ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS AWAMORI - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Российский патент 2003 года по МПК C12N9/34 C12N1/14 C12N9/34 C12R1/665 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, различным областям пищевой биотехнологии и может быть использовано для получения глюкоамилазы с целью ее дальнейшего применения для ферментативной обработки крахмалсодержащего сырья в спиртовой, крахмалопаточной, хлебопекарной и пивоваренной промышленности.

В качестве продуцентов амилолитических ферментов наиболее часто используют плесневые грибы рода Aspergillus видов oryzae, usamii, awamori, batatae; рода Rhizopus видов delemar, fonkinsis, neveus, tonnensis, japonicum, topnineusis, а также отдельные представители Neurospora crassa и Mucor. Дрожжи и дрожжеподобные микроорганизмы родов Candida, Saccharomyces, Endomycopsis и Endomyces также способны синтезировать ферменты амилолитического действия.

Как правило, природные микроорганизмы образуют комплекс амилолитических ферментов, способных гидролизовать растительные субстраты на основе крахмалистых углеводов. В этот комплекс входят α-амилазы и глюкоамилазы, гидролизующие молекулы крахмала до α-амилазы и глюкоамилазы, гидролизующие молекулы крахмала до глюкозы и декстринов различной молекулярной массы; протеазы, разрушающие белок сырья до аминокислот, являющихся ценным азотистым питанием для дрожжей; глюканазы, которые интенсифицируют процесс ферментативной обработки сырья за счет гидролиза некрахмалистых полисахаридов; пектиназы, разрушающие пектин, другие ферменты литического действия.

Получаемые в настоящее время полиферментные препараты имеют различный ферментный состав и различаются по уровню активности отдельных ферментов. В целом известные полиферментные препараты с амилолитической активностью нуждаются в улучшении их функциональных характеристик, что повысит эффективность их промышленного применения.

Особый интерес представляют ферментные препараты с повышенной активностью глюкоамилазы.

Глюкоамилаза - (α-1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.3.) -глюкозообразующая амилаза, экзофермент, атакует крахмал с нередуцирующего конца полисахаридной цепочки, последовательно отщепляя глюкозные остатки и полностью превращая крахмал в глюкозу. У большинства выделенных глюкоамилаз микробного происхождения проявляются некоторые общие свойства. Как правило, это кислотостабильные ферменты с оптимумом рН 4,5-5,0, оптимумом температуры 55-60^oС. Кроме специфичных α-1,4- глюкановых связей глюкоамилазы гидролизуют α-1,6 связи как в полисахаридах, так и в низкомолекулярных олигосахаридах. Под их действием крахмал полностью гидролизуется до глюкозы.

Способность глюкоамилазы гидролизовать как α-1,4, так и α-1,6 связи с отщеплением глюкозы ставит этот фермент на первое место по эффективности гидролиза крахмала с целью дальнейшего сбраживания образовавшегося сахара.

В спиртовой, крахмало-паточной, хлебопекарной промышленности необходим глубокий гидролиз крахмала. Обычно гидролиз осуществляют в две стадии: на первой стадии проводят обработку α-амилазой (стадия разжижения крахмала), затем оклейстеризованную и разжиженную суспензию при температуре не выше 60^oС и рН 5,0-5,5 обрабатывают глюкоамилазой (стадия осахаривания крахмала). В результате совместного действия ферментов степень гидролиза крахмала достигает 98-99%.

Однако несмотря на высокую рентабельность данной технологии, эффективность процесса ферментативной обработки крахмала может быть повышена за счет применения высокоактивных ферментных препаратов. При этом достигается значительное снижение стоимости ферментативной обработки сырья за счет сокращения дозировки ферментов и продолжительности процесса гидролиза, обеспечивается высокая степень деструкции крахмала и как следствие этого увеличение выхода конечного продукта.

