ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS ORYZAE - ПРОДУЦЕНТ КИСЛОЙ АЛЬФА-АМИЛАЗЫ Российский патент 2009 года по МПК C12N9/28 C12R1/69 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности при производстве кислой α-амилазы, применяемой в различных областях промышленности и сельского хозяйства для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья, а именно в хлебопечении, спиртовой, пивоваренной, кондитерской и крахмалопаточной промышленности (выработка паток, сиропов, глюкозы), при производстве крупяных изделий, овощных продуктов, изделий из фруктов (соков, сиропов, экстрактов, варений, пектина), детского питания, в текстильной, бумажной промышленности при производстве моющих средств, а также в медицине.

α-Амилаза (α-1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.1.) является ферментом амилолитического действия, относится к классу гидролаз, подклассу гликозидаз, гидролизует внутренние α-1,4-глюкозидные связи в крахмале, гликогене и родственных им поли - и олигосахаридах, приводя к образованию мальтодекстринов различной молекулярной массы, мальтотриозы, изомальтозы и глюкозы.

По составу конечных продуктов гидролиза крахмала α-амилазы подразделяются на два типа - декстринирующие (разжижающие), приводящие к образованию мальтоолигосахаридов (мальтопентаозы и мальтогексаозы), и сахарогенные, приводящие к образованию в основном мальтозы (и глюкозы).

Роль кислой α-амилазы в процессах биоконверсии крахмалосодержащего сырья в настоящее время значительно возросла в связи с разработкой и реализацией технологии производства топливного этанола из крахмалосодержащего сырья, предусматривающей использование низкотемпературной водно-тепловой обработки с применением высокоактивных и кислотоустойчивых ферментных препаратов кислой α-амилазы и глюкоамилазы. Совместное использование ферментов способствует увеличению скорости и глубины деструкции крахмала, в результате степень гидролиза крахмала достигает 98-99%, при этом эффективность процесса ферментативной обработки может быть значительная повышена за счет применения высокоактивных ферментных препаратов.

Известны микроорганизмы различных таксономических групп - продуценты амилаз и способы их культивирования в аэробных условиях. Выбор штамма-продуцента зависит от его способности обеспечить высокий уровень активности в культуральной жидкости, скорости биосинтеза, выхода ферментов с единицы использованного субстрата, стоимости субстрата.

В мировой практике для промышленного получения продуктов гидролиза крахмала используют, главным образом, амилазы, образуемые грибами, относящиеся к роду Aspergillus с желто-зеленым пигментообразованием: Asp.flavus Asp.oryzae, Asp.glauscus, Asp.ochraceusi, Asp.fumigatus, в том числе рекомбинантными. Применение рекомбинантных штаммов существенно усложняет процесс получения ферментных препаратов. Это связано, в первую очередь, с необходимостью проведения постоянных исследований по поддержанию штаммов в стабильном и активном состоянии, созданием специальных условий культивирования, не всегда доступных при промышленном ведении процесса.

В настоящее время в России препараты кислых α-амилаз не производятся, главным образом, из-за низкой активности имеющихся продуцентов. Выпускаемый в промышленном масштабе ПО «Сиббиофарм» (г.Бердск) Амилосубтилин Г3х - ферментный препарат α-амилазы на основе штамма бактерий Bacillus subtilis, обладает несколько иными свойствами, чем кислая α-амилаза, являясь препаратом разжижающего действия, проявляющего максимальную активность в нейтральной и слабощелочной зоне.

Известен штамм плесневелого гриба Asp.oryzae 740-А2 - активный продуцент α-амилазы (Калунянц К.А. и Голгер Л.И. Микробные ферментные препараты. М.: Пищевая промышленность, 1979, стр.8-9). Активность получаемой α-амилазы составляет 200,0 ед/г сухого вещества.

Недостатком известного штамма следует признать нестабильную активность α-амилазы при культивировании его в производственных условиях, а также повышенную восприимчивость к инфекциям.

Известен (US, патент 4,593,005) штамм Asp.oryzae - продуцент кислой α-амилазы, способной гидролизовать гранулированный крахмал. При культивировании в колбах на твердой или жидкой среде при температуре 45°С и рН от 4,0 до 7,0 он обеспечивает максимальную активность фермента после 168 ч роста - 12 ед. в 1 мл культуральной жидкости. В питательных средах в качестве источника углерода могут быть использованы крахмал, кукурузная крупка, пшеничная мука, меласса, в качестве источника азота - пептон, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, казеин, кукурузный экстракт, солодовый экстракт, соевое масло, неорганические аммонийные соли, нитраты. Кроме того, для обеспечения нормального роста продуцента и биосинтеза фермента необходимо присутствие в питательных средах следующих неорганических солей: KH₂PO₄, FeSO₄, MgSO₄, KCl, CaCl₂, CoCl₂, MnSO₄.

