CПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ИНТЕРФЕРОН-СТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2011 года по МПК C12P21/00 C07K1/34 

Описание патента на изобретение RU2409678C1

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской, фармацевтической промышленности, а именно получению иммуномодулирующих низкомолекулярных пептидов из отходов производства лактоглобулинов.

Среди низкомолекулярных пептидов молозива наиболее известен иммуномодулятор фактор переноса. По данным У.Дж.Хэннен самым лучшим источником фактора переноса является коровье молозиво (Доктор Уильям Дж.Хэннен «Трансфер Фактор-плюс. Идеальная комбинация биологически активных веществ для оптимального иммунитета» / Под ред. Ю.П.Гичева и Э.Огановой. - Новосибирск, 2001. - 73 с.) Известно, что фактор переноса обладает универсальной иммуномодулирующей эффективностью независимо от биологического вида донора и реципиента (Лыкова С.Г. с соавт. «Опыт применения Трансфер Фактора в дерматологии» // Сибирский журнал дерматологии и венерологии. - 2002, №3, - с.34-35). Поэтому антигенспецифичные низкомолекулярные пептиды, выделенные из иммунного молозива коров, могут обеспечить иммунитет против соответствующих заболеваний и значительно облегчить их течение.

Существует способ получения низкомолекулярных пептидов - биологически активной добавки «Милканг» (RU №2183935. 2002.06.07). Указанный способ получения низкомолекулярных пептидов, выбранный в качестве прототипа, позволяет получить малые пептиды весом более 50 кДа путем использования неиммунного сырья (молока, обезжиренного молока, молозива, стародойного молока, подсырной или творожной сыворотки, ультрафильтратов обезжиренного или цельного молока). Сам процесс получения низкомолекулярных пептидов включает ряд этапов: центрифугирование, сорбцию белков на ионообменнике, хроматографическое разделение, диализ и стабилизацию микрофильтрацией.

В Ростовском НИИ микробиологии и паразитологии развернуто производство медицинского иммунобиологического препарата для лечения и профилактики острых кишечных инфекций «Лактоглобулин против условно-патогенных бактерий и сальмонелл коровий сухой для перорального применения» (регистрационное удостоверение №ЛСР-002636/08 от 09.04.2008; Промышленный регламент №ПР 01898776-02-06). Сырьем для производства лактоглобулина служит иммунное молозиво коров. Согласно способу получения иммунного лактоглобулина (RU 2298409 10.05.2007) в производственный процесс внесены изменения (дополнение №1 ПР 01898776-02-06), согласно которому в технологическом процессе разделения лактосыворотки путем ультрафильтрации на мембранном кассетном модуле получают 2 фракции: высокомолекулярные лактоглобулины и низкомолекулярную фракцию, содержащую пептиды молекулярной массой менее 5 кДа, являющуюся отходом производства лактоглобулина.

Целью изобретения является разработка способа получения низкомолекулярных пептидов, обладающих выраженной интерферон-стимулирующей активностью, из отходов производства лактоглобулина иммунного (против условнопатогенных энтеробактерий и сальмонелл).

Цель достигается тем, что ультрафильтрат, содержащий низкомолекулярные пептиды, многократно диализуют против дистиллированной воды на полисульфидных мембранах с диаметром пор 1 кДа. Полученный раствор концентрируют с помощью ионообменной гельхроматографии. Элюацию проводят 0,5 М водным раствором хлорида натрия. Данный способ позволяет получить концентрированный раствор низкомолекулярных пептидов с общим содержанием белков 3 мг/мл.

Исходным сырьем для получения низкомолекулярных пептидов (НМП) служит отход производства лактоглобулина против условно патогенных бактерий и сальмонелл (RU 2298409, 2007), в соответствии с которым иммунное молозиво коров подвергают сбраживанию пепсином, удаляют творожную массу. Из полученной иммунной сыворотки молозива коров методом ультрафильтрации удаляют денатурированные белки и жир, получая очищенную лактосыворотку. Полученную лактосыворотку разделяют на ультрафильтрационной установке на две фракции: высокомолекулярную фракцию (лактоглобулин) и содержащий низкомолекулярные пептиды фильтрат в качестве отхода производства, который и используют для получения НМП.

