КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩИЙ ГИДРОГЕЛЬ ИЗ КОСТНОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК A61K35/32 A61K38/39 A61P19/00 A61L27/24 A61L27/52 B33Y70/00 

Изобретение относится к области реконструктивно-регенеративной и персонифицированной медицины и касается способа получения коллагенсодержащего бесклеточного гидрогеля из готовых аллогенных материалов.

Регенерация опорных и соединительных тканей человека – одно из ведущих направлений и задач реконструктивной хирургии. Для этих целей в настоящее время используются разнообразные материалы, клеточные культуры, факторы, стимулирующие регенерацию. В качестве связующего звена данных компонентов широко используют гели, в том числе на основе коллагенов – важнейших белков соединительной ткани. Коллаген биосовместим, легко комбинируется с другими материалами, гидрофилен, способствует высокой пористости создаваемых конструкций, обладает оптимальным биоразложением [1, 2].

На сегодня имеется большое количество научных данных в области создания коллагенсодержащих гидрогелей. В основном в качестве источников сырья для получения таковых используют биоматериалы ксеногенного происхождения, например, крысиные хвосты, кожа крупного рогатого скота и другие, а также материалы аллогенного происхождения.

Аллогенные биоматериалы имеют ряд преимуществ в сравнении с ксеногенными. Они обладают хорошей биосовместимостью, способностью к биодеградации, биомиметичностью, оптимальной механической эластичностью, способностью к обеспечению структурной поддержки и благоприятной среды для адгезии клеток, и дальнейшего развития тканей, значительно низким иммунным ответом, а также максимальным соответствием критериям репаративной регенерации в плане резорбции с замещением вновь образуемой собственной тканью.

Известен способ получения стерильного прозрачного концентрированного раствора биосовместимого коллагена для изготовления биомедицинских клеточных продуктов или трехмерных тканеинженерных конструкций. [3].  Способ включает экстракцию коллагенсодержащей ткани в растворе разбавленной органической кислоты; многократную очистку кислого водно-солевого экстракта от иммуногенных макромолекул, пирогенных примесей; обычных и спорообразующих микроорганизмов, а также надмолекулярных агрегатов коллагена; доведение раствора коллагена до требуемой концентрации в нем белка.

Известен способ изготовления 3D-коллагенового матрикса на основе аллогенной или ксеногенной соединительнотканной оболочки, включающий её механическую очистку от жировой ткани, обработку гипертоническими растворами солей, экспозицию в растворе щелочи с последующей нейтрализацией, обработку сырья раствором угольной кислоты, полученным путем насыщения воды углекислым газом высокого давления, помещения материала в морозильник при 60-80°С на 6-12 часов, лиофилизацию и стерилизацию [4].

Известен способ изготовления бесклеточного гидрогеля из Вартонова студня пуповины человека, включающий стерилизацию пуповины 10% раствором перекиси водорода, ее препарирование, фрагментирование и гомогенизацию, децеллюляризацию, отмывку от реагента и открепившихся клеток, нейтрализацию раствором гидроокиси натрия, лиофилизацию [5].

Известен способ получения коллагенового геля, включающий выделение коллагена 1 типа из сухожилий крысиных хвостов, отличающийся тем, что извлеченные из крысиных хвостов сухожилия экстрагируют в 0,5 М уксусной кислоте, раствор центрифугируют, вносят в чашку Петри, добавляют 0,8 мл 10-кратной среды М 199 и концентрированный раствор аммиака до доведения рН до 7,0-7,2 и выдерживают в течение 5 мин, полученный в результате коллагеновый гель промывают в стерильной дистиллированной воде 3 раза в течение 30 мин [6]. Данный способ взят нами за прототип.

Целью изобретения является разработка способа получения и создание коллагенсодержащего гидрогеля из костного аллогенного материала с приближенным по своему составу к комплексу белковых компонентов исходного материала, не являющегося цитотоксичным.