В настоящее время при промышленном получении продуктов гидролиза крахмала - декстрозы, глюкозофруктозных сиропов, на стадии осахаривания главным образом используют глюкоамилазы продуцентов, относящихся к роду Aspergilllus: Asp. niger. Asp. awamori, Asp. oryzae (1-5), оптимальные условия действия которых рН 5,0, 55^oС.

Известны рекомбинантные и мутантные штаммы продуцентов глюкоамилазы гриба Aspergillus niger. Описаны штаммы: Asp. niger, синтезирующий 150 ед/мл глюкоамилазы (1); Asp. niger В1-Д, проведены исследования по влиянию условий аэрации на рост микроорганизма и биосинтез фермента (2); Asp. niger N 402 В 1, полученный на основе природного штамма, содержит 20 копий гена глюкоамилазы (3); Asp. niger B0 -1 (4). Asp. oryzae - мутант, синтезирует как глюкоамилазу, так и амилазу (5).

Использование рекомбинантных штаммов связано с необходимостью проведения постоянных исследований по поддержанию штаммов в стабильном и активном состоянии, созданием специальных условий культивирования, которые не всегда доступны при промышленном ведении процесса.

Известны и широко используются для осахаривания крахмалсодержащего сырья при промышленном получении декстрозы, глюкозофруктозных сиропов, этанола плесневые грибы вида Asp. awamori.

Достаточно активными в отношении синтеза глюкоамилазы из известных грибов Asp. awamori являются Asp. awamori 466, синтезирующий при выращивании на среде с кукурузной мукой при использовании осахаривания солодовым молоком и солодового сусла с диаммонийфосфатом на 184 ч роста 183 ед/мл фермента (6), и Asp. awamori ВУД Т-2 F 203, при культивировании которого на среде с кукурузной мукой при осахаривании солодовым молоком или бактериальной амилазой при специальной подготовке посевного материала и многостадийности процесса удается на 130 ч культивирования получить активность глюкоамилазы равной 200 ед/мл (7).

Наиболее близким аналогом по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Aspergillus awamori ВНИИгенетика 120/177 ЦМПМ F-166 (8). Штамм, выращенный на агаризованной среде с кукурузным экстрактом, для получения посевного материала культивируют на среде, содержащей крахмал, солодовые ростки и минеральные соли. Ферментационная среда содержит кукурузную муку, кукурузный экстракт, бактериальную амилазу. Культивирование осуществляют при 28^oС в течение 120 ч. Уровень активности глюкоамилазы составляет 240 ед/мл. Для повышения синтетической активности штамма используют 2-стадийную подготовку посевного материала, включающую сначала получение спорового материала на среде с пшеничными отрубями, затем проращивание его на жидкой среде ферментационного состава и последующее культивирование на среде, содержащей кукурузную муку, крахмал, БВК, амилосубтилин и диаммонийфосфат, при 34^oС. Активность глюкоамилазы на 120 ч культивирования составляет 340 ед/мл.

Недостатком описанного штамма является необходимость для получения достаточно высокой активности культуральной жидкости использования многостадийной подготовки посевного материала и для основного процесса ферментации обогащенной питательной среды.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, расширение арсенала штаммов-продуцентов глюкоамилазы.

Технический результат заключается в получении нового высокопродуктивного штамма-продуцента, не требующего для синтеза продукта сложных высоконцентрированных сред и сложных приемов культивирования штамма.

Сущность объекта изобретения - новый специально селекционированный штамм Aspergillus awamori N 400 - продуцент глюкоамилазы.

Штамм Aspergillus awamori депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под N ВКМ F- 3689 D.

Штамм получают с помощью многоступенчатой генетической селекции исходного штамма Aspergillus awamori BKM F-758 с использованием методов мутагенеза - ультрафиолетового облучения с одновременным воздействием химических мутагенов.

