СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКОГО КОДЖИ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Настоящее изобретение относится к способу получения жидкого коджи, в частности способу получения жидкого коджи с повышенной ферментативной активностью.

Что касается коджи, используемого в производстве алкогольных напитков, существует твердый коджи, который выращивают посредством того, что споры волокнистых грибков высевают на сырье, прошедшее термическую обработку и т.п., и жидкий коджи, который выращивают посредством того, что сначала путем добавления в воду сырья и других источников питательных веществ создают жидкую среду, а потом в эту среду высевают споры плесени коджи или уже выращенные грибницы плесени коджи и т.п.

В традиционном производстве ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как алкогольные напитки, включая, например, сакэ, шочу, соевый соус, ферментированная паста из соевых бобов, сладкая сакэ и т.п., то, что называется твердым коджи, приготовляемым методом твердой культуры, получило широкое применение. Метод твердой культуры - это метод культивирования, в котором споры плесени коджи, такие, как Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae и подобные им, рассеивают на твердом сырье типа термообработанного зерна, чтобы позволить плесени коджи расти на твердой поверхности.

Например, для изготовления шочу широко используется такой твердый коджи, как Aspergillus kawachii и Aspergillus awamori. Однако поскольку метод твердой культуры является системой культивирования, в которой сырье и плесень коджи распределяются неравномерно, трудно обеспечить однородность таких параметров, как температура, содержание воды и различные питательные составы, и метод твердой культуры очень сложен с точки зрения контролирования культуры. В дополнение к этому, получение коджи часто осуществляется в открытых условиях, так что для предотвращения загрязнения другими бактериями требуется большая тщательность при контролировании качества. По этой причине метод твердой культуры непригоден для широкомасштабного производства.

В противоположность этому, метод жидкой культуры обеспечивает легкий контроль культуры и качества, по причине чего он пригоден для эффективного производства. Однако по той причине, что, например, ферментативная активность недостаточна для варения шочу, культура, полученная культивированием плесени коджи в жидкой среде, редко используется как коджи для шочу. Культурой, полученной в методе жидкой культуры, может быть сама культура, полученная методом культивирования в жидкой среде (здесь и далее также называемая «жидким коджи»), а также культуральная жидкость, клетки и их концентрат или их сухой порошок.

В дополнение к вышеуказанным причинам, весомой причиной, по которой культура, полученная методом культивирования в жидкой среде, не используется для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как шочу, является то, что известно, что поведение плесени коджи, состоящее в производстве таких белков, как амилаза и целлюлаза, в жидкой культуре сильно отличается от соответствующего поведения в твердой культуре, и также известно, что продуктивность этих белков в целом низка (см. непатентные документы 1 и 2).

В производстве алкогольных напитков, таких, как шочу, алкоголь обычно генерируется в процессе одновременного засахаривания и брожения. В силу этого расщепляющие сахар ферменты плесени коджи, которые влияют на снабжение плесени коджи глюкозой, в частности, глюкоамилаза и кислотоустойчивая α-амилаза, являются ключевыми ферментами в алкогольном брожении. Однако, известно, что в культуре, полученной методом культивирования в жидкой среде, активность глюкоамилазы крайне низка, и ее производительность также сильно отличается от производительности в твердой культуре (см. непатентные документы 3-6).

В качестве способа улучшения глюкоамилазной активности плесени коджи, есть сообщения о способе культивирования плесени коджи, в котором упор делается на выращивание грибницы (см. патентный документ 1), и о способе, в котором жареные зерновые добавляются в жидкую культуру плесени коджи (см. патентный документ 2). В способе, раскрытом в патентном документе 1, культивирование осуществляют на пористой мембране или в инклюзивном связующем агенте, имеющим воздушные полости, что обеспечивает экспрессию нового гена glaB, кодирующего глюкоамилазу, для повышения, таким образом, ферментативной активности.

Соответственно, этот метод требует строгого контроля и специфического оборудования для выращивания, по причине чего неудобен для практического применения. В методе же, раскрытом в патентном документе 2, плесень коджи разводят в жидкой среде с использованием жареных зерновых в качестве, по меньшей мере, части сырья, что требует дополнительной стадии жарения зерновых.

Авторы настоящего изобретения предоставили изобретение, относящееся к способу выращивания плесени коджи с использованием жидкой среды, содержащей сахариды, которые плесень коджи разлагает с трудом (см. патентный документ 3). Путем культивирования плесени коджи в жидкой среде с использованием настоящего изобретения, культура плесени коджи, имеющая высокую активность гликолитических ферментов, таких, как глюкоамилаза, что может быть использовано для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как сакэ, может быть получена удобным и недорогим способом.

С другой стороны, недавно был проведен детальный молекулярно-биологический анализ кислотоустойчивой α-амилазы (см. непатентный документ 7). Анализ принес следующие результаты: белая плесень коджи имеет два разных гена амилазы, которые соответственно отвечают за две разные характеристики, а именно, некислотоустойчивая α-амилаза и кислотоустойчивая α-амилаза. Характер экспрессии соответствующих генов сильно различен. При жидком культивировании, некислотоустойчивая α-амилаза производится в достаточных количествах, тогда как кислотоустойчивая α-амилаза, являющаяся ключевым ферментом в производстве шочу, едва ли производится.

Для производства шочу сбраживание производится при низком pH с целью предотвращения гниения шочу-каши. Некислотоустойчивая амилаза вносит очень маленький вклад в гликолиз при варении шочу, потому при низком pH она быстро инактивируется. Таким образом, для производства шочу является безусловно необходимым, чтобы, путем жидкого выращивания плесени коджи, кислотоустойчивая α-амилаза производилась в большом количестве, что, как считают, вносит вклад в гликолиз при сбраживании шочу.

Характеристики производства кислотоустойчивой α-амилазы при жидком выращивании плесени коджи были детально исследованы и опубликованы. Однако, в данном способе используется синтетическая среда, содержащая пептон и раствор цитратного буфера и требующая 100 или более часов выращивания культуры, по причине чего ее было бы трудно использовать в самом варении шочу (см. непатентные документы 8-10).

Как описано выше, вообще, считается, что кислотоустойчивая α-амилаза - это фермент, который по существу не может быть получен путем жидкого культивирования, и, таким образом, жидкий коджи, имеющий высокую активность кислотоустойчивой α-амилазы, не разрабатывался.

Патентный документ 1: JP 11-225746 A

Патентный документ 2: JP 2001-321154 A

Патентный документ 3: JP 2003-265165 A

Непатентный документ 1: Iwashita K. et al: Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946(1998)

Непатентный документ 2: Yuichi Yamane et al.: Journal of the Brewing Society of Japan, 99, 84-92(2004)

Непатентный документ 3: Hata Y. et al.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)

Непатентный документ 4: Hata Y. et al.: Gene., 207, 127-134 (1998)

Непатентный документ 5: Ishida H. et al.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)

Непатентный документ 6: Ishida H. et al.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)

Непатентный документ 7: Nagamine K. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 2194-2202 (2003)

Непатентный документ 8: Sudo S. et al.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993)

Непатентный документ 9: Sudo S. et al.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)

Непатентный документ 10: Shigetoshi Sudo et al.: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994).

Раскрытие изобретения

Проблема, которую изобретение разрешает

Авторы настоящего изобретения выяснили, что жидкий коджи, в достаточной степени имеющий активность ферментов, таких, как глюкоамилаза, кислотоустойчивая α-амилаза и им подобные, необходимые для производства шочу и ему подобных, могут быть получены путем культивирования плесени коджи в жидкой среде, содержащей в качестве культурального сырьевого материала зерна, поверхность которых полностью или частично покрыта шелухой, и уже подали заявки на патенты (см. описания патентной заявки JP No. 2004-350661 и патентной заявки JP No. 2004-352320).

Однако характеристики производства ферментов, за исключением глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы, в этих способах остались неизвестными.

Цель настоящего изобретения - разработать способ увеличения ферментативной активности амилолитических ферментов, таких, как глюкоамилаза и кислотоустойчивая α-амилаза, и других ферментов в жидком коджи. В частности, цель настоящего изобретения - предоставить способ получения жидкого коджи, имеющего высокую активность фермента, путем оптимизации состава жидкой среды.