Эта цель достигается тем, что костные биоматериалы, изготовленные из биоимплантатов торговой марки «Лиопласт»® измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2-7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6-14 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля, лиофилизацию и стерилизацию радиационным методом. Коллагенсодержащий гидрогель из костной ткани человека не является цитотоксичным, максимально приближен по своему составу к комплексу белковых компонентов исходного материала, прозрачный, без запаха, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2-7,4, с показателем вязкости в пределах 15-28 Р*с, концентрацией коллагена 1,86-3,0 мг/мл.

Преимущества предложенного изобретения перед аналогами и прототипом

1. В качестве исходного сырья используют костные аллогенные биоматериалы торговой марки «Лиопласт»® [7,8]. Данные биоматериалы производят в Cамарском Банке тканей НИИ БиоТех Самарского государственного медицинского университета (сертификат соответствия ISO 13485:2016, рег. № RU CMS-RU.PT02.00115; сертификат ISO 9001:2015, рег. № TIC 15 100 159171). Они представляют собой бесклеточные продукты матрикса, содержащие комплекс биологически активных веществ (каркасных коллагеновых и внеклеточных белков – стимуляторов и ингибиторов регенеративного процесса), необходимых для обеспечения репаративной регенерации поврежденных тканей пациента [8].

2. Основные модули производственного процесса биоматериалов «Лиопласт»®: низкочастотная ультразвуковая обработка, лиофилизация и радиационная стерилизация. Биоматериалы в процессе производства уже подверглись децеллюляризации, деминерализации, делипидизации. Кроме того, они лишены патогенов, неиммуногенны. Материалы «Лиопласт»® широко применяются в современной реконструктивной хирургии, в том числе для замещения дефектов, регенерации опорных и соединительных тканей. Поэтому производимый из них коллагенсодержащий гидрогель безопасен.

3. В материалах «Лиопласт»® сохранен, приближенный к нативной ткани комплекс белковых компонентов естественного происхождения, который сохраняется и в коллагенсодержащем гидрогеле [8]. Это необходимо в дальнейшем при его использовании для нормальной жизнедеятельности клеток, что позволяет поддерживать в физиологических параметрах репаративный характер регенеративных процессов и контролируемую пролиферацию клеток опорных и различных видов соединительных тканей. Белковый состав коллагенсодержащего геля, приближенный к нативной ткани, обеспечивает оптимальные адгезивные свойства и управление регенерацией в необходимом направлении.

4. Добавление после центрифугирования к раствору кислотно-основного индикатора фенолового красного обусловлено присутствием аналогичного компонента в составе питательной среды М199, что является важным для дальнейшей корректной оценки значения кислотности среды в процессе тестировании полученных коллагенсодержащих гидрогелей на клетках.

5. Добавление в раствор коллагена после полимеризации 1% раствора аскорбиновой кислоты необходимо для придания раствору прозрачности, а также в качестве ценного компонента, отвечающего за антиокисдантную активность и повышение уровня кислорода, что особо важно для нормальной жизнедеятельности клеток и регенерации тканей в условиях гипоксии при отсутствии должного снабжения кислородом напечатанных конструктов на этапах биопринтинга и постбиопринтинга, и, в перспективе, для использования данного гидрогеля при восстановлении костных и хрящевых дефектов.

6. Добавление в раствор коллагена после полимеризации 1% раствора рамнозы объясняется наличием ряда ценных свойств моносахарида, таких как стимуляция пролиферации клеток и биосинтеза коллагена, модулирование биосинтеза матрикса, и наличием подтверждённой противовоспалительной и иммунорегуляторной биологической активностью, что в совокупности оказывает положительное влияние в усилении формирования опорных и соединительных тканей.

Изобретение реализуется следующим образом. Материалы «Лиопласт»®, произведенные на основе костной ткани, измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С. Полученный раствор коллагена центрифугируют, тем самым отделяя раствор коллагена от нерастворенных частей костной ткани.

