СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ АНТИДИАБЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/16 A61P3/10 C12N15/27 C12N5/02 

Изобретение относится к области экспериментальной медицины и может быть использовано для создания нового антидиабетического препарата.

На сегодняшний день известно, что негликозилированные формы рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (нейпоген, филграстим) обладают широким спектром действия на различные типы клеток, включая гемопоэтические клетки-предшественники нейтрофилов, зрелые нейтрофилы, некоторые злокачественные клетки, а также способны вызывать мобилизацию стволовых клеток костного мозга в периферическую кровь [1, 2].

Используемое нами оригинальное средство негликозилированной формы рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора из E.coli было разработано и получено в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» совместно с ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН [3].

По своей структуре это соединение представляет собой белок, состоящий из 174 аминокислот, с молекулярной массой 19,6 кДа.

Нами впервые выявлена его антидиабетическая активность.

Ранее было показано наличие антидиабетического эффекта на фоне проведения традиционной комплексной сахароснижающей терапии у препарата граноцит [4], представляющего собой кислый гликопротеин (продуцируемый клетками культуры яичника золотистого хомячка), от которого используемое нами средство по структуре отличается тем, что оно не гликозилировано и содержит дополнительный остаток метионина на N-конце.

Учитывая вышеперечисленные данные, мы предположили наличие антидиабетической активности у аналога граноцита - негликозилированной формы рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, получаемого из E.coli более экономически выгодным и менее трудоемким путем.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств с антидиабетической активностью.

Новым в предлагаемом изобретении является применение негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора для эффективной терапии экспериментального сахарного диабета.

Заболевания поджелудочной железы являются весьма распространенными во всем мире и занимают значительное место в структуре заболеваемости, смертности и инвалидизации населения нашей страны. Особую опасность для здоровья и социальную значимость патологии данного органа представляет сахарный диабет. При этом на сегодняшний день способов радикального излечения от данного заболевания не существует. Пациентам приходится постоянно, в течение всей жизни, принимать заместительную гормональную терапию либо другие сахароснижающие препараты. Вместе с тем, благодаря современному развитию клеточных технологий появилась возможность поиска новых средств терапии [2, 5], в том числе заболеваний поджелудочной железы, способных путем модификации функций эндогенных стволовых клеток оказывать лечебный эффект. При этом согласно имеющимся представлениям негликозилированный рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор наиболее эффективно способен влиять на функциональные свойства эндогенных стволовых клеток при его подкожном введении в дозе 125 мкг/кг в течение 5 дней [2].

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют проводить эффективную терапию сахарного диабета, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему чертежей:

на фиг.1 - гистологический препарат ткани поджелудочной железы, содержащей островок Лангерганса при введении аллоксана (21-е сут опыта), окраска гематоксилин-эозин, ув. 600×; на фиг.2 - гистологический препарат ткани поджелудочной железы, содержащей островок Лангерганса при введении аллоксана на фоне назначения негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (21-е сут опыта), окраска гематоксилин-эозин, ув. 600×.

Эксперименты были проведены на мышах линии CBA/CaLac в количестве 215 шт., массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Оценку состояния эндокринного аппарата поджелудочной железы животных производили по регистрации уровня глюкозы в периферической крови и с помощью морфологического исследовании органа.

Содержание глюкозы определяли утром натощак на 11-е и 21-е сут опыта с помощью глюкометра «Optilite» (Венгрия) и прилагаемых к нему полосок «Optilite test strip».

Для морфологического исследования на 8, 11, 15, 21-е сут эксперимента часть поджелудочной железы, прилегающую к селезенке, фиксировали в 10% растворе формалина и заливали в парафин. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На срезах определяли площадь 10 последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа, посчитывали в них общее количество клеток, число пикнотизированных клеточных элементов и вычисляли содержание клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных клеток.

С целью исследования механизма действия средства изучали состояние различных пулов стволовых клеток: количество мехенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге и периферической крови на 8-е сут эксперимента [6] и динамику содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе на 8, 11, 15, 21-е сут. Количество регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе определяли путем культивирования ее клеточной взвеси в 24-луночных планшетах в культуральной среде следующего состава: 80% среды DMEM, 20% неинактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 10 г/л глюкозы, 500 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина, 5000 МЕ/л гепарина, 50 мг/л инсулина, 10 нг/мл фактора роста стволовых клеток, 30 нг/мл эпидермального фактора роста, 10 нг/мл лейкозингибирующего фактора, 10 нг/мл интерлейкина-6, 10 нг/мл фактора роста фибробластов и инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 21 сут. После чего с помощью бинокулярного микроскопа МБС-9 (ув. 56×) подсчитывали число многоклеточных (более 30 клеток) ацинусоподобных образований - клоногенных единиц.

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Экспериментальной моделью сахарного диабета служил хронический аллоксановый диабет. У мышей диабет моделировали подкожным введением 1-водного аллоксана по следующей схеме: в течение 4-х дней ежедневно по 300 мг/кг, затем еще раз в той же дозе на 7-й день после последнего введения в объеме 0,2 мл/мышь. Опытным животным с 3-х сут после начала моделирования диабета подкожно 1 раз в день в течение 5 дней вводили 125 мкг/кг негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, растворенного в 0,2 мл растворителя. Контрольным животным по той же схеме в эквивалентном объеме вводили дистиллированную воду.

