СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНОГО ОСТЕОГЕНЕЗА Российский патент 2009 года по МПК A61B17/56 A61K35/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и предназначено для стимуляции репаративного остеогенеза при замещении дефектов кости, возникших в результате травмы или после резекции кости.

Проблема стимуляции остеогенеза, наряду с изысканием возможностей управления регенерацией костной ткани, является одной из актуальных. Это обусловлено большим количеством больных ортопедо-травматологического профиля с повреждениями, протекающими с угнтением репаративного остеогенеза, а также заболеваниями опорно-двигательного аппарата, в патогенезе который лежит дисбаланс нормального костеобразования (например остеопороз).

Известны различные способы стимуляции репаративной костной регенерации:

1. Трансплантация детерминированных остеогенных продромальных клеток (ДОПК), обладающих собственной потенцией костеобразования - остеобластический остеогенез (Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Труды РНИИТО им.Вредена, 1973 г.).

- Способ лечения переломов нижней челюсти путем введения в дефект кости биостимулятора, в качестве которого используют аутологический костный мозг (авт. св. СССР 1799554).

Способ из-за сложности культивирования и короткого срока жизни клеток вне питательной среды не получил широкого применения.

2. Способ пассивной стимуляции ДОПК с помощью аллогенных костных трансплантатов, синтетических или полусинтетических заменителей кости - остеокондуктивный остеогенез или остеокондукция. Имплантаты искусственного или биологического происхождения в этом случае являются остовом (кондуктором) для прорастания кровеносных сосудов, после чего происходит врастание клеток (остеобластов) из костного ложа.

- Способ оптимизации репаративного остеогенеза, включающий введение в костномозговой канал зоны перелома или ложного сустава коллогенсодержащего препарата в виде предварительно измельченного и смешанного с аутокровью биоматериала аллопланта для склеропластики (пат. РФ 2315580).

- Способ лечения больных, заключающийся в подготовке аллотрансплантата и последовательным напылением слоя никеля и слоя серебра и последующего замещения дефектов кости (авт. св. 1461473).

- Способ стимуляции восстановления костной ткани, основанный на введении в очаг остеодистрофии или дефекта кости стимулятора остеогенеза, в качестве которого используют гликозаминогликаны в сочетании с измельченной аллогенной костью (пат РФ 2071737).

Способ стимуляции является весьма трудоемким и дорогостоящим.

3. Воздействие специфическими субстанциями, к которым принадлежит костный морфогенетический белок (BMP - bone morphogenetic protein), точнее, некоторые из семейства морфогенетических белков, индуцирующих фенотипическое преобразовании полипотентных стволовых соединительно-тканных клеток, или индуцибельных остеопродромальных клеток в остеобласты - остеоиндуктивный остеогенез или остеоиндукция (Urist M.R.. Nilsson О.. Rasmussen J. // Clm. Orthop. - 1987. №214. - p.295-304).

- Способ стимуляции остеоиндуктивных свойств диминерализованного костного трансплантата путем использования иммуностимулятора тактивина (пат. РФ 2157220). Тактивин имеет определенные противопоказания.

Проблемой применения культуры аутоклеток и факторов роста для стимуляции репаративного остеогенеза является их доставка в зону дефекта. Введение культуры аутоклеток или факторов роста непосредственно в область костного дефекта инъекционным путем не обеспечивает их длительного присутствия в зоне повреждения и пролонгированной стимуляции.

4. Воздействие на остеогенез факторами, стимулирующими новообразование кости (TGFβ, IGF-I, IGF-II, PDGF, bFGF, aFGF, BMPs) - стимулированный остеогенез. Эти факторы постоянно присутствуют в нативной костной ткани, являясь медиаторами клеточной пролиферации и дифференцировки, ангиогенеза и минерализации как при физиологической, так и при репаративной регенерации костной ткани.