В полученный раствор коллагена добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный, затем раствор нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения рН 7,2-7,4 и охлаждают. В раствор коллагена добавляют бидистиллированную воду в соотношении 1:50 (гель:вода), что позволяет сократить количество повторностей отмывки исходного раствора, затем тщательно перемешивают и центрифугируют.

Полного удаления солей из полученного геля коллагена добиваются путем диализа раствора коллагена с использованием диализных мешков 6-14 кДa. После очистки раствора раствор коллагена полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С. В полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля.

В результате получают прозрачный гидрогель, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2-7,4, не обладающий запахом, с показателем вязкости геля (η) в пределах 15-28 Р*с (при крутящем моменте - 1,33 mN*m, частоте вращения - 17,38 rpm, напряжении сдвига - 635,31 Ра, скорости сдвига - 150 s^-1 и t=18-19°С).

На фиг. 1 представлен полученный гидрогель.

Гель лиофилизируют и стерилизуют радиационным методом, что обеспечивает длительную сохранность полученного геля.

Использование коллагенсодержащего гидрогеля имеет преимущества применения в репаративной регенерации перед ксеногенными и синтетическими аналогами, благодаря наличию в биоактивном материале – гидрогелей комплекса белков с сохранением всех типов структурированного коллагена, присущего для конкретного вида соединительных и опорных тканей.

Результаты исследований коллагенсодержащего гидрогеля, полученного из костного биоматериала «Лиопласт»®

Предлагаемый способ позволяет сохранить структуру коллагеновых белков, к примеру, коллагена I типа, целостность которого в итоговом образце гидрогеля подтверждается электрофоретическим исследованием (Фиг. 2). На Фиг. 2 представлены результаты электрофоретического исследования коллагенсодержащего гидрогеля, полученного из костных биоматериалов «Лиопласт»®, в 10% ПААГ по методу Laemmli (1979), где: 1 – маркеры (10 мкл); 2 – стандарт сравнения, коллаген I+III типа (25 мкл); 3 – коллагенсодержащий гидрогель с преимущественным содержанием коллагена I типа (лиофилизат) (35 мкл); 4 – редуцированная форма коллагена гидрогеля (р-а); 4 – белки-маркеры с указанием молекулярной массы (три эталонных белка: 25, 50, 75 кДа).

Электрофорез белков образцов исследуемых материалов проводили с использованием денатурирующей системы, в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Laemmli. Применяли камеру для вертикального электрофореза с размерами стекол 7×8 см (WIX–easy PRO4 Mini) Wix Technology CO., LTD производства КНР.

Использовали белки-маркеры «Al blue prestained standards» (Bio-Rad,США) для градиентного геля 4-20% с молекулярной массой 10-250 кДa и тремя эталонными белками 25, 50 и 75 кДа. На дорожку наносили 10 мкл исходного раствора. В качестве стандарта сравнения использовали также коллаген I+III типа С13 («Имтек», Россия). Белки исследуемых образцов солюбилизировали в буфере 0,0625 М трис-НСl, рН 6,8, содержащем 25% глицерин, 4% додецилсульфат натрия (1 мг/мл).

Перед анализом к образцам добавляли β-меркаптоэтанол (5% от полученного объема). Все материалы инкубировали на кипящей водяной бане 5-10 мин. После добавления 0,04% раствора бромфенолового синего подготовленные растворы использовали для нанесения на дорожки ПААГ: коллаген I + III типа 25 мкл, все остальные образцы по 35 мкл. Электрофорез проводили при напряжении 160-180 V в течение часа. Гели после окрашивания в растворе кумасси G-250 отмывали 7% уксусной кислотой 2-3 дня.

