СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ Российский патент 2015 года по МПК C07K1/18 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения пептидов из дрожжевых автолизатов.

В современных технологических процессах дрожжи используют в качестве сырья для получения различных продуктов, биологически активных веществ, аминокислот, нуклеиновых компонентов, витаминов и т.д. К числу известных способов переработки дрожжевой биомассы относится автолиз, осуществляемый собственными гидролитическими ферментами дрожжей. В ходе автолиза происходит накопление в автолизате свободных аминокислот, низших (ди-, три-, тетра-) пептидов и пептидов с более высокой молекулярной массой.

Известны способы получения биологически активных пептидов-аналогов природных пептидных регуляторов, иммуномодуляторов, морфиноподобных пептидов, антимикробных пептидов и других методами химического синтеза или химической модификации природных пептидных регуляторов или активной части их структуры (патенты РФ №№2043769, 2047621, 2060998, 2067000, 2087480, 2107691, 2126014, 2141527, 2145233, 2145234, 2146262, 2316336, 2478105, 2494105, 2182155, 2111215). Недостатком известных способов является необходимость информации о точной структуре природного аналога, дорогостоящая и сложная процедура пептидного синтеза из исходных производных аминокислот, не позволяющая зачастую получить промышленные количества продукта.

Известны способы получения природных пептидов из органов и тканей сельскохозяйственных животных (патенты РФ №№2075944, 2104702, 2161501, 2043364). Недостатком этого способа является дефицит этого вида природного сырья.

Известен способ получения продукта, содержащего гипотензивные пептиды и его применения в качестве антигипертензивного, годного в пищу продукта (патент РФ №2276689, МПК С12Р 21.02; A23J 1/20, публикация 2006 г.). Способ включает стадии ферментации казеинсодержащего заквасочного материала молочно-кислой бактерией, нанофильтрации полученного пептидсодержащего ферментационного продукта и выделения продукта. Полученный продукт используют в качестве антигипертензивного агента, а также как годный в пищу продукт.

Недостатком известного способа является невысокая степень очистки пептидов.

Известен способ получения пептидов и аминокислот из белкового сырья (патент РФ №2333663, МПК A23J 3/04, публикация 2008 г.), по которому сырьем служит казеин молока, а гидролиз его осуществляют в присутствии эндогенных ферментов и далее подвергают разделительной обработке, включающей коагуляцию белковых остатков.

Известен также способ получения пептидов с высоким содержанием триптофана (патент РФ №2043364, МПК C07K 1/12; A61K 38/01, публикация 1995 г.), включающий суспендирование белка фибриногена в воде, последующий щелочной и ферментативный гидролиз белка, инактивирование фермента при 90-100°C в течение 15-20 мин, центрифугирование гидролизата, осаждение конечного продукта из надосадочной жидкости ацетоном и сушку осадка.

Недостатком указанных способов является использование дефицитного сырья и экзогенных ферментов.

Известны способы получения смеси аминокислот и низших пептидов путем автолиза дрожжей с последующей очисткой целевого продукта на ионитах (например, патент США №2272982, патент Великобритании №952713, авт. свидетельства СССР №№957835, 1369300, 1731806).

Известен также способ получения смеси аминокислот и пептидов путем фильтрации автолизата через слабоосновный анионит ИА-1р с последующей сорбцией из фильтрата аминокислот и низших пептидов на сульфокатионите КУ-2×8, упариванием элюата и сушкой готового продукта (авт. свидетельство СССР №602543).

Существенными недостатками известных способов является высокое содержание в целевом продукте аминокислот, составляющих 70-76% от общего количества продукта, что обусловливает ограничение сферы использования продукта в качестве средства пищевого и фармакологического назначения, а также в виде пептидного компонента при создании микробиологических питательных сред и парфюмерных композиций.

Известен способ получения низкомолекулярных пептидов, обладающих интерферонстимулирующей активностью (патент РФ №2409678, МПК С12Р 21/00; C07K 1/34, публикация 2011 г.), согласно которому в качестве сырья используют отход при производстве препарата лактоглобулина, который подвергают диализу на полисульфидных мембранных фильтрах с диаметром пор 1 кДа против дистиллированной воды до достижения концентрации общего белка в препарате 3 мг/мл с последующим концентрированием методом ионообменной хроматографии в геле и элюцией 0,5М раствором хлорида натрия. Исходным сырьем для получения низкомолекулярных пептидов служит отход производства лактоглобулина против условно патогенных бактерий и сальмонелл (патент РФ №2298409, публикация 2007 г.), в соответствии с которым иммунное молозиво коров подвергают сбраживанию пепсином, удаляют творожную массу. Из полученной иммунной сыворотки молозива коров методом ультрафильтрации удаляют денатурированные белки и жир, получая очищенную лактосыворотку. Полученную лактосыворотку разделяют на ультрафильтрационной установке на две фракции: высокомолекулярную фракцию (лактоглобулин) и содержащий низкомолекулярные (1-5 кДа) пептиды фильтрат в качестве отхода производства, который и используют для получения НМП.

