СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ КЛЕТОК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2011 года по МПК C12N5/71 C08L5/08 

Изобретение относится к биотехнологиям и может быть использовано в цитологии, гистологии, трансплантологии, микробиологии, медицинских исследованиях.

Известен способ диссоциации клеток, разработанный на примере гепатоцитов (Заявка на изобретение №2005104557/13 от 17.07.2003, БИ №25, 2005). Способ заключается в следующем. Исследуемая ткань помещается в раствор фосфатного буфера с коллагеназой и панкреатином. Выдерживается 30-35 минут при температуре 37°С. Затем следует несколько циклов, состоящих из центрифугирования, фильтрования. В заключительной стадии раствор клеток помещается в культуральную среду для обеспечения их жизнедеятельности.

Приведенный способ имеет существенные недостатки. Клетки в культуральной среде могут распределяться не только по поверхности, но и по всей толщине слоя культуральной среды, что негативно сказывается на измерениях. При этом после проведения измерений клетки погибали, и для дальнейших измерений эти клетки необходимо культивировать. Наличие нескольких циклов, состоящих из фильтрования и центрифугирования, значительно усложняет процесс.

Техническим результатом способа являются получение монослоя жизнеспособных клеток и обеспечение их жизнедеятельности на 2-3 часа.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения жизнеспособных клеток молочной железы, предусматривающем ферментативное расщепление в растворе коллагеназы исследуемой ткани при температуре 37°С в течение 30-35 минут, раствор клеток наносят на биоматериал из гиалуроновой кислоты, хранят при комнатной температуре и постоянной влажности 30-50%, а контроль за жизнеспособностью клеток осуществляют по изменении окраски монослоя клеток.

На фигуре 1 изображено распределение клеток по поверхности биоматериала, показывающее обеспечение биоматериалом из гиалуроновой кислоты уникальной адгезии прививаемых на его поверхности клеток. При аппликации клеточной взвеси на поверхность биополимера клетки равномерно распределялись по его поверхности, сохраняя жизнеспособность. На фигуре 2 изображено распределение клеток в культуральной среде. В отличие от распределения на биоматериале большая часть клеток в культуральной среде распределялась по всей ее толщине.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве источника клеточного материала для исследования выбраны нормальные и опухолевые клетки молочной железы мышей линии BYRB, поскольку данные лабораторные животные считаются эталонными для подобных исследований.

Кусочки опухолевой и нормальной исследуемой ткани молочной железы мышей линии BYRB помещают в бюкс с раствором коллагеназы в фосфатном буфере (рН 7.4) с концентрацией 0.5 мг/мл. Этот раствор с кусочком исследуемой ткани выдерживают при температуре 37°С при постоянном помешивании. Оптимальное время диссоциации для опухолевой и здоровой ткани составляет 30-35 минут. После проведения ферментативной диссоциации суспензию клеток наносят на биоматериал из гиалуроновой кислоты (толщиной 0.25 мм, плотностью 340.13 кг/м³), представляющий собой полимер гиалуроновой кислоты нативной формы. Этот материал отвечает основным критериям биологически совместимой матрицы: отсутствие цитотоксичности, поддержание адгезии, что показано на фигуре 1; фиксация, пролиферация и дифференцировка помещенных на ее поверхность клеток, отсутствие воспалительной реакции на материал и иммунного ответа, достаточная механическая прочность в соответствии с назначением, биорезорбируемость обычными метаболическими путями (Agrawal CM et al. Biodegradable PLA/PGA polymers for tissue engineering in orthopaedica // Material Science Forum. - 1997. - P.115-128; Burg KJL et al. Biomateriats development for bone tissue engineering // Biomateriats. - 2000. №21. - Р. 2347-2359). Биоматериал с клетками хранят при комнатой температуре в эксикаторе, в который непосредственно перед помещением клеток наливали физиологический раствор (0.9% NaCl), для поддержания биоматериала во влажном состоянии. Сразу после нанесения раствора клеток на биоматериал клетки равномерно распределяются по поверхности, образуя монослой клеток. Уменьшение жидкости в капле раствора клеток за счет испарения, метаболических процессов в клетках и впитывание влаги биоматериалом компенсируют добавлением фосфатного буфера. Контроль за жизнеспособностью клеток осуществляют визуально по цветовой окраске их монослоя. В случае живых клеток монослой имеет белую окраску, в случае омертвевших клеток - светло-коричневую.

Выбор биоматериала из гиалуроновой кислоты обусловлен биологической функцией гиалуроновой кислоты в нагивных тканях (соединительная, покровная ткани). Установлено, что гиалуроновая кислота благодаря уникальным физическим качествам обеспечивает стеарическое распределение клеток в межклеточном матриксе и создает оптимальные условия для их миграции и митоза (Brun P., Cortivo R., Radicc М., Abatangeio G. Hyaiuronan-based biomaterials in tissue engineering. New Frontiers in Medical Sciences: Redefining Hyaluronan // Symposium Proceedings, Padua, Italy. - June 1999. - P.269).

Способ осуществляли при различной влажности хранения биоматериала с нанесенными клетками. Зависимость состояния биоматериала от влажности, которая отражается на жизнеспособности клеток, отражена в таблице.

Диапазон влажности, % Состояние структуры биоматериала Жизнеспособность клеток, мин Менее 30 Нарушена (низкая адгезия клеток, отсутствие образования монослоя клеток) Менее 10 30 Сохранена (адгезия клеток оптимальная, образуется монослой клеток) 120-180 40 Сохранена (адгезия клеток оптимальная, образуется монослой клеток) 120-180 50 Сохранена (адгезия клеток оптимальная, образуется монослой клеток) 120-180 Более 50 Нарушена (биоматериал становится гелеобразным, отсутствие монослоя клеток) Менее 15

Выбор условий влажности продиктован гидрофильными свойствами биоматериала. При влажности менее 30% структура биоматериала не позволяет клеткам оптимально адгезироваться на его поверхности, в результате чего клетки жизнеспособны в пределах 10-15 минут. При влажности более 50% нарушается структура биоматериала, он становится гелеобразным и непригодным для наслоения клеток на его поверхность.

Таким образом, на биоматериале получается монослой клеток и обеспечивается их жизнеспособность на 2-3 часа.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу получения жизнеспособных клеток, и может быть использовано в исследованиях морфологии живых клеток в норме и при патологии. Раствор жизнеспособных клеток молочной железы после ферментативного расщепления в растворе коллагеназы исследуемой ткани при температуре 37°С в течение 30-35 минут наносят на биоматериал из нативной формы гиалуроновой кислоты, хранят при комнатной температуре и постоянной влажности 30-50%, а контроль за жизнеспособностью клеток осуществляют по изменению окраски монослоя клеток. Изобретение позволяет получить монослой жизнеспособных клеток и обеспечить их жизнедеятельность на 2-3 часа. 1 табл., 2 ил.

Способ получения жизнеспособных клеток молочной железы, предусматривающий ферментативное расщепление в растворе коллагеназы исследуемой ткани при 37°С в течении 30-35 мин, отличающийся тем, что после ферментативного расщепления раствор клеток наносят на биоматериал на основе полимера нативной формы гиалуроновой кислоты, хранят при комнатной температуре и постоянной влажности 30-50%, а контроль за жизнеспособностью клеток осуществляют по изменению окраски монослоя клеток.