоксичности.
В современной медицине активно формируется новый мировой биотехнологический рынок БМКП, содержащий стволовые клетки (СК), для онкологии, неврологии, восстановительной и регенеративной медицины. Применение СК в БМКП позволяет восполнить недостаточную функциональную активность тканей и способствует регенерации поврежденных органов и тканей. Функцию обновления и восстановления тканей in vivo выполняют преимущественно тканеспецифичные СК, которые представляют собой пул запасных недифференцированных предшественников клеток различных типов (Тепляшин А.С., 2005). Выделены различные типы тканеспецифических СК взрослого организма - ГСК с маркерами клеточной поверхности CD34+, CD45+ (предшественники всех клеток крови), см. патент РФ № RU 2283119); нейрональные СК (НСК) с маркерами клеточной поверхности CD133+, CD133- (предшественники клеток нервной ткани), патент РФ № RU 2394593); МССК с маркерами клеточной поверхности CD10+, CD 13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимального происхождения), см. патент РФ № RU 2252252, а также СК других зародышевых листков.
Смысл лечения препаратами БМКП, содержащими СК, состоит в том, что весь потенциал для здоровой и продолжительной жизни в организме человека в нем с самого начала. Человеческий организм содержит особые клетки, которые постоянно возвращают нас к норме - это и есть СК. С одной стороны, СК это эталон нормы, из которого способны сформироваться нормальные клеточные системы любого фенотипа, а с другой стороны, СК это главный контролер и регулятор саногенеза в организме человека. Современные биотехнологии медицины позволяют забрать СК человека из организма пациента или донора и использовать их в виде БМКП для лечения заболеваний, ранее считавшихся неизлечимыми (Тепляшин А.С., 2010; Bryukhovetskiy et al., 2014).
В настоящее время изучены основные пути и механизмы действия, которыми СК способны восстановить поврежденные клетки (ПовК) в ткани организма человека:
1. Путь функционального и морфологического замещения ПовК стволовыми клетками в зоне повреждения и направленная дифференцировка СК в фенотип ПовК или группы ПовК.
2. Путь слияния цитогенетического биоматериала СК с биоматериалом ПовК для ее регенерации и реставрации.
3. Путь регуляции и управления путями внутриклеточной сигнальной трансдукции ПовК молекулярнонацеленными биологически активными веществами (микроРНК, ДНК, белками), продуцируемыми СК при межклеточном взаимодействии (S. Kuroda et al., 2013, Брюховецкий А.С., 2014).
На данный момент времени для целого ряда серьезных осложнений после хирургического, химиотерапевтического и радиационного лечения онкологических заболеваний БМКП являются практически единственным способом возможного лечения. Кроме того, применение БМКП, содержащих СК, повышает эффективность традиционных методов лечения, существенно облегчает течение заболевания и приближает момент выздоровления (Баклаушев В.П., 2016).
Необходимо отличать как взрослые ГСК с маркерами CD34+, CD45+, HLA DR+, CD38-, Gp130- от гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) с несколько другими маркеры клеточной поверхности CD34+, CD45-, HLA DR-, CD38+, Gp130+, так и взрослые МССК с маркерами клеточной поверхности CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- от мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+и CD117+. Помимо отличий в маркерах клеточной поверхности, ГСК и МССК отличаются от ГКП и МСКП соответственно своими фундаментальными свойствами и функциями. Только взрослые СК способны при делении давать две СК или СК и КП (клетку-предшественник), а КП способна поделиться только на две КП, которые не способны в обычных условиях производить СК. Функциональная плюрипотентность свойственна только СК, а у КП она значительно ниже, чем у СК. Для ПК характерна мультипотентность и склонность к дифференцировке.
Самым первым и самым эффективным опытом терапии с использованием СК, позволившим полностью излечить пациентов от рака крови еще в 60-х годах XX века, был опыт применения препарата ГСК для трансплантации клеток костного мозга, то есть клеток, являющихся предшественниками кроветворения. Путем трансплантации ГСК, полученных из костного мозга донора, удалось заместить все клетки кроветворения (гемопоэза) реципиента и полностью вылечить больного, страдающего острым миелолейкозом (Blood Stem Cell Transplantation, edited by J. Reiffers, J.M. Goldman, J.O. Armitage, 1998). Поэтому противоопухолевые свойства ГСК в онкогематологии являются «золотым стандартом» терапии СК и постоянным предметом изучения ученых уже более 70 лет. Более того, сегодня стало очевидно, что ГСК, кроме формирования кроветворения, имеют важнейшую регуляторную и системообразующую функцию в организме. В связи с этим считается, что применение БМКП, изготовленных на основе ГСК и МССК, является наиболее перспективным направлением в современной медицине (Тупицын Н.Н. с соавт., 2014, отчет DARPA за 2011 г., D. Caplan, 2017). Уже более 100000 пациентов по всему миру получили лицензированный американский препарат «ГЕМАКОРД», содержащий ГСК пуповинной крови, и более 520 онкологических больных и более 5700 неврологических пациентов получили комбинацию клеточных систем и вспомогательных веществ, обозначенную нами как БМКП «ГемаКомб». При этом 52 пациента с тяжелым повреждением спинного мозга успешно получили экспериментальное интрамедуллярное (внутрь спинного мозга) введение этого препарата в поврежденный спинной мозг или в полный разрыв спинного мозга при операциях по тканевой инженерии спинного мозга. В последних случаях вспомогательным веществом в БМКП был биодеградируемый гетерогенный матрикс «СфероГель» (патент RU 2249462, 2005 г.), и нейропротезная система имплантировалась в спинной мозг во время нейрохирургических операций по тканевой инженерии спинного мозга.
ГСК впервые были описаны русским эмигрантом в США профессором А.А. Максимовым в 1908 году, как клетки-родоначальницы кроветворения. Им было показано, что именно ГСК это клетки, формирующие гемопоэз, то есть клетки, лежащие в основе всего процесса кроветворения человека и животных. Но как мощное терапевтическое средство эти клетки не получили своего заслуженного признания в начале XX века. Более полувека они были забыты и только в середине 60-х годов прошлого века ГСК были успешно применены для лечения острых и хронических лейкозов, лимфолейкозов и миелолейкозов у взрослых и детей путем проведения трансплантации костного мозга (Менткевич Г.Л., Маякова Н.И., 2010). Невероятные успехи в лечении рака крови и даже полное излечение больных от этого онкологического недуга обусловили широкое, но преимущественно одностороннее, в основном онкогематологическое, применение ГСК в лечении заболеваний человека. Позже, к концу XX века ГСК в большинстве современных исследований широко применялись для восстановительного лечения нарушенного гемопоэза у онкологических пациентов после высокодозной химиотерапии и лучевой терапии опухолей. ГСК использовались как фундаментальная основа трансплантаций костного мозга в лечении неопластических образований, но прямого противоопухолевого эффекта ГСК на раковые клетки доказано не было (Брюховецкий А.С., 2011).
ГСК с маркерами клеточной поверхности CD34+, CD45+, HLA DR-, CD38-, Gp130- в организме человека являются самыми универсальными регуляторами гомеостаза, так как имеют самый большой период жизненного клеточного цикла (около 360 дней) (Пальцев М.А. с соавт., 2009). В свете современных концепций системного подхода к управлению, очевидно, что в любом биохимическом процессе в организме человека и животных управляющей является самая медленная фаза (Неймарк Ю., 1985). В этой связи ГСК (CD34+, CD45+, HLA DR-, CD38-, Gp130-) в организме человека обладают доминирующими управляющими свойствами среди всех клеточных систем организма и их регуляторные функции являются системообразующими (Брюховецкий А.С., 2010) для всех нормальных клеток организма человека. Также ГСК в зависимости от органных потребностей тканей организма человека способны под влиянием сигналов микроокружения трансформироваться как в НСК, так и МССК, что с позиций теории «клеточного замещения» является крайне важным для реставрации поврежденных тканей.
Взрослые ГСК (CD34+, CD45+, HLA DR-, CD38-, Gp130-) обладают уникальной способностью направленного трансфера в зону повреждения тканей органа, мигрируя на градиент концентрации воспаления (патотропизм или хоуминг СК) (Баклаушев В.П, 2015, Брюховецкий А.С., 2013). ГСК, попадая в головной и спинной мозг, являются мощным индуктором синапсогенеза в них или участвуют в формировании новых межклеточных контактов в тканях солидных органов (Брюховецкий А.С., 2010, 2013).
Известно, что при пересадке ГСК в различные органы (почки, мозг, печень и т.д.) не наблюдалась их прямая дифференцировка в специализированные клетки (кардиомиоциты, миоциты или клетки кожи) этих органов, а трансплантация клеток-предшественников гемопоэза в сердце не приводила к формированию нейронов или секреторных клеток кишечника. Локальная дифференцировка in situ, как правило, контролировалась «сигналами» микроокружения. Хорошо известна потенциальная возможность трансдифференцировки ГСК в НСК in vitro под воздействием определенных пертурбогенов (ретиноивая кислота) (S. Kuroda et al., 2010). Многолетние клинические наблюдения также подтвердили отсутствие аномалий дифференцировки СК в трансплантате. В то же время ГСК обладают функцией целенаправленной миграции к зонам повреждения (Чехонин В.П. с соавт., 2005; Баклаушев В.П. с соавт., 2014) в головном мозге, как и НСК и МССК. В России была запатентована технология трансплантации ГСК для интрацеребрального введения при лечении поврежденного мозга (патент RU 2216336, 2003 г.), которая была рекомендована авторами для использования в терапии болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и болезни Крейцфельда-Якоба. Аналогичные свойства целенаправленной миграции к повреждению, хоуминга, патотропизма характерны и для других тканеспецифических СК и их предшественников, таких как МССК и НСК (Kaplan D., 2006; Snyder Е. at al., 2006).
В настоящее время доказано, что трансплантированные клетки лейкоконцентрата (ЛК) мобилизованных мононуклеарных клеток (МНК) формировали кластеры ГСК и гемопоэтических клеток-предшественников (ГКП) в ткани поврежденного органа (Ono K. et al., 1999). В своей собственной работе авторы настоящего изобретения показали, что мультиклеточный кластер мобилизованных МНК, ГСК и ГКП человека после введения в организм (кровь, ликвор, ткань органа) крысы вели себя как системоообразующие по отношению к входящим в него клеткам и они очень организованно и скученно мигрировали преимущественно (78%) в пострадавший орган, а затем и в зону максимального повреждения и равномерно распределялись в этой зоне (Брюховецкий А.С., 2013). Е Snyder (2005) описал подобный эффект миграции НСК при введении в ткань мозга из правого (интактного) полушария в левое полушарие, где была смоделирована глиальная опухоль мозга мыши, за 36 дней. Авторы настоящего изобретения повторили этот эксперимент на крысах с глиомой С6 путем введения ЛК мобилизованных МНК, содержащих ГСК и МССК, и установили, что миграция этих клеток в сторону полушария с опухолью заняла 14 дней. Этот феномен может быть ключевым не только в решении вопроса регенерации поврежденных органов и тканей, но и в разработке и создании клеточных препаратов на основе ГСК. Именно клеточный кластер трансплантированных кроветворных клеток имеет важнейшее значение для трансфера этих клеток к месту повреждения, а также целенаправленного распределения их в зоне повреждения патологического органа и адгезии СК к пострадавшим клеткам, оказанию оптимального саногенетического регуляторного и реставрационного воздействия СК и их предшественников на ПовК.
По-видимому, роль клеток микроокружения ГСК в восстановлении нарушенного гемопоэза является определяющей для уровня функциональной активности ГСК как в нише костного мозга, так и для ГСК, трансплантируемых в кровь (ликвор, ткань) в составе кластера костномозговых клеток. В этой связи авторы настоящего изобретения полагают, что для того, чтобы получить требуемый функциональный (регуляторный, противоопухолевый, нейрореставрационный и т.д.) эффект ГСК в организме человека, целесообразно использовать их именно в составе лейконцентрата, содержащего весь спектр клеток микроокружения костномозговой ниши. Именно поэтому в клинике нервных болезней авторы широко использовали этот подход для введения ГСК в организм неврологического и нейроонкологического пациента при интравентрикулярной или интратекальной трансфузии. ГСК обязательно вводили в составе мононуклеарной фракции ЛК мобилизованной периферической крови (ПК), так как эффект от введения чистой культуры ГСК не был отмечен ни в эксперименте, ни в клинике. (Брюховецкий А.С., 2010, 2011, 2013; Брюховецкий А.С.с соавт., 2014, 2016). Интересно, что изолированное введение клеток МНК ЛК, освобожденных от ГСК (CD34+, CD45+, CD45-), не обеспечивает требуемых нейрореставрационных эффектов в эксперименте у крыс (Брюховецкий А.С. с соавт., 2015).
Как отмечено выше, мобилизованные МНК костного мозга являются важной частью костномозговой ниши, в которой располагаются ГСК и МССК, и клетки микроокружения даже в ПК сопровождают ГСК и имеют важнейшее значение в поддержании активности и функциональности ГСК в ПК. ГСК и МССК и клетки их микроокружения при внутривенном, внутриартериальном или интратекальном введении человеку движутся в биологических жидкостях организма в виде организованного клеточного кластера. По-видимому, клетки естественного микроокружения ГСК и МССК обеспечивают активность и системную функциональность ГСК и МССК. В этом ключе применение ГСК и МССК при других нозологических заболеваниях целесообразно использовать совместно с клетками их ближайшего микроокружения (Брюховецкий А.С., 2013; Брюховецкий А.С., Хотимченко Ю.С., 2018). То есть МНК мобилизованной крови являются необходимым условием эффективности как собственных, так и донорских ГСК и МССК. Не до конца понятно, какие именно клетки микроокружения являются определяющими в функциональной активности ГСК и МССК, поэтому в терапии авторы настоящего изобретения используют весь спектр МНК-кластера мобилизованной крови.
ГСК, имплантированные в полушарие, противоположное опухолевому или другому патологическому (воспалительному, ишемическому, кровоизлиянию и т.д.) очагу, так же как и введенные внутривенно, демонстрируют общее свойство ГСК - целенаправленную миграцию к очагу патологии и восстановление нарушенного внутритканевого гомеостаза (Брюховецкий А.С., 2011; Брюховецкий И.С. с соавт., 2015). Данное свойство ГСК используется для суперселективной доставки иммунолипосомальных конструкций, содержащих противоопухолевые химиопрепараты или другие молекулы цитотоксического или цитостатического действия (патент RU 2336901, 2008 г.). Кроме того, возможна суперселективная доставка рентгеноконтрастных веществ, радиоизотопных препаратов, сигнальных белков и наноконструкций, повышающих чувствительность опухолевых клеток (ОК) к традиционным способам терапии (Брюховецкий А.С., 2011). Перспективной представляется стратегия использования ГСК как транспортной системы при адресной доставке биологической информации для локальной модуляции процессов апоптоза, что требует продолжения исследований в данном направлении (Брюховецкий И.С. с соавт., 2014, 2016). Аналогичные свойства СК, характерные для ГСК, описаны и для МССК (Caplan D., 2013, 2014; M. Choop et al., 2015, 2016).