Суспензию спор исходного штамма (титр разведения - 10^-4-10^-6) облучают ультрафиолетом в 20%-ном глицерине в течение 4-5 мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, выживаемость при этом составляет 1-2%. Засеянные чашки инкубируют в течение 7 сут при 35^oС и дополнительно выдерживают 7 сут при 22-23^oС. Каждую выросшую колонию пересевают на чашки, содержащие агаризованные среды с добавлением в качестве единственного источника углерода крахмал.

Интенсивность синтеза глюкоамилазы мутантных клонов тестируют по величине отношения диаметра просветления крахмала к диаметру колонии (D=Dзпк/Dк). Клоны, имеющие значение D в 2- 4 раза выше, чем в контроле, тестируют на эффективность синтеза глюкоамилазы при периодическом культивировании на жидких средах в колбах. Наиболее продуктивный вариант снова подвергают УФ-облучению и селекции, как описано выше.

Условия хранения: штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой Чапека или Мальц-агаре при +4^oС с обязательным пересевом не реже одного раза в 3 месяца.

Культурально-морфологические признаки штамма
Макроскопические характеристики: колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 25^oС, имеют диаметр 70-71 мм/7сут, радиально-бороздчатые, поверхность бархатистая, край тонкий, конидиальная область - темно-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 37^oС, имеют диаметр 70-71 мм/7сут., культуральные характеристики схожи с таковыми на CYA, 25^oС.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S), 25^oС, имеют диаметр колонии 68 - 70 мм/7сут., слабо радиально-бороздчатые, поверхность порошистая, край тонкий, конидиальная область темно-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Микроскопические характеристики: конидиальные головки шаровидные, затем рыхлорадиальные, распадающиеся на отдельные колонки, конидиеносцы слабоокрашенные в терминальной части, гладкостенные 250-1200 х 6 -12 мкм, аптикальные расширения шаровидные 20-45 мкм в диаметре, покрыто стеригмами по всей поверхности. Стеригмы преимущественно двухъярусные, метулы 6-16 х 3,5 -7 мкм, фиалиды 5-8 х 2 - 4 мкм. Конидии шаровидные, 3,5-6 мкм, гладкие.

Физиолого-биохимические свойства штамма
Отношение к сахарам
Культура штамма хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, и слабо - мальтозу, лактозу, галактозу и рамнозу.

Крахмал гидролизует до глюкозы.

Хорошо ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты. Пептонизирует молоко.

Температурный оптимум роста 34-35^oС, рН 4,5-6,0. Аэроб.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении о порядке учета, хранение обращения, отпуска и пересылки культур бактерии, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Полученный мутант по своим морфологическим свойствам отличается от исходного интенсивностью спороношения, цветом пигмента спор, окраской колонии с обратной стороны при выращивании на агаризованных средах, более коротким циклом роста, образованием более обильной биомассы, повышенной способностью к биосинтезу глюкоамилазы при глубинном культивировании на жидких средах.

При рассеве штамма на селективные среды наблюдается выщепление 3-6% нетипичных колоний, что свидетельствует о высокой морфологической стабильности штамма, а следовательно, о его стабильности к продукции глюкоамилазы при длительном культивировании.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35^oС в течение 120-144 ч, рН среды 5,2-5,5. Для роста культуры и биосинтеза глюкоамилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, экструдат муки злаковых культур (кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи), аммонийный азот, кукурузный экстракт.

Штамм обладает повышенной способностью к синтезу глюкоамилазы, а также продуцирует незначительные количества α-амилазы, протеазы и β-глюканазы.

Для ферментативной обработки крахмалосодержащего сырья при производстве спирта ферментный препарат может быть использован в виде культуральной жидкости или в виде концентрированных препаратов, получаемых известными биохимическими методами, например осаждением этанолом из ультрафильтрата культуральной жидкости.