Средства для решения проблемы

Ввиду того, что в жидком кожди достигается повышенное производство ферментов, авторы настоящего изобретения глубоко исследовали свойства комбинаций видов вышеупомянутого культурального сырьевого материала и различных источников питательных веществ, и выяснили, что продуктивность глюкоамилазы, являющейся амилолитическим ферментом, целлюлазы, являющейся целлюлолитическим ферментом, и кислотной карбоксипептидазы, являющейся протеолитическим ферментом, может быть увеличена, если в жидкую среду включить специальный источник азота и, дополнительно к этому, позволить источнику азота сосуществовать, по меньшей мере, с одним из двух - сульфатом или фосфатом, и, таким образом, оформили изобретение.

То есть, в соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента, способ, включающий культивирование белой плесени коджи и/или черной плесени коджи в жидкой среде, содержащей источник азота, при использовании в качестве культурального сырьевого материала зерна, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором источник азота включает нитратную соль.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором источник азота включает, по меньшей мере, один из группы, состоящей из дрожжевых клеток или их обработанных продуктов, шелухи и отрубей зерновых, или их смеси с нитратной солью.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором жидкая среда содержит нитратную соль в концентрации от 0,05 до 2,0% (вес./об.).

В соответствии с пятым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии со вторым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит фосфатную соль.

В соответствии с шестым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с пятым аспектом, в котором жидкая среда содержит фосфатную соль в концентрации от 0,05 до 1,0% (вес./об.).

В соответствии с седьмым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с пятым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит сульфатную соль.

В соответствии с восьмым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с седьмым аспектом, в котором жидкая среда содержит сульфатную соль в концентрации от 0,01 до 0,5% (вес./об.).

В соответствии с девятым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором фермент включает один или два или более из группы, состоящей из амилолитического фермента, целлюлолитического фермента и протеолитического фермента.

В соответствии с десятым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения жидкого коджи, имеющего повышенную активность фермента в соответствии с первым аспектом, в котором зерно включает рис, пшеницу, ячмень, гречку, японское просо, итальянское просо, просо, сорго или кукурузу.

В соответствии с одиннадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен жидкий коджи, полученный способом в соответствии с любым из аспектов с первого по десятый.

В соответствии с двенадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения ферментного препарата, включающий применение жидкого коджи в соответствии с одиннадцатым аспектом.

В соответствии с тринадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен ферментный препарат, полученный способом в соответствии с двенадцатым аспектом.

В соответствии с четырнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента, включающий получение фермента путем культивирования белой плесени коджи и/или черной плесени коджи в жидкой среде, содержащей источник азота и, в качестве культурального сырьевого материала, зерно, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой.

В соответствии с пятнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором источник азота включает нитратную соль.

В соответствии с шестнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором источник азота включает, по меньшей мере, один из группы, состоящей из дрожжевых клеток или их обработанных продуктов, шелухи и отрубей зерновых, или их смеси с нитратной солью.

В соответствии с семнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором жидкая среда содержит нитратную соль в концентрации от 0,05 до 2,0% (вес./об.).

В соответствии с восемнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с пятнадцатым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит фосфатную соль.

В соответствии с девятнадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с восемнадцатым аспектом, в котором жидкая среда содержит фосфатную соль в концентрации от 0,05 до 1,0% (вес./об.).

В соответствии с двадцатым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с восемнадцатым аспектом, в котором жидкая среда далее содержит сульфатную соль.

В соответствии с двадцать первым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с двадцатым аспектом, в котором жидкая среда содержит сульфатную соль в концентрации от 0,01 до 0,5% (вес./об.).

В соответствии с двадцать вторым аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором фермент включает один или два или более из группы, состоящей из амилолитического фермента, целлюлолитического фермента и протеолитического фермента.

В соответствии с двадцать третьим аспектом настоящего изобретения, предложен способ получения фермента в соответствии с четырнадцатым аспектом, в котором зерно включает рис, пшеницу, ячмень, гречку, японское просо, итальянское просо, просо, сорго или кукурузу.

В соответствии с настоящим изобретением, специфическое органическое и/или неорганическое вещество в качестве источника азота добавляется в жидкую среду, содержащую в качестве культурального сырьевого материала зерно, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой, далее туда добавляется сульфатная соль и фосфатная соль, и плесень коджи выращивается в жидкой среде, что приводит не только к заметному улучшению производительности амилолитических ферментов в жидком коджи, но также обеспечивает получение жидкого коджи, содержащего большие количества целлюлолитических и протеолитических ферментов. В дополнение к этому, считается, что производительность ферментов, производимых плесенью коджи, обычно улучшается, даже если это не вышеупомянутые ферменты.

Когда ферментированные пищевые продукты и напитки, такие, как шочу, производятся с использованием жидкого коджи, полученного в соответствии с настоящим изобретением, хорошее ферментирование имеет место благодаря понижению вязкости каши в силу высокой активности целлюлолитических ферментов, по причине чего может ожидаться повышение выхода алкоголя. В дополнение к этому, по причине высокой активности протеолитических ферментов, повышается производство аминокислот, благодаря чему можно производить ферментированные пищевые продукты и напитки с великолепным привкусом.

Далее, по сравнению с твердым культивированием, жидкое культивирование строго управляется, так что можно дешево производить жидкий коджи, отличающийся стабильным качеством.

Кроме того, зерновые, используемые в настоящем изобретении, являются неочищенными или очищенными до такой степени, что, по меньшей мере, шелуха остается на поверхности. Таким образом, можно ожидать улучшение ситуации в плане доступности сырья и выхода продукта.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 иллюстрирует активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием нитрата калия в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.2 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием соединения с неорганическим азотом и неорганической соли. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.3 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием дрожжевых клеток и дрожжевого лизата в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.4 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием комбинации соединения с неорганическим азотом, неорганической соли и дрожжевых клеток. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.5 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием комбинации ячменных отрубей, дрожжевых клеток и соединения с неорганическим азотом в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.6 иллюстрирует активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы культур, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием комбинации ячменной шелухи и дрожжевых клеток в качестве источника азота. Каждый черный столбик обозначает активность глюкоамилазы (ед./мл), а каждый белый столбик - активность α-амилазы (ед./мл).

Фиг.7 иллюстрирует активность различных ферментов культур плесени коджи, каждая из которых получена культивированием в жидкой среде с использованием сульфатной соли, соли нитрата и фосфатной соли. Панели от (А) до (D) иллюстрируют активности (ед./мл) глюкоамилазы (GA), кислотоустойчивой α-амилазы (ASAA), целлюлазы (CEL) и кислотной карбоксипептидазы (ACP).

Ниже подробно описаны предпочтительные варианты выполнения.

Способ получения жидкого коджи в соответствии с настоящим изобретением включает стадию культивирования плесени коджи в жидкой среде, приготовленной путем добавления в нее сырья, такого, как зерно, и источников азота, что приводит к получению жидкого коджи с повышенной ферментативной активностью.

В более частном случае, в настоящем изобретении плесень коджи выращивается с помощью жидкой среды, которая содержит зерна, поверхность которых полностью или частично покрыта шелухой, и, таким образом, требуется определенное время на засахаривание крахмалов в зернах, скорость выхода сахаридов в культуру понижается, в силу чего ферментативная активность жидкого коджи повышается. Далее, различные ферменты производятся плесенью коджи в больших количествах, потому что жидкая среда содержит специальные источники азота.

Здесь примеры ферментов, которые могут производиться плесенью коджи, включают (но без ограничения этим) амилолитический фермент, такой, как глюкоамилаза и α-амилаза, целлюлолитический фермент, такой, как целлюлаза и β-глюкозидаза, и протеолитические ферменты, такие, как кислотная карбоксипептидаза или кислотная протеаза.

В настоящем изобретении примеры зерна, которые могут использоваться как сырье для культуры, включают ячмень, рис, пшеницу, гречку, японское просо, итальянское просо, просо, сорго, кукурузу и т.п. Каждый из материалов, используемых в качестве культурального сырьевого материала, должен быть в форме, поверхность которой полностью или частично покрыта шелухой. Может использоваться необработанный материал или материал, имеющий равный или больший показатель обработки, при котором он был обработан, так что шелуха, по меньшей мере, осталась на поверхности зерен; также могут использоваться сырой рис, сырой ячмень, и т.п. В случае риса, может использоваться сырой рис, рис со всей чешуей и рис с частью чешуи.

