РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА ASPERGILLUS AWAMORI - ПРОДУЦЕНТ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ Российский патент 2012 года по МПК C12N9/34 C12N15/09 C12N15/56 C12R1/665 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и пищевой промышленности для получения глюкоамилазы с целью дальнейшего ее применения для осахаривания (гидролиза) крахмалосодержащего сырья в спиртовой, хлебопекарной, крахмалопаточной и пивоваренной промышленности.

Изобретение касается создания высокоактивного рекомбинантного штамма гриба Aspergillus awamori - продуцента глюкоамилазы.

Штамм создан на основе промышленного продуцента, мутантного штамма, Aspergillus awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) с использованием методов генной инженерии [1].

Изобретение обеспечивает получение высокоактивных ферментных препаратов глюкоамилазы в результате глубинного культивирования нового рекомбинантного штамма на мучных ферментационных средах.

Глюкоамилаза - (α-1,4-глюкан-глюканогидролаза, 3.2.1.3.) - глюкозообразующая амилаза, экзофермент, атакует крахмал с нередуцирующего конца полисахаридной цепочки, последовательно отщепляя глюкозные остатки и полностью превращая крахмал в глюкозу.

Отличительной особенностью глюкоамилаз является широкая субстратная специфичность и способность гидролизовать как α-1,4, так и α-1,6 глюкозидные связи в полисахаридах и олигосахаридах, в том числе низкомолекулярных, таких как паноза и изомальтоза. Вследствие этого глюкоамилаза является основным ферментом при осахаривании крахмалосодержащего сырья, а штаммы микроорганизмов, продуцирующие активную глюкоамилазу, имеют широкие перспективы применения во многих отраслях биотехнологии.

В мировой практике одними из основных продуцентов глюкоамилазы являются штаммы грибов рода Aspergilllus - Asp. niger, Asp. oryzae, Asp. usamii, Asp. awamori, Asp. batatae.

Наиболее известны штаммы Asp. awamori 466 [2], Asp. awamori ВУД T-2 F-203 [3], Asp. awamori ВНИИгенетика 120\177 ЦМПМ F-166 [4], Asp. awamori N 400 (ВКМ F-3689 D) [5].

Недостатком вышеуказанных штаммов является низкая продуктивность по целевому ферменту, сложность процессов (стадий) ведения и подготовки посевного материала, использование многокомпонентных дорогостоящих питательных сред для производственных ферментации, и как следствие этого - низкая рентабельность технологии производства глюкоамилазы.

Наиболее близким к заявляемому объекту по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является штамм Asp.awamori M-2002, ВКМ F-3771D [1], который при культивировании в глубинных условиях в течение 168-192 ч на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода гидролизат муки злаковых культур или прогидролизованный экструдат кукурузной муки, синтезирует глюкоамилазу с активностью 800 и 1080 ед/мл соответственно.

Однако для повышения рентабельности производства ферментных препаратов глюкоамилазы требуется создание более продуктивных штаммов.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, - получение нового штамма-продуцента глюкоамилазы, способного при культивировании на дешевых технологичных средах обеспечивать высокий уровень активности глюкоамилазы и выход фермента с единицы массы использованного субстрата.

Технический результат, получаемый от создания и использования нового рекомбинантного штамма A.awamori amyR-T-19, содержащего дополнительную копию активатора транскрипции генов амилолитических ферментов amyR, заключается в получении высокоактивных ферментных препаратов глюкоамилазы для использования в различных отраслях АПК при культивировании продуцента на дешевых технологичных средах.

В целях повышения уровня биосинтеза целевых ферментов грибными штаммами в настоящее время успешно применяются технологии рекомбинантных ДНК. Увеличения экспрессии секретируемых ферментов достигают за счет получения штаммов с увеличенным числом копий генов целевых ферментов (т.н. мультикопийных штаммов) или направленного изменения в механизме регуляции синтеза этих ферментов.

Ключевую роль в регуляции синтеза ферментов у грибов играет белок активатор транскрипции, который взаимодействует со специфическими нуклеотидными последовательностями в промоторных районах регулируемых генов вблизи от старта транскрипции, способствует ее инициации и обеспечивает тем самым увеличение синтеза целевых ферментов. В настоящее время клонирован ряд генов, кодирующих активаторы грибной природы, в том числе и амилазный активатор, кодируемый геном amyR. A.oryzae и amyR A.niger [6, 7].

Сущность объекта изобретения - новый рекомбинантный штамм Aspergillus awamori amyR-T-19 (ВКМ F-4277D) - продуцент глюкоамилазы.