- Способ стимуляции репаративного остеогенеза, включающий на этапе фиксации сформированного регенерата кости компонентов крови, забираемой в период дистракции, при этом в качестве компонентов крови используют раствор предварительно фракционированной и лиофилизированной плазмы крови и введение осуществляют непосредственно в зону новообразующейся костной ткани (пат. РФ 2193868).

- Способ оптимизации репаративной регенерации кости путем воздействия на остеогенез путем приготовления биоантиоксидантного раствора тиофана на основе масляного раствора альфа-токоферола из расчета 5 мг тиофана на 5 мл альфа-токоферола, введения биоантиоксидантного раствора в дозе 5 мг/кг веса в костномозговой канал поврежденной кости через полихлорвиниловый катетер один раз в сутки, ежедневно в течение 4 дней, затем через день, общий курс лечения составляет 10 дней (пат. РФ 22972170).

- Способ стимуляции нормального репаративного остеогенеза путем использования иммуностимулятора налоксона гидрохлорида (пат РФ 2240122).

- Способ стимуляции репаративного остеогенеза путем использования опиоидного пептида DAGO подкожно в дозе 6,3 мкг на 1 кг массы тела в 0,1 мл физиологического раствора в течение 7 дней с момента перелома (пат. РФ 2195311).

Наиболее патогномоничным и безопасным способом стимуляции репаративного остеогенеза является трансплантация собственных остеобластных клеток [Фриденштейн А.Я., Ладынина К.С., Matti H. 36, 67]. При этом наряду со сложностями в процессе культивирования и дифференцировки стволовых мезенхимальных полипотентных аутоклеток сохраняется проблема выбора систем доставки этих клеток в зону репаративного остеогенеза. В настоящее время известны и испытаны в экспериментальных условиях такие системы доставки как: пористая (гидрооксиаппатит-керамика) матрица-аутоклетки [Yoshikawa H, Myoui A. J Aril/Organs. 2005; 8(3): 131-6], гидрооксиаппатит-трикальций фосфатная матрица [HA/TCP - De Kok IJ, Drapeau SJ, Young R, Cooper LF. - Int J Oral Maxillofac Implants. 2005 Jul-Aug; 20(4): 511-8], MSCs/PRP система (мезенхимальные стволовые аутоклетки и кожный коллаген в виде геля - platelled-rich plasma - [Ohya M, Yamada Y, Ozawa R. Ito K, Takahashi M, Ueda M Clin Oral Implants Res. 2005 Oct; 16(5): 622-9}, комбинация из двухфазно кальцинированной кости и мезенхимальных аутоклеток костного мозга - BMSC-BCB [Dai KR, Xu XL, Tang ТТ, Zhu ZA, Yu CF, Lou JR, Zhang XL. - Calcif Tissue Int. 2005 Jul; 77(1): 55-61. Epub 2005 Jul 14].

Наиболее выраженным терапевтическим потенциалом при патологии костной ткани обладают мезенхимальные стволовые клетки, (которые правильно называть, исходя из источника - аутологичные костномозговые стромальные клетки-предшественники), способные восполнять необходимое количество остеобластов и, соответственно, ремоделирующих единиц костной ткани. Являясь уникальной «фабрикой» цитокинов и факторов роста, донорские мезенхимальные стволовые клетки (МСК) обеспечивают активизацию собственных резервов организма. МСК в основном получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза.

Известен способ лечения остеопороза, характеризующийся тем, что пациенту внутривенно, капельно вводят битрансплантат включающий от 50 до 500 млн мезенхимальных стволовых клеток (пат. РФ 2265442).

Известен также способ стимуляции репаративного остеогенеза, включающий инъекционную имплантацию в зону костного повреждения культивированных аутологичных костномозговых стромальных клеток-предшественников /мезенхимальных полипотентных стволовых клеток/ - Injectable bone [Yamada Y, Hata К, Ueda M., din Calcium. 2002 Feb;] 2(2): 22 8-32]. Введение аутоклеток проводят с помощью инъекции взвеси клеток в геле - MSCs/PRP система (см. выше).