Например, когда зерном является ячмень, может использоваться необработанный материал с показателем обработки в 100%, либо при условии, что показатель обработки необработанного материала определяется как 100%, а материал имеет показатель обработки, полученный вычитанием процента шелухи ячменя (обычно 7-8%) из показателя обработки необработанного материала, то есть показатель обработки не менее примерно 92-93%.

Здесь термин «показатель обработки» обозначает процент того, что осталось после обработки зерна. Например, термин «показатель обработки в 90%» означает, что 10% шелухи и прочего из части, соответствующей поверхностному слою, было удалено. В настоящем изобретении, более того, термин «сырой ячмень» включает все, от необработанного ячменя до обработанного ячменя, имеющего оставшуюся на поверхности зерен шелуху, то есть материал с показателем обработки в 90% или более. В дополнение к этому, термин «шелуха» относится к внешней части, которая покрывает поверхности зерна.

Любой из вышеупомянутых типов культурального сырьевого материала используется сам по себе, либо два или более типа используются в сочетании для приготовления последующей жидкой среды. Другими словами, для приготовления жидкой среды зерно в качестве культурального сырьевого материала смешивают с водой в комбинации с описанным здесь источником азота. Значение показатель смешивания зерна устанавливается таким, чтобы ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент, избирательно генерировались и накапливались в выращиваемой культуре плесени коджи.

Например, когда в качестве культурального сырьевого материала используется ячмень, жидкая среда приготовляется путем добавления в воду от 1 до 20% (вес./об.) сырого ячменя. Когда в качестве сырого ячменя используется необработанный ячмень, более предпочтительно, жидкая среда приготовляется путем добавления от 8 до 10% (вес./об.). Когда используется ячмень с показателем обработки в 95%, более предпочтительно, жидкая среда приготовляется путем добавления от 1 до 4% (вес./об.).

В дополнение к этому, когда в качестве культурального сырьевого материала используется рис, у которого была удалена чешуя, жидкая среда приготовляется путем добавления в воду от 1 до 20% (вес./об.) сырого риса, предпочтительно от 5 до 13% (вес./об.), более предпочтительно от 8 до 10% (вес./об.).

Когда используются другие зерновые, жидкая среда приготовляется таким же образом - путем добавления в воду от 1 до 20% (вес./об.) зерновых.

При таком подходе наиболее пригодное для смешивания количество варьируется в зависимости от степени очистки используемых сырья, штаммов коджи, вида сырья и тому подобного, так что с учетом этих факторов оно может быть выбрано подобающим образом.

Когда количество культурального сырьевого материала превышает верхнее пороговое значение, вязкость среды возрастает, и приток кислорода или воздуха, требуемый для аэробного культивирования плесени коджи, становится недостаточным для того, чтобы культура развивалась, и такой случай не является желательным. С другой стороны, когда количество культурального сырьевого материала не отвечает нижнему пороговому значению, необходимые ферменты не могут быть произведены в больших количествах.

Крахмалы, включаемые в сырье для культуры, могут быть желатинированы перед культивированием. Способов желатинирования крахмалов не особо мало, так что оно может быть осуществлено в соответствии с любым их общеупотребительных методов, включая паровой метод и метод поджарки. На стадии стерилизации жидкой среды (как будет описано далее), если крахмалы нагреваются до температуры гелеобразования или выше, когда осуществляется стерилизация при высоких температурах и высоких давлениях, желатинирование крахмалов происходит одновременно со стерилизацией.

В жидкой среде органическое вещество, неорганическое вещество и тому подобные включаются в качестве источника азота в дополнение к вышеупомянутому сырью для культуры. Источники азота не очень малочисленны, коль скоро плесень коджи растет и в достаточном количестве производит требуемые ферменты. Примеры органического вещества включают дрожжевые клетки или продукты их обработки (такие, как разложившиеся дрожжевые клетки, дрожжевые экстракты и т.п.), шелуха, отруби зерновых и т.п.. Пример неорганического вещества включает нитратную соль.

Нитратная соль включает нитрат калия, нитрат натрия и т.п., и нитрату калия отдается особое предпочтение.

Любой из источников азота может использоваться сам по себе, либо же два или более органических вещества и/или неорганические вещества могут использоваться одновременно.

Количество дополнительного источника азота особо не ограничено, коль скоро росту плесени коджи оказывается содействие, однако для органического вещества - от 0,1 до 2% (вес./об.), предпочтительно, от 0,5 до 1,0% (вес./об.); количество же дополнительной соли нитрата как неорганического вещества - 0,05 до 2,0% (вес./об.), предпочтительно, от 0,1 до 2,0% (вес./об., более предпочтительно 0,2 до 1,5% (вес./об.).

Добавление источника азота в количестве, превышающем верхнее пороговое значение, нежелательно, поскольку этим подавляется рост плесени коджи. С другой стороны, количество добавляемого источника азота ниже нижнего порогового значения также нежелательно, постольку не будет поддерживаться производство ферментов.

Примеры дрожжей, которые могут использоваться в качестве одного из видов источника азота, в настоящем изобретении включают пивные дрожжи, винные дрожжи, дрожжи для виски, дрожжи для шочу, дрожжи для сакэ и хлебные дрожжи, которые используются в процессах сбраживания или производства пищевых продуктов, и дрожжевые клетки родов Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Hanseniaspora, Hansenula, Debaryomyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes, Pichia, Pachysolen и подобные.

Клетки дрожжей сами могут использоваться в качестве источника азота, и также могут использоваться в форме разложившихся дрожжей или дрожжевого экстракта. Разложившиеся дрожжевые клетки или дрожжевой экстракт могут быть получены, если дрожжи подвергнуть обработке, такой, как метод автолиза (метод повышения растворимости клеток с использованием протеолитических ферментов, которые от природы присутствуют в дрожжевых клетках), метод ферментативного расщепления (метод повышения растворимости путем добавления ферментного препарата или ему подобного, взятого из микроорганизмов или растений), метод экстракции в горячей воде (метод повышения растворимости путем погружения дрожжевых клеток в горячую воду на определенное время), метод кислотного или щелочного разложения (метод повышения растворимости путем добавления различных кислот или щелочей), метод физического разрушения (метод разрушения с помощью ультразвукового воздействия, или метод гомогенизации под высоким давлением, или смешивание с твердым телом, таким, как стеклянные бусины, и взбалтывание), и метод замораживания-размораживания (метод разрушения путем, по меньшей мере, однократного замораживания и размораживания).

В дополнение к этому, отруби зерновых, такие, как рисовые отруби, являющиеся побочным продуктом обработки зерна, мошут также быть использованы в качестве источника азота. Зерно состоит из оболочки, зародышевой части, эндосперма и шелухи, которая все это защищает. Отруби - это часть, состоящая из зародыша и оболочки.

Далее, в настоящем изобретении, зерновая шелуха, то есть его наружная оболочка, может использоваться как источник азота, и обычно используется шелуха зерновых того же типа, что и зерна, используемые в качестве культурального сырьевого материала. Эти отруби и шелуха могут использоваться в комбинации с другими источниками азота.

В жидкой среде, которая используется в настоящем изобретении, сульфатную соль и фосфатную соль могут быть включены в дополнение к сырью для культуры и источникам азота, как описано выше. При использовании этих неорганических солей в комбинации становится возможным повысить активность фермента - амилолитического фермента, целлюлолитического фермента, протеолитического фермента и им подобных.

Примеры сульфатных солей включают сульфатированный гептагидрат магния, сульфатированный гептагидрат железа и сульфат аммония, но сульфатированному гептагидрату магния отдается особое предпочтение. Примеры фосфатных солей включают первичный кислый фосфористокислый калий и фосфат аммония, но первичному кислому фосфористокислому калию отдается особое предпочтение.

Любая из этих неорганических солей может использоваться сама по себе, либо две из них или более могут использоваться в комбинации.

В дополнение к этому, концентрация неорганических солей в жидкой среде устанавливается такой, чтобы ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент, избирательно генерировались и накапливались выращиваемой культуре плесени коджи. Например, концентрация сульфатной соли - от 0,01 до 0,5%, предпочтительно от 0,02 до 0,1%, а концентрация фосфатной соли - от 0,05 до 0,1%, предпочтительно от 0,1 до 0,5%, при том условии, что каждое значение выражено в единицах вес./об..