Глюкоамилаза активна в широком диапазоне рН - от 3,5 до 7,5 с оптимумом при рН 4,5-5,0; в диапазоне температуры от 30 до 65^oС с оптимумом при 60 - 62^oС. Глюкоамилаза стабильна в течение 2 ч при 45^oС. Инкубирование при температуре 55^oС в течение 2 ч приводило к снижению активности на 50%.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал (инокулюм) получают выращиванием штамма Aspergillus awamori BKM F-3689 D на твердой питательной среде, состоящей из 50% пшеничных отрубей и 50% солодовых ростков, увлажненных водопроводной водой до 60%, рН среды - 5,2-5,5. Выращиваие спорового посевного материала осуществляют в колбах, содержащих 20-30 г твердого субстрата, в стационарных условиях при температуре 35^oС в течение 5-6 сут и при 22-23^oС в течение 7 сут.

Полученный посевной материал в количестве 0,08-0,1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды состава, г/л: кукурузная мука - 240,0; водопроводная вода - остальное, рН среды 5,2-5,5.

Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35^oС на качалке с 240 об/мин в течение 120-144 ч. Каждые 24 ч, начиная с 72 ч роста, отбирают пробы, в которых определяют способность культуральной жидкости гидролизовать крахмал.

Метод определения активности глюкоамилазы основан на определении глюкозы, образовавшейся при гидролизе растворимого крахмала ферментом (9).

За единицу глюкоамилазной активности принимают такое количество фермента, которое, действуя на растворимый крахмал при 30^oС и рН 4,7 в течение 1 мин, освобождает 1 мкмоль глюкозы.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 120 ч роста составляет 400 ед/мл, на 144 ч роста - 450 ед/мл. Удельная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости равна 15,5 ед/мг белка.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в ферментационной среде вместо кукурузной муки используют экструдат кукурузной муки в количестве 250 г/л.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 144 ч роста 500 ед/мл.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но ферментационная среда вместо кукурузной муки содержит пшеничную муку в количестве 180 г/л.

Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 144 ч роста 380 ед/мл.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus awamori BKM F- 3689 D позволяет значительно повысить глюкоамилазную активность в культуральной жидкости и, следовательно, увеличить эффективность использования ферментных препаратов на основе этого штамма в различных областях биотехнологии.

Кроме того, для получения высокой продуктивности штамма не требуется применения сложных питательных сред и сложных приемов культивирования продуцента. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

ЛИТЕРАТУРА
1. Патент США N 4335208, кл.195-5, опубл. 1982 г.

2. Wongwicham A et. al.: Biotechnol. Bioeng, Nov 20; 65(4), 1999.

3. Withersy M et. al.: Biotechnol. Bioeng., 1998, Aug 20; 59(4), 407-418.

4. Pederson et. al. : Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, Mar 53(3), 272-276.

5. Bocring Sp.: Biotechnol. Bioeng, 1999, Dec 20; 65(6), 638-648.

6. Авторское свидетельство СССР N 800185, кл.С 12 D 13/10, опубл. 1981 г.

7. Авторское свидетельство СССР N 1094346, кл.С 12 N 9/34, опубл. 1985 г.

8. Авторское свидетельство СССР N 1271068, кл.С 12 N 9/34, опубл. 1994 г.

9. ГОСТ 20264-4.89.

Изобретение относится к биотехнологии, может применяться для осахаривания крахмалистого сырья в различных отраслях пищевой промышленности, где требуются высокоактивные ферментные препараты, устойчивые к кислым значениям рН. Штамм Aspergillus awamori N 400 ВКМ F-3689 D получен многоступенчатой генетической селекцией исходного штамма Aspergillus awamori ВКМ F-758 с применением ультрафиолетового облучения с одновременным воздействием химических мутагенов. Штамм обладает высокой глюкоамилазной активностью. Глюкоамилаза активна в диапазоне рН 3,5-7,5 и температуре 30-65^oС. Для получения высокой продуктивности штамма могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов, не требуются сложные приемы культивирования продуцента.

Штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori BKMF-3689 D (Всероссийская коллекция микроорганизмов при ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН) - продуцент глюкоамилазы.