Создание рекомбинантного штамма на основе мутантного штамма A.awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) проводили в несколько этапов. На первом этапе с использованием индуцированного мутагенеза был получен ауксотрофный реципиентный штамм A. awamori 6804-19 niaD^-, дефектный по нитратредуктазе, для отбора трансформантов по способности расти на минимальной среде с нитратом натрия в качестве единственного источника азота. На втором этапе реципиентный штамм A.awamori 6804-19 niaD^- котрансформировали плазмидой pAN52-AmyR, несущей ген амилазного активатора транскрипции amyR из A.niger [6], с плазмидой pSTA10, несущей селективный маркер - ген нитратредуктазы. В результате последующей селекции был получен трансформант с уровнем активности на 15-20% выше исходного штамма.

Проводили сравнительную характеристику уровня глюкоамилазной активности заявляемым рекомбинантным штаммом и исходным штаммом A.awamori M-2002. Активность глюкоамилазы определяли согласно ГОСТ 20264.4-89 [8], В таблице 1 представлены данные по биосинтезу глюкоамилазы исходным мутантным штаммом (прототипом) и рекомбинантным штаммом Asp.awamori.

Таким образом, предлагаемый штамм Aspergillus awamori amyR-T-19 при культивировании на питательной среде на основе пшеничной муки, традиционно применяемой в производстве ферментных препаратов, обеспечивает высокую глюкоамилазную активность в культуральной жидкости, что позволяет в значительной степени повысить выход глюкоамилазы с единицы субстрата и, соответственно, удешевить процесс производства ферментных препаратов, получаемых на его основе.

Штамм Aspergillus awamori amyR-T-19 депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН под № ВКМ ВКМ F-4277D.

Культурально-морфологические признаки штамма Aspergillus awamori amyR-T-19

Макроскопические характеристики: колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 25°С, имеют диаметр 30-35 мм/7 сут, слабо радиально-бороздчатые, поверхность бархатистая, край тонкий (1-2 мм), конидиальная область темно-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA), 37°С, имеют диаметр 26-30 мм/7 сут, слабо радиально-бороздчатые, поверхность шерстистая, край тонкий (1 мм), конидиальная область серовато-коричневая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы (CY20S), 25°С, имеют диаметр колонии 26-28 мм/7 сут, гладкие, поверхность клочковато-шерстистая, край до 5 мм, конидиальная область темно-коричневая до черной; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Колонии на Мальц-агаре (МЕА), имеют диаметр 35-40 мм/7 сут, радиально-борозчатые, поверхность клочковато-шерстистая, край неровный, до 6 мм конидиальная область темно-серая; эксудат отсутствует, обратная сторона тускло-желтая.

Микроскопические характеристики: конидиальные головки шаровидные, затем рыхлорадиальные, распадающиеся на отдельные колонки, конидиеносцы слабо окрашенные в терминальной части, гладкостенные 250-1200×6-12 мкм, апикальные расширения шаровидные 20-45 мкм в диаметре, покрыто стеригмами по всей поверхности. Стеригмы преимущественно двухъярусные, метулы 6-16×3,5-7 мкм, фиалиды 5-8×2-4 мкм. Конидии шаровидные, 3,5-6 мкм, гладкие.

Физиолого-биохимические свойства штамма:

Культура штамма хорошо усваивает глюкозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, и слабо - мальтозу, лактозу, галактозу и рамнозу. Крахмал гидролизует до глюкозы.

Хорошо ассимилирует аммонийные соли неорганических кислот. Потребляет пептон, казеин, аминокислоты. Пептонизирует молоко.

Температурный оптимум роста 34-35°С, pH 4,5-6,0. Аэроб.

Данный вид мицелиального гриба не числится в качестве патогенного в «Положении о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерии, вирусов, риккетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактериальных токсинов, ядов биологического происхождения».

Полученный рекомбинантный штамм отличается от исходного наличием в геноме дополнительной копии гена amyR, кодирующего активатор транскрипции амилолитических ферментов, что обеспечивает повышенную способность продуцента к биосинтезу глюкоамилазы при глубинном культивировании на жидких средах и стабильность при пересевах.

Штамм может храниться в лиофилизированном состоянии в течение нескольких лет или на косяках с агаризованной средой Чапека или Мальц-агаре при +4°С с обязательным пересевом не реже одного раза в 3 месяца. Для дополнительной стабилизации активного посевного материала рекомендуется вносить в агаризованные среды 1% мальтодекстрина, являющегося индуктором гена amyR и способствующего увеличению продуктивности штамма.

Культивирование мутантного штамма Asp.awamori amyR-T-19 осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С в течение 168-192 ч, pH среды 5,2-5,5. Для роста культуры и биосинтеза глюкоамилазы источником углерода и азота могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, мука злаковых культур (кукурузы, пшеницы, ячменя, ржи) или ее экструдат, аммонийный азот, кукурузный экстракт.