Полученные результаты разделения исследуемых белков в 10% ПААГ позволяют выявить наряду с молекулярной формой коллагена его полимеры, включающие большее количество цепочек и не прошедшие полную диссоциацию в ходе подготовки материала к электрофорезу. Молекулярная масса олигомеров достигает 180 kDa. Коллагенсодержащий гель, полученный по разработанному способу из костного материала «Лиопласт»®, распределяется в 10% ПААГ подобно стандарту сравнения (коллаген I+III тип; ВКНЦ России), мигрирует в геле с такой же скоростью, что и коллаген I+III типа. Это свидетельствует о достаточно высокой степени очистки белка и сходстве его характеристик в двух сравниваемых образцах коллагена. Предварительная оценка состояния белка в образцах гидрогелей позволяет сделать вывод о расщеплении (редукции или диссоциации) коллагена с выделением трех полипептидных цепочек.

Проводили оценку аллогенных коллагенсодержащих гидрогелей, полученных из костной ткани методом ИК-Фурье спектроскопии (Фиг. 3). На Фиг. 3 представлены усредненные спектры ИК-Фурье исследуемых групп образцов, где: I - коллагенсодержащий аллогенный гидрогель (лиофилизат); II - стандартный образец коллагена I типа (Human, лиофилизат).

На спектре образца лиофилизата коллагенсодержащего гидрогеля отмечается присутствие полос, которые характерных для амидных групп, представленных полосой валентного колебания карбонильной группы ν=(С-О), характерной для Амида I (полоса поглощения при 1640 см^-1) и полосами поглощения при 1551 см^-1 ν=(N-H), характерными для Амида II. Также для Амида III отмечаются полосы поглощения при 1234 см^-1 ν=(N-H). В сравнительном аспекте полученный спектр коллагенсодержащего материала (Group 1) сравнивали со спектром лиофилизата человеческого коллагена I типа (Human) (Group 2), для которого отмечаются схожие характеристики спектральных данных, что говорит о сохранности структуры коллагеновых белков на этапах технологического процесса получения гидрогеля.

Полученные из костных биоматериалов «Лиопласт»®, гидрогели не цитотоксичны, что подтверждается данными их исследования на клетках (фибробластах). Выявление жизнеспособных и поврежденных клеток в опытных и контрольных лунках проводили при помощи МТТ-теста (колориметрический метод, планшетный ридер). Колориметрический тест для оценки метаболической активности клеток. Интенсивность окрашивания количественно определяли при помощи планшетного ридера. При этом интенсивность окраски была пропорциональна числу живых клеток. Число живых и поврежденных клеток оценивали в процентах по отношению к контрольным образцам.

Для данного исследования была использована культура фибробластов, Визуализацию жизнеспособных клеток на поверхности гидрогелей проводили с помощью набора флуорофоров Live-Dead, который относится к витальным красителям, поскольку не оказывает отрицательного воздействия на морфофункциональное состояние клеток, то есть не обладает цитотоксичностью. Исследование in vitro на клеточных культурах фибробластов продемонстрировало цитоадгезивность материала и отсутствие цитотоксичности.

Схема эксперимента была следующей: Использовали 48 – луночный планшет. 6 лунок – контрольные. Дно обрабатывали желатином и засевали клетки в дозе 2×104.

- 6 лунок с питательной средой без клеток.

- 6 лунок. Дно обрабатывали полученным гелем, а затем засевали клетки в той же дозе (2×104).

- 6 лунок с гелем, но без клеток.

- 6 лунок, заселенные клетками на желатине в качестве контроля.

Через 48 часов от момента заселения клеток планшет изымали из эксперимента и проводили метаболический тест (МТТ).

Результаты осмотра нативной культуры. На Фиг. 4 приведены результаты тестирования гидрогеля на клетках – фибробластах (Увеличение ×100), где:

- А, Б – 5 суток эксперимента. Контрольная культура фибробластов на поверхности, обработанной желатином, и культура фибробластов в лунках, дно которых обработаны гелем. Нативная культура. Инвертированный микроскоп. Фазовый контраст;

- В, Г – 5 суток эксперимента. Контрольная культура фибробластов и культура фибробластов в присутствии гидрогеля соответственно. Флуоресцентная визуализация клеток (набор Live-Dead). Инвертированный микроскоп с флуоресцентным модулем.