Исследования авторов настоящего изобретения показали достаточно высокую эффективность мобилизации ГСК (CD34+, CD45+) и МССК (CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117-) в ПК у больных с неонкологическими заболеваниями (до 95,1%). Хорошо известно, что в условиях спокойного, неповрежденного гемопоэза в ПК человека обязательно циркулируют ГСК и МССК, однако, их концентрация столь ничтожна (менее 0,01%), что делает их детальное изучение или, тем более, использование для целей трансплантации практически невозможным. Выход ГСК и МССК из центральных органов гемопоэза (костный мозг) наблюдается после травмирования гемопоэза (чаще всего, как результат химиотерапии), а также под действием колониестимулирующих факторов (КСФ). В клинике наибольшее распространение получили гранулоцитарный КСФ (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагальный КСФ. Под действием этих факторов концентрация ГСК и КП крови возрастает в 100-1000 раз, что позволяет собрать эти клетки и использовать их для трансплантации в клинике. Сбор ГСК в этих случаях преимущественно осуществлялся для последующего восстановления нарушенного гемопоэза после высокодозной химиотерапии. У онкологических больных, вследствие предшествовавшей химиотерапии, костный мозг является к моменту проведения мобилизации в определенном смысле «истощенным», и эффективные мобилизации СК (более 20 клеток в мкл крови) достигались не во всех случаях. Как правило, набрать необходимое для трансплантации количество клеток (2⋅106 /кг веса больного) удавалось только за 2-3 сеанса лейкоцитофереза.
Известно, что применение изолированных ГСК (CD34+, CD133+, CD45+) для восстановления нарушенного гемопоэза после высокодозной химиотерапии или лучевой терапии при трансплантации костного мозга у онкологических больных оказалось абсолютно неэффективным, и все больные, получавшие только изолированные ГСК (CD34+, CD133+, CD45+), умирали, так как эти клетки не приживались в костном мозге реципиента, то есть чистая культура клеток ГСК и МССК (CD10-, CD 13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117-) не была способна обеспечивать восстановление поврежденного гемопоэза (Blood Stem Cell Transplantation, edited by J. Reiffers, J.M. Goldman, J.O. Armitage, 1998). Эти данные получили подтверждение в работе отечественных онкотрансфузиологов (Мхеидзе Д.М. с соавт., 2012) и специалистов-трансплантологов костного мозга (Менткевич Г.Л. с соавт., 2013). Именно поэтому применение только одних очищенных ГСК (CD34+, CD133+, CD45+) для восстановления нарушенного гемопоэза, считается методически ошибочным и неверным. В то же время, если общее количество ГСК в трансплантируемом материале лейкоферезного продукта или костного мозга менее 1%, то риск неблагоприятного исхода восстановления нарушенного кроветворения после трансплантации костного мозга увеличивается в 2 раза (Л.Ю. Гривцова, 2017).
Несмотря на то, что трансплантация ГСК и трансплантация костного мозга осуществляется в России более 70 лет, специальных отечественных препаратов, содержащих ГСК, не существует, а трансплантации ГСК и подбор доноров костного мозга осуществляются стихийно, только как «трансплантация костного мозга» и только на основе комплекса гистосовместимости HLA I и II типов и количества ГСК. Не существует и официальных клеточных препаратов для восстановления поврежденного гемопоэза после химио- и лучевой терапии. При угнетении миелоидного ростка в процессе этих терапий (преимущественно при облучении плоских костей - грудины и таза) быстро (7-12 дней) или отставленно (3-6 недель) формируется нейтропения, опасная развитием инфекционных осложнений, грибковых поражений, повреждений кожи (мукозид, раны, трещины), присоединяется сопутствующий иммунодефицит и цитомегаловирусная инфекция. К лечению добавляют антибиотики для лечения внутритканевой инфекции и Г-КСФ (нейпоген, граноцид, нейпомакс, грановесил и т.д.). Тромбоцитопения опасна развитием геморрагического диатеза, поэтому применяется тромбоцитопенический концентрат. Таким образом, вопрос о новых клеточных продуктах, которые могут быть использованы для терапии осложнений и побочных эффектов от терапии опухолей крайне актуален для современной отечественной и мировой онкологии.
В июле 2016 года в России принят Федеральный закон №180 ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах», который на государственном уровне регулирует разработку и создание БМКП, доклинические исследования и ограниченные клинические испытания БМКП, оборот БМКП и их широкое применение в клинике на людях. Поэтому актуальность создания новых клеточных продуктов очевидна, так как до настоящего времени в России говорили преимущественно о клеточных технологиях и СК, а не о БМКП. Под биомедицинским клеточным продуктом указанный закон понимает комплекс, состоящий из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ, либо из клеточной линии (клеточных линий) и вспомогательных веществ в сочетании с прошедшими государственную регистрацию лекарственными препаратами для медицинского применения и (или) медицинскими изделиями.
В качестве наиболее близкого аналога, т.е. прототипа настоящего изобретения принят препарат аутологичных ГСК для трансплантации при поражении нервной системы и способ получения этого препарата (патент RU 2283119, 2006 г.). Этот известный препарат представляет собой аутологичные клетки, полученные из ПК пациента, обогащенной ГСК, содержащими антиген CD34, в конечной концентрации (40-100)×106 клеток/мл.
Уникальной особенностью в процессе приготовления этого известного клеточного препарата было то, что в отличие от мобилизованных ГКП и МСКП для лечения онкологических пациентов, введение Г-КСФ осуществляли не 6-7 дней (классический вариант стимуляции ГСК), что позволяло получать зрелые ГСК (CD34, CD133+, CD45+), а применяли стимуляцию Г-КСФ только 4 дня и в результате забора на 5-й день стимуляции получали из ПК преимущественно ГКП (CD34+, CD133, CD45-). Этот препарат до сих пор успешно применяется до настоящего времени для лечения крайне тяжелых неврологических больных с травматической болезнью головного и спинного мозга. Однако, при составлении этого известного препарата и его применении абсолютно не учитывалась роль МССК в нем, а в настоящее время требуется более высокая эффективность БМКП такого типа.
Задачей настоящего изобретения является создание нового БМКП с использованием СК преимущественно для нужд современной онкологии и неврологии. Техническими результатами, достигаемыми при использовании БМКП по настоящему изобретению, являются эффективное восстановление миелоидного ростка и всего гемопоэза в период коррекции осложнений и восстановления клеточных повреждений после лучевой и химиотерапии, а также эффективное заживление органических повреждений головного и спинного мозга человека.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения решение указанной задачи достигается тем, что предложен БМКП для лечения и профилактики онкологических и неврологических заболеваний, содержащий линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных (от аллореактивного, а лучше от гаплоидентичного донора) мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+, выделенных из нативного костного мозга или жировой ткани и культивированных in vitro в среде, способствующей мезенхимальной дифференцировке (компонент А), неманипулированные или маломанипулированные аутологичные или аллогенные мобилизованные мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из лейконцентрата периферической крови (ЛК ПК), очищенные от плазмы крови, эритроцитов и гранулоцитов (компонент Б), и вспомогательное вещество в виде биологически стабильной и стерильной трансфузионной среды (компонент В) при следующем соотношении компонентов (об. % от общего количества БМКП):
компонент А - 1-19,5;
компонент Б - 79,5-90;
компонент В - остальное.
Преимущественно, компонент Б содержит αβ Т-клетки, γδ Т-клетки, NК- и NKT-клетки, В1- и В2-клетки, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+, HLA DR+, гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) с маркерами CD34+, CD45-, HLA DR-, МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD 117- и МСКП с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+ при следующем соотношении компонентов (об. % от общего количества компонента Б):
αβ Т-клетки - 55-60;
γδ Т-клетки - 10-15;
NК- и NKT-клетки - 15-20;
В1- и В2-клетки - 10-15;
ГСК и ГКП - 1,5-2,5;
МССК и МСКП - 1,5-2,5.
В одном из вариантов настоящего изобретения компонент Б частично очищен от αβ Т-клеток при следующем соотношении компонентов (об. % от общего количества компонента Б):
αβ Т-клетки - 30-55;
γδ Т-клетки - 15-20;
NК- и NKT-клетки - 17-30;
В1- и В2-клетки - 10-15;
ГСК и ГКП - 1,5-2,5;
МССК и МСКП - 1,5-2,5.
В качестве вспомогательного вещества может быть использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) в объеме 5-100 об. %. от объема физиологического раствора NaCl или биодеградируемый полимерный матрикс с трансфузированным в нем гранулоцитарным колониестимулирующимо фактором (Г-КСФ) в объеме 5-20 об. % от объема матрикса.
Преимущественно, аллогенные МНК иммуносовместимы по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови.
Согласно второму аспекту настоящего изобретения решение вышеуказанной задачи достигается тем, что предложен способ приготовления ex tempore биомедицинского клеточного продукта (БМКП), предложенного по настоящему изобретению, включающий в себя:
получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+и CD117+ путем выделения этих клеток из нативного костного мозга или жировой ткани и дальнейшего культивирования in vitro в среде, способствующей мезенхимальной дифференцировке (компонент А),
получение неманипулированных или маломанипулированных аутологичных или аллогенных мобилизованных мононуклеарных клеток (МНК) путем их выделения из лейконцентрата периферической крови (ЛК ПК) с последующей очисткой от плазмы крови, эритроцитов и гранулоцитов (компонент Б) и
смешивание ex tempore компонентов А, Б и вспомогательного вещества в виде биологически стабильной и стерильной трансфузионной среды (компонент В).
При необходимости, полученные компоненты А и Б криоконсервируют, а перед их смешиванием ex tempore с компонентом В размораживают.
Согласно следующим аспектам настоящего изобретения предложены применения БМКП по настоящему изобретению для лечения и профилактики рака и других злокачественных новообразований, а также для лечения неврологических заболеваний.
Под неманипулированными или маломанипулированными клетками в современной мировой иммунологии, регенеративной медицине и трансфузиологии понимаются клеточные системы человека и животных, которые в результате выделения, очистки, обработки, стандартизации, сертификации, криоконсервации и хранения не подвергаются процессам модификации генома, культивированию или длительному (более 12 часов) инкубированию полученных клеток с химическими веществами или лекарственными препаратами, а также клетки, в результате манипуляций с которыми остаются неизменными нативные (природные) генетические и постгеномные характеристики транскриптома, протеома, метаболома и секретома этих клеток.
На фиг. 1 представлена диаграмма иммунофенотипических характеристик маркеров клеточной поверхности ГСК (CD34+, CD 133+) в норме (доноры), у нейроонкологических больных и больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС).
Согласно настоящему изобретению предложен альтернативный американскому препарату "HEMACORD" новый БМКП с торговым названием "ГемаКомб". Предложенный БМКП, также как и "HEMACORD", содержит ГСК и МССК и направлен на реставрацию (восстановление) клеток поврежденной ткани организма онкологического больного, полученных в результате различных типов токсичности после конвенциональной и таргетной противоопухолевой терапии, а также имеет достоинства, не имеющиеся у американского продукта. Во-первых, МССК и ГСК, применяемые в предложенном БМКП, находятся в привычном тканеспецифичном микроокружении клеток костномозговой ниши, что значительно повышает их эффективность и биологическую активность. Во-вторых, работами японских исследователей показано (К. Ono et al., 2001), что клетки ЛК мобилизованных МНК костного мозга при инфузии их в кровь реципиента или в ткань поврежденного органа мигрируют к зонам повреждения в составе костно-мозгового кластера, что позволяет повысить выживаемость СК многократно и добиться более эффективного хоуминга этих клеток к зонам повреждения. В случае правильного молекулярно-генетического подбора компонента Б противоопухолевая активность БМКП возрастает многократно в связи с аллореактивностью этих клеточных систем за счет наличия в них NK-, NKT-клеток и 
Т-клеток (системы врожденного иммунитета), способных уничтожать опухолевые клетки пациента. В-третьих, предложенный БМКП способен оказывать мощное иммунное эффекторное воздействие на ОК, мобилизуя свои противоопухолевые эффекторные клеточные системы врожденного иммунитета (NK-клетки, NKT-клетки, 
Т-клетки, В1-клетки), находящиеся в ЛК МНК. В-четвертых, при правильном расчете количества МССК и ГСК в предложенном БМКП можно добиться реального воздействия на пролиферативные, репродуктивные и миграционные свойства раковых стволовых клеток (РСК), что сегодня не способен обеспечить не один фармацевтический таргетный противоопухолевый препарат.В итоговом отчете о прикладных научных исследованиях по теме «Разработка биомедицинского клеточного препарата гемопоэтических стволовых клеток для персонифицированной протеом-основанной терапии опухолей головного мозга», выполненного в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2014-2020 годы" (шифр заявки 2014-14-576-0057-078) авторами настоящего изобретения было показано, что при соотношении количества здоровых ГСК или МССК к ОК равном 3 к 1 in vitro и in vivo функциональная активность РСК блокируется путем горизонтального и вертикального переноса регуляторных белков из СК в РСК.
Авторы настоящего изобретения в процессе разработки БМКП по настоящему изобретению проводили исследования и модификации вышеуказанного известного препарата, принятого в качестве прототипа (патент RU 2283119, 2006 г.). До 2008 г. в этом известном препарате использовали только аутологичный биоматериал (полученный от самих пациентов), а с 2008 г. стали использовать аллогенный донорский материала и в течение 3-7 дней культивировать стандартный лейкоконцентрат с ростовой средой, препятствующей дифференцировке, но позволяющей наращивать ГСК до 2% и более, в результате чего отметили повышение эффективности продукта. В дальнейшем стали обогащать ЛК МНК костного мозга клеточными системами из линии МССК аллогенных здоровых доноров, как в целях нейрореставрации, так и для целей восстановления поврежденного костного мозга и коррекции последствий лучевой и химиотерапии у онкологических пациентов. Добавление линии клеток аллогенных МССК и культивирование ЛК МНК в течение 3-7 дней обеспечило высокую очистку препарата от оставшихся эритроцитов и гранулоцитов и повысило эффективность продукта из МССК для использования его в онкологической и неврологической практике.
Таким образом, биотехнологическая платформа создания БМКП по настоящему изобретению под торговым названием «ГемаКомб» или другими словами, базовая клеточная матрица продукта по настоящему изобретению основана на широко используемой авторами изобретения (Брюховецкий А.С. с соавт., 2010-2016; Dolgopolov I.S. et al., 2010) с 2002 по 2018 г.г .препарате из аутологичной (собственной) или аллогенной (донорской) иммуносовместимой (по группе крови, резус-фактору, иммунофенотипу) клеточной суспензии МНК мобилизованной ПК, содержащей в себе небольшое (0.5-2%) количество ГСК (CD34+CD45+) и ГКП (CD34+CD45-), а также минимальное количество (1-1,5%) МСКП (с клеточными маркерами CD10-, CD 13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117-), которые обогащали донорскими МССК, полученными из клеточной линии в условиях производства GMP стандарта. Клеточная линия МССК имела клеточные системы с маркерами клеточной поверхности CD 10+, CD 13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и МСКП (CD10+, CD 13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+. CD34+, CD45+ и CD117+). Источником получения аллогенных МССК было от 2-5 мл эксфузата костного мозга самого пациента или здорового донора или 5-10 мл ЛК МНК костного мозга самого пациента или здорового донора. В ряде случаев линию МССК получали из жировой ткани пациента или донора путем хирургического иссечения ее на передней брюшной стенке или полученной путем процедуры стандартной липосакции.