Вышеупомянутые неорганические соли могут использоваться сами по себе, либо две из них или более могут использоваться в комбинации.

В жидкую среду могут при желании быть добавлены органическое вещество и неорганическая соль, не в качестве вышеупомянутых источника азота и неорганической соли как источника питательных веществ. Добавки особо не ограничиваются, коль скоро они являются веществами, обычно используемыми для выращивания плесени коджи. Примеры органического вещества включают пшеничные отруби, кукурузный экстракт, соевый жмых и обезжиренные соевые бобы.

Примеры неорганической соли включают растворимые в воде соединения, такие, как соль аммония, соль калия, соль кальция, соль магния и т.п.. Два или более органических вещества

и/или неорганические соли могут использоваться одновременно.

Их количество в качестве добавки особо не ограничивается, коль скоро этим облегчается рост плесени коджи. Количество добавляемого органического вещества - предпочтительно порядка от 0,1 до 5% (вес./об.), а количество добавляемой неорганической соли - предпочтительно порядка от 0,1 до 1% (вес./об.).

Добавление источника питательных веществ в количестве, превышающем верхнее пороговое значение, нежелательно, поскольку этим подавляется рост плесени коджи. С другой стороны, количество добавляемого источника азота ниже нижнего порогового значения также нежелательно, постольку не будет поддерживаться производство ферментов.

Жидкая среда для плесени коджи, полученная путем смешивания вышеупомянутого культурального сырьевого материала и источника азота с водой, может по желанию быть подвержена стерилизации, и способ стерилизации особо не ограничен никакими рамками. Пример такого способа включает стерилизацию при высокой температуре и под высоким давлением, и в этом случае стерилизация может осуществляться при 121°С в течение 15 минут.

Стерилизованная жидкая среда охлаждается до температуры, при которой осуществляется культивирование, после чего белая плесень коджи и/ли черная плесень коджи высаживается в жидкую среду.

Примеры плесеней коджи, используемых в настоящем открытии, предпочтительно включают плесени коджи, которые способны производить амилолитические ферменты, такие, как глюкоамилаза, кислотоустойчивая a-амилаза и a-амилаза, целлюлолитические ферменты, такие, как целлюлаза и b-глюкозидаза, и протеолитические ферменты, такие, как кислотная карбоксипептидаза и кислотная протеаза. Специфические примеры плесеней коджи включают белые плесени коджи, такие, как Aspergillus kawachii, и черные плесени коджи, такие, как Aspergillus awamori и Aspergillus niger.

Форма плесени коджи, высаживаемая в среду, произвольна, и любые споры и грибницы плесени коджи могут быть для этого использованы.

Эти плесени коджи могут быть использованы для культуры, соответствующей одному штамму, или для смешанной культуры с двумя или более гомологичными или гетерологичными штаммами. Позволительно использовать любую форму спор или грибниц, полученных при предварительном выращивании. Однако, предпочтительно использовать грибницы, поскольку в этом случае на фазу логарифмического роста требуется меньше времени.

Количество плесени коджи, высаживаемого в жидкую среду, особо не ограничивается, но число спор может находиться примерно в пределах от 1×10⁴ до 1×10⁶ на миллилитр жидкой среды. В случае грибниц, предварительно высадить порядка от 0,1 до 10% предварительной культуры.

Температура, при которой выращивается плесень коджи, - предпочтительно от 25 до 45°С, более предпочтительно от 30 до 40°С, но особо она не ограничивается, коль скоро это пагубным образом не влияет на рост. Если температура культивирования низка, то культура зачастую оказывается зараженной микробами, и рост плесени коджи замедляется. Таким образом, времени культивирования подобает варьироваться от 24 до 72 часов.

Установка для культивирования может быть любой, какая способна осуществлять жидкое выращивание. Плесень коджи должна выращиваться в аэробных условиях. Таким образом, выращивание должно осуществляться в аэробных условиях при которых в среду могут подаваться кислород или воздух. В дополнение к этому, является предпочтительным, чтобы среда перемешивалась, так, чтобы сырье, кислород и плесень коджи равномерно распределялись по объему установки во время культивирования. Характеристики процесса перемешивания и подачи воздуха могут быть произвольными, коль скоро поддерживается аэробная среда, и могут, таким образом, правильно выбираться с учетом установки, в которой осуществляется выращивание, вязкости среды и тому подобного.

При выращивании вышеописанным способом, ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент могут производиться в больших количествах. Как результат, получается жидкий коджи, имеющий активность фермента, что можно использовать для производства шочу.

В соответствии с настоящим изобретением, жидкий коджи включает культуральную жидкость, полученную из продукта выращивания с помощью разделения центрифугой и тому подобного, ее концентрат, ее сухой вариант и т.п., а также сам продукт выращивания.

Как описано выше, в соответствии с описанным выше методом выращивания, ферменты, такие, как амилолитический фермент, целлюлолитический фермент и протеолитический фермент могут производиться в больших количествах.

Таким образом, способ получения фермента, описанный в четырнадцатом аспекте настоящего изобретения, - тот же, что и вышеописанный способ получения жидкого коджи.

Жидкий коджи, полученный способом настоящего изобретения, может подходящим образом применяться в производстве ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как шочу. Жидкий коджи может применяться вместо твердого коджи, например, в случае производства сакэ, на стадии приготовления дрожжей или сусла; в случае производства шочу, на стадии приготовления сусла; в случае производства соевого соуса, на стадии наращивания (piling); в случае производства мисо, на стадии приготовления; в случае производства сладкой сакэ, на стадии приготовления; и в случае производства амазаке, на стадии приготовления.

В дополнение к этому, часть получающегося жидкого коджи может быть использована в качестве затравки для дальнейшего производства жидкого коджи. Путем непрерывного получения жидкого коджи таким способом, можно достичь стабильного производства, и в то же время улучшить его эффективность.

Когда ферментированные пищевые продукты и напитки, такие, как шочу, производятся с использованием упоминаемого выше жидкого коджи, все этапы производства могут быть осуществлены в жидкой фазе. Способ производства ферментированных продуктов питания и напитков в жидкой фазе целиком, например, когда производится шочу, состоит в том, что кукуруза, пшеница, рис, картофель, сахарный тростник и т.п.в качестве сырья нагреваются до примерно 80°С до превращения в жидкость путем растворения вместе с термостойким препаратом фермента, туда, для осуществления в сусле спиртового брожения, добавляются вышеописанный жидкий коджи и дрожжи, и далее это дистиллируется при нормальном или пониженном давлении и тому подобном.

Жидкий коджи, полученный способом настоящего изобретения, обладает высокой ферментативной активностью, так что жидкий коджи может использоваться для приготовления фермента и фармацевтического препарата, такого, как средство, стимулирующее пищеварение. В этом случае, полученный продукт культуры плесени коджи может концентрироваться и очищаться до желаемой степени и, тем самым, превращаться в препарат с добавлением в него нужного наполнителя, отвердителя, подсластителя и тому подобного.

В дополнение к этому, при использовании промотерного участка гена амилолитического фермента и тому подобного в плесени коджи, в продукте выращивания плесени коджи можно высокоэффективно получить желаемый гетеро-белок.

ПРИМЕРЫ

Хотя настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на Примеры и т.п., настоящее изобретение не ограничено этими Примерами и тому подобным.

Пример 1

Добавление соединения с неорганическим азотом при получении жидкого коджи

Эффект от добавления в жидкую среду нитрата калия в качестве вещества с неорганическим азотом был исследован и описывается ниже.

Сначала были приготовлены жидкие среды трех типов, в которые соответственно был добавлен сырой ячмень: в воду без добавок (контроль), в воду, содержащую 0,2% (вес./об.) нитрата калия, и в воду, содержащую 0,4% (вес./об.) нитрата калия, так, что количество сырого ячменя было приведено к 2% (вес./об.).

Каждые 100 мл жидких сред были помещены в 500-миллилитровую конусообразную колбу с выступами и автоклавированы, и белая плесень коджи (Aspergillus kawachii IFO4308), выращенная заранее в жидкой среде, была высажена так, чтобы ее количество в жидкой среде составило 1% (вес./об.). В качестве сырого ячменя использовался ячмень Стирлинг с показателем обработки 95%, сделанный в Австралии (это в целом правда в нижеприводимых примерах).