Фибробласты в контрольных лунках равномерно распределены по всему дну. Клетки четко визуализировали. Они имели вытянутую форму, в центре располагалось ядро (Фиг. 4-А). Фибробласты в опытных лунках сохраняли структуру монослоя. Клетки чётко визуализировали при осмотре практически не отличались от контроля (Фиг. 4-Б). При окраске флуорофорами монослоя в контрольных лунках визуализировали жизнеспособные клетки гомогенно окрашенные в зеленый цвет. Монослой плотный. Границы клеток четко определяли (Фиг. 4-В). При окраске монослоя в опытных лунках выявляли единичные поврежденные клетки, ядра которых были окрашены ярко-красным цветом. При подсчете поврежденные клетки составляли не более 1% от всего количества клеток, что говорило о их незначительном повреждении (Фиг. 4-Г).

Результаты МТТ – теста представлены в Табл. 1. Жизнеспособность клеток в опытных группах достоверно снижалась на 28,7% по сравнении с контролем.

Таблица 1

Показатели Клетки (контроль) Среда 10% Клетки
+Гидрогель (опыт) Среда
+ Гидрогель Оптическая плотность (Е):
Среднее, М
Ошибка среднего, m
Жизнеспособность клеток (% от контроля)
Количество лунок, n
Уровень значимости р (сравнение с контролем) 0,939
0,053
100%
6 0,094
0,002
6 0,696
0,051
71,3%
6
р=0,006 (р<0,05) 0,091
0,001
6

Материал содержит набор белков, необходимых для осуществления репаративного процесса напечатанного конструкта, что подтверждается данными протеомного анализа. Присутствие в биополимере широкого спектра специфических белков естественного происхождения, обладающих как ингибирующим, так и стимулирующим действием на процессы пролиферации и дифференцировки клеток, позволяет поддерживать в физиологических параметрах репаративный характер регенеративных процессов и контролируемую пролиферацию клеток опорных тканей. Эти белки вызывают антиметастатические процессы, ингибируют онкогенную передачу сигналов. Белковый состав данного скаффолда обеспечивает их оптимальные адгезивные свойства и управление регенерацией в необходимом направлении.

Сравнительные результаты масс-спектрометрического анализа аллогенного коллагенсодержащего гидрогеля, полученного из костного биоматериала «Лиопласт»® с данным же материалом до обработки представлены в Табл. 2.

Таблица 2

№ п/п Белки нативной костной ткани Белки гидрогеля костной ткани Кодирующий ген Масса, кДа 1. Collagen alpha-2(I) chain Collagen alpha-2(I) chain COL1A2 129.2 2. Collagen alpha-1(I) chain Collagen alpha-1(I) chain COL1A1 138.9 3. Collagen alpha-1(II) chain Collagen alpha-1(II) chain COL2A1 141.7 4. Collagen alpha-2(IV) chain Collagen alpha-2(IV) chain COL4A2 167.4 Collagen alpha-2(VI) chain Collagen alpha-2(VI) chain COL6A2 108.0-168.0 5. Collagen alpha-2(IX) chain Collagen alpha-2(IX) chain COL9A2 65.1 Collagen alpha-2(XII) chain Collagen alpha-2(XII) chain COL12A2 108.0-168.0 6. Collagen alpha-1(XXVII) chain Collagen alpha-1(XXVII) chain COL27A1 186.8 7. Collagen alpha-1(XXVIII) chain Collagen alpha-1(XXVIII) chain COL28A1 116.6 8. Integrin alpha-10 Integrin alpha-10 ITGA10 127.5 9. Spectrin beta chain (Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2),
non-erythrocytic и Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK Spectrin beta chain (Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2),
non-erythrocytic и Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK SPTBN2
AHNAK 271.2 10. Cryptochrome-1 Cryptochrome-1 CRY1 66.4 11. Alanine-tRNA-ligase
Alanine--tRNA ligase, mitochondrial Alanine-tRNA-ligase
Alanine--tRNA ligase, mitochondrial AARS2 107.6 12. Protein Jumonji Protein Jumonji JARID2 138.3 13. ELAV-like protein 3 ELAV-like protein 3 ELAVL3 39.5 14. Bifunctional peptidase and arginylhydroxylase JMJD5
KDM8 Bifunctional peptidase and arginylhydroxylase JMJD5
KDM8 JMJD5
KDM8 47.2 15. Фибронектин Фибронектин FN1 262.6 16. Остеомодулин Остеомодулин OMD 49.4