Описанный способ является наиболее близким по технической сущности к предлагаемому, однако он имеет главный недостаток - отсутствие оптимальных условий в зоне повреждения для трансплантированных в эту зону аутоклеток. В зоне повреждения (на первом, наиболее коротком посттравматическом этапе) имеются неблагоприятные условия для пролиферации и дифференцировки введенных клеток -экссудативная фаза воспалительной реакции в области травмы костной ткани, сопровождающаяся тканевым ацидозом, повышенным осмотическим давлением, задержкой воды в тканях, наличием лейкоцитарных ферментов.

Целью и задачей предлагаемого способа является устранение этого недостатка, a именно - инъекция аутоклеток в период течения раневого процесса с благоприятными условиями для их дифференцировки и пролиферации - создание благоприятных условий для быстрой дифференцировки и пролиферации имплантированных клеток остеобластного ряда и, как следствие, формирования костного регенерата с последующим полноценным восстановлением поврежденной кости.

Поставленная цель достигается за счет использования способа стимуляции репаративного остеогенеза, включающего инъекционную имплантацию в зону костного повреждения культивированных аутологичны костномозговых стромальных клеток-предшественников. При этом имплантацию клеток проводят в период завершения воспаления в зоне костного повреждения и начала естественного остеогенеза 3-5 раз с интервалом в 2-3 дня, поддерживая при каждой инъекции количество клеток в зоне повреждения 2-5×10⁶ клеток/мл.

Способ осуществляется следующим образом: 1. Операционным (или пункционным) путем производится забор части костного мозга у пациента. 2. Выделенные аутологичные костно-мозговые стромальные клетки-предшественники культивируются до необходимого количества - 2-5×10⁶ клеток/мл. 3. Взвесь клеток в физиологическом растворе инъецируется в область повреждения кости с замедленной (или неполноценной) репарацией.

Инъекционная трансплантация начинается с 7-ых суток после травмы или оперативного вмешательства, т.е. в срок соответствующий формированию в зоне повреждения оптимального (для жизнедеятельности трансплантированных и местных остеобластов) микроокружения. Инъекция взвеси клеток проводится несколько раз (3-5) через 2-3 суток с целью компенсации неизбежной гибели части их в случае отставания ангиогенеза. При каждой инъекции поддерживается количество клеток в зоне повреждения 2-5×10⁶ клеток/мл.

Это, в свою очередь, приводит к формированию костного регенерата с последующим полноценным восстановлением поврежденной кости.

Аутологичные костномозговые стромальные клетки-предшественники имеют преимущества, т.к. представляют собой фракцию высокоочищенных собственных стволовых клеток. Выращенные в культуральной среде аутологичные костномозговые стромальные клетки-предшественники при введении больному безопасны, т.к. это собственные клетки, благодаря чему исключается возможность аллергических реакций. Большое количество вводимых клеток дает выраженный лечебный эффект.

Предложенный способ лечения базируется на экспериментально доказанном факте репаративного действия аутологичных костно-мозговых стромальных клеток-предшественников.

Трансплантацию осуществляли в условиях терапевтического или любого профильного отделения. Перед началом трансплантации осуществляют биологическую пробу. Культура аутологичных костномозговых стромальных клеток-предшественников разводится в 50 мл физиологического раствора, тчательно перемешивается, вводится инъекционно в зону повреждения кости в соответствии с заявленным способом. В течение 24 часов после трансплантации за пациентом необходимо наблюдение.

Предложенный способ был испытан в условиях лаборатории соединительной ткани с группой клинической генетики и отделения экспериментальной травматологии и ортопедии ФГУ «ЦИТО им.Н.Н.Приорова Росздрава» на экспериментальной модели диафизарного дефекта лучевой кости кролика (дефект критического размера - более двух диаметров диафиза лучевой кости) с положительным результатом - достигнуто восстановление поврежденной кости.