Количество ГСК, применяемое в предложенном данном БМКП составляет 1-2% от массы всего ЛК МНК ПК и этого количества вполне достаточно для тех регуляторных и системных функций, которые должны выполнить эти клетки при инфузии пациенту. Однако количество МССК в данном ЛК МНК ПК составляет не более 1% и этого количества СК, необходимых для нейрореставрационных целей реконструкции поврежденного мозга или блокирования пролиферативных, миграционных репродуктивных функций явно недостаточно. Поэтому в предложенном БМКП мобилизованные клетки ЛК МНК ПК (компонент Б) обогащены взрослыми МССК с маркерами клеточной поверхности CD10+, CD 13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105, CD34-, CD45- и CD117- и МСКП с маркерами CD10+, CD 13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+и CD117+из клеточной линии, полученной из костного мозга или жировой ткани (компонент А).
Полная структура мобилизованных МНК, предшественников ПК мыши и человека, представлена натуральными киллерами (NK-клетки, NKT-клетки), Т-клетками (Т-лимфоциты: γδ Т клетки, αβ Т-клетки), ГСК (CD34+, CD133+, CD 45+, HLA DR+) и ГКП (CD34+, CD133+, CD45-, HLA DR-), МССК (CD10+, CD 13+, CD44+, CD90+(Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117-) и МСКП (CD10+, CD13+, CD44-, CD90+(Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+и CD117+), В-клетками (В-лимфоцитами: В1- и В2-клетки). Мобилизованные МНК ПК представляют собой очень гетерогенную структуру кроветворных, иммунных и стволовых клеток крови различной стадии дифференцировки. Использование гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ) для мобилизации этих клеток в течение 4-х дней обеспечили постоянство состава мультиклеточной матрицы из иммунных, кроветворных и прогениторных клеток.
Учитывая, что αβ Т-клетки (Т-хелперы, Т-супрессоры, Tregs), содержание которых в вышеописанном исходном препарате составляет 50-60%, являются основным источником реакции «трансплантат против хозяина», то применение этого препарата имеет значительные ограничения у большого числа онкологических пациентов и определенные трудности при внутривенном введении у неврологических пациентов.
Для решения этой проблемы настоящее изобретение предусматривает частичную очистку компонента Б от αβ Т-клеток, когда стандартными методами иммуносепарации с антителами CliniMACS TCR alpha/beta Kit осуществляют деплецию или истощение αβ Т-клеток на аппарате CliniMACS® plus, клинически применяемом для иммуномагнитной селекции клеток. Однако для терапии неврологических пациентов такое истощение αβ Т-клеток необязательно. В обработанном и манипулированиом ЛК мобилизованных МНК оставались все основные эффекторы врожденного иммунитета (NК-клетки и NKT-клетки, В1-клетки, 
Т-лимфоциты, ГСК и ГКП, МССК) здорового донора в количестве 45-50% клеточной массы. Таким образом, ЛК, истощенный αβ Т-клетками, будет содержать γδ Т-клетки (лимфоциты) в количестве 20-30%, αβ Т-клетки 5-10%, NК-клетки и NKT-клетки - 34-40%, В1-клетки -до 10% от общего количества клеток, ГСК и ГКП - до 4-5%, МССК - до 4-5%.
Таким образом, в результате стандартной процедуры лейкоцитофереза получается ЛК мобилизованных МНК ПК, и после обогащения его различными типами СК получилась универсальная биотехнологическая клеточная платформа для целой линейки различных противоопухолевых препаратов. Добавление в эту платформу культуры клеток ГСК или МССК значительно увеличивает потенциал этого препарата против раковых СК (РСК). Обогащение этой натуральной мононуклеарной клеточной платформы линией аллогенных СК (ГСК, МССК, НСК) значительно увеличивает ее противоопухолевые свойства с одной стороны и повышает регенеративный потенциал, с другой стороны.
Количество требуемых культивированных донорских МССК определяют путем несложных расчетов. Рассчитывают количество ОК в организме пациента различными методами (например методом Кшивца). Содержание РСК составляет 1-2% от количества ОК в организме пациента. Умножив количество РСК на коэффициент 3 (соотношение, блокирующее функцию РСК, составляет 3 ГСК или МССК на 1 РСК) получают оптимальное количество СК, необходимое для блокировки функций РСК у конкретного пациента. Полученный БМКП по настоящему изобретению вводили различным онкологическим и неврологическим пациентам внутривенно или интратекально с учетом совместимости группы крови и резус-фактора донора и реципиента. Хотя при хорошей очистке ЛК от эритроцитов и гранулоцитов эти показатели не обязательны к исполнению.
В ряде случаев ЛК мобилизованных МНК клеток в течение 3-7 суток культивировали в среде с содержанием интерлейкина-2 (ИЛ-2). Прокультивированный ЛК оценивали после культивирования по клеточному составу для определения процентного и количественного содержания базовых клеточных элементов в нем (ГСК, ГКП, МССК, NК-клетки и NKT-клетки, γδ Т -лимфоциты и В1 и В2-клетки). После 3-5 дней культивирования эти МНК клетки могли использоваться у пациента без учета групповой и резус-факторной совместимости, так как эритроцитов и гранулоцитов в этой клеточной суспензии больше не было.
Сочетание МНК ПК, содержащих ГКП и МССК со взрослыми кроветворными СК (ГСК) и (или) СК мезенхимального ряда (МССК), обеспечивает образование оптимального клеточного симбиоза внутри кластера кроветворных и иммунных клеток, в котором функциональные и регуляторные свойства ГКП и ГСК, а также МСКП и МССК являются максимально активными и достаточно физиологичными. Формирование прокультивированного в течение 3-7 дней в ростовой среде, препятствующую дифференцировку, мононуклеарного терапевтического кластера кроветворных клеточных систем в БМКП позволяет создать принципиально новую биологически активную композицию клеточных систем, способную к максимально быстрому и оптимальному восстановлению нарушенного гемопоэза, реставрации повреждений в органах и тканях онкологического больного после проведенной хирургической резекции опухоли, лучевой терапии и (или) химиотерапии, а также позволяет профилактировать рецидивы опухоли и дальнейшее распространение (метастазирование) опухоли по организму онкологического больного. Но самое главное, это позволяет не потерять, а наоборот, нарастить количество ГСК в ЛК мобилизованных МНК, в которых количество ГСК является определяющим для успешной трансплантации клеток костного мозга. Использование краткосрочного (3-5 дней) культивирования ЛК МНК ПК в ростовой среде, препятствующей дифференцировке и способствующей увеличению количества ГСК, позволяет повысить качество данного препарата и увеличить потенциальные возможности его применения для трансплантации ГСК и восстановления поврежденного процесса кроветворения у онкологических больных после лучевой и химиотерапии.
Создание системообразующего и биологически активного мононуклеарного мультиклеточного кластера из мобилизованных кроветворных и иммунных клеток, содержащих предшественники гемопоэза и донорские ГСК и МССК, имеет важнейшее значение для реконструктивно-восстановительного эффекта предлагаемого БМКП. Исторически сложилось так, что роль ГКП при трансплантации костного мозга практически не учитывалось в ЛК мобилизованных МНК, так как для этого вида терапии именно количество ГСК является определяющим для восстановления нарушенного кроветворения. Но именно большое количество ГКП в ЛК мобилизованных МНК потенцирует и определяет выраженные клинические эффекты незначительного количества ГСК, а при других задачах терапии также является важнейшим терапевтическим компонентом. Авторы настоящего изобретения уже более 14 лет широко применяют матрицу предлагаемого БМКП из аутологичных или гаплоидентичных ГКП и МСКП в МНК в лечении различных нервных заболеваний у человека в качестве самостоятельного клеточного препарата и имеют большой клинический опыт (более 15000 трансфузий) применения препаратов, содержащих ГКП в лечении 5807 пациентов. Препарат применялся в клинике нервных болезней различным неврологическим и онкологическим больным интратекально (введение в спинномозговую жидкость), интравентрикулярно (инфузии в желудочковую систему головного мозга), внутривенно и внутриартериально. Авторы настоящего изобретения считают, что наиболее привлекательными для воздействия на патологический очаг в организме человека представляются именно аутологичные ГКП и ГСК (Брюховецкий А.С., 2005-2016, Bryukhovetskiy A.S. et al., 2006-2016), так как на фоне их многолетнего системного применения был отмечен убедительный нейрореставрационный (нейровосстановительный), морфологический и клинический эффект (57-61,2% случаев), и практически не было жизнеугрожающих ситуаций и осложнений у пациентов. Эти линии ГКП и МСКП уже получили свой вектор дифференцировки, и технологии их получения не представляет больших трудностей (прототип по патенту RU 2283119). Все осложнения, которые отмечались на фоне применения предложенного БМКП, были достаточно понятными и легко купировались симптоматически, не приводя к нарушениям витальных функций или тяжелым последствиям.
Для определения необходимого и достаточного количества ГСК и МССК в предложенном БМКП были проведены эксперименты и простые математические расчеты. Эксперимент по моделированию межклеточного взаимодействия ГСК с патологическими клетками наиболее наглядно демонстрируется на модельных системах рака. Результаты исследований по этому вопросу были опубликованы в журнале «Гены и клетки», том XI, №3 в 2016 году в оригинальной статье (Милькина Е.В. с соавт., 2016). В этой статье показано, что любое взаимодействие между живыми объектами или клеточными системами это передача информации, что полностью согласуется с данными литературы (Пальцев М.А. с соавт., 2003). Показано, например, что миграционная активность ГСК в отношении клеток глиобластомы превосходит их «подвижность» относительно ОК других типов, что свидетельствует о высоком информационном потенциале клеток глиобластомы. Описанная в литературе способность глиобластомы рекрутировать клетки различных типов (de Fonseca A.S., Badie В., 2013; Rishardson, 2015) подтверждает это наблюдение. Как известно, ГСК мигрируют в область повреждения по градиенту концентрации хемоатрактантов. Основная роль в этом процессе принадлежит фактору стромальных клеток 1α (SDF-1α). Кроме того, описано еще 80 лигандов, продуцируемых поврежденными клетками и тканями. При этом основным индуктором синтеза этих молекул являются высокоактивные молекулы семейства HIF-факторов, индуцируемых гипоксией (Брюховецкий И.С., Брюховецкий А.С., Мищенко П.В. с соавт., 20013). Гипоксия, один из ключевых критериев мультиформной глиобластомы (МГБ), запускает механизмы клональной селекции, что резко увеличивает инвазивный потенциал опухоли, вследствие чего возрастает количество экзосом, выделяемых ОК и транспортирующих широкий спектр молекул, способствующих также миграции СК в опухолевый очаг (Нu J., Sun Т., Wang Н. et al., 2016; King H.W., Michael M.Z.., Gleadolle J.M., 2012; Iwadate Y., Matsutani Т., Hirono S. et al., 2016). В процессах инвазивного роста и метастазирования злокачественных опухолей особая роль принадлежит эпителиально-мезенхимальному переходу - сложному процессу изменения эпителиальными клетками своего фенотипа на мезенхимальный, что сопровождается глубокими изменениями клеточного протеома (Iwadate Y., 2016; Kubelt Hatterman K., Sebens et al., 2015). Как было показано в эксперименте, стимуляция клеток глиобластомы человека трансформирующим фактором роста 1β изменяет молекулярный фенотип клеток линии U87 глиобластомы человека (Bryukhovetskiy I., Shevchenko V.E., 2016). Продукция TGF-1β возрастает в условиях гипоксии, при этом максимальная концентрация TGF-1β отмечена вокруг некротических областей в ткани глиобластомы (Iwadate Y., Matsutani Т., Hirono S. et al., 2016), где накапливаются мигрировавшие в опухоль нормальные СК, продуцирующие экзосомы (Bryukhovetskiy I., Bryukhovetskiy A., Chotimchenko Y. et al., 2016).
Исследования специалистов по иммунологии гемопоэза в ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Минздрава РФ (Гривцова Л.Ю., Тупицын Н.Н., 2016) показали, что при глубоком изучении маркеров клеточной поверхности аутологичных ГКП и взрослых ГСК, которые применялись для лечения различных пациентов, иммунофенотип маркеров ГСК гетерогенен и сильно различается у здоровых доноров, взрослых онкологических пациентов и детей, страдающих различными онкологическими заболеваниями, и значительно отличается у пациентов с дегенеративными и атрофическими заболеваниями нервной системы. Несмотря на то, что в клиническом анализе крови не были видны количественные нарушения и формальные изменения формулы крови и нарушения морфологии структурных элементов крови у этих пациентов, их гемопоэз (кроветворение) на разных стадиях заболевания различается очень сильно и серьезно страдает на уровне регуляторных клеточных систем врожденного и приобретенного иммунитета.
Как видно из диаграммы на фиг. 1, у больных боковым амиотрофическим склерозом (БАС) на поверхности аутологичных ГСК больных практически отсутствует маркер CD38, а также резко снижены показатели CD117 и CD71, а у больных с онкологическими заболеваниями на поверхности ГСК отмечено значительное подавление маркера CD33 и маркеров CD71 и CD90 (Thy-1). Общее количество лейкоцитов в ЛК МНК костного мозга составляет (10-20)⋅109 клеток, то есть из них ГСК и ГКП составляют не менее 1%, то есть (1-2)⋅106 клеток. Поэтому для восстановления гемопоэза этих клеток может быть и будет вполне достаточно, но для подавления регуляторных свойств ОК и РСК здоровыми ГСК в количестве 0,5-1% их будет явно недостаточно. Учитывая, что, например, количество РСК (глиомасфер) мультиформной глиобластомы составляет от 6-15%, то в зависимости от объема опухоли количество МССК должно быть в диапазоне (100-300)×106. А это возможно только при обогащении ЛК МНК клетками клеточной линии МССК. Также вполне достаточным является количество ГСК и ГКП в препарате для усиления клинического эффекта заместительного и регенераторного воздействия аутологичных ГСК и ГКП на пострадавшую ткань органа или массивного воздействия биологически активными веществами и регуляторными веществами, продуцируемыми ГСК. Однако при массивных повреждения нервной ткани количество МССК должно быть не менее (30-60)×106. Также это количество ГСК и ГКП является вполне эффективным для возникновения адекватного клинического эффекта как в нейрорегенерации, так и в восстановления гомеостаза и реставрации повреждений в органах и тканях. Однако количество МССК, необходимых для блокирования РСК и их предшественников, явно недостаточное.
Последние 10 лет исследовательская группа, в которую входили авторы настоящего изобретения, занималась серьезными фундаментальными научными исследованиями в области межклеточного взаимодействия СК и различных типов ОК и РСК in vitro и in vivo (Брюховецкий А.С., 2003-2016; Брюховецкий И.С. с соавт., 2010-2016; Bryukhovetskiy A.S. et al., 2013-2016; Bryukhovetskiy I.S. et al., 2010-2016). Главным научным фактом этих исследований стало убедительное экспериментальное доказательство биологического эффекта горизонтального информационного переноса микро- и наночастей цитоплазмы СК в ОК и РСК и наоборот. Было доказано, что горизонтальный информационный обмен между этими клеточными системами является основным инструментом регуляции ГСК и осуществляется путем секреции ГСК мультивезикулярных пузырьков различного диаметра (от 10 до 1000 нм), обладающих мощным противоопухолевым (антипролиферативным, антимиграционным, антирепродуктивным и т.д.), а также выраженным нейровосстановительным и регенеративным потенциалами. Была поставлена задача проследить за перемещениями белков и РНК между ГСК, ОК и РСК. Очевидно, что белки и РНК, после того как их поглотит клетка-мишень, можно определить, только пометив их с помощью специальных флуоресцентных меток, позволяющих отслеживать такие перемещения посредством флуоресцентной микроскопии. Для этого цитоплазму ОК, РСК и ГСК метили флуоресцентными красителями. В результате этих исследований впервые в мире было показано, что при соотношении трех клеток ГСК к одной ОК или одной РСК (3:1) в патологическом очаге происходит полное блокирование основных функций (репродукции, митоза, миграции и т.д.) ГСК. Именно установление факта блокировки функционирования и репродукции ОК и ОСК за счет регуляторного ингибиторного воздействия регуляторных белков и РНК этих ГСК при опухоли (Брюховецкий И.С. с соавт., 2016) и стало главным достижением этих исследований. Однако, при взаимодействии ГСК с ПовК (неопухолевыми) при соотношении 2 ГСК к 1 ПовК запускаются противоположные опухолевым саногенетические процессы регенерации и реставрации ПовК (Брюховецкий И.С. с соавт., 2016).