В образцах отмечается присутствие основных типов коллагена. Среди которых образующий фибриллы коллаген I типа; специфичный для хрящевой ткани II тип; коллаген IV типа – основной структурный компонент базальных мембран. В этой же группе IX тип коллагена, являющийся компонентом гиалинового хряща, коллаген XXVII типа, играющий важную роль при кальцификации хряща и переходе хряща в кость, а также коллаген XXVIII типа, который может действовать как связывающий клетки белок и коллагены VI и XII типов.

Наряду с этим выявлены мембранные рецепторы коллагена, интегрины – Integrin alpha-10 (ITGA10) – мембранные рецепторы коллагена, что в совокупности позволяет выдвинуть предположение об участии компонентов коллагеновых носителей в инициации сигнальных путей и каскадов ферментативных реакций в популяции клеток, развивающихся на подобных носителях. А также белков: Spectrin beta chain, non-erythrocytic 2 (SPTBN2), non-erythrocytic, Neuroblast differentiation-associated protein AHNAK, Cryptochrome-1 (CRY1), Alanine--tRNA ligase mitochondrial (AARS2), Protein Jumonji (JARID2), ELAV-like protein 3 (ELAVL3), Bifunctional peptidase and arginylhydroxylase (JMJD5), Фибронектин (FN1), Остеомодулин (OMD) и ряд других белков в органическом матриксе аллогенного коллагенсодержащего материала человека.

Таким образом, коллагенсодержащий гель, полученный разработанным способом, обладал заявленными характеристиками и мог быть использован в дальнейшем в качестве компонента биочернил в технологии 3D-биопринтинга, создании инъекционных (шприцевых форм), формирования комбинированных клеточных конструктов для восстановления поврежденных и разрушенных опорных, соединительных и эпителиальных тканей.

Способ создания коллагенсодержащего геля иллюстрируется примерами.

Пример 1

Способ получения коллагенсодержащего геля из костного биоматериала «Лиопласт»® - губчатой ткани. Биоматериал измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Был получен прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,2, не обладающий запахом, с показателем вязкости 15 Р*с, концентрацией коллагена 1,86 мг/мл.

Получение лиофилизата коллагенового геля осуществляли на аппарате лиофильной сушилки марки «AK Lyogene 2-55» (Россия). Время лиофилизации – 17 часов; значение температуры конденсора: -76°С; значение параметра вакуумирования: 0,100 mBar; значение температуры полок: +37°С. Итоговый образец представляет собой однородную коллагеновую губку без запаха белого цвета, которую в дальнейшем подвергали стерилизации радиационным методом - гамма-облучением.

Пример 2

Способ получения коллагенсодержащего геля из костного биоматериала «Лиопласт»® - компактной ткани. Биоматериал измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 14 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С в течение часа, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Был получен прозрачный, однородный по структуре, обеспечивающий стабильность поддержания заданной формы с pH=7,4, не обладающий запахом, с показателем вязкости 28 Р*с, концентрацией коллагена 3,00 мг/мл.