Известен (SU, авторское свидетельство 1158579) штамм микроскопического гриба Asp.oryzae НРВ-169 (коллекция Центрального Музея промышленных микроорганизмов «ВНИИГенетика», коллекционный номер ЦМПМ F-257) - продуцент α-амилазы. В качестве источника углерода может использовать крахмал картофельный или кукурузный. Активность α-амилазы составляет 40-55 ед/мг. Его недостатком следует признать низкую активность относительно кислой α-амилазы.

Известен также (RU, патент 2070921) штамм Asp.oryzae 387 (ВКПМ F-683) - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов. При культивировании на питательной среде, содержащей, %: ячменная мука - 3,0; отруби - 3,0; КН₂PO₄ - 1,5; водопроводная вода, рН естественный, в аэробных условиях при 28-30°С в течение 42-48 ч штамм синтезирует комплекс кислых и слабокислых протеаз с общей протеолитической активностью 11,5 ед ПС/мл, кислую α-амилазу с активностью 12 ед на 1 мл КЖ, а также сопутствующие ферменты целлюлолитического комплекса. Однако заявляемая амилолитическая активность штамма Asp.oryzae 387 очень низкая, что делает его практическое применение с этой точки зрения нецелесообразным.

Известен (SU, авторское свидетельство 1440922) штамм Asp.oryzae ВКПМ F-369 - продуцент амилолитических и протеолитических ферментов. При культивировании на питательной среде, содержащей, %: ячменная мука - 14,0; соевая мука - 0,5; КН₂PO₄ - 0,5; водопроводная вода, рН естественный, в аэробных условиях при 28°С в течение 96 ч штамм синтезирует комплекс кислых и слабокислых протеаз, при этом ферментативные активности составляют по АС - 20,7, по ПС - 17,3 ед/мл. Однако заявляемая амилолитическая активность штамма Asp.oryzae ВКПМ-F-369 очень низкая, что делает его практическое применение с этой точки зрения нецелесообразным.

Известен штамм Asp.awamori М-2002 (ВКМ F-3771D) (Семенова М.В. и др. Микробные биокатализаторы для перерабатывающих отраслей АПК - М.: ВНИИПБТ, 2006, 304 с.). При культивировании в глубинных условиях в течение 192 ч на питательной среде, при использовании в качестве источника углерода гидролизата муки злаковых культур штамм синтезирует глюкоамилазу с активностью 800-1080 ед/мл. Введение солей CaCO₃, MgSO₄ или комплексного соединения углекислых солей кальция и магния (или окиси магния) в питательные среды способствует стабилизации рН среды в течение всей ферментации на уровне от 5,9 до 6,4, что приводит к изменению направленности процесса биосинтеза в сторону увеличения синтеза кислой α-амилазы. Таким образом, изменяя условия культивирования штамма Asp.awamori М-2002, можно получать высокоактивные комплексные ферментные препараты, обладающие глюкоамилазной и α-амилазной активностью. Однако, являясь на текущий момент высокоактивным продуцентом глюкоамилазы, штамм Asp.awamori М-2002 в отношении синтеза α-амилазы находится на относительно низком уровне продуктивности, обеспечивая максимальную α-амилазную активность на уровне 60-80 ед/мл культуральной жидкости на 192 ч роста.

Недостатками всех вышеперечисленных продуцентов являются низкая продуктивность штаммов применительно к кислой α-амилазе и сложность способа их культивирования. Высокоактивные продуценты недоступны для организации отечественного производства, поскольку являются собственностью зарубежных фирм-производителей.

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в получении нового высокопродуктивного штамма мицелиальных грибов - продуцента кислой α-амилазы, способного при культивировании на дешевых и технологичных средах обеспечивать высокий уровень активности и выход фермента с единицы массы использованного субстрата.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в получении нового высокопродуктивного штамма - продуцента кислой α-амилазы при одновременном расширении спектра используемых субстратов (крахмалосодержащие субстраты, кукурузный экстракт, растительные белки).

Для достижения указанного технического результата предложено использовать новый селекционированный мутантный штамм мицелиального гриба Asp.oryzae UV27R-14 - продуцент кислой α-амилазы.

Штамм Asp.oryzae (Ahlburg) Е. Cohn UV27R-14 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под №ВКМ F-3927 D.