Поэтому применение ГСК (CD34+, CD45+) и ГКП (CD34+, CD45-), содержащихся только в ЛК мобилизованных МНК ПК пациента, явно достаточно не только для регенерации и восстановления ПовК после лучевой или химиотерапии (ГСК:ПовК=1:2), но и тем более для оказания противоопухолевого эффекта (ГСК:РСК или ОК=3:1).
На основе вышеприведенных исследований, согласно настоящему изобретению, был создан научно-обоснованный, сбалансированный, имеющий повышенные противоопухолевые и регенеративные свойства терапевтический БМКП, являющийся комбинацией МНК мобилизованной ПК (компонент Б), обогащенной клеточными системами линии культивированных МССК с маркерами клеточной поверхности CD10+, CD 13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и МСКП с маркерами клеточной поверхности CD10+, CD 13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+. CD34+, CD45+ и CD117+ (компонент А) и помещенной во вспомогательную среду (компонент В) в виде 0,9% физиологического раствора натрия хлорида или биодеградируемого полимерного матрикса, в качестве которого может быть использован матрикс "Сферогель", описанный в патенте RU 2249462, 2005 г.
Прокультивированный в течении 2-6 дней в специальных условиях ЛК мобилизованных МНК ПК становится высокоэффективным для внутривенного применения у онкологических больных для восстановления нарушенного гемопоэза и коррекции осложнений после химиотерапии и лучевой терапии опухолей, а также он эффективен при терапии токсических стоматитов, циститов, дерматитов, гепатотоксичности, кардиотоксичности, желудочно-кишечных нарушениях (токсических энтеритах и энтероколитов), легочной токсичности и нейротоксичности. При интратекальном введении БМКП «ГемаКомб» способен также оказывать нейрорегенеративное действие на органическое поражение ЦНС. Кроме того, применение БМКП «ГемаКомб» является биомедицинским способом повышения качества приживаемости ГСК трансплантата костного мозга и восстановления кроветворения после курса высокодозной миелооблативной химиотерапии при трансплантации костного мозга.
Механизм действия предложенного БМКП. При парентеральном введении препарата (внутривенно, интратекально, интравентрикулярно, внутриартериально) в организм пациента ГСК, МССК и МНК препарата мигрируют в зону патологии поврежденных органов и тканей в виде мультиклеточного мононуклеарного кластера, независимо от этиопатогенеза заболевания: опухоль, ишемия, травма, атрофия, дегенерация и т.д. Патотропизм мононуклеарного мультиклеточного кластера клеточных систем, содержащих ГКП, МСКП, ГСК и МССК, в зоне повреждения осуществляется внутри кровеносных сосудов, лимфатических сосудов и (или) непосредственно внутри ткани органа и даже нервной ткани мозга. Трансфер клеточного кластера препарата связан с генетически обусловленным самонаведением СК на градиент концентрации воспаления (SDF-a) в патологическом очаге и их хоумингом (направленной миграции) и клеточной адгезией к патологическим клеткам. Именно ГСК и ГКП являются основными навигационными системами всего мультиклеточного кластера по сосудам и внутри ткани органов. Мультиклеточный мононуклеарный кластер препарата в зоне максимальных повреждений оседает в поврежденном органе и активирует содержащиеся в нем ГСК и МССК, которые затем адгезируют к патологическим клеткам и по механизму by stander effect воздействуют на клеточные системы пострадавшего органа цитокинами и цитоплазматическими белками. ГСК, ГКП, МСКП и МССК, находящиеся в мультиклеточном мононуклеарном кластере препарата, начинают оказывать регуляторное и саногенетическое воздействие на пострадавшие клетки в поврежденных тканях и восстанавливают их морфологию и нарушенные функции ПовК. В здоровой ткани клетки препарата не задерживаются и утилизируются, но при наличии повреждения стационарных тканей (нервная ткань, мышечная ткань, суставная ткань, костная ткань) клеточные системы СК препарата могут стимулировать регенерацию путем слияния их ядер с ядрами ПовК органов и тканей, секретировать биологически активные цитокины и факторы роста, оказывать регуляторное воздействие на ПовК. В тканях, способных к регенерации, клеточные системы препарата могут активировать процессы репаративной регенерации органов и тканей.
Поскольку аллогенный БМКП при необходимости может быть очень эффективно очищен при культивировании с ИЛ-2 от эритроцитов и гранулоцитов, его безопасное парентеральное введение может быть применено как внутривенно и внутриартериально, так и интратекально и интравентрикулярно любому пациенту, что делает возможным не учитывать групповую и резус-принадлежность этих клеток к определенному иммунофенотипу, групповую совместимость и резус-фактор.
Экспериментальным обоснованием создания БМКП по настоящему изобретению может быть также серия дополнительных экспериментов, проведенных авторами настоящего изобретения. Так, по современным представлениям, в процессах метастазирования, инвазивного роста и терапевтической резистентности злокачественных опухолей исключительно важная роль принадлежит ОСК (Nessar D., Blanpain С., 2016). В серии собственных исследований авторами изобретения показано, что подвижность ГСК и ГКП человека в отношении клеток глиобластомы на 61% более выражена по сравнению с их подвижностью в отношении клеток иного происхождения (Брюховецкий И.С., Дюйзен И.В., Шевченко В.Е. и соавт., 2016). Данные настоящего исследования убедительно свидетельствуют в пользу того, что миграционная активность ГСК в отношении клеток глиобластомы также превосходит их миграционные возможности в отношении клеток других новообразований, что может быть связано с высоким инвазивным экзосомальным потенциалом данной опухоли. Но следует отметить, что низкая миграционная активность ГСК и ГКП в отношении клеток рака легкого и молочной железы, в сравнении с таковой по отношению к клеткам глиобластомы, может быть связана с тем, что в естественных условиях ГСК и ГКП не имеют физиологических или анатомических препятствий для миграции и взаимодействия с клетками этих опухолей, а продуцируемые в процессе неопластического роста хемокины способны иммобилизовать ГСК и ГКП из ниш в костном мозге. Конечно, разница в условиях культивирования (например, без добавления эстрогенов в случае линии MCF-7) отразилась на способности этих клеток привлекать ГСК, но это не должно вводить в заблуждение. Миграция в неопластический очаг это фундаментальное свойство СК всех типов (Bryukhovetskiy I., Bryukhovetskiy A., Chotimchenko Y et al., 2016; Брюховецкий И.С. Брюховецкий А.С., Мищенко П.В. с соавт., 20013; Брюховецкий И.С., Дюйзен И.В., Шевченко В.Е. и соавт., 2016). Представляется важным момент адгезии ГСК к клеткам опухолей различных линий. Особого внимания заслуживает феномен, наблюдаемый в процессе мониторинга в режиме реального времени, когда, перемещаясь по дну планшета в пределах поля зрения, клетка глиобластомы, рака легкого и рака молочной железы как-бы собирает на себя отдельные ГСК, которые прикрепляются к ней (Abody K.S., Braun A., Rainov, 2000). Суть данного феномена состоит в том, что ГСК или МССК, введенные в опухоль или зону ишемии ткани, мигрируют вслед за клеткой, начавшей вторгаться в ткань органа, прилипают к ней и сопровождают опухолевую или другую патологическую клетку, «оседлав, подобно наезднику», или «inpiggy-backfashion» (Abody K.S., Braun A., Rainov, 2000), при этом ГСК продуцируют регуляторные экзосомы. Данное явление наблюдалось авторами настоящего изобретения в процессе взаимодействия ГСК с клетками глиобластомы, рака легкого и рака груди. Авторы считают этот феномен системным. Описание подобных функций у линии ГСК и МССК в зоне ишемического инсульта имеется в литературе (M. Chopp et al., 2016). Более того, вероятно, целесообразно говорить не только, и не столько о высокой подвижности ГСК к ОК МГБ и клеткам раков, а скорее об их высокой взаимной подвижности по отношению друг к другу. В этой связи допустимо предположить, что в ответ на гипоксическое поражение вещества мозга растущей опухолью или прогрессирующей ишемией, с одной стороны, происходит запуск процессов направленной миграции СК, а с другой стороны, активизируется миграция клеток глиобластомы в направлении участков ишемии. Следуя этой логике, не лишенным смысла представляется рассмотрение процессов инвазивного роста как результата взаимодействия различных типов СК и ОК в условиях гипоксически прекондиционированной среды. Как показано в ходе предшествующих экспериментов, адгезируя к клеткам глиальных опухолей, ГСК обмениваются с ними цитоплазматической меткой, что проявляется накоплением флуоресцентного красителя, неразрывно связанного с белками цитоплазмы ГСК в клетках рака легкого, рака молочной железы и МГБ (Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Толок Е.В., 2014). Было показано, что этот процесс сопровождается некоторым угнетением жизнедеятельности ОК (Брюховецкий И.С., Мищенко П.В., Толок Е.В., 2014). Детальное изучение межклеточного взаимодействия свидетельствует о высокой динамичности этого процесса. В ходе эксперимента при взаимодействии СК и ОК наблюдалось два принципиально противоположных эффекта. В первом случае, клетки рака легкого преимущественно накапливают флуоресцентную метку, неразрывно связанную с белками цитоплазмы, привнесенную из ГСК, что вероятно является одним из механизмов противоопухолевого действия этого типа клеток. Данный механизм и был использован авторами при создании противоопухолевых биопрепаратов на основе ГСК. Во втором случае, при культивировании ГСК с клетками линии U87 глиобластомы наблюдается перенос цитоплазматической метки из ОК в ГСК. При этом важно, что к 96 часу после начала эксперимента в ко-культуре ГСК с клетками глиобластомы практически не остается СК, позитивных только в отношении одного из используемых красителей, что может говорить о рекрутировании клеток этого типа в неопластический процесс. Исключительно важное значение имеет вопрос об информационной составляющей части клеточного протеома, который вероятно транспортируется вместе с флуоресцентной меткой из одного типа клеток в другие с помощью экзосом. В этой связи, обнаруженные эффекты трансфера флуоресцентной метки, неразрывно связанной с белками цитоплазмы, могут быть способом переноса инвазивного молекулярного фенотипа как между различными типами ОК, так и из ОК в нормальные СК. Но если клетки МГБ способны рекрутировать нормальные СК путем привнесения в их цитоплазму онкогенных факторов, то каков механизм этого процесса? В одной из современных работ исследователь из Гарвардского университета J. Godlewski, 2015 утверждает, что ОК секретируют экстрацеллюлярные везикулы, наполненные микроРНК и обеспечивающие программирование клеток, контактирующих с клетками новообразования. Кроме того, одним из механизмов является образование нанотрубок между клетками, посредством которых происходит обмен везикулами (Godlewski J., Krichevsky A.M., Jonson M.D et al., 2015). Существуют данные о возможности клеточной фузии или слиянии стволовой и неопластической клеток (Vittori М., Breznik В., Gredar Т., 2016). Теоретически, этот механизм может обеспечивать образование своеобразных «цитогибридов», обладающих как инвазивными свойствами, так и валентностями СК в ОК и других патологических клетках. По-видимому, на примере опухолей авторами изобретения был зарегистрирован классический механизм регуляторного воздействия ГСК на патологические клетки.
Таким образом, результаты проведенного эксперимента позволили сделать следующие важные выводы и заключения для создания БМКП:
- миграционная активность ГСК и ГКП, а также МССК в отношении клеток глиальной опухоли превосходит их миграционные возможности в отношении ОК других типов;
- ГСК и МССК обладают способностью адгезировать к поверхности ОК различных линий, причем эта способность особенно ярко выражена в отношении клеток глиобластомы;
- в процессе межклеточного взаимодействия наблюдается перенос части цитоплазмы из ГСК в ОК и наоборот.
Поэтому теоретически абсолютно верно, что чем большее количество ГСК и МССК будет в БМКП, тем больше шансов будет на подавление активности патологической клетки, но наличие большого количества ГСК имеет и отрицательные последствия. Так очень высокая концентрация ГСК в очаге поражения (опухолевом, ишемическом, дегенеративном и т.д.) на практике нежелательна. Она может быть очень опасна для пациента, так как при высоком уровне клеточности ГСК в очаге и из-за бурного обмена информационными микровизикулами, содержащими онкоспецифические белки ОК с нормальными СК, нормальные СК могут быстро трансформироваться в РСК и становятся дополнительным источником канцерогенеза и причиной массивной раковой интоксикации.
Существует еще одна особенность ГСК и МССК, не позволяющая применять их без дополнительных ограничений. При введении их в кровь они, после выполнении своих регуляторных функций и завершения восстановления ПовК, мигрируют в костный мозг пациента. Поэтому излишнее количество ГСК и МССК в костном мозге может нарушить баланс кроветворения, и целесообразно часть донорских ГСК заменить на МССК, количество которых в ПК не является столь критическим. Однако, учитывая строгое соотношение ГСК и МССК в ПК при мобилизации костного мозга колониестимулирующими факторами, авторы изобретения решили не нарушать этого баланса в препарате, вводимом в периферическую кровь внутривенно и внутриартериально.
Очевидно, что целью применения ГСК и линии МССК в БМКП на основе мобилизованных МНК ПК при повреждениях клеток ткани в результате лучевой или химиотерапии является контроль и управление функциями ПовК. Это первоочередная и основная цель терапии БМКП, содержащих ГСК, ГКП и МССК. Основываясь на полученных собственных экспериментальных результатах проекта доклинических исследований на I-IV этапах (отчет о прикладных научных исследованиях по теме «Разработка биомедицинского клеточного препарата гемопоэтических стволовых клеток для персонифицированной протеом-основанной терапии опухолей головного мозга», выполненного в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса на 2014-2020 годы", шифр заявки 2014-14-576-0057-078), а также на данных предшествующих исследований, необходимо заметить, что ГСК и МССК сами по себе обладают выраженным противоопухолевым потенциалом. Однако этот потенциал не может быть эффективно реализован только при условии количественного преобладания ГСК над другими субтипами ОК. Поэтому очень важно рассчитать необходимую дозу донорских ГСК и МССК в БМКП. Доза препарата должна рассчитываться от потребностей блокирования РСК, которые составляют от 1-2% до 15% от всей клеточной массы опухоли, и количество ГСК, ГКП и МССК в БМКП должно превышать количество РСК в 3 раза. Этот расчет должен быть основополагающим при подборе дозы внутривенного введения. Количество ГСК и ГКП для интравентрикулярного и интратекального введения также должно рассчитываться от объема опухоли и количества РСК в ней. Поскольку объем всего ликвора человека составляет около 120 мл, то интратекальное введение препарата ограниченно объемом 1-3 мл. Поэтому набор дозы БМКП может быть осуществлен из этого расчета, но постепенно, путем еженедельного введения БМКП в ликвор до полного набора дозы.