После аналогичной лиофилизации итоговый образец геля представляет собой однородную коллагеновую губку без запаха белого цвета, которую в дальнейшем подвергали стерилизации радиационным методом - гамма-облучением.

Таким образом, полученный их костной ткани коллагенсодержащий гель может быть использован в дальнейшем в качестве компонента биочернил в технологии 3D-биопринтинга, при создании инъекционных (шприцевых форм), формировании комбинированных клеточных конструктов для восстановления поврежденных и разрушенных опорных, соединительных и эпителиальных тканей в реконструктивной хирургии.

ИСТОЧНИКИ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gelse K., Pöschl E., Aigner T. Collagens – structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev 2003; 55:1531–46. DOI: 10.1016/j.addr.2003.08.002.

2. Glowacki J., Mizuno S. Collagen scaffolds for tissue engineering. Biopolymers 2008; 89:338–44. DOI: 10.1002/bip.20871.

3. Патент РФ на изобретение № 2715715 от 3.03.2020 «Стерильный прозрачный концентрированный раствор биосовместимого коллагена, способ его получения и применения».

4. Патент РФ на изобретение № 2683328 от 28.03.2019 C2 «Способ изготовления 3d коллагенового матрикса».

5. Патент РФ на изобретение № 2745995 от 5.04.2021 «Способ изготовления бесклеточного гидрогеля из вартонова студня пуповины человека для внутрисуставного применения».

6. Патент РФ на изобретение № 2791324 «Способ получения коллагенового геля для использования в медицине и косметологии».

7. Патент РФ на изобретение № 2366173 от 10.09.2009 «Способ изготовления крупноблочных лиофилизированных костных имплантатов».

8. https://lyoplast.com/manufacture/ Производство. Очистка и обработка материала. Получение биоимплантов.

Изобретение относится к области реконструктивно-регенеративной медицины и касается способа получения коллагенсодержащего бесклеточного гидрогеля из костной ткани человека, очищенной по запатентованному способу производства крупноблочных биоимплантатов торговой марки «Лиопласт»®. Предложенный cпособ получения коллагенсодержащего гидрогеля из костной ткани человека для восстановления поврежденных и разрушенных опорных, соединительных и эпителиальных тканей, с концентрацией коллагена 1,86-3,00 мг/мл, характеризуется тем, что костные биоматериалы, изготовленные из биоимплантатов торговой марки «Лиопласт», измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2-7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6-14 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля. Полученный гидрогель можно подвергать лиофилизации и стерилизации радиационным методом. Использование изобретения обеспечивает получение коллагенсодержащего гидрогеля из костного аллогенного материала с приближенным по своему составу к комплексу белковых компонентов исходного материала, не являющегося цитотоксичным. 1 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Способ получения коллагенсодержащего гидрогеля из костной ткани человека для восстановления поврежденных и разрушенных опорных, соединительных и эпителиальных тканей, с концентрацией коллагена 1,86-3,00 мг/мл, заключающийся в том, что костные биоматериалы, изготовленные из биоимплантатов торговой марки «Лиопласт», измельчают на лабораторной мельнице при комнатной температуре с последующей экстракцией полученной массы в 30% уксусной кислоте в течение 7 дней при температуре 5°С; полученный раствор центрифугируют, в него добавляют кислотно-основный индикатор феноловый красный и нейтрализуют слабым раствором щелочи до достижения значения рН=7,2-7,4, охлаждают раствор и добавляют в него бидистиллированную воду в соотношении 1:50, перемешивают и центрифугируют, проводят диализ полученного раствора с использованием диализных мешков 6-14 кДa, раствор полимеризуют путем постепенного повышения температуры до 37°С, в полученный гидрогель добавляют 1% раствор аскорбиновой кислоты и 1% водный раствор рамнозы, проводят гомогенизацию гидрогеля.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный гидрогель подвергают лиофилизации и стерилизации радиационным методом.