В ходе эксперимента введение аллоксана приводило к пикнозу значительной части клеток островков Лангерганса, наблюдаемому во все сроки исследования. Кроме того, отмечались выраженные явления отека и гиперемии эндокринного аппарата с развитием значительной лимфомакрофагальной инфильтрации ткани (табл.1; фиг.1). Закономерным отражением морфологических изменений со стороны поджелудочной железы явилось значительное возрастание содержания глюкозы в периферической крови и развитие гипергликемии (табл.2)

При этом курсовое введение негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора после моделирования аллоксанового диабета приводило к достоверному снижению процента пикнотизированных клеток в островках Лангерганса на 11, 15-е сут опыта на фоне уменьшения общего количества клеток на единицу площади островка в результате значительного снижения инфильтрации островков (см. табл.1; фиг.2). Описанная патоморфологическая картина сопровождалась нормализацией уровня глюкозы в крови (см. табл.2)

Таблица 1
Динамика содержания пикнотизированных клеток в островке Лангерганса в % (А) и общее количество клеток на единицу площади островка (Б), (Х±m)Сроки исследования (сутки)Контроль (аллоксановый диабет)Используемое средствоАБАБинтакт3,88±0,230,75±0,043,88±0,230,75±0,048-е16,18±0,89*0,75±0,0314,32±1,23*0,79±0,0611-е14,35±0,94*0,77±0,038,44±0,49*#0,61±0,02#15-е12,8±1,06*0,74±0,037,9±0,23*#0,83±0,1221-е11,8±1,97*0,9±0,0713,39±0,55*0,77±0,12* Отмечена достоверность относительно интактных животных при р<0,05.
# Отмечена достоверность относительно животных с аллоксановым диабетом при р<0,05

Таблица 2
Уровень содержания глюкозы в периферической крови, ммоль/л (Х±m)Сроки исследования (сутки)Контроль (аллоксановый диабет)Используемое средствоинтакт3,16±0,3911-е17,11±1,15*4,6±0,72#21-е13,03±0,9*4,97±0,98#* Отмечена достоверность относительно интактных животных при р<0,05.
# Отмечена достоверность относительно животных с аллоксановым диабетом при р<0,05

При исследовании возможных механизмов действия выявленной высокой эффективности негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при экспериментальной терапии сахарного диабета в контрольной группе было обнаружено отсутствие изменений со стороны костномозгового и циркулирующего пулов истинных (мезенхимальных) стволовых клеток. Более того, на протяжении всего эксперимента отмечалось выраженное падение содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе (табл.3). Вместе с тем исследование возможной стимуляции данных компенсаторно-приспособительных механизмов при моделировании сахарного диабета с помощью введения негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора выявило значительное повышение МСК в периферической крови (до 325,0% от фона на 8-е сут) при снижении количества данных элементов в костном мозге. В целом указанные сдвиги в состоянии пула стволовых клеток гемопоэтической ткани и периферической крови, свидетельствующие о мобилизации и миграции МСК, сопровождались их хомингом в поджелудочную железу, что проявлялось в возрастании количества регионарных стволовых клеток на 11-е сут опыта при назначении негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (см. табл.3).

Таблица 3
Количество мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге, на 10 миелокариоцитов (А), в периферической крови, на 10⁶ мононуклеаров (Б), и динамика содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе, на 10⁵ нуклеаров (В), (Х±m)Сроки исследования (сутки) Контроль (аллоксановый диабет)Используемое средствоАБВАБВинтакт7±24±215,17±1.37±24±215.17±1,38-е10±25±28,83±0,54*4±2#13±3*#8,0±0,52*11-е--6,17±0,87*--9,5±0,76*#15-е--8,17±1,25*--6,83±0,3*21-е--6,5±0,76*--6,17±0,31** Отмечена достоверность относительно интактных животных при р<0,05.
# Отмечена достоверность относительно животных с аллоксановым диабетом при р<0,05

Таким образом, негликозилированный рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор позволяет проводить эффективную терапию сахарного диабета путем мобилизации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, сопровождаемой увеличением содержания регионарных стволовых клеток в поджелудочной железе, с последующей репарацией инсулин-продуцирующего аппарата органа и нормализацией уровня глюкозы в периферической крови.

Литература

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. - 15-е изд. перераб., испр. и доп. - М.: ООО «Издательство Новая волна», 2005. - С.717.

2. Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг Е.Д. Роль стволовых клеток в адаптации к гипоксии и механизмы нейропротективного действия гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.202-208.

3. Патент (RU) на изобретение №2201962 от 10.04.2003 «Способ получения рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека».

4. Патент (RU) на изобретение №2240134 от 20.11.2004 «Способ лечения больных сахарным диабетом».

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С.184-199.

6. In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. e.a. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol.88. - P.845-852.

Предложено средство с антидиабетической активностью. Средство представляет собой негликозилированный рекомбинантный человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (нрчГ-КСФ). От нативного препарата граноцит он отличается тем, что не гликозилирован и содержит дополнительный остаток метионина на N-конце. Действие средства связано с мобилизацией и миграцией мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, хомингом в поджелудочную железу. Это приводит к репарации инсулинпродуцирующего аппарата органа и к нормализации уровня глюкозы в периферической крови в результате монотерапии нрчГ-КСФ. 2 ил., 3 табл.

Применение негликозилированного рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в качестве средства, обладающего антидиабетической активностью.