Объектом исследования являлись половозрелые кролики породы шиншилла, весом от 3 до 4 кг, обоего пола, у которых проводилась резекция центральной части диафиза лучевой кости с созданием дефекта критического размера - 1 см.

В 1-ой (контрольной) группе животных дефект оставался свободным; во 2-ой группе во время операции в дефект помещали аутологичные костно-мозговые стромальные клетки-предшественники, выделенные из костного мозга и размноженные в культуре; кроликам 3-ей группы аналогичные клетки имплантировали инъекционным способом в костный дефект через 7, 10, 13 дней после операции. Культуру клеток-предшественников получали из стромальных клеток костного мозга, выделенных из биоптата крыла подвздошной кости.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В течение месяца после начала эксперимента проводилось рентгенологическое исследование оперированных предплечий кроликов. В контрольной (1-ой) группе животных костные дефекты лучевых костей, в которые не имплантировались аутологичные костномозговые стромальные клетки-предшественники, не заполнялись костными регенератами. Последние формировались вблизи костных отломков, закрывая их костномозговые каналы замыкательными пластинками.

У 2-ой (опытной) группы животных костные дефекты лучевых костей, в которые помещали аутологичные костномозговые стромальные клетки-предшественники, также не были заполнены рентгеноконтрастными структурами.

В области костных дефектов лучевых костей, в которые имплантировались инъекционно на седьмой день после операции аутологичные стромальные костномозговые клетки-предшественники, рентгенологически наблюдалось формирование костных регенератов между костными отломками лучевых костей (3-я группа кроликов).

Через месяц после последней инъекции животные всех групп были выведены из эксперимента путем передозировки наркоза.

У животных контрольной 1 и 2 групп костный дефект заполнялся рыхлой волокнистой неоформленной соединительной тканью, жировой и мышечной тканью и лишь частично костными регенератами у краев костных отломков, образующими замыкательные пластинки (фиг.1).

В 3-ей (опытной) группе кроликов инъекционную имплантацию аутологичных костномозговых стромальных клеток-предшественников в костный дефект проводили через 7 дней. К этому времени дефекты между костными отломками лучевых костей были заполнены рыхлой неоформленной волокнистой соединительной тканью и сосудами. Через месяц после инъекций у некоторых кроликов регенераты соединяли костные отломки, восстанавливая целостность поврежденных костей (фиг.2). Между костными отломками обнаружены полиморфные регенераты, состоящие в основном из ретикулофиброзной и пластинчатой костной ткани, по периферии которой наблюдались участки хондроидной и фиброзной ткани.

Таким образом, результаты исследований доказывают, что предлагаемый способ эффективно стимулирует репаративный остеогенез в области перелома, основан на применении аутологичных стромальных стволовых клеток-предшественников, обладающих выраженным модуляторным эффектом, не является трудоемким и не требует больших временных затрат.

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии и предназначено для стимуляции репаративного остеогенеза при замещении дефектов кости, возникших в результате травмы или после резекции кости. Техническим результатом способа является создание благоприятных условий для быстрой дифференцировки и пролиферации имплантированных клеток остеобластного ряда и, как следствие, формирования костного регенерата с последующим полноценным восстановлением поврежденной кости. Способ включает инъекционную имплантацию в зону костного повреждения культивированных аутологичных костномозговых стромальных клеток-предшественников. При этом имплантацию клеток проводят в период завершения воспаления в зоне костного повреждения и начала естественного остеогенеза 3-5 раз с интервалом в 2-3 дня, путем инъекции физиологического раствора содержащего 2-5×10⁶ клеток. 2 ил.

Способ стимуляции репаративного остеогенеза, включающий инъекционную имплантацию в зону костного повреждения культивированных аутологичных костномозговых стромальных клеток-предшественников в период завершения воспаления в зоне костного повреждения, отличающийся тем, что имплантацию клеток в зону повреждения проводят в период начала естественного остеогенеза 3-5 раз с интервалом в 2-3 дня путем инъекции физиологического раствора содержащего 2-5×10⁶ клеток.