С учетом уникальности и чрезвычайно высокой биологической ценности такого регуляторного ресурса как ГСК или МССК, например, в коррекции последствий лечения опухолей (химиотерапии и лучевой терапии), реабилитации и профилактики рецидивов опухоли, применение БМКП с целью регуляторного воздействия на РСК и ОК принципиально допустимо только после терапевтического уменьшения количества ОК в ткани вещества органов до уровня не более 500000 ОК. То есть проводить терапию препаратом «ГемаКомб» следует только после хирургической циторедукции опухоли, завершения курса химио- и лучевой терапии опухоли. Практическим критерием применения данного БМКП является невозможность выявления опухолевого очага всеми стандартными методами онкодиагностики. Это связано с тем, что в настоящее время установлено допустимое количество ОК у каждого здорового человека и это количество держится на уровне ≤500000 ОК (Арчаков А.И., 2012). Иммунная система здорового человека способна ограничить репродукцию РСК и ОК на этом уровне. Эта цифра может уточняться, но ее порядок в норме вряд ли будет изменен.
Не менее принципиальным условием применения предложенного БМКП является проведение биологической паспортизации патологических (опухолевых, ишемизированных и т.д.) клеток. Рассмотрим диапазон требуемых ГСК и МССК для блокирования репродуктивных и пролиферативных функций РСК на различных субтипах МГБ. Согласно собственным данным, количество OK CD133+ (один из ведущих пронейральных субтипов РСК) при МГБ составляет 1,45% от общей популяции клеток, т.е. 7250 РСК пронейрального фенотипа. При этом, по данным литературы, количество РСК мезенхимального фенотипа в опухолевой ткани, удаленной из мозга больных, варьирует от 4 до 30%, т.е. 20000-150000 ОК и РСК или. С учетом того, что все субтипы РСК обладают наилучшими механизмами резистентности при противоопухолевом лечении, то для начала применения БМКП именно количество РСК этого типа должно быть ≤150000. Таким образом, диапазон количества РСК пронейрального и мезенхимального фенотипа в ткани глиальной опухоли мозга после проведения эффективной конвенциональной противоопухолевой терапии составляет диапазон от 7200 до 150000 РСК. Понятно, что данная величина носит концептуальный характер и в каждом конкретном случае она должна быть установлена индивидуально в зависимости от молекулярно-биологического фенотипа РСК опухоли. Однако максимальная величина (150000 РСК) является наиболее эффективным критерием и оптимальным количеством РСК для проведения интратекальной клеточной противоопухолевой терапии после того, как завершена химио- и лучевая терапия.
Как указывалось выше и было показано на предшествующих этапах доклинических исследований, максимальная степень угнетения жизненных функций CD 133+ и нестин+ неопластических клеток экспериментальной глиобластомы отмечена при сокультивировании с ГСК в соотношении РСК:ГСК=1:3. В этом случае очевидно, что адекватной максимальной дозой ГСК для создания минимальной курсовой биодозы БМКП является количество ГСК и МССК равное 4,5×105 и количество МССК в объеме 1×106.
Однако по данным литературы известно, что при глиобластоме до 96% ОК могут являться РСК (Брюховецкий А.С., 2013). Поэтому, если считать, что эти данные также имеют право на существование, то целесообразно расчет максимальной дозы ГСК делать с учетом и этого фактора. В этом случае, адекватной максимальной курсовой биодозой ГСК и МССК для создания рабочей биологической дозы БМКП является количество ГСК и МССК равное 1,5×106.
Таким образом, конкретную дозу ГСК необходимо корректировать с учетом процентного соотношения РСК фенотипа у конкретного больного в опухолевой ткани, что возможно сделать при генетическом анализе популяции ОК. Диапазон возможного применения ГСК и МССК в БМКП в целях профилактического противоопухолевого лечения составляет от 4,5×105 до 9,0×106 (эмпирически установленные объемы СК в одной пробирке).
Источником ГКП CD34+, CD45+, МССК и МСКП в БМКП является ЛК МНК, мобилизованных в кровеносное русло пациента. Стандартная аликвота ЛК в 1 мл содержит в среднем от 6,25×105 до 1×106 CD34+ МНК. Согласно собственным ранее опубликованным данным, количество ГСК в нем варьирует в пределах 0,5-2%, что в значительной мере определяется особенностями метода получения (от 0,5 до 3%). Если принять 1,5-2% ГСК в качестве более стандартного параметра содержания ГСК в культивированном ЛК МНК, то одна аликвота ЛК содержит от 6,25×103 до 1×104 CD34+ ГСК. Для блокирования функций РСК необходимо иметь в одной дозе препарата ГСК в 100 раз больше. Это диктует необходимость получения МНК в количестве 
Таким образом, количество МНК составит 15×106 клеток (15 миллионов). Если вводить ЛК в кровь, то эту дозу легко набрать путем трех доз ЛК. Но введение в ликвор и лимфатическую систему таких больших доз МНК может иметь негативные последствия. Поэтому недостающее количество ГСК в одной аликвоте ЛК с ГСК можно дополнить повторными введениями ГСК в количестве от 6,25×105 до 1×106 или от 50×106 до 100×106 МССК.
Таким образом, была рассчитана курсовая доза ГСК и (или) МССК для терапии БМКП «ГемаКомб», которая должна быть реализована за 4-5 введений с интервалом в одну неделю. То есть доза ГСК и МССК в препарате должна быть разделена на 4-5 частей для однократного введения. В этом случае разовая доза ГСК и МССК в БМКП может быть определена из расчета числа введений и максимальной суммарной дозы и составляет 3×105 ГСК и МССК на одно введение. Таким образом, к каждой дозе ЛК необходимо добавить 3×105 CD34+ ГСК и МССК, что можно сделать, увеличив соответственно количество доз препарата.
Применение в предложенном БМКП аутологичных и аллогенных мобилизованных ГКП и ГСК в виде МНК мобилизованной ПК крови и линии МССК способно стать решением проблемы недостаточной эффективности терапий только неманипулированными клеточными системами ГСК и МССК. Терапевтическая и регуляторная роль линии ГСК в таких препаратах была недооценена, поэтому авторы изобретения полагают что применение предложенного БМКП после лучевой и химиотерапии усилит противоопухолевый потенциал этого препарат, а также мобилизует реконструктивно-восстановительные возможности репарации поврежденных тканей и органов человека.
Компонент А предложенного БМКП получают путем культивирования нативного костного мозга самого пациента или здорового донора, полученного путем стернальной пункции или эксфузии из грудины пунктата костного мозга в объеме 1-5 мл. В других случаях, когда требовался значительный объем костного мозга, аллогенный или аутологичный биоматериал костного мозга получали во время операции эксфузии костного мозга, проводимой под спинальной или эпидуральной анестезией путем трепанбиопсии костного мозга из грудины и подвздошных костей пациента или биосовместимого донора и забирали до 400-1000 мл костного мозга. В последующем, из полученного костного мозга или ЛК ПК методом градиентного центрифугирования фракционировали общую массу клеток, получали суспензию МНК. В ряде случаев источником линии МССК была жировая ткань пациента или здорового донора, полученная путем ее хирургического иссечения или полученная путем процедуры стандартной липосакции. В дальнейшем эксфузат КМ или ЛК МНК ПК культивировали в условиях чистых помещений GMP-стандарта в культуральных боксах. В аналогичных культуральных условиях культивировали жировые клетки для получения МССК. Линию МССК выделяли после 3-5 пассажей костномозговых клеток.
Линию МССК изготавливают из 10-50 мл эксфузата костного мозга или лейкоконцентрата МНК ПК.
Выделение и культивирование линии МССК
МССК выделяли и изолировали из разных источников по известным международным протоколам - из костного мозга (P. Penfornis, R. Pochampally et al., 2011) из пуповинной крови (Can A. and Balci D., 2011) или из жировой ткани (Zachar V., Rasmussen J.G. and Fink Т., 2011) самого пациента или донора. Для изоляции МССК из жировой ткани использовали отечественную модификацию (Тепляшин А.А., 2012), а для изоляции и выделения МССК из костного мозга пуповинной крови использовали модификацию профессора Коноплянникова А.Г. (2014).
Для получения МССК использовали материал забора костного мозга. Осуществляли эксфузию 5-50 мл костного мозга из гребня подвздошной кости специальными биопсийными иглами для трепанбиопсии.
Пример выделения МССК из костного мозга
После отстаивания образца костного мозга в течение 1-2 часов при комнатной температуре выделенная верхняя фракция клеток отбиралась пастеровской пипеткой и ресуспендировалась в ростовой среде. В качестве ростовой среды использовали среду RPMI-1640, содержащую пенициллин-стрептомицин (100 ед/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин 2 мМ, 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Культивирование проводилось в пластиковых флаконах с площадью дна 25 см2, в которые вносили (2-10)×105 клеток/ см2 в 8 мл ростовой среды. Флаконы помещали в СО2-инкубатор (5% СО2). Через 48 часов среду с не прикрепившимися клетками удаляли и заменяли на свежую. При достижении конфлюэнтного монослоя (90-100%) клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в новые флаконы сначала с площадью дна 75 см2, а впоследствии при нарастании клеточной массы - в большие культуральные флаконы с площадью дна 175 см2. Такой метод позволяет к концу 5-6 недели добиться получения популяции МССК в количестве (1-2)×108 клеток, достаточных для трансплантации в организм реципиентов. Изучение специфических маркеров полученных культур МССК методом проточной цитофлуорометрии показывает, что они относятся к популяции CD10low, CD34-, CD45-, CD44+, CD90+, CD105+, CD13+, CD117-, что характерно для клеток, происходящих из мультипотентных мезенхимальных СК взрослого организма.
Вся клеточная масса МССК в количестве (1-2)×108 клеток проходит транскриптом-модифицирующую предобработку путем кондиционирования культуры МССК с одним из четырех пертурбогенов в определенной концентрации в микромоль/л (мкМ): Sol. Propidium iodide (0,000006 мкМ), Sol. Acidi acetylsalicylic (0,0001 мкМ), Sol. Trichostatin A (0,0000001 мкМ), Sol. Niclosamide (0,0000122 мкМ). Через 6 часов среда удаляется и заменяется на 0,9% физиологический раствор NaCl. Производится отмывание полученного клеточного биоматериала от среды культивирования тем же 0,9% физиологическим раствором NaCl путем двукратного центрифугирования клеток при 2000 g, и материал может быть сразу использован сразу для трансплантации. Он отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в 200 мл физиологического раствора с 10 ед\мл гепарина. Если материал планируется для интратекального введения, то он должен быть расфасован на аликвоты по 1×106 МССК в криопробирки по 2 мл и заморожен в программном замораживателе. Если материал будет использоваться для внутривенного или внутриартериального введения, то криоконсервируется весь объем (1-2)×108 МССК в криопробирки по 5-10 мл или специальные мешки для хранения костного мозга.
Криоконсервация клеточного материала
1. К охлажденной суспензии клеток в аутологичной плазме добавляется стерильный раствор диметилсульфоксида (ДМСО) до конечной концентрации 10%.
2. Суспензия расфасовывается в необходимое количество криопробирок, маркируется, упаковывается и замораживается.
3. После замораживания криопробирки переносятся в сосуд Дьюара для хранения в парах азота.
Использование клеточного материала для трансплантации
1. Материал, предназначенный для трансплантации, отмывается от среды культивирования физиологическим раствором и переводится в 200 мл физиологического раствора с 10 ед\мл гепарина.
2. Транспортировка клеточного материала осуществляется на льду в термоизолированном контейнере.
3. Клеточный материал вводится внутривенно с использованием трансфузионной системы в течение 1 ч. За 10 мин до начала процедуры пациент получает 4 мг метипреда.
Пример выделения МССК из жировой ткани
Жировую ткань забирают биопсией в объеме 10 г. Полученные 10 г трижды промывают PBS (Gibco) при рН 7.2, без ионов Са2+ и Mg2+, содержащим однократный раствор антибиотиков и антимикотика (Gibco), конечная концентрация пенициллина составляет 100 ед/мл, стрептомицина 100 мкг/мл, амфотерицина В 0,25 мкг/мл, и удаляют примеси плотной соединительной ткани. Далее проводят механическую фрагментацию ткани медицинскими ножницами в культуральных чашках диаметром 10 см (Costar) до получения мелкодисперсной массы, которую переносят в две пробирки объемом 50 мл с коническим дном (Costar) и суспендируют каждый образец в 25 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Далее проводят стадию обработки ферментом: в полученные суспензии вводят по 1 мл 2% раствора коллагеназы I типа (Gibco) в буферном растворе PBS без ионов Са2+ и Mg2+, до конечной концентрации фермента 0,075%, инкубируют при температуре 37°С в течение 30 минут при медленном покачивании. Полученную смесь тщательно перемешивают, затем добавляют эквивалентный объем DMEM, содержащую 10% FBS, антибиотики и антимикотик, и центрифугируют в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость и жировые капли удаляют, осадки объединяют и суспендируют в 10 мл холодного лизирующего буфера (+4°С), содержащего 155 мМ NH4Cl, 10 мМ КНСО3, 0.1 мМ Na2EDTA. Смесь тщательно перемешивают и инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре. Далее в клеточную суспензию добавляют 10 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Клетки осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 1000 g. Надосадочную жидкость удаляют и проводят стадию промывания. Клеточный осадок ресуспендируют в 30 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик, и центрифугируют в режиме 1000 g в течение 10 минут. Полученный осадок ресуспендируют в 25 мл среды DMEM, содержащей антибиотики и антимикотик. Полученную клеточную суспензию пропускают через фильтр с размером пор 100 мкм и центрифугируют в течение 10 минут при 300 g. Осадок ресуспендируют в среде DMEM, дополненной антибиотиками и антимикотиком, 10% FBS и однократным раствором заменимых аминокислот (Non-Essential Amino Acids, Gibco) в объеме 25 мл. Суспензию пропускают через фильтр с размером пор 10 мкм. В результате получают гомогенную фракцию клеток, свободную от клеточного дебриса и клеток крови.
Полученную клеточную суспензию оценивают подсчетом в камере Горяева и высевают во флаконы площадью 75 см2 из расчета 106 клеток/см2. Доля прикрепившихся клеток составляет приблизительно 1-1,5%. Таким образом, количество мезенхимальных СК, выделенных из 1 г жировой ткани, составляет около (1,5-3)×104 клеток. По истечении 24 часов проводят смену среды на DMEM, содержащей антибиотики (100 ед/мл пеницилина, 100 мкг/мл стрептомицина, Gibco), 10% FBS и однократный раствор заменимых аминокислот (Non-Essential Amino Acids, Gibco). По достижении монослоя клетки субкультивируют, проводят визуальную оценку морфологии клеток методом фазово-контрастного микроскопирования, оценивают митотический индекс и время цитогенерации. По результатам морфологического анализа в полученной после выделения фракции клеток выявлено две субпопуляции. Первый тип клеток представляет собой субпопуляцию малых веретеновидных клеток диаметром 10-15 мкм с четко выделенным ядром и гомогенной цитоплазмой. Второй тип представлен клетками округлой формы с вытянутым с одной стороны плоским выростом цитоплазмы, размер клеток достигает 40 мкм; отмечается темное ядро, смещенное к одному краю, гетерогенная цитоплазма и повышенная гранулярность в ядерной области. В фазе логарифмического роста клеток подсчитывают митотический индекс и время цитогенерации. Соотношение количества митотических клеток к общему количеству клеток составляет 34%. Время удвоения 54-62 час.Полученные клетки иммунофенотипируют методом непрямой иммунофлуоресценции. Посредством проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter) выявлен высокий уровень экспрессии следующих антигенов CD10, (CALLA), CD 13 (APN), CD44 (hyaluronic acid receptor), CD90 (Thy-1), CD 105 (endoglin) (Becton Dickinson). Также показано отсутствие экспрессии маркеров ГСК CD34, CD45 и CD117 (Becton Dickinson). Результаты иммунофенотипирования показывают, что популяция полученных клеток соответствует МССК по экспрессии поверхностных антигенов.