Далее производилось выращивание в течение 48 часов при температуре 37°С и с перемешиванием в 100 об./мин.. По окончании, каждый из полученных продуктов выращивания был протестирован на предмет активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы. Активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы продуктов выращивания, полученных культивированием плесени коджи в жидкой среде, в зависимости от количества нитрата калия были показаны в Таблице 1 и на Фиг.1.

Для измерения ферментативной активности глюкоамилазы использовали набор для фракционного количественного анализа содержания сахаров (фирмы Kikkoman). Для измерения ферментативной активности кислотоустойчивой α-амилазы, метод, описанный в «Nagamine K. et al.: Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 2194-2202 (2003)», был немного модифицирован. То есть кислотоустойчивая α-амилаза была инактивирована путем обработки продукта культивирования кислотой, после чего активность кислотоустойчивой α-амилазы была измерена с помощью α-амилазного измерительного набора (выпускаемого Kikkoman). Если более точно, то в 9 мл 100 мМ ацетатного буфера (pH 3) добавлялся 1 мл культуры, обработка кислотой проводилась при 37°С в течение 1 часа, после чего производилось измерение с помощью α-амилазного измерительного набора (выпускаемого Kikkoman).

Как показано в Таблице 1 и на Фиг.1, активности ферментов глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы заметно улучшились на диаграммах, соответствующих добавлению 0,2% и 0,4%, где жидкие среды выращивались путем добавления в них нитрата калия в качестве вещества с неорганическим азотом, по сравнению со контрольной диаграммой, соответствующей отсутствию добавления; кроме того, был хорошим баланс между активностями глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы.

Таблица 1 № Количество добавленного KNO₃ (вес./об.) Ферментативная активность (ед./мл) Глюкоамилаза (GA) Кислото-устойчивая α-амилаза (ASAA) 1 (Контроль) Без добавления 32,6 2,5 2 0,20% 124,3 8,7 3 0,40% 137,9 7,9

Пример 2

Добавление множества неорганических веществ при получении жидкого коджи

Эффект от добавления множества неорганических веществ был исследован и описывается ниже.

Нитрат калия или нитрат натрия в качестве вещества с неорганическим азотом, и первичный кислый фосфористокислый калий в качестве неорганической соли были добавлены в воду в составах, приведенных в Таблице 2. Количество добавляемого нитрата натрия рассчитывалось из молярной концентрации, соответствующей 2,0% нитрата калия, то есть 20 мМ, и было сделано 1,7%, так что концентрации ионов нитрата становятся одинаковыми. В качестве контроля использовалась вода без вещества с неорганическим азотом или неорганической солью.

В воду для сырья, приготовленную как описано выше, в качестве культурального сырьевого материала был добавлен сырой ячмень в концентрации 2% (вес./об.), и было приготовлено 4 типа жидкой среды. Жидкое выращивание белой плесени коджи было проведено при тех же условиях, что и в Примере 1. После этого активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы были определены тем же методом, что и в Примере 1. Таблица 2 и Фиг.2 иллюстрируют результаты.

Как показано в Таблице 2 и на Фиг.2, активности ферментов глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы улучшились на диаграммах, соответствующих веществам с неорганическим азотом и неорганической соли, по сравнению со контрольной диаграммой, соответствующей отсутствию добавления.

Таблица 2   Среда (2% сырой ячмень) Ферментативная активность(ед./л) Вещество с неорганическим азотом (вес./об.) Неорганическая соль (вес./об.) Глюкоамилаза (GA) Кислото-устойчивая α-амилаза (ASAA) №1 (контроль) - - 32,6 2,5 №2 0,20% KNO₃ 0,27% KH₂PO₄ 143,6 8,8 №3 0,17% NaNO₃ 0,27% KH₂PO₄ 125,6 7,7

Пример 3

Добавление дрожжевых клеток или дрожжевого автолизата при получении жидкого коджи

Жидкий коджи был получен при использовании жидкой среды, в которую были добавлены дрожжевые клетки или дрожжевой автолизат (то есть дрожжевой экстракт).

(1) Приготовление добавляемых дрожжевых клеток или дрожжевого автолизата

Пивные дрожжи, взятые с одной из стадий пивоварения, были обработаны при следующих условиях, чтобы таким образом получить пивные дрожжевые клетки и дрожжевые автолизаты (1) и (2) для использования в получении жидкого коджи.

Дрожжевые клетки: Пивные дрожжевые клетки, полученные обезвоживанием пивных дрожжей до около 70% содержания воды путем центрифугирования при 5000 g в течение 15 минут.

Дрожжевой автолизат (1): Дрожжевой автолизат, полученный культивированием пивных дрожжевых клеток в равном количестве воды и помещением смеси при 52°С на 18 часов.

Дрожжевой автолизат (2): Дрожжевой автолизат, полученный культивированием пивных дрожжевых клеток в равном количестве 1%-ой молочной кислоты и помещением смеси при 52°С на 18 часов.

(2) Приготовление жидкого коджи при использовании жидкой среды, куда добавлены дрожжи

Как дрожжевые клетки, так и дрожжевые автолизаты (1) и (2), которые были приготовлены как описано выше, были добавлены в воду соответственно до концентраций 0,20%, 0,50% и 1% (вес./об.), чтобы приготовить воду для сырья. Сырой ячмень в качестве культурального сырьевого материала был добавлен в каждый из растворов воды для сырья до концентрации 2% (вес./об.), и таким образом готовилась жидкая среда. Жидкое выращивание белой плесени коджи было проведено при тех же условиях, что и в Примере 1. После этого активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы были определены тем же методом, что и в Примере 1.

В качестве контроля жидкая среда (то есть Диаграмма 1) приготовлялась путем добавления только лишь сырого ячменя в воду до концентрации только лишь в 2% (вес./об.), после чего белая плесень коджи высаживалась туда тем же способом, что и в Примере 1, для культивирования в жидкой среде. Активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы, получающегося жидкого коджи, были определены тем же способом. Таблица 3 и Фиг.3 иллюстрируют результаты.

Таблица 3   Среда (2%-сырой ячмень) Ферментативная активность (ед./мл) Дрожжевые клетки * Дрожжевой автолизат (1)* Дрожжевой автолизат (2)* Глюкоамилаза (GA) Кислото-устойчивая α-амилаза (ASAA) №1 - - - 16,3 1,0 №2 0,2% - - 29,2 2,1 №3 0,5% - - 48,2 2,1 №4 1,0% - - 74,9 9,2 №5 - 0,2% - 35,3 2,5 №6 - 0,5% - 56,6 3,1 №7 - 1,0% - 110,0 9,6 №8 - - 0,2% 23,7 1,8 №9 - - 0,5% 59,1 5,2 №10 - - 1,0% 68,0 10,3 *:единица=вес./об.

(3) Результаты

Как показано в Таблице 3 и на Фиг.3, активность как глюкоамилазы, так и кислотоустойчивой α-амилазы была улучшена на всех экспериментальных диаграммах, соответствующих случаям, когда были добавлены сами дрожжевые клетки, и экспериментальных диаграммах, соответствующих случаям, когда был добавлен дрожжевой экстракт, по сравнению с контрольной диаграммой (то есть, диаграммой номер 1), соответствующей отсутствию добавления. В частности, хороший результат показала экспериментальная диаграмма номер 7. В дополнение к этому, на каждой экспериментальной диаграмме активность глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы были улучшена пропорционально количеству добавленных дрожжевых клеток или дрожжевого автолизата.

Пример 4

Добавление комбинации вещества с неорганическим азотом и/или неорганической соли с дрожжевыми клетками

Нитрат калия, первичный кислый фосфористокислый калий и дрожжевые клетки были скомбинированы так, как показано в Таблице 4, и добавлены в воду, чтобы приготовить воду для сырья. Используемые дрожжевые клетки были сами пивные дрожжевые клетки (то есть дрожжевые клетки, приготовленные в Примере 3), полученные обезвоживанием пивных дрожжей, взятых с одной из стадий пивоварения, до содержания воды в 70% с помощью центрифугирования. В качестве контроля (то есть Диаграмма 1) использовалась вода для сырья без добавлений.

В воду для сырья, приготовленную с комбинациями из Таблицы 4, как описано выше, был добавлен сырой ячмень в концентрации 2% (вес./об.). Белую плесень коджи высевали в жидкую среду тем же способом, что и в Примере 1, для культивирования в жидкой среде. Были соответственно определены активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы в этих средах. Таблица 4 и Фиг.4 иллюстрируют результаты.