Пример 1. Получение исходного сырья для выделения НМП в процессе производства лактоглобулина.

20 л иммунного молозива коров подвергают сбраживанию путем добавления 20 г пепсина и выдерживания при температуре 37°С в течение 18-20 ч. Творожную массу удаляют.

Полученные 10 л лактосыворотки очищают от остатков жировой эмульсии и казеина на кассетной фильтрационной установке с общей площадью мембран 2 м2 и диаметром пор 0,2 мкм.

Очищенную лактосыворотку подвергают разделению по молекулярным параметрам на ультрафильтрационной установке с общей фильтрующей поверхностью 1 м2 с диаметром пор 15 кДа. В результате разделения получают две фракции: высокомолекулярную - концентрат (свыше 15 кДа) и низкомолекулярную - фильтрат (менее 15 кДа). Высокомолекулярная фракция используется для получения специфических лактоглобулинов, а фильтрат - для выделения низкомолекулярных пептидов. Выход фильтрата с молекулярными параметрами менее 15 кДа - 7 л.

Пример 2. Получение низкомолекулярных пептидов.

Фильтрат подвергают диализу на полисульфидных полых волокнах с общей фильтрующей поверхностью 1 м2 с диаметром пор 1 кДа в течение 4 ч против 50,0 л дистиллированной воды. Скорость потока составляет 10-15 л/ч. В результате получают 5 л исходного раствора, содержащего НМП с концентрацией белка (по Лоури) 3 мг/мл.

Раствор, содержащий НМП, концентрируют с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЕ - целлюлозе на колонке диаметром 100 мм и длиной 250 мм. Скорость потока 50 мл/мин. Элюцию НМП производят 0,5 М водным раствором хлорида натрия. Выход НМП - 0,5 л с концентрацией общего содержания белка (по Лоури) 3 мг/мл.

Пример 3. Контроль НМП на специфичность.

В качестве контроля НМП на специфичность была использована реакция преципитации в геле. Двух кроликов породы шиншилла весом 2,5 кг иммунизировали коммерческим препаратом «Трансфер Фактор» (США), содержащим низкомолекулярные пептиды молозива коров, и двух кроликов - полученными НМП. Оба препарата были стандартизованы по белку до концентрации 10 мкг/мл. Иммунизацию проводили по общепринятой схеме (Фримель 1985). Через месяц сыворотки крови иммунизированных животных разводили 0,15 М раствором хлорида натрия 1:1 и ставили реакцию преципитации в геле (1% агар «Дифко») против двух тестируемых антигенов: «Трансфер Фактора» (США) и НМП. Методом радиальной иммунодиффузии были выявлены общие зоны преципитации, что свидетельствует о подлинности полученного препарата.

Контроль НМП на специфичность осуществляли также с помощью иммунно-ферментного анализа (ИФА).

«Трансфер Фактор» (США) и НМП, полученные предлагаемым способом, были стандартизированы в 0,015 М фосфатном буфере рН 7,2 - 7,4 по количеству общего белка 20 мкг/мл. Препараты разводили до концентрации: 20; 10; 5; 2,5; 1,25; 0,6; 0,3; 0,15; 0,08 мкг/мл. Далее ИФА проводили с использованием кроличьих сывороток, полученных в результате иммунизации кроликов двумя тестируемыми антигенами: «Трансфер Фактором» (США) и выделенными НМП, описанной выше.

Исследование 6 различных серий антигенов показало, что низкомолекулярные пептиды в 100% проб показывали полную выявляемость с 6 вариантами сывороток с чистотой препарата 96 - 100%. «Трансфер Фактор» (США) также давал 100% выявляемость низкомолекулярных пептидов, однако чистота препарата варьировала от 100% при использовании сывороток кроликов, иммунизированных собственно «Трансфер Фактором» (США), и 40% при использовании антисывороток к низкомолекулярным пептидам (таблица 1).