Компонент Б выделяли из свежего собственного или донорского эксфузата костного мозга или ЛК МНК ПК с использованием технологии лейкоцитофереза (Miltenyi Biotec, Germany или Spectra Coba, USA). В дальнейшем, в течение 3-7 суток наращивали количество МНК ПК путем культивирования в среде, блокирующей их дифференцировку, но способствующей увеличению из количества, а затем отмывали от культуральной жидкости двукратным центрифугированием с 0,9% ФРНХ, делили на аликвоты по 1×106 ГСК и криоконсервировали и хранили при -196°С.
Получение ЛК МНК из неманипулированного костного мозга
Требования к донорам костного мозга
Доноры должны быть предварительно обследованы на инфекции ВИЧ 1 и ВИЧ 2, синдром иммунодефицита; сифилис, гепатиты В и С, острые инфекционные заболевания, прионы.
Получение костного мозга
Забор материала для последующего выделения клеток осуществляет врач-хирург, имеющий практический опыт проведения данной процедуры. Эксфузия костного мозга производится в операционной посредством пункции дистальной части гребня подвздошной кости под общей или местной анестезией. Пункцию проводят стернальной иглой, забор костного мозга производят шприцем типа «Луер», костномозговую суспензию переносят в мешок с изотоническим антикоагулянтом.
Основные этапы эксфузии костного мозга
1. Производят тщательную дезинфекцию кожи в области дистальной части гребня подвздошной кости.
2. Стернальную иглу, снабженную мандреном и защитником, вкалывают отвесно до упора ее в кость.
3. Равномерным вращательным движением прокалывают костную стенку. Проникновение иглы в костномозговое пространство определяют по ослаблению сопротивления, оказываемого корковым слоем кости.
4. После прокола костной стенки мандрен удаляют, на иглу насаживают точно пригнанный шприц (20 мл), содержащий 100 ME гепарина/мл костного мозга и производят вытягивание поршня.
5. После заполнения шприца требуемым количеством костного мозга полученный эксфузат переносят в мешок донорской системы с изотоническим антикоагулянтом.
6. После изменения положения иглы, если необходимо, повторяют эксфузию до получения требуемого количества костного мозга.
7. В случае необходимости, проводят забор периферической (венозной) крови, используя шприцы объемом 20-50 мл или мешок донорской системы.
8. Образец сопровождается документацией, содержащей сведения, характеризующие данный образец (данные о доноре, идентификационный код, источник, время и условия забора, условия хранения).
9. Полученный образец в стерильном биксе и изотермическом транспортном контейнере доставляют в лабораторию для выделения МССК.
Получение ЛК МНК мобилизованной ПК
Мобилизация ГСК в ПК
С целью увеличения количества СК в ПК донор или пациент получает 8 инъекций Г-КСФ подкожно с интервалом в 10-12 часов в течение 4 дней. Г-КСФ представляет собой медицинский препарат, полученный путем генной инженерии, и является абсолютным аналогом человеческого фактора. В первые три дня доза препарата составляет 2,5 мкг/кг, в последний день доза удваивается. Ежедневно производят общий анализ крови и на 4-5 день делается УЗИ брюшной полости и фиброгастроскопия.
Сбор ГСК и ГКП
Сбор осуществляется на 5 день от начала стимуляции Г-КСФ на сепараторе крови COBE-Spectra с использованием одноразовой системы для сепарации и стандартных растворов. Длительность процедуры 3-4 часа в зависимости от скорости процедуры, веса донора и параметров анализа крови. Процедура проводится путем забора крови из одной вены, обработки ее внутри сепаратора, забора определенного объема СК и возврата остальных компонентов крови донору через другую вену. Венозный доступ осуществляется путем пункции двух периферических вен или через двухпросветный центральный катетер, установленный в подключичную вену на время проведения сеанса. Средний объем собранного материала 300-400 мл. Собранный материал оценивают по двум параметрам - по общему количеству ядерных клеток в сепарате и по количеству CD34+ клеток на килограмм веса больного. Ядерные клетки в сепарате определяются путем подсчета в камере Горяева до проведения каких-либо манипуляций. Процент CD34+ клеток в клеточной суспензии, полученной в ходе цитофереза, определяют методом проточной цитофлуориметрии.
Определение периферических СК и ГКП
Установление субпопуляционного состава CD34+ клеток проводится цитофлуориметрически с применением метода тройной метки (одновременная окраска клеток антителами к трем разным антигенам, нагруженным различными флуорохромными красителями).
Стандартизация препарата
Определение количества клеток-предшественниц проводится цитофлуориметрически, в прямой реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Проводится метод двойной метки, с одновременным окрашиванием клеточного субстрата моноклональными антителами к антигену CD34+ как основному маркеру клеток пула ГСК и к молекуле CD45-, лейкоцитарному антигену, определяющему ГСК. Подобная методика позволяет сразу рассчитать соотношение количества CD34+ клеток и всех ГСК (CD45+) в материале. Для оценки уровней неспецифического связывания часть клеток окрашивают изотипическими контролями. В качестве изотипических контролей стандартно применяются мышиные иммуноглобулины IgG1 изотипа (IgG1), меченые красителями, аналогичными метке используемых моноклональных антител (РЕ, FITC, PerCP).
Подготовка клеточных проб
Перед постановкой реакции клетки ПК и цитоферезного продукта освобождают от примеси эритроцитов путем стандартной процедуры лизиса и последующей отмывки в ЗФР-БСА центрифугированием при 1000 g в течение 5 минут. ЗФР-БСА может быть заменен средой Хенкса или 199.
Методика лизиса эритроцитов
1. Добавить 2 мл лизирующего раствора к 0,2-0,5 мл клеточного осадка, перемешать, инкубировать до тех пор, пока раствор не станет прозрачным (лаковым).
2. Отмыть клетки два раза средой 199 при центрифугировании (1000 g, 5-7 мин).
С выделенными клетками проводят прямую РИФ в 96-луночном планшете, при этом для определения количества клеток в любом материале используется панель из трех лунок - 1) неокрашенные клетки; 2) клетки, окрашенные изотипическими контролями с меткой, соответствующей метке использованных моноклональных антител (МКА); 3) клетки, окрашенные одновременно МКА к антигенам CD34 и CD45.
Следует обратить особое внимание, что МКА к CD34+ предпочтительнее использовать с фикоэритриновой (РЕ) или перидининхлорофиловой (PerCP) метками. Данные флуорохромы имеют более высокий уровень специфического сигнала по сравнению с флуоресцеинизотиоционатом (FITC).
Для определения количества CD34+ клеток оптимальными являются антитела к антигену CD34 клона НРСА-2 (8G12), изотипа IgG1.
Таким образом, стандартная панель имеет вид
1. контроль IgG1 РЕ + контроль IgG1 FITC
2. контроль IgG1 РЕ + МКА к CD45 FITC
3. МКА к CD34 РЕ (НРСА-2) + МКА к CD45 FITC
Постановка РИФ
1. В лунки вносят клетки в количестве не менее 500000 на лунку.
2. Далее в каждую лунку вносят коктейль антител в соответствии с панелью и аккуратно ресуспендируют пипеткой. Каждое МКА берут в количестве 10 мкл на лунку, суммарный объем МКА в лунке - 20 мкл.
3. Клетки инкубируют с антителами в течение 30 минут при 4°С (нижняя полка обычного холодильника).
4. По окончании времени инкубации клетки дважды отмывают от не связавшихся антител путем центрифугирования в течение 5-7 минут при 1000 g.
5. Клетки переносят в специальные пластиковые пробирки для счета на проточном цитометре.
6. Объем клеточной суспензии в каждой пробирке доводят до 200-500 мкл путем добавления к клеткам ЗФР-БСА.
Счет должен быть осуществлен сразу после постановки реакции. Счет и запись на проточном цитофлуориметре
Оценку реакции проводят на проточном 5-параметровом цитометре. Данная схема применима для проточного цитофлуориметра любой конфигурации. CD34+ клетки в ПК представляют собой малую клеточную популяцию. Даже в условиях предварительной стимуляции кроветворения максимальный процент данных клеток составляет 1-3%. Поэтому при подсчете данных клеток в каждой анализируемой пробе следует накапливать не менее 20000 клеточных событий.
Сбор и анализ клеток осуществляется в гейте CD45+ клеток, который включает все ГСК. В данном контексте гейт подразумевает область накопления событий, ограниченную определенными параметрами. В данном случае SSC/ FL-1 (CD45 FITC). То есть, по оси абсцисс (FL-1) на точечной цитограмме будут видны все CD45+ события. По оси ординат (параметр SSC- боковое светорассеяние) клеточные события будут расположены в соответствии с их гранулярностью (цитометрический, а не морфологический термин). Подсчет абсолютного числа CD34+клеток в 1 мкл крови и цитоконцентрата проводили на основании числа лейкоцитов в гемограмме на день исследования.
Принцип определения CD34+ клеток в гемопоэтической ткани. Запись проб
1. Выбор области анализа - гейта. В приборе открыто меню записи клеточных образцов Acquisition. На первом этапе в режиме Setup (режим просмотра клеточного образца без записи) просматриваются пробы №1 (IgG1 РЕ+ IgG1 FITC) и №2 (IgG1 РЕ +CD45 FITC) и выявляются CD45+ события. Данные события расположены правее значений 101 (среднее пороговое значение уровня специфического сигнала для флуоресцеина FITC) по оси абсцисс - FL-1 (CD45+ клетки) и достаточно четко визуализируются по сравнению с контрольной пробой №1. По пробе №1 ограничивается вся область, расположенная правее основной клеточной плотности - гейт, включающий только CD45+ события в пробе №2 и содержащая минимальное количество клеточных событий в пробе №1.
2. Прибор переводится в режим записи образцов (normal), и проба №1 собирается и записывается на 20000 клеточных событий без гейта (вся клеточная популяция). Запись данной пробы в гейте не имеет смысла, так как в ней отсутствуют МКА к CD45 антигену. Как показано выше, данная проба необходима для правильного выбора гейта, содержащего только CD45+ события.
3. Пробы №2 и №3 собираются и записываются в гейте CD45+. Данный гейт идентичен для этих проб (то есть изменения параметров гейта в процессе сбора не происходит). Минимальное количество клеточных событий - 20000 для каждой пробы.
Анализ записанных проб
1. Переходим в меню анализа записанных образцов Analysis. Открываем цитограмму (dot-plot) пробы №2 в параметрах SSC/FL-2, в гейте R1 - CD45+ (гейт выбран нами ранее в момент записи сбора и автоматически перенесен в режим анализа). При этом по оси ординат будет отражен параметр SSC - гранулярность событий, попавших в анализируемый гейт, а по оси абсцисс FL-2 - детектор, отражающий уровни неспецифического связывания для фикоэритринового красителя, выявляемые анителами к иммуноглобулинам мыши IgG1PE.
2. По данной цитограмме устанавливается контрольный маркер таким образом, чтобы в правом нижнем квадранте практически не оказалось клеточных событий. В среднем, для вертикальной планки маркера, значения будут около 130 (правее 102), а для горизонтальной планки маркера средние значения составят 60, что соответствует понятию SSC-low. То есть клетки с минимальным количеством клеточных включений. Таким образом, уровни неспецифического связывания будут равны или близки к нулю.
3. Автоматически переходим к пробе №3. Все показания прибора, принятые для второй пробы, сохраняются. То есть, цитограмма открыта в параметрах SSC/FL-2, сохранен гейт, выбранный ранее при сборе по CD45+ клеточным событиям, и сохранены значения контрольного маркера, установленного по пробе №2. Только на данной цитограмме по оси абсцисс будут отражены не уровни неспецифического связывания, как во второй пробе, а специфичные CD34+ события. Процент CD34+ клеток выводится прибором автоматически.
4. При необходимости, истощение полученного ЛК от αβ Т-клеток (лимфоцитов) производили на стандартном аппарате CliniMACS® plus для иммуномагнитной селекции клеток (оборудование для клинического применения) с использованием специальных антител CliniMACS TCR alpha/beta Kit по стандартным протоколам производителя. Культивирование истощенного ЛК осуществляли по описанной выше методике.
Криоконсервирование ЛК МНК
Традиционный метод криоконсервирования заключается в добавлении ДМСО к клеточной суспензии в конечной концентрации 10% и стандартном замораживании на 1 градус в минуту до -80°С или -120°С с использованием стандартных программ электронного программного замораживателя с последующим хранением в жидком азоте или парах жидкого азота.
Выделение клеточной фракции
Гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП). Сепарированные клетки концентрируются путем центрифугирования при скорости вращения центрифуги 2000 об/мин в минуту в течение 10 мин при +18°С. С помощью ручного плазмоэкстрактора из контейнера максимально удаляется плазма, клетки остаются в объеме 40-60 мл.
Добавление криопротектора
В качестве криопротектора кроветворных клеток используется высокоочищенный ДМСО. К полученным клеткам при постоянном перемешивании добавляют равные объемы полиглюкина и ДМСО. Смешивание ДМСО с полиглюкином происходит по типу экзотермической реакции с выделением умеренного количества тепла. Концентрация ДМСО в полиглюкине - 10-12%. Таким образом, его конечная концентрация в замораживаемом материале составит 5-6%.
Применение полиглюкина позволило снизить количество ДМСО вдвое, до 5-6% конечной концентрации, так как полиглюкин обладает следующими свойствами - во-первых, способностью дезагрегировать клетки и тем самым улучшать проникновение криофилактика в клетки, а во-вторых, полиглюкин (6% декстран) сам по себе является криофилактиком.
Подсчет количества криоконсервируемых клеток
На следующем этапе обязательно производят подсчет ядросодержащих клеток, а также CD 34+ клеток, подлежащих заморозке.
Выбор оптимального объема замораживаемого материала
При криоконсервировании для создания наилучших условий важное значение имеют соотношение объема пластикового контейнера к объему замораживаемого в нем материала и концентрация замораживаемых клеток. Как было установлено, оптимальная концентрация замораживаемых клеток составляет (40-100)×106 клеток в мл.
Замораживание ЛК мобилизованных МНК
В зависимости от конечного объема замораживаемого материала выбирается количество полимерных ампул (20-25) для глубокого программного замораживания. Далее клеточную взвесь переводят в эти термостойкие пластиковые пробирки.