Как показано в Таблице 4 и на Фиг.4, активность как глюкоамилазы, так и кислотоустойчивой α-амилазы была крайне высокой на всех экспериментальных диаграммах, по сравнению с контрольной диаграммой (то есть, диаграммой номер 1), соответствующей отсутствию добавления. В частности, крайне высокой была активность обоих ферментов на экспериментальных диаграммах номер 15 и 18. На основании этих результатов было сочтено, что совокупное использование вещества с неорганическим азотом и/или неорганической соли и дрожжевыми клетками улучшило баланс питательных веществ в жидкой среде, так что волокнистые грибки энергично производили ферменты.

Таблица 4   Среда (2%-сырой ячмень) Ферментативная активность (ед./мл) KNO₃ (вес./об.) KH₂PO₄ (вес./об.) Дрожжевые клетки (вес./об.) Глюкоамилаза (GA) Кислото-устойчивая α-амилаза (ASAA) №1 (контроль) - - - 32,6 0,8 №2 0,05% - - 52,9 3,8 №3 0,10% - - 91,7 4,6 №4 0,20% - - 114,0 5,6 №5 0,40% - - 137,9 6,9 №6 - - 0,20% 40,8 2,4 №7 0,05% - 0,20% 60,3 3,7 №8 0,10% - 0,20% 101,4 5,4 №9 0,20% - 0,20% 103,6 6,4 №10 0,40% - 0,20% 139,9 8,6 №11 - - 0,50% 44,5 3,7 №12 0,05% - 0,50% 94,4 6,5 №13 0,10% - 0,50% 94,9 6,9 №14 0,20% - 0,50% 135,7 8,3 №15 0,40% - 0,50% 154,0 10,4 №16 0,20% 0,30% - 139,9 10,5 №17 0,20% 0,30% 0,20% 160,7 11,6 №18 0,20% 0,30% 0,50% 178,5 12,3

Пример 5

Комбинация ячменных отрубей, дрожжевых клеток и неорганического вещества

Ячменные отруби и дрожжевые клетки, нитрат калия и первичный кислый фосфористокислый калий были скомбинированы так, как показано в Таблице 5, и добавлены в воду, чтобы приготовить воду для сырья для жидкой культуры. Используемые ячменные отруби были взяты со стадии обрушивания ячменя с показателем обработки 70% (Стирлинг, сделано в Австралии) и содержали ячменную шелуху и отруби. Используемые дрожжевые клетки были сами пивные дрожжевые клетки (то есть дрожжевые клетки, приготовленные в Примере 3), полученные обезвоживанием пивных дрожжей, взятых с одной из стадий пивоварения, до содержания воды в 70% с помощью центрифугирования. В качестве контроля использовалась вода для сырья без добавлений.

В воду для сырья, приготовленную с комбинациями из Таблицы 5, как описано выше, был добавлен сырой ячмень в концентрации 2% (вес./об.). Белую плесень коджи высевали в жидкую среду тем же способом, что и в Примере 1, для культивирования в жидкой среде. Были соответственно определены активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы в этих средах. Таблица 5 и Фиг.5 иллюстрируют результаты.

Таблица 5   Среда (2%-сырой ячмень) Ферментативная активность (ед./мл) Неорганическое соединение Ячменные отруби (вес./об.) Дрожжевые клетки (вес./об.) Глюкоамилаза (GA) Кислото-устойчивая α-амилаза (ASAA) №1 (контроль) - - - 25,7 0,9 №2 - 0,1% 0,1% 43,5 2,9 №3 - 0,5% 0,5% 54,6 3,9 №4 - 1,0% 1,0% 111,0 13,6 №5 - 2,0% 2,0% 50,9 8,5 №6 - 1,0% - 77,6 8,9 №7 - - 1,0% 92,3 9,5 №8 о 1,0% - 106,0 10,3 №9 о - 1,0% 318,6 15,5 о: экспериментальная диаграмма, к которой были добавлены 0,2% (вес./об.) нитрата калия и 0,3% (вес./об.) первичного кислого фосфористокислого калия.

Как показано в Таблице 5 и на Фиг.5, активность как глюкоамилазы, так и кислотоустойчивой α-амилазы была крайне высокой на всех экспериментальных диаграммах, по сравнению с контрольной диаграммой (то есть, Диаграммой номер 1), соответствующей отсутствию добавления. В частности, крайне высокой была активность обоих ферментов на экспериментальной Диаграмме номер 4, и был хорошим баланс.

На основании этих результатов было сочтено, что совокупное использование ячменных отрубей с дрожжевыми клетками улучшило баланс питательных веществ в жидкой среде, так что волокнистые грибки энергично производили ферменты.

Надо заметить, что совокупное использование ячменных отрубей или дрожжевых клеток и вещества с неорганическим азотом и неорганической соли (то есть Диаграммы номер 8 и 9) показало хороший результат.

Пример 6

Добавление сочетания ячменной шелухи и дрожжевых клеток

Нитрат калия, первичный кислый фосфористокислый калий, ячменная шелуха и дрожжевые клетки были скомбинированы так, как показано в Таблице 6, и добавлены в воду, чтобы приготовить воду для сырья для жидкой культуры. Используемая ячменная шелуха была получена просеиванием ячменных отрубей, полученных на стадии обрушивания ячменя с показателем обработки 70%, с помощью сита с 2-миллиметровыми ячейками, и далее выбиранием только ячменной шелухи. В дополнение к этому, используемые спрессованные дрожжи были сами пивные дрожжевые клетки (то есть дрожжевые клетки, приготовленные в Примере 3), полученные обезвоживанием пивных дрожжей, взятых с одной из стадий пивоварения, до содержания воды в 70% с помощью центрифугирования. В качестве контроля использовалась вода для сырья без добавлений (то есть Диаграмма номер 1).

Таблица 6   Среда Ферментативная активность(ед./л) Дрожжевые клетки (вес./об.) Ячменная шелуха (вес./об.) Глюкоамилаза (GA) Кислото-устойчивая α-амилаза (ASAA) №1 (контроль) - - 33,9 0,8 №2 - 0,1% 65,3 5,5 №3 - 0,5% 55,2 6,3 №4 - 1,0% 48,5 6,9 №5 - 2,0% 44,3 4,6 №6 1,0% 0,1% 94,4 9,9 №7 1,0% 0,5% 79,8 9,4 №8 1,0% 1,0% 85,8 11,0 №9 1,0% 2,0% 82,3 7,1

В воду для сырья, приготовленную с комбинациями из Таблицы 6, как описано выше, был добавлен сырой ячмень в концентрации 2% (вес./об.). Белую плесень коджи высевали в жидкую среду тем же способом, что и в Примере 1, для культивирования в жидкой среде. Были соответственно определены активности глюкоамилазы и кислотоустойчивой α-амилазы в этих средах. Таблица 6 и Фиг.6 иллюстрируют результаты.

Как показано в Таблице 6 и на Фиг.6, активность как глюкоамилазы, так и кислотоустойчивой α-амилазы была крайне высокой на всех экспериментальных диаграммах, по сравнению с контрольной диаграммой (то есть, Диаграммой номер 1), соответствующей отсутствию добавления. В частности, крайне высокой была активность обоих ферментов на экспериментальных Диаграммах номер 6 и 9, и был хорошим баланс. На основании этих результатов было сочтено, что совокупное использование ячменной шелухи с дрожжевыми клетками улучшило баланс питательных веществ в жидкой среде, так что волокнистые грибки энергично производили ферменты.

Пример 7

Эффект добавления сульфатной соли при получении жидкого коджи

Жидкий коджи был получен способом, описанным ниже, и была определена его ферментативная активность.

1. Метод предварительного выращивания

8 граммов ячменя с показателем обработки 65% (Стирлинг, сделано в Австралии) и 100 мл воды были помещены в 500-миллилитровую конусообразную колбу с выступами и автоклавированы при 121°С в течение 15 минут.

После охлаждения, белая плесень коджи (Aspergillus kawachii NBRC4308) была высажена до концентрации 1×10⁶ на мл в среду для предварительного выращивания и выращивалась встряхиванием при 37°С и 100 оборотах в минуту в течение 24 часов. Эта среда определялась как среда для предварительного выращивания.