Таблица 1 Выявляемость низкомолекулярных пептидов разными сериями кроличьих сывороток Серии препаратов Антисыворотки к «Трансфер Фактору» США (1-я серия иммунизации) Антисыворотки к низкомолекулярным пептидам (2-я серия иммунизации) количество препарата, мкг/мл выявляемость в ИФА, % количество препарата, мкг/мл выявляемость в ИФА, % Серия низкомолекулярных пептидов №1 9,6 96 10 100 Серия низкомолекулярных пептидов №2 9,8 98 10 100 Серия низкомолекулярных пептидов №3 10 100 10 100 Серия низкомолекулярных пептидов №4 9,8 98 98 98 Серия низкомолекулярных пептидов №5 9,8 98 10 100 Серия низкомолекулярных пептидов №6 10 100 10 100 Трансфер Фактор (США) 10 100 4 40

Пример 4. Стимуляция выработки интерферона-гамма под действием низкомолекулярных пептидов.

Для изучения возможности стимуляции выработки интерферона-гамма была использована экспериментальная модель на белых беспородных лабораторных мышах весом 12-14 г. В эксперименте участвовали 4 группы мышей по 10 штук в каждой:

1-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней низкомолекулярные пептиды перорально по 0,2 мл (общее содержание белка 3 мг/мл);

2-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней парентерально (внутрибрюшинно) гентамицин в суточной лечебной дозе;

3-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней низкомолекулярные пептиды перорально по 0,2 мл (общее содержание белка 3 мг/мл) и парентерально (внутрибрюшинно) гентамицин в суточной лечебной дозе в течение 5 дней;

4-я группа - интактные мыши (контрольная группа).

Через 3 дня после отмены препаратов у опытных и контрольных животных изучали содержание интерферона-гамма в копрофильтратах с использованием набора реагентов для иммуноферментного анализа (Pro Con IFgamma Санкт-Петербург).

Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2 Количество интерферона-гамма в копрофильтратах экспериментальных животных Опытная группа. Вводимые препараты Количество интерферона-гамма в копрофильтратах, нг/мл Достоверная разница от показателей в контрольной группе Достоверная разница от показателей в группе с гентамицином 1-я группа - мыши, получавшие в течение 5 дней низкомолекулярные пептиды 400 3,3:1 2:1 2-я группа - мыши, получавшие гентамицин 200 1,6:1 1:1 3-я группа - мыши, получавшие низкомолекулярные пептиды и гентамицин 350 2,9:1 1,75:1 4-я группа - интактные мыши (контрольная группа) 120 1:1 1:1,6

Как представлено в таблице 2, при применении низкомолекулярных пептидов отмечено достоверное повышение содержания интерферона-гамма в копрофильтратах опытных групп по сравнению с контрольной группой: в 1-й группе - в 3,3 раза; 2-й группе - в 1,6 раза; 3-й группе - в 2,9 раза. Кроме того, как в группе животных, получавших только низкомолекулярные пептиды, так и в группе мышей, получавших сочетание низкомолекулярных пептидов и антибиотиков, происходило достоверное увеличение интерферона-гамма по сравнению с группой животных, получавших только гентамицин (в 2 раза и в 1,7 раза соответственно).