В настоящее время методики криоконсервирования клеточных препаратов предполагают использование электронных программных замораживателей. Для замораживания ампул с клеточной взвесью их помещают в электронный программный замораживатель. Скорость охлаждения биоматериала при температуре от 0°С до -40°С составляет 1,1 градус в минуту, а затем 1 градус в минуту до -80°С или -120°С. После завершения цикла программного электронного замораживания пробирки с замороженным материалом переносят в хранилище для длительного хранения. Затем пробирки с замораживаемым материалом помещают в пары жидкого азота при температуре от -165 до -170°С, где они будут находиться в жидком азоте или его парах до использования.
В предлагаемой методике учтены и реализованы основные требования, предъявляемые к биоматериалу, подвергнутому криоконсервированию, а именно максимальное сохранение жизнеспособности СК, минимальный объем (100-120 мл) замораживаемого материала при максимальном количестве содержащихся клеток (до 100×106/мл), для ПК минимальный объем 50-60 мл; минимальное количество объема аутотрансплантата.
Преимуществами криоконсервирования в парах жидкого азота являются большая безопасность хранения пробирок с клеточным биоматериалом и значительно меньший расход азота;
Культивирование
Жидкая культуральная система состоит из среды Пскова в модификации Дульбекко (Iscove's modified Dulbecco's Medium IMDM, Gibco, UK) с добавлением 0,5 г/л бычьего сывороточного альбумина (Sigma Aldrich), 0,39 мкг/мл человеческого инсулина и 60 мкг/мл трансферрина (Gibco). В культуральную среду добавляют фактор роста стволовых клеток SCF, другое название c-Kit-ligand (c-KitL, R&D Systems), в концентрации 100 нг/мл, а также Flt3-ligand (Flt3L) в концентрации 20 нг/мл (R&D Systems) и иономицин (Sigma Aldrich) в концентрации 0,1 мкМ/мл
Способ культивирования ЛК МНК ПК. Клетки культивируют при 37°С во влажной атмосфере с притоком 5% СО2. Свежую среду и цитокины добавляют каждый третий день. Время культивирования составляет 3-7 дней. Использованные факторы роста способствуют пролиферации СК, при этом не нужно добавлять агенты, подавляющие дифференцировку. Получаемые суспензии СК любого индивидуума могут быть сохранены в замороженном виде либо могут быть введены в БМКП непосредственно после культивирования и применены больным.
Заключение: Материал сохранный. На основании данных проточной цитометрии возможные для анализа лимфоциты составляют 84,7%. Среди них зрелые Т-клетки составляют 81,2% с преобладанием CD4+ субпопуляций, γδ-Т-клетки составили 1,2%. Гетерогенные NK-клетки представлены популяциями CD94+, CD16+, CD56- и CD94-, CD56+, CD16- и CD16++, CD56++, суммарно составляющими 14,0% от лимфоцитов. Популяции CD16+, CD56low не выявлено
Получение предложенного компонента БМКП, позволяющего культивировать СК с цитокинами, которые способствуют пролиферации, но не дифференцировке СК, открывает перспективы для применения собственных СК больного для лечения таких заболеваний, как ишемическая болезнь сердца, ожоги, долго незаживающие раны и травмы конечностей, травмы спинного и головного мозга. Аутологичные СК могут быть выделены и храниться в замороженном виде, чтобы быть использованы в случае острой необходимости. При этом способность к последующей дифференцировке у таких культивируемых клеток сохранена на уровне первоначально выделяемых СК.
Криоконсервация клеточного материала
К охлажденной суспензии клеток в аутологичной плазме добавляют стерильный раствор ДМСО до конечной концентрации 10%. Суспензию расфасовывают в необходимое количество криопробирок, маркируют, упаковывают и замораживают.После замораживания криопробирки переносят в сосуд Дьюара для хранения в парах азота.
Использование клеточного материала для трансплантации
Материал, предназначенный для трансплантации, отмывают от среды культивирования физиологическим раствором и переводят в 200 мл физиологического раствора с 10 ед\мл гепарина. Транспортировку клеточного материала осуществляют на льду в термоизолированном контейнере. Клеточный материал вводят пациенту внутривенно с использованием трансфузионной системы в течение 1 ч. За 10 мин до начала процедуры пациент получает 4 мг метипреда.
Компонент В. Предложенный БМКП изготавливали ex tempore путем смешивания в стерильных условиях размороженных на водяной бане клеток компонента А с компонентом Б и компонентом В виде 0,9% физиологического раствора NaCl или (и) гетерогенного биополимерного матрикса, например, матрикса «СфероГель».
Предложенный БМКП «ГемаКомб» на физиологическом растворе может вводиться подкожно, внутримышечно, внутривенно, внутриартериально, интратекально, а на основе указанного матрикса - в паренхиму тканей путем внутритканевых инъекций и имплантаций.
Изобретение позволяет применять БМКП «ГемаКомб» как терапевтическое и профилактическое противоопухолевое средство выбора при реабилитации онкологических больных после лучевой терапии и химиотерапии, у больных с повреждением и заболеваниями центральной нервной системы, при системных заболеваниях и дегенеративных процессах в органах и тканях, при органной и полигландулярной недостаточности, а также для улучшения качества жизни геронтологических и соматически ослабленных больных и продления их жизни.
Пример. Данные фенотипического анализа МНК в одном показательном эксперименте, проведенном на клетках ЛК донора Н.
Подготовка БМКП к трансфузии и его применение. Размораживание компонентов
Размораживание компонентов А и Б производится непосредственно перед трансплантацией или трансфузией в процедурном кабинете на водяной бане при температуре 37-40°С до момента перехода замороженного материала в жидкую фазу. В дальнейшем путем центрифугирования при 1500 об/мин каждый используемый компонент осаждают на дно центрифужной пробирки, отсасывают надосадочную жидкость и заливают 1 мл 0,9% физиологического раствора NaCl или трансфузируют в гетерогенный биополимерный коллагеновый матрикс. Процедуру повторяют дважды. Компоненты А и Б препарата в размороженном состоянии могут применяться в течение 6 часов после приготовления. Если препарат за это время не использован, то он подлежит утилизации.
Внутривенная или внутриартериальная трансфузия БМКП «ГемаКомб»
Внутривенное или внутриартериальное введение БМКП производится путем стандартного внутривенного или внутриартериального медленного болюсного введения препарата от одной до 20 биодоз, разведенных в 0,9% физиологическом растворе NaCl.
Интратекальное введение БМКП
Интратекальное введение препарата «ГемаКомб» должно производиться только в условиях реанимационного отделения. Трансфузия препарата осуществляется через люмбальный прокол, выполненный в типичном месте (в L3-L4 промежутке) под местной анестезией 1% раствора лидокаина. Затем забирают 3 мл ликвора и смешивают с одной или двумя биодозами клеточного препарата (максимальный объем до 3 мл), ресуспензируют клеточный препарат в ликворе и медленно вводят в субарахноидальное пространство. Накладывают асептическую повязку. При необходимости повторяют интратекальные трансфузии препарата «ГемаКомб», но не ранее чем через 7 дней после цитотранфузии. Для коррекции возможных аллергических реакций с профилактической целью делается однократное внутримышечное введение кортикостероидных препаратов (4 мг дексаметазона).
Основными критериями эффективности проведенного вмешательства является улучшение клинической симптоматики. Срок ожидаемого результата крайне индивидуален для каждого пациента и зависят от объема повреждения органа, давности травмы, степени компенсации нарушенных функций. Эффективность терапии варьирует от 1-3 дней до 12-16 месяцев после трансфузии, и оценивается клиническими шкалами и электрофизиологическими методами исследования (ЭКГ, церебральным картированием ЭЭГ, транскраниальной магнитной стимуляцией, соматосенсорными вызванными потенциалами и электонейромиографией, а также комплексным уродинамическим исследованием и т.д.).
Возможные осложнения и способы их устранения
Не было отмечено ни одного факта осложнения в результате инфузий БМКП «ГемаКомб» в кровь и ликвор онкологических пациентов, что связано с применением аутологичного биоматериала и иммуносовместимого аллогенного материала, подобранного по иммунофенотипу крови. Однако теоретически возможны аллергические реакции на криопрофилактик ДМСО в случае его недостаточной отмывки перед употреблением. Способы устранения подобных аллергических реакций являются стандартными. Для профилактики возможных аллергических реакций пациента на трансфузию препарата целесообразно за 20 минут до манипуляции произвести однократное внутримышечное введение препарата «Дексометазон» в дозе 4 мг/мл.
Эффективность БМКП «ГемаКомб» в лечении онкологический заболеваний
Анализ эффективности препарата «ГемаКомб» проверяли на различных группах онкологических пациентов и сравнивали с эффективностью обычного ЛК мобилизованных ГСК, применяемого для восстановления гемопоэза при трансплантации костного мозга.
Характеристика взрослых онкологических больных (1 группа). Средний возраст взрослых больных составил 33 года (медиана 32 года, от 16 до 64 лет), вес пациентов варьировал от 43 до 113 кг. Среди пациентов преобладали мужчины - 113 человек, женщины - 54 человека (32,3%). Распределение больных представлено в таблице 2.
В экспериментальной группе преобладали больные с онкогематологической патологией (158 человек, 94,6% от общего числа больных). Незначительную число составили больные с негемопоэтическими опухолями (всего 5,3%, 9 человек). Во всех случаях для мобилизации СКК у взрослых использован Г-КСФ. Предлеченность у взрослых больных варьировала от 2 до 22 курсов химиотерапии. Химиотерапевтические режимы, предшествующие введению ростовых факторов, варьировали в зависимости от диагноза больного. Так, в случае лимфом Ходжкина и в нескольких случаях НХЛ использованы схемы DEXA-BEAM и ВЕАСОРР. В ряде случаев В-клеточных лимфом у взрослых использованы схемы с ритуксимабом (R-СНОР). При лимфоме Ходжкина также в нескольких случаях применены схемы CHOP. При множественной миеломе назначению ростовых факторов предшествовала схема VAD, при раке молочной железы - CAF. Курсы лучевой терапии прошли 22 пациента.
Характеристика доноров для приготовления аллогенной формы препарата
Для приготовления препарата «ГемаКомб» был использован 61 образец ЛК, полученного у 50 доноров при наборе кроветворной ткани для аллогенной трансплантации 47 пациентам. Перед сборами донорам проводили мобилизацию ГСК с использованием стандартного протокола стимуляции в монорежиме: ростовые факторы без химиотерапии (Г-КСФ в первый - третий дни по 5,0 мкг/кг веса дважды, четвертый день по 10,0 мкг/кг веса дважды). Наиболее частой была трансплантация от матери к дочери (19 процедур), от матери к сыну - 14 трансплантаций, от отца к сыну - 9 трансплантаций и от отца к дочери - 5 трансплантаций. Выбор донора при родственной трансплантации определялся в первую очередь совместимостью, состоянием здоровья потенциальных доноров и возрастом. При равных прочих условиях для отца и матери предпочтение отдавалось матери ввиду существования феномена «фетоматеринского химеризма». Средний возраст доноров составил 34 года (от 17 до 48 лет), преобладали женщины (36 женщин и 14 мужчин).
Произведена 51 трансплантация СК, из которых 31 это гаплотрансплантации (частично совместимые) и 20 аллогенных родственных трансплантаций. Восстановление гемопоэза и проявлений токсичности после химио- и лучевой терапии провели на основе БМКП «ГемаКомб» у 164 пациентов.
Набор материла для полноценной трансплантации (то есть не менее 2,0×106 CD34+ клеток на кг массы тела реципиента) для большинства пациентов осуществляли за 1 сеанс лейкофереза.
Для 8 пациентов материал полноценной трансплантации был набран за 2 сеанса лейкофереза, в одном случае потребовалось 3 последовательных процедуры сбора СК. Для 7 пациентов количество трансплантированных CD34+ клеток составило менее 2,0×106 на кг массы тела реципиента (от 0,1 до 1,93)×106. Тем не менее, трансплантации были выполнены.
Иммунологическая характеристика препарата для трансплантации костного мозга и БМКП «ГемаКомб»
Оценка количества СК и характеристика их субпопуляций проводилась в образцах ПК накануне проведения процедуры цитофереза и непосредственно в образцах лейкоферезного продукта. У большинства пациентов количество ГСК в образцах ПК оценивалось накануне или в день первой процедуры лейкофереза.
Оценка качества трансплантационного материала осуществлялась иммунологически в реакции прямой иммунофлуоресценции с учетом данных на проточном цитометре.
Непосредственно после процедуры лейкофереза в образцах проводился подсчет CD34+ клеток, а также зрелых Т-клеток (CD3+), у части доноров проводилась также оценка количества субпопуляций Т-лимфоцитов (CD8, CD4) и числа NK-клеток (CD56).
Оценку количества СК CD34+ осуществляли на основании ISHAGE-протокола в реакции двойной иммунофлуоресценции с использованием прямых конъюгатов моноклональных антител к антигену СК CD34 и общелейкоцитарному антигену CD45. Флуорохромные метки и клоны используемых антител указаны в таблице 3.
Для оценки субпопуляций CD34+ клеток, в том числе неэкспрессирующих общелейкоцитарный антиген, ISHAGE-протокол был модифицирован. Подсчет количества МССК CD34+ проводили на всю клеточную популяцию образца, а затем полученный процент CD34+ клеток пересчитывали на лейкоциты (CD45+ клетки) в зависимости от их количества в пробе. Субпопуляционный состав ГСК оценивали в пределах CD34+ клеток с использованием тройной флуоресцентной метки.
Была оценена пропорция ранних предшественников по экспрессии линейно-неограниченных антигенов (HLA-DR, CD38, CD71), маркеров ранних этапов дифференцировки (CD117, CD90) и молекул клеточной адгезии (CD50, CD56, CD45). А также количество линейно-коммитированных ГСК: миелоидных (антигены CD13, CD33), лимфоидных (CD7, CD19) мегакариоцитарных (CD61) и эритроидных предшественников по экспрессии антигена клеток красного ряда гликофорина (CD236a).
На основании проанализированных в работе антигенов, с высокой долей вероятности были охарактеризованы направление дифференцировки и оценено количество полипотентных и бипотентных (миелоидных CD13+, CD33+) или лимфоидно-коммитированных (В-линия - CD19+, CD34+, Т-линия - CD7+, CD34+) стволовых кроветворных клеток, а также СК с мегакариоцитарной направленностью дифференцировки (CD61+).
Популяция клеток-предшественников эритроидной направленности дифференцировки (CD71+, CD236a+) среди образцов данной анализируемой группы была очень незначительной и анализ данной субпопуляции не проводился.
Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием программы SPSS версия 17 для Windows. При обработке материала использованы функция частот для описания последовательных рядов переменных, средних значений, медианы, стандартной ошибки средних значений и вариабельности значений переменных, функция бивариантных корреляций для определения коэффициента корреляции двух независимых переменных (корреляция достоверна при р≤0,05), функции сравнения средних значений независимых и зависимых переменных (доверительный интервал 95% и выше), функция кодирования переменных в соответствии с интервалами значений выбранной переменной.
Полученные результаты показали, что лучший эффект стимуляции на основании количества CD34+ лейкоцитов отмечен у больных с множественной миеломой и НХЛ в сравнении с лимфомой Ходжкина. Образцы с максимальным количеством CD34+ лейкоцитов характеризовались более низкой пропорцией CD34+CD38+, CD34+CD33+и CD34+CD7+ СКК. В 35 случаях в качестве трансплантационного материала у взрослых больных использовались только клетки ПК (30 больных - 30 первых трансплантаций и 5 повторных; дозы, набранной за один цикл лейкофереза, хватило на повторную трансплантацию у больных с множественной миеломой, в соответствии с клиническим протоколом). В 9 случаях в качестве гематологической поддержки была проведена трансплантация клеток ПК в виде препарата «ГемаКомб». В 30 случаях использовался только БМКП «ГемаКомб».