2. Метод главного выращивания

100 мл жидкой культуры соответственно готовились как пять экспериментальных диаграмм, каждая из которых содержала 2,0% (вес./об.) ячменя с показателем обработки 98% (сырой ячмень Стирлинг, сделано в Австралии), 0,2% (вес./об.) нитрата калия, 0,3% (вес./об.) первичного кислого фосфористокислого калия, 0,1% (вес./об.) сульфатированного гептагидрата магния и 0,082% (вес./об.) хлорированного гексагидрата магния в пропорции, указанной в Таблице 7. Эти пять жидких сред были соответственно помещены в 500-миллилитровую конусообразную колбу с выступами и автоклавированы при 121°С в течение 15 минут до стерильного состояния.

Таблица 7   Состав среды Экспериментальная диаграмма 1 2%-сырой ячмень 0,2% KNO₃ 0,3% KH₂PO₄ - - Экспериментальная диаграмма 2 2%-сырой ячмень 0,2% KNO₃ 0,3% KH₂PO₄ 0,1%
MgSO₄.7H₂O - Экспериментальная диаграмма 3 2%-сырой ячмень 0,2% KNO₃ 0,3% KH₂PO₄ - 0,082% MgCl₂ ^.6H₂O Экспериментальная диаграмма 4 2%-сырой ячмень - 0,3% KH₂PO₄ 0,1%
MgSO₄.7H₂O - Экспериментальная диаграмма 5 2%-сырой ячмень 0,2% KNO₃ - 0,1%
MgSO₄.7H₂O -

После охлаждения, 1 мл жидкости предварительного выращивания был высажен в главную среду для выращивания и все это выращивалось встряхиванием при 37°С и 100 об/мин в течение 48 часов. Эта среда определялась как среда для предварительного выращивания. Следует отметить, что количество добавляемого хлорированного гексагидрата магния рассчитывалось из молярной концентрации, соответствующей 1,0% хлорированного гексагидрата магния, то есть 8,12 мМ, так, чтобы концентрации ионов магния в среде на каждой экспериментальной диаграмме нитрата стали одинаковыми.

3. Метод определения ферментативной активности

По окончании выращивания, были определены активности глюкоамилазы (GA) и кислотоустойчивой α-амилазы (ASAA), являющихся амилолитическими ферментами.

Активность глюкоамилазы (GA) была определена набором для фракционного количественного анализа степени засахаривания (a saccharification power fractional quantification kit) (выпускаемый Kikkoman). Для измерения активности кислотоустойчивой α-амилазы, метод, описанный в Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), and Shigetoshi Sudo et al: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774(1994), был немного модифицирован. То есть кислотоустойчивая α-амилаза была инактивирована путем обработки продукта культивирования кислотой, после чего активность кислотоустойчивой α-амилазы была измерена с помощью α-амилазного измерительного набора (выпускаемого Kikkoman). Если более точно, то в 9 мл 100 мМ ацетатного буфера (pH 3) добавлялся 1 мл культуры, обработка кислотой проводилась при 37°С в течение 1 часа, после чего производилось измерение с помощью α-амилазного измерительного набора (выпускаемого Kikkoman).

В то же самое время были определены активности целлюлазы (CEL), являющейся целлюлолитическим ферментом, и кислотной карбоксипептидазы (ACP), являющейся одним из протеолитических ферментов.

Активность целлюлазы (CEL) была измерена методом количественного анализа количества восстановленного сахарида, который генерируется путем гидролиза карбоксиметилцеллюлозы (CMC) в качестве субстрата, методом динитросалициловой (DNS) кислоты. Если более точно, то 1 мл раствора культуры был добавлен к 1 мл 1%-го раствора субстрата СМС (низкая вязкость^ТМ, производимая Sigma-Aldrich, была растворена в 100 мМ ацетатного буфера (pH 5)), и все это было подвергнуто ферментативной реакции при 40°С в точности на 10 минут. После этого к смеси добавили 4 мл реагента DNS, содержащего 0,75% динитросалициловой кислоты, 1,2% гидроокиси натрия, 22,5% тетрагидрата натрий-калиевого тартрата и 0,3% моногидрата лактозы, и все это было хорошо перемешано, чтобы таким образом остановить реакцию. Для того, чтобы численно выразить количество восстановленного сахарида в растворе, в котором остановлена реакция, этот раствор был нагрет в ванне с кипящей водой в точности на 15 минут. В дальнейшем, после того, как раствор был охлажден до комнатной температуры, было определено поглощение на длине волны 540 нм, чтобы таким образом рассчитать количество восстановленного сахарида, соответствующего глюкозе. Одна единица активности целлюлазы (CEL) была представлена количеством фермента, требуемого для производства восстановленного сахарида, соответствующего 1 мкМ глюкозы в минуту.

Активность кислотной карбоксипептидазы (ACP) была определена при использовании набора для измерения кислотной карбоксипептидазы (выпускаемый Kikkoman).

Фиг.7 иллюстрирует результаты определения.

Как показано на Фиг.7А, активность глюкоамилазы была значительно улучшена на экспериментальной Диаграмме 2, то есть диаграмме, соответствующей добавлению сульфата магния. В дополнение к этому, как показано на Фиг.7C и 7D, активности целлюлазы и кислотной карбоксипептидазы были также улучшены на экспериментальной Диаграмме 2, то есть диаграмме, соответствующей добавлению сульфата магния. С другой стороны, активность не была улучшена на экспериментальной Диаграмме 3, соответствующей добавлению хлорида магния, то есть, такой же соли магния, так что было предложено, что радикал сульфата служит в качестве основной причины для этих благоприятных эффектов в производительности фермента.

В дополнение к этому, благоприятные эффекты в производительности фермента не наблюдаются на экспериментальных Диаграммах 4 и 5, соответствующих добавлению сульфата магния, но не нитрата калия или первичного кислого фосфористокислого калия. Соответственно, было найдено, что производительность ферментов была значительно улучшена, когда соли нитрата, фосфатной соли и сульфатной соли были включены одновременно.

Как описано выше, когда плесень коджи разводится с использованием жидкой среды, в которую добавлены зерна, поверхность которых покрыта шелухой (например, сырой ячмень), соли нитрата, фосфатной соли и сульфатной соли, может производиться жидкий коджи, содержащий в большом количестве целлюлазу, являющуюся целлюлолитическим ферментом, и кислотную карбоксипептидазу, являющуюся протеолитическим ферментом, в дополнение к ферментам, требуемым для производства шочу и тому подобного, таких, как глюкоамилаза и кислотоустойчивая α-амилаза.

Пример 8

В качестве плесени коджи использовали черную плесень коджи штамм Aspergillus awamori NBRC 4388, а в качестве исходного зернового материала использовали шесть типов ячменя, каждый их который имел свою степень очистки от шелухи («шлифовки»).

Сырой ячмень, использованный для очистки, был австралийским ячменем сорта «Stirling», шлифовали до заданной степени очистки с использованием полировальной машины ТМ05С фирмы Satake К.К., или сырой ячмень подвергали дроблению. Степень очистки от шелухи было выражено в весовых процентах от веса ячменя после полирования, где неполированный ячмень приняли за 100%. Например, степень очистки 65% означает, что при полировке удалено 35 вес.% внешнего слоя.

Сначала приготавливали жидкую среду, в которую добавляли каждый образец ячменя с разной степенью очистки от шелухи и дробленого ячменя.

В качестве жидкой среды использовали водный раствор, содержащий 0,2 вес./об.% нитрата калия и 0,3 вес./об.% дигидрофосфата калия. Образцы ячменя добавляли в количестве 2 вес./об.%.

100 мл аликвоты жидкой среды помещали в 500 мл коническую колбу, которую закупоривали и автоклавировали, после чего черную плесень коджи вводили в жидкую среду в количестве 2 вес./об.% от объема жидкой среды и культивировали в течение 72 часов при температуре 37°С и скорости встряхивания колбы 100 об./мин.

После культивирования, в каждом образце измеряли глюкоамилазную активность (GA) и кислото-устойчивую альфа-амилазную активность (ASAA) методом, описанным в примере 1.

Глюкоамилазные и кислотостабильные альфа-амилазные активности показаны ниже на графиках Фиг.8(А), (В).