Штамм Aspergillus awamori amyR-T-19 при культивировании в течение 192 ч на среде, содержащей гидролизат пшеничной муки, обеспечивает активность в культуральной жидкости от 950 до 1050-1100 ед/мл. При культивировании продуцента на прогидролизованном экструдате кукурузной муки активность глюкоамилазы на 192 ч роста составляет 1150-1200 ед/мл.

Для ферментативной обработки крахмалосодержащего сырья при производстве спирта ферментный препарат может быть использован в виде культуральной жидкости (Глюковамарин Гх), или в виде ультраконцентрата (Глюковамарин Г18х), или в виде концентрированных препаратов, получаемых известными биохимическими методами, например осаждением этанолом из ультрафильтрата культуральной жидкости (Глюковамарин Г20х).

Глюкоамилаза активна в широком диапазоне pH - от 3,0 до 8,0 с оптимумом при pH 4,2-5,0; в диапазоне температуры от 30° до 75°С с оптимумом при 60-65°С.

Глюкоамилаза обладает высокой стабильностью в широком диапазоне pH, лишь при pH 2.0 и 8,0 наблюдается ее существенная инактивация. Фермент стабилен в течение 2-х часов при 45°-55°С; инкубирование при температуре 60°С в течение 2-х часов приводит к снижению активности на 40%. Инкубирование при температуре 65°С в течение 1 часа снижает активность фермента штамма на 40-45%.

Таблица 1. Биосинтез глюкоамилазы исходным и рекомбинантным штаммом A.awamori на ферментационной среде на основе пшеничной муки № Штамм ГлА на 192 ч роста, ед/мл 1 Asp. awamori M-2002, ВКМ F-3771D (исходный штамм, прототип) 880 2 Asp. awamori amyR-T-19 (рекомбинантный штамм) 1040

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Посевной материал в виде споровой суспензии в количестве 0,1% к объему среды вносят в качалочные колбы объемом 750 мл, содержащие 100 мл среды состава, г/л: пшеничная мука, прогидролизованная препаратом α-амилазы, - 240,0; водопроводная вода - остальное, pH среды 5,2-5,5. Культивирование штамма осуществляют в аэробных условиях при температуре 35°С на качалке с 240 об/мин в течение 168-192 ч. Каждые 24 ч, начиная с 72 ч роста, отбирают пробы, в которых определяют активность глюкоамилазы. Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 168 ч роста составляет 840 ед/мл, на 192 ч роста - 1040 ед/мл, содержание растворимого белка в культуральной жидкости - 26-28 мг/мл, удельная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости равна 38-39 ед/мг белка.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в ферментационной среде вместо пшеничной муки используют экструдат кукурузной муки в количестве 300 г/л. Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 192 ч роста составляет 1200 ед/мл.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но с внесением в ферментационную среду 10 г/л мальтодекстрина. Максимальная глюкоамилазная активность в культуральной жидкости на 192 ч роста составляет 1080 ед/мл.

Используемые источники

1. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.

2. Авторское свидетельство СССР N 800185, C12D 13/10, 1981.

3. Авторское свидетельство СССР N 1259673, C12N 9/34, 1982.

4. Авторское свидетельство СССР N 1271068, C12N 9/34, 1979.

5. Патент РФ №2196821 от 20.01.2003.

6. Pel Herman J et al. Genome sequencing and analysis of the versatile cell factory Aspergillus niger CBS 513.88. // Nat. Biotechnol. 2007. V.25 (2). P.221-231.

7. Gomi et al. Molecular cloning and characterization of a transcriptional activator gene, amyR, involved in the amylolytic gene expression in Aspergillus oryzae. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. V.64(4). P.816-827.

8. Препараты ферментные. ГОСТ 20264-4.89. - М.: Изд. Государственный комитет СССР по стандартам, 1995. С.70.

Аналогичные патенты РФ:

1. Патент РФ №2196821 от 20.01.2003.

2. Патент РФ №2245364 от 27.01.2005.

Штамм создан на основе промышленного продуцента, мутантного штамма, Aspergillus awamori M-2002 (ВКМ F-3771D) с использованием методов индуцированного мутагенеза и плазмидной трансформации. Штамм A.awamori amyR- Т-19 депонирован в BKM ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под №4277D, хранится в лиофильно высушенном состоянии на скошенном сусло-агаре в отделе биотехнологии ферментных препаратов в пищевой промышленности ГНУ ВНИИ пищевой биотехнологии Россельхозакадемии г. Москвы. Изобретение позволяет в значительной степени повысить выход глюкоамилазы с единицы субстрата. 1 табл., 2 пр.

Штамм гриба Aspergillus awamori ВКМ F-4277D - продуцент глюкоамилазы.