В целом по группе больных, которым трансплантировались только периферические СК, средняя скорость восстановления тромбоцитов до 20000 клеток/мкл составила 14,26±1,14 дня при медиане 12 дней и разбросе от 9 до 59 дней. Средняя скорость восстановления нейтрофилов до 500 клеток/мкл составила 12,2±0,3 при медиане 12 дней и разбросе от 7 до 24 дней.
Сроки восстановления гемопоэза у 30 больных, получавших «ГемаКомб» были короче, чем при обычной трансплантации (лейкоциты - 12 дней (БМКП «ГемаКомб») против 14 дней (пуповинные ГСК), тромбоциты 14 дней (БМКП «ГемаКомб») против 18 дней (пуповинные ГСК). Различия статистически недостоверны, скорее всего, из-за разницы в количестве случаев - 35 трансплантаций пСКК против 30 БМКП «ГемаКомб».
Достоверно более быстрое восстановление нейтрофилов выявлено при применении БМКП «ГемаКомб» в сравнении с трансплантацией части набранных ГСК, несмотря на меньшую трансплантированную дозу ГСК (3,5×106/ кг против 6,2×106/кг, р=0,001).
Более короткие сроки критической тромбоцитопении ассоциированы с большей дозой CD34+CD71++ и CD34+CD13+ ГСК (р<0,03), более короткий период критической нейтропении отмечен при большей пропорции CD34+CD71++ГСК и CD34+CD19+ГСК (р<0,035), что было характерно для применения препарата «ГемаКомб». Более короткие сроки тромбоцитопении были обусловлены невысоким содержанием в материале первого дня сбора CD34+CD61+СКК. Эффективность БМКП «ГемаКомб» для коррекции критической тромбоцитопении была очевидна и статистически достоверной (р<0,05) по сравнению с обычной трансплантацией клеток.
Оптимальной суммарной дозой трансплантированных ГСК в БМКП «ГемаКомб», обеспечивающей у взрослых больных восстановление нейтрофилов и тромбоцитов в течение не более 11 дней с момента трансплантации, является (3,0-5,0)×106 CD34+ клеток, содержащих более 1,0106 на кг CD34+CD45low ГСК. Присутствие CD34+CD45- субпопуляции ГСК в количестве 15% и более от суммарного пула ГСК обеспечит восстановление нейтрофилов в течение 10 дней, см. таблицу 4.
Существенным является количество миелоидно-рестриктированных CD33+ ГСК в БМКП «ГемаКомб», меньшее количество которых в трансплантате сопряжено с более короткими сроками восстановления нейтрофилов. Сокращение критической тромбоцитопении до 10 дней обусловлено присутствием среди трансплантируемых ГСК более 35,0% CD34+Thy-1+ клеток и более 5,0% CD34+CD7+ ГСК.
Таким образом, применение для лечения онкологических пациентов препарата БМКП «ГемаКомб» может рассматриваться как метод выбора терапии осложнений после химиотерапии, лучевой терапии, сочетающийся с реабилитационной терапией. Предложенный метод лечения БМКП «ГемаКомб» на сегодня является достаточно эффективным и безопасным способом лечения онкологических больных, что может привести к реальному улучшению не только их состояния, но и социальной реабилитации в обществе. Показана более высокая эффективность применения БМПК «ГемаКомб» при реабилитации онкологических больных после лучевой и химиотерапии, а также применении у ослабленных и геронтологических пациентов Экономическая эффективность применения БМКП «ГемаКомб» пациентам по сравнению только с аутологичными ГСК в ЛК мобилизованных МНК костного мозга очевидна и не вызывает сомнения. Возвращение пациентов к нормальной общественно-социальной деятельности, реабилитация онкологических больных после лучевой и химиотерапии, улучшение качества жизни ослабленных и геронтологических больных, даже при небольшом улучшении качества их жизни несет в себе большую экономическую целесообразность и социальную обоснованность, как с учетом возобновления трудовой деятельности, так и с учетом уменьшения затрат на длительное и малоэффективное фармакологическое лечение и только физическую реабилитацию.
Эффективность применения препарата «ГемаКомб» при неврологических заболеваниях
Анализ эффективности препарата «ГемаКомб» основан на клиническом исследовании и ретроспективном многолетнем изучении 2780 историй болезни 458 пациентов с различными органическими заболеваниями ЦНС, проходивших многолетнее стационарное экспериментальное лечение в клинике восстановительной интервенционной неврологии и терапии «НейроВита» (Россия, г. Москва) с сентября 2002 года по март 2016 года в рамках отраслевой программы Российской академии медицинских наук «Новые клеточные технологии - медицине» (руководитель программы академик РАМН проф. В.К. Ярыгин, координатор исследований проф. А.С. Брюховецкий). Распределение больных по нозологиям нервных болезней представлено в таблице 5.
Распределение больных по возрасту и полу и области повреждения спинного мозга представлены в таблице 6.
Как видно из представленных материалов, в клиническом исследовании принимали участие пациенты разных возрастных групп. Исследователи постарались, чтобы контрольная группы коррелировали по возрасту с экспериментальной группой. Так получилось, что в контрольную группу вошли только одни мужчины, но тендерный признак практически не повлиял на результаты исследования.
Был проведен анализ применения различных стратегий применения СК и технологий регенеративной медицины у больных с различными неврологическими заболеваниями. Распределение больных в зависимости от стратегии применения технологий регенеративной медицины (консервативная, хирургическая и комбинированная) представлены в таблице 7. Как видно из таблицы 7, основная стратегия клинического применения СК была стратегия клеточной терапии, которая составила 72,4%, тканевая инженерия в изолированном виде применялась только в 13,8%, а в 13,7% случаев исследовали комбинировали и дополняли тканевую инженерию клеточной терапией.
Больные с различными неврологическими заболеваниями, включенными в программу, находились под постоянным динамическим наблюдением и изучались в течение 3-8 лет, проходя контрольные стационарные обследования через каждые 3 месяца с обязательным проведением клинического обследования, включающего в себя неврологический осмотр, МРТ головного мозга (ГМ) или спинного мозга (СМ) с контрастным усилением (у 50 пациентов с травматической болезнью СМ проведена трактография проводящих путей ГМ и СМ на основе диффузно-тензорного исследования), нейрофизиологическое обследование в виде электронейромиографии, электронейромиографии с соматосенсорными вызванными потенциалами, тестовые исследования по разным шкалам (шкала ASIA, шкала FIM), рентген-контроль коленных и тазобедренных суставов в соответствии с существующим протоколом научных исследований, утвержденным ученым советом и этическим комитетом Российского государственного медицинского университета им Н.И. Пирогова (РГМУ). Все промежуточные и заключительные отчеты по данным исследованиям ежегодно предоставлялись в ректорат РГМУ и Министерство здравоохранения РФ. Для лечения разных типов повреждений нервной ткани ГМ и СМ применялись различные виды клеточных препаратов: препарат мобилизованных из костного мозга ГСК и ГКП (CD34+, CD45-) (производитель препарата - Российский онкологический научный центра им Н.Н. Блохина), препарат нейральных СК (CD 133+), выделенных из обонятельной выстилки пациента (производитель препарата - Государственный научный центр социальной и судебной психиатрии им. В.П. Сербского) и препарат МССК, выделенных из костного мозга пациента (производитель препарата - Федеральный научно-клинический центр ФМБА России). Весь клеточный материал был стандартизирован и сертифицирован государственными научно-исследовательскими учреждениями, и государственные сертификаты качества материала вклеивались в историю болезни пациентов.
Оценка эффективности клеточной терапии во многом зависела от нозологической принадлежности заболевания и целей применения СК. Анализ результатов эффективности при различных нозологиях болезней ЦНС представлен в таблицах 8, 9.
По результатам ранних исследований авторов, эффективность применения препаратов СК в режиме клеточной терапии наиболее эффективная и составляет до от 35 до 56% (Брюховецкий А.С., 2003). В данном исследовании показано, что терапия эффективна в 55,4% случаев, а высокоэффективная клеточная терапия отмечена в 15,1% наблюдений Эффективность тканевой инженерии и биоинженерии составляет около 41-49.6%. Повысить эффективность технологий регенеративной медицины выше 56% пока что не удалось, несмотря на разнообразие применения различных клеточных препаратов. При этом применение клеточных препаратов оказалось достаточно безопасно.
Перечень используемых сокращений
РЕ - фикоэритриновая метка
PerCP - перидининхлорофиловая метка
БАС - боковой амиотрофический склероз
БМКП - биомедицинский клеточный продукт
ГКП - гемопоэтические клетки-предшественники
Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор
ГМ - головной мозг
ГСК - гемопоэтические стволовые клетки
ДМСО - диметилсульфоксид
КП - клетки-предшественники
КСФ - колониестимулирующий фактор
ЛК - лейкоконцентрат
МГБ - мультиформная глиобастома
МКА - моноклональные антитела
МНК - мононуклеарные клетки
МССК - мезенхимальные стромальные стволовые клетки
МСКП - мезенхимальные стромальные клетки-предшественники
НХЛ - неходжкинские лимфомы
ОК - опухолевые клетки
ОМЛ - острый миелоидный лейкоз
ПК - периферическая кровь
ПовК - поврежденные клетки
РИФ - реакция иммунофлуоресценции
РНК - рибонуклеиновая кислота
РСК - раковые стволовые клетки
СК - стволовые клетки
СМ - спинной мозг
ЦНС - центральная нервная система.
Группа изобретений относится к медицине, в частности к онкологии и неврологии и может быть использована в лечении злокачественных новообразований и неврологических заболеваний. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для лечения онкологических или неврологических заболеваний содержит линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+, выделенных из нативного костного мозга или жировой ткани и культивированных in vitro в среде, способствующей мезенхимальной дифференцировке (компонент А), неманипулированные аутологичные или аллогенные мобилизованные мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из лейконцентрата периферической крови (ЛК ПК), очищенные от плазмы крови, эритроцитов и гранулоцитов (компонент Б), и вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды (компонент В) при следующем соотношении компонентов (об.% от общего количества БМКП): компонент А - 1-19,5; компонент Б - 79,5-90; компонент В - остальное. Группа изобретений относится также к способу получения ex tempore указанного биомедицинского клеточного продукта и его применению для лечения онкологических и неврологических заболеваний. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 9 табл., 1 ил.
1. Биомедицинский клеточный продукт (БМКП) для лечения онкологических или неврологических заболеваний, содержащий линию аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+, выделенных из нативного костного мозга или жировой ткани и культивированных in vitro в среде, способствующей мезенхимальной дифференцировке (компонент А), неманипулированные аутологичные или аллогенные мобилизованные мононуклеарные клетки (МНК), выделенные из лейконцентрата периферической крови (ЛК ПК), очищенные от плазмы крови, эритроцитов и гранулоцитов (компонент Б), и вспомогательное вещество в виде стерильной трансфузионной среды (компонент В) при следующем соотношении компонентов (об.% от общего количества БМКП):
компонент А - 1-19,5;
компонент Б - 79,5-90;
компонент В - остальное.
2. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что компонент Б содержит αβ Т-клетки, γδ Т-клетки, NК- и NKT-клетки, В1- и В2-клетки, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+, HLA DR+, гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) с маркерами CD34+, CD45-, HLA DR-, МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и МСКП с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+ при следующем соотношении компонентов (об.% от общего количества компонента Б):
αβ Т-клетки - 55-60;
γδ Т-клетки - 10-15;
NК- и NKT-клетки - 15-20;
В1- и В2-клетки - 10-15;
ГСК и ГКП - 1,5-2,5;
МССК и МСКП - 1,5-2,5.
3. БМКП по п. 1, отличающийся тем, что компонент Б содержит αβ Т-клетки, γδ Т-клетки, NК- и NKT-клетки, В1- и В2-клетки, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) с маркерами CD34+, CD45+, HLA DR+, гемопоэтические клетки-предшественники (ГКП) с маркерами CD34+, CD45-, HLA DR-, МССК с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и МСКП с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+, причем компонент Б частично очищен от αβ Т-клеток при следующем соотношении компонентов (об.% от общего количества компонента Б):
αβ Т-клетки - 30-55;
γδ Т-клетки - 15-20;
NК- и NKT-клетки - 17-30;
В1- и В2-клетки - 10-15;
ГСК и ГКП - 1,5-2,5;
МССК и МСКП - 1,5-2,5.
4. БМКП по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве вспомогательного вещества использован 0,9%-ный физиологический раствор NaCl с гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) в объеме 5-100 об.%. от объема физиологического раствора NaCl.
5. БМПК по одному из пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве вспомогательного вещества использован биодеградируемый полимерный матрикс с трансфузированным в нем гранулоцитарным колониестимулирующим фактором (Г-КСФ) в объеме 5-20 об.% от объема матрикса.
6. БМПК по п. 1, отличающийся тем, что алогенные МНК иммуносовместимы по группе крови, резус-фактору и иммунофенотипу крови.
7. Способ получения ex tempore биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-6, включающий в себя:
получение линии аутологичных или иммуносовместимых аллогенных мезенхимальных стромальных стволовых клеток (МССК) с маркерами CD10+, CD13+, CD44+, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34-, CD45- и CD117- и мезенхимальных стромальных клеток-предшественников (МСКП) с маркерами CD10+, CD13+, CD44-, CD90+ (Thy-1), CD105+, CD34+, CD45+ и CD117+ путем выделения этих клеток из нативного костного мозга или жировой ткани и дальнейшего культивирования in vitro в среде, способствующей мезенхимальной дифференцировке (компонент А),
получение неманипулированных аутологичных или аллогенных мобилизованных мононуклеарных клеток (МНК) путем их выделения из лейконцентрата периферической крови (ЛК ПК) с последующей очисткой от плазмы крови, эритроцитов и гранулоцитов (компонент Б) и
смешивание ex tempore компонентов А, Б и вспомогательного вещества в виде стерильной трансфузионной среды (компонент В) при следующем соотношении компонентов (об.% от общего количества БМКП):
компонент А - 1-19,5;
компонент Б - 79,5-90;
компонент В - остальное.
8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что полученные компоненты А и Б криоконсервируют, а перед их смешиванием ex tempore с компонентом В размораживают.
9. Применение биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-6 для лечения онкологических заболеваний.
10. Применение биомедицинского клеточного продукта по любому из пп. 1-6 для лечения неврологических заболеваний.
| ПРЕПАРАТ АУТОЛОГИЧНЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, КРИОКОНСЕРВАЦИИ И ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТРАВМАТИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ | 2005 |
|
RU2283119C1 |
| БИОТРАНСПЛАНТАТ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЗАДЕРЖКИ ПСИХИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ | 2006 |
|
RU2303462C1 |
| Биомедицинский клеточный препарат | 2017 |
|
RU2647429C1 |
| US 20170198257 A1, 13.07.2017 | |||
| WO 2015145370 A1, 01.10.2015 | |||
| US 20140341863 A1, 20.11.2014 | |||
| J | |||
| DE LA RUBIA et al | |||
| Autologous blood stem cell transplantation for acute myeloblastic leukemia in first complete remission | |||
| Intensification therapy before transplantation | |||