Результаты показали, что чем выше степень очистки ячменя, тем выше ферментная активность. Конкретнее, ферментная активность заметно снизилась при степени очистки около 80%. Также слабая ферментная активность была получена с дробленым ячменем. Соответственно, был сделан вывод, что при культивировании важное значение имеет захват крахмального компонента шелухой.

Пример 9

В качестве плесени коджи использовали белую плесень коджи штамм Aspergillus kawachii NBRC 4308, а в качестве исходного зернового материала использовали неочищенное пшеничное зерно "Sanuki-no-yume 2000".

Сначала приготавливали жидкую среду, в которую вносили неочищенное пшеничное зерно в количестве 2,0% (вес./об.), нитрат калия в количестве 0,8% (вес./об.) и дигидрофосфат калия в количестве 0,8% (вес./об.).

100 мл жидкой среды помещали в 500 мл коническую колбу, которую закупоривали и автоклавировали при 121°С в течение 15 минут. Предварительно выращенную в жидкой культуре белую плесень коджи вводили в стерилизованную жидкую среду в количестве 2% (вес./об.).

Культивирование проводили в течение 42 часов при 37°С и с перемешиванием со скоростью 100 об./мин.

После завершения культивирования полученный продукт исследовали на глюкоамилазную активность (GA) и кислотостабильную альфа-амилазную активность (ASAA) методом, описанным в примере 1.

Ферментативные активности полученного продукта показаны ниже в Таблице.

Пример 10

В качестве плесени коджи использовали белую плесень коджи штамм Aspergillus kawachii NBRC 4308, а в качестве исходного зернового материала использовали неочищенный рис "Koshishikari".

Сначала приготавливали жидкую среду, содержащую 0,2% (вес./об.) нитрата калия, в которую вносили неочищенный рис в количестве 2,0% (вес./об.).

100 мл жидкой среды помещали в 500 мл коническую колбу, которую закупоривали и автоклавировали. Предварительно выращенную в жидкой культуре белую плесень коджи вводили в стерилизованную жидкую среду в количестве 1% (вес./об.).

Культивирование проводили в течение 48 часов при 37°С и с перемешиванием со скоростью 100 об./мин. После завершения культивирования полученный продукт исследовали на глюкоамилазную активность (GA) и кислотостабильную альфа-амилазную активность (ASAA) методом, описанным в примере 1. Ферментативные активности полученного продукта показаны ниже в Таблице 8 по примерам 9 и 10

Таблица 8   Исходные материалы Ферментативная активность (ед./мл) GA ASAA Пример 9 Неочищенное пшеничное зерно 202,7 17,6 Пример 10 Неочищенный рис 260 11

Результаты, приведенные в таблице, подтверждают возможность достижения высоких уровней GA и ASAA также при использовании пшеницы и риса, не подвергавшихся удалению шелухи, причем достигнутые уровни ферментативной активности были даже выше, чем в Примере 1, где использовался ячмень со степенью обработки 95%.

Благодаря большому количеству целлюлолитических ферментов, может ожидаться понижение вязкости сусла или повышение выхода алкоголя при производстве шочу, и если аминокислотные компоненты в сусле шочу увеличиваются благодаря большому количеству протеолитических ферментов, то можно получить шочу с великолепным вкусом.

В дополнение к этому, в соответствии со способом настоящего изобретения, ожидается, что ферменты, производимые плесенью коджи, такие, как амилолитические ферменты, целлюлолитические ферменты и протеолитические ферменты, но не те, о которых здесь говорилось, в целом производятся в больших количествах.

В соответствии с настоящим изобретением, является возможным, что не только продуктивность амилолитических ферментов в жидком коджи значительно улучшается, но и получается жидкий коджи, содержащий большие количества целлюлолитических и протеолитических ферментов. Далее, жидкое культивирование можно строго контролировать по сравнению с твердым культивированием, так что жидкий коджи, имеющий стабильное качество, может дешево эффективно производиться.

Путем применения жидкого коджи, полученного, в соответствии с настоящим изобретением, для производства ферментированных пищевых продуктов и напитков, таких, как шочу, выход алкоголя и количество производимых аминокислот могут быть увеличены, в силу чего можно эффективно производить ферментированные пищевые продукты и напитки, имеющие великолепный вкус.

Более того, зерна, используемые в настоящем изобретении, являются необработанными или обработанными до такой степени, что, по меньшей мере, на поверхности остается шелуха. Таким образом, можно ожидать улучшение в плане доступности сырья и выхода продукта.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ заключается в том, что выращивают белую плесень коджи или черную плесень коджи в жидкой среде в течение 48 ч при температуре 37°С и с перемешиванием 100 об./мин. Жидкая среда содержит источник азота, выбранный из группы, состоящей из: дрожжевых клеток, дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, шелухи и отрубей зерновых или их смеси с нитратной солью в концентрации 0,05-2,0% вес./об. В жидкую среду дополнительно добавляют фосфатную соль в концентрации 0,05-1,0% (вес./об.) и сульфатную соль в концентрации 0,01-0,5% (вес./об.). В качестве сырьевого материала используют зерно ячменя (степень обработки 93%), пшеницу или рис, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой. Определяют активность ферментов полученного коджи. Способ позволяет получить жидкий коджи, обладающий высокой ферментативной активностью, и один, два или более ферментов из группы, состоящей из амилолитического, целлюлолитического и протеолитического фермента. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл.

1. Способ получения жидкого коджи, предусматривающий культивирование белой плесени коджи или черной плесени коджи в жидкой среде, содержащей источник азота, путем использования в качестве исходного материала зерна, поверхность которого полностью или частично покрыта шелухой, причем указанное зерно включает ячмень, пшеницу или рис.

2. Способ по п.1, в котором источник азота включает нитратную соль.

3. Способ по п.1, в котором источник азота включает, по меньшей мере, один материал, выбранный из группы, состоящей из дрожжевых клеток, дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, шелухи и отрубей зерновых, или их смеси с нитратной солью.

4. Способ по п.1, в котором жидкая среда содержит нитратную соль в концентрации от 0,05 до 2,0% (вес./об.).

5. Способ по п.2, в котором жидкая среда дополнительно содержит фосфатную соль.

6. Способ по п.5, в котором жидкая среда содержит фосфатную соль в концентрации от 0,05 до 1,0% (вес./об.).

7. Способ по п.5, в котором жидкая среда дополнительно содержит сульфатную соль.

8. Способ по п.7, в котором жидкая среда содержит сульфатную соль в концентрации от 0,01 до 0,5% (вес./об.).

9. Способ по п.1, в котором коджи включает один, два или более ферментов из группы, состоящей из амилолитического фермента, целлюлолитического фермента и протеолитического фермента.

10. Способ по п.1, в котором зерно включает ячмень.

11. Способ по п.10, в котором ячмень имеет степень обработки не менее 93%.

12. Жидкий коджи, полученный способом по любому из пп.1-11.

13. Способ получения фермента, в котором фермент получают путем культивирования жидкого коджи способом по п.1.

14. Способ по п.13, в котором источник азота включает нитратную соль.

15. Способ по п.13, в котором источник азота включает, по меньшей мере, один материал из группы, состоящей из дрожжевых клеток, дрожжевого автолизата или дрожжевого экстракта, шелухи и отрубей зерновых, или их смеси с нитратной солью.

16. Способ по п.14, в котором жидкая среда содержит нитратную соль в концентрации от 0,05 до 2,0% (вес./об.).

17. Способ по п.14, в котором жидкая среда дополнительно содержит фосфатную соль.

18. Способ по п.17, в котором жидкая среда содержит фосфатную соль в концентрации от 0,05 до 1,0% (вес./об.).

19. Способ по п.17, в котором жидкая среда дополнительно содержит сульфатную соль.

20. Способ по п.19, в котором жидкая среда содержит сульфатную соль в концентрации от 0,01 до 0,5% (вес./об.).

21. Способ по п.13, в котором фермент включает один или два или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из амилолитического фермента, целлюлолитического фермента и протеолитического фермента.

22. Способ по п.13, в котором зерно, используемое в качестве исходного материала, включает ячмень.

23. Способ по п.22, в котором ячмень имеет степень обработки не менее 93%.
Приоритет пунктов формулы изобретения следующий:
пп.1-5, 9-19, 23 имеют приоритет от 22.07.2005 по заявке 2005-212290 JP,
пп.6, 7, 8, 20, 21 и 22 имеют приоритет от 04.10.2005 по заявке 2005-290651 JP.