Штамм Asp.oryzae ВКМ F-3927D получен методом многоступенчатой генетической селекции с применением эффективного мутагенеза - ультрафиолетового облучения с одновременным воздействием химических мутагенов из штамма Asp.oryzae ВКМ F-52 согласно следующей методике. Суспензию спор исходного штамма, полученную в дистиллированной воде с добавлением 0,1% Твина-80, облучают ультрафиолетом (облучение световым потоком мощностью 3 мВт/см²) в течение 10 мин. Облученные споры высевают на чашки Петри с селективными средами, выращивают при 35°С в течение 5 суток. Мутанты с улучшенной продукцией кислой α-амилазы отбирают визуально по увеличенным зонам просветления вокруг колоний. Наиболее активные мутанты, отобранные на чашках, проверяют на продуктивность синтеза кислой а - амилазы при культивировании в жидкой среде в колбах. Отобранные при культивировании в колбах активные клоны снова (многократно) подвергают облучению и селекции на чашках и колбах, как описано выше.

Условия хранения. Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет и/или на косячках с агаризованной средой Чапека или сусло-агаре при +4°С при обязательных пересевах не реже одного раза в течение 3-6 месяцев.

Макроскопические характеристики. Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 25°С имеют диаметр 65-70 мм/7 сут, зеленовато-желтые, поверхность пушистая до хлопьевидной, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) при 37°С имеют диаметр 60-65 мм/7 сут, оливково-желтоватые, поверхность пушистая, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S) при 25°С имеют диаметр колонии 67-71 мм/7 сут, оливково-желтые, поверхность пушистая до клочковатой, край ровный; мицелий плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона неокрашенная.

Колонии на Мальц-агаре (МЕА) при 25°С имеют диаметр 65-70 мм/7 сут, зеленовато-желтые, поверхность клочковатая, край ровный; мицелий не очень плотный, белый, эксудат отсутствует, обратная сторона желтовато-серая.

Микроскопические характеристики. Конидиальные головки шаровидные до рыхло колонковидных. Конидиеносцы не окрашены, гладкостенные до слабо шероховатых, 500-1000х10-25 мкм. Везикулы (апикальные расширения) полушаровидные до грушевидных, 22-50 мкм шириной; стеригмы одноярусные и двухъярусные в пределах одной колонии, покрывают от 1/2 до 2/3 поверхности везикулы, метулы - 8-12x4-6 мкм, фиалиды - 8-12x3-5 мкм. Конидии шаровидные, 4,0-8,5 мкм в диаметре, гладкостенные до слабо шероховатых при старении. Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: крахмале, β-глюкане, пектине и галактоманнане.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в "Положении порядка учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения".

Полученный мутант по своим морфологическим свойствам отличается от исходного характером спороношения, цветом пигмента спор, более коротким циклом роста при выращивании на твердых и жидких средах, повышенным синтезом кислой α-амилазы при глубинном культивировании.

При изучении морфологической изменчивости при рассеве штамма Asp.oryzae на селективных средах отмечено выщепление нетипичных колоний в количестве 5-7%, что свидетельствует о стабильности культуры.

Культивирование штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927D осуществляют в аэробных условиях в погружном состоянии при температуре 35°С в течение 120 часов, рН среды 5.8-6.2. Для роста культуры и биосинтеза кислой α-амилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, соевая, кукурузная или другая зерновая мука, либо их экстракты, аммонийный азот, кукурузный экстракт.

Активность кислой α-амилазы в культуральной жидкости определяют по способности катализировать гидролиз крахмала до декстринов различной молекулярной массы. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое в течение 10 минут при 30°С при рН 4,7 катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала, что составляет 30% от введенного в реакцию.

Ферментные препараты, полученные с помощью предлагаемого штамма, могут быть использованы в виде культуральной жидкости, жидких концентрированных препаратов, получаемых с помощью ультрафильтрации или упаривания культуральной жидкости, или в виде сухих препаратов (Амилоризин Г10х, Г20х), получаемых осаждением этанолом или другими органическими растворителями из ультрафильтрата культуральной жидкости, а также высушиванием или гранулированием.

Методом гидрофобной хроматографии ферментного препарата Амилоризина Г10х получена гомогенная кислая α-амилаза Asp.oryzae с молекулярной массой 52 кДа, удельная амилолитическая способность которой составляет 39 ед/мг белка. Кислая α-амилаза Asp.oryzae активна при температуре от 30 до 70°С с оптимумом действия при 58-60°С; стабильна в широком интервале значений рН - от 3.5 до 8.0, с оптимумом действия при рН 5,0-6,0; в более кислой зоне, характерной для мучных замесов (рН 4,5), проявляет активность на 85-95%; является мальтогенной кислой α-амилазой, предельная степень гидролиза растворимого и нерастворимого крахмала составляли 38 и 34% соответственно.