Похожие патенты RU2409678C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОГО ЛАКТОГЛОБУЛИНА 2004
  • Вачаев Борис Федорович
  • Шепелев Александр Павлович
  • Яговкин Эдуард Александрович
  • Соболева Светлана Васильевна
  • Чупрынина Раиса Павловна
  • Бибов Михаил Юрьевич
RU2298409C2
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ 2008
  • Терновская Лариса Николаевна
  • Гапон Марина Николаевна
  • Васерин Юрий Иванович
  • Бескровная Юлия Григорьевна
RU2416243C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ 2014
  • Бубнов Александр Владимирович
  • Островский Давид Исаакович
  • Рязанов Евгений Михайлович
RU2544959C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА 1995
  • Волков А.В.
  • Алешкин В.А.
RU2108794C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА "АФФИНОЛЕЙКИН" ДЛЯ ПРОТИВОИНФЕКЦИОННОЙ ИММУНОТЕРАПИИ 1991
  • Мац А.Н.
  • Перепечкина Н.П.
  • Воейкова Е.С.
  • Райхер Л.И.
  • Райхер И.И.
  • Старкова Б.А.
  • Пархоменко Т.Г.
  • Майчук Ю.Ф.
  • Позднякова В.В.
RU2076715C1
ЛАКТОСЫВОРОТКА ИММУННАЯ СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОТИВ HELICOBACTER PYLORI И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ 2000
  • Жебрун А.Б.
  • Сафонова Н.В.
  • Геннадьева Т.Я.
  • Довгаль С.Г.
  • Денисова И.И.
  • Гончарова Л.Б.
RU2201256C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛАКТОГЛОБУЛИНА 1993
  • Соболева С.В.
  • Шепелев А.П.
  • Федорова Т.А.
  • Гугуева В.С.
  • Чернавская Л.Н.
  • Яговкин Э.А.
  • Адамов А.К.
  • Ломов Ю.М.
RU2090193C1
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ 2012
  • Староверов Сергей Александрович
  • Волков Алексей Анатольевич
  • Ларионов Сергей Васильевич
  • Степанов Виталий Сергеевич
  • Козлов Сергей Васильевич
  • Субботин Александр Михайлович
  • Строгов Владимир Викторович
  • Фомин Александр Сергеевич
RU2485964C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТОГО ПРОТЕИНОВОГО ПРОДУКТА С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ МИНОРНЫХ БЕЛКОВ 2020
  • Бурачевский Николай Викторович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Кузьмин Сергей Владимирович
  • Майзель Сергей Гершевич
  • Осьмакова Алина Геннадьевна
  • Пастухов Антон Михайлович
  • Пехотин Игорь Юрьевич
  • Попова Анна Юрьевна
RU2736645C1
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТЫЙ ПРОТЕИНОВЫЙ ПРОДУКТ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ МИНОРНЫХ БЕЛКОВ 2020
  • Бурачевский Николай Викторович
  • Донник Ирина Михайловна
  • Кузьмин Сергей Владимирович
  • Майзель Сергей Гершевич
  • Осьмакова Алина Геннадьевна
  • Пастухов Антон Михайлович
  • Пехотин Игорь Юрьевич
  • Попова Анна Юрьевна
RU2738745C1

Реферат патента 2011 года CПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ИНТЕРФЕРОН-СТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ заключается в том, что в качестве сырья используют отход ультрафильтрации при производстве препарата лактоглобулина, содержащий низкомолекулярные пептиды. Проводят диализ на полисульфидных мембранных фильтрах с диаметром пор 1кДа против дистиллированной воды до достижения концентрации общего белка в препарате 3 мг/мл. Полученный препарат концентрируют с помощью ионообменной хроматографии в геле. Элюцию проводят 0,5М водным раствором хлорида натрия. Способ позволяет получить концентрированный раствор низкомолекулярных пептидов с общим содержанием белка 3 мг/мл, обладающих интерферон-стимулирующей активностью. 2 табл.

Формула изобретения RU 2 409 678 C1

Способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферон-стимулирующей активностью, отличающийся тем, что в качестве сырья используют отход ультрафильтрации при производстве препарата лактоглобулина, который подвергают диализу на полисульфидных мембранных фильтрах с диаметром пор 1 кДа против дистиллированной воды до достижения концентрации общего белка в препарате 3 мг/мл с последующим концентрированием методом ионообменной хроматографии в геле и элюцией 0,5М раствором хлорида натрия.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2409678C1

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ "МИЛКАНГ" И ПОЛУЧЕННАЯ ЭТИМ СПОСОБОМ БАД "МИЛКАНГ" 2000
  • Рогов И.А.
  • Титов Е.И.
  • Шалыгина А.М.
  • Тихомирова Н.А.
  • Комолова Г.С.
  • Рогов С.И.
RU2183935C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТИГОНАДОТРОПНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 1997
  • Мельников Н.В.
  • Нигамов Ф.Н.
  • Алсынбаев М.М.
RU2136296C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИАНДРОГЕННОЙ И АНТИЭСТРОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ 1993
  • Бахтинов Анатолий Петрович
RU2074726C1

RU 2 409 678 C1

Авторы

Алешукина Анна Валентиновна

Вачаев Борис Федорович

Яговкин Эдуард Александрович

Юрьева Ирина Леонидовна

Яцкий Александр Николаевич

Даты

2011-01-20Публикация

2009-08-31Подача