Таким образом, свойства фермента кислой α-амилазы Asp.oryzae ВКМ F-3927D обеспечивают эффективность ее применения для осахаривания крахмалосодержащего сырья. Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал (инокулюм) получают выращиванием штамма на жидкой питательной среде состава: пшеничная мука - 6%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NH₄NO₃ - 0,3%, КН₂PO₄ - 0,02%, СаСО₃ - 1,2%, вода дистиллированная, рН среды 5,8-6,2, в колбах, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке с 240 об/мин при 30°С в течение 48 часов.

Полученный посевной материал в количестве 2% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 50 мл среды следующего состава, мас.%: пшеничная мука - 6%, соевая мука -4%, кукурузный экстракт - 1%, NH₄NO₃ - 0,3%, КН₂PO₄ - 0,02%, СаСО₃ - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Среду предварительно обрабатывают ферментным препаратом бактериальной кислой α-амилазы из расчета 2 ед/г крахмала при 70°С в течение 20 минут.

Культивирование осуществляют в аэробных условиях на качалке (240 об/мин) при температуре 30°С.

Максимальная ферментативная активность кислой α-амилазы (120 ч роста)в культуральной жидкости составляет 380 ед/мл.

Пример 2. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, мас.%: кукурузный крахмал - 10%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NH₄NO₃ - 0,3%, КН₂PO₄ - 0,02%, СаСО₃ - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Максимальная ферментативная активность кислой α-амилазы (120 ч роста) в культуральной жидкости составляет 425 ед/мл.

Пример 3. Культивирование осуществляют в качалочных колбах, как описано в примере 1, используя жидкую питательную среду следующего состава, мас.%: пшеничная мука - 10%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NH₄NO₃ - 0,3%,

КН₂PO₄ - 0,02%, СаСО₃ - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. Максимальная ферментативная активность кислой α-амилазы на 120 ч роста в культуральной жидкости составляет 480 ед/мл.

Пример 4. Проводят процесс культивирования в лабораторных ферментерах фирмы "Anglicon" (Великобритания), емкостью 10 л, оснащенных системами автоматического регулирования рН, pO_2, температуры и пеногашения. Массообмен осуществляется при помощи барботера и двухъярусной мешалки, обеспечивающих аэрацию - до 15 г O₂/л ч.

Условия культивирования: коэффициент загрузки ферментеров - 0,5; посевной материал - вегетативная культура, выращенная в колбах (по примеру 1); доза засева посевной культуры в ферментер - 2%. Температурный режим - дифференцированный: первые 48 ч культивирования 35°С, далее 30°С.

Состав ферментационной среды, г/л: пшеничная мука - 6%, соевая мука - 4%, кукурузный экстракт - 1%, NH₄NO₃ - 0,3%, КН₂PO₄ - 0,02%, СаСО₃ - 1,2%, вода водопроводная, рН среды 5,8-6,2. На 24 и 30 ч культивирования вносят подпитку в виде 50%-го гидролизата крахмала кукурузной муки в количестве 30% от объема ферментационной среды.

Активность кислой α-амилазы на 120 ч культивирования в культуральной жидкости составляет 700-800 ед/мл.

Полученные данные свидетельствуют об увеличении активности амилазы в культуральной жидкости заявляемого штамма Asp.oryzae ВКМ F-3927D по сравнению с наиболее известным из штаммов-мутантов Asp.awamori М-2002 в 8-10 раз.

Для достижения высокой активности штамма не требуется применения сложных и дорогих питательных сред. Для культивирования могут использоваться питательные среды, традиционно применяемые в промышленных технологиях получения такого рода ферментных препаратов.

Высокий уровень активности кислой α-амилазы позволяет рассматривать штамм, как продуцент перспективного ферментного препарата для обработки крахмала или крахмалосодержащего сырья с целью его глубокого гидролиза.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм мицелиального гриба Aspergillus oryzae ВКМ F-3927 D - продуцент кислой α-амилазы, может быть использован в различных областях промышленности и сельского хозяйства для осахаривания крахмалсодержащего сырья. Изобретение позволяет увеличить выход кислой α-амилазы.

Штамм мицелиального гриба Aspergillus oryzae ВКМ F-3927D - продуцент кислой α-амилазы.