Существенным недостатком указанного способа является дефицит сырья (молозиво коров), крайне низкое содержание целевого продукта в отходе, требующее предварительной концентрации на мембранных фильтрах.

Известен способ получения смеси аминокислот и низших пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием и очистку автолизата на ионитах, отличающийся тем, что в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола (патент РФ №2284356, МПК С12Р 13/06; A23J 1/18, публикация 2006 г. - ближайший аналог).

Недостатком указанного способа является то, что в отходе (проскоке с катионита) содержится ценный продукт - пептиды, который можно извлечь только с применением дополнительных операций выделения и очистки.

Целью настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа получения высокоочищенной смеси пептидов из практически неограниченного возобновляемого сырья - дрожжей.

Указанная цель достигается тем, что в качестве сырья используется отход при производстве смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжей, содержащий пептиды.

Сущность предложенного способа заключается в следующем.

Способ получения пептидов включает автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием, очистку автолизата на ионитах и получение водного раствора пептидов (проскок), при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола, при этом полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с pH 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит.

В ходе производственного процесса по выделению аминокислот и низших пептидов автолизат обрабатывают следующим образом: отделяют клеточные оболочки центрифугированием, полученный раствор подвергают ультрафильтрации через мембраны с номинальной отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 5-15 кДа, ультрафильтрат подкисляют до pH 3,0 и пропускают через сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола. При этом аминокислоты и низшие пептиды сорбируются на катионите, а пептиды с более высокой молекулярной массой не сорбируются и концентрируются в отходе (проскоке). Это позволяет практически полностью отделить индивидуальные (свободные) аминокислоты от пептидов в одноактном процессе сорбции из автолизата, при этом целевой продукт - пептиды остаются в растворе.

Проскок представляет собой водный раствор целевого продукта (пептидов) с низким pH (1,0-1,2), перегруженный балластными органическими (пигментированными) и минеральными веществами. Сущность предложенного способа получения смеси пептидов заключается в выделении пептидов из проскока. Для этого проскок фильтруют через колонку с анионитом до получения раствора с pH 2,0-2,6 (предпочтительно 2,4), а затем пропускают через гелевый сульфокатионит в водородной форме с содержанием ДВБ 1-2% или через макропористый сульфокатионит. Десорбцию с катионита ведут 2,5-3,0% водным раствором аммиака, полученный элюат упаривают для отгонки аммиака и сушат на сублимационной сушилке.

Существенными преимуществами предлагаемого изобретения по сравнению с известными является то, что в ходе процесса достигается высокая степень очистки продукта от сопутствующих минеральных и органических веществ. Способ позволяет получать пептиды, не

содержащие аллергены и нуклеиновые компоненты, жиры, сахара и соли. Способ позволяет получать пептиды из практически неограниченного возобновляемого сырья - пекарских или пивных дрожжей. Получаемый по заявляемому способу продукт обладает выраженной биологической активностью.

Физико-химический анализ продукта показал, что содержание пептидов в сухом продукте составляет 88-92%, аминокислот 6-9%. Продукт состоит из смеси 22 индивидуальных пептидов с молекулярной массой от 0,8 до 2,5 кДа. В экспериментальном исследовании продукт показал выраженную противоишемическую активность, перспективен в плане профилактики и терапии ишемической болезни сердца.

Пример №1

35 л проскока, полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с сильно сшитым (12% ДВБ) сильноосновным анионитом Dowex 550А, объем анионита 3,5 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 1,0 л дистиллированной воды. Получают 36 л раствора с pH 2,2. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3%) аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,43 кг продукта, содержащего 90% пептидов и 7% аминокислот.

Пример №2

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с сильноосновным высокоемким полиакриловым гелевым анионитом Purolite А830 в ОН^- форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в H+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,44 кг продукта, содержащего 89% пептидов и 7% аминокислот.

Пример №3

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН^- форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом КУ-23 в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3,2 л элюата (pH 10,4), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,3 кг продукта, содержащего 76% пептидов и 8% аминокислот.

Пример №4

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН^- форме, объем анионита 2,0 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым слабо сшитым (1% ДВБ) катионитом Dowex W50×l в Н+ форме, объем катионита 13 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3,2 л элюата (pH 10,3), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,42 кг продукта, содержащего 91% пептидов и 5% аминокислот.

Пример №5

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом, объем анионита 2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым сульфокатионитом Dowex W50×2, содержащим 2% сшивки (ДВБ) в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 2,7 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,4 кг продукта, содержащего 88% пептидов и 9% аминокислот.

Пример №6

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом, объем анионита 2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 35,5 л раствора с pH 2,4. Полученный раствор фильтруют через колонну с гелевым сульфокатионитом Dowex W50×4 (4% ДВБ) в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 2,7 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,22 кг продукта, содержащего 75% пептидов и 8% аминокислот.

Пример №7

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН^- форме, объем анионита 2,2 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды и получают 35,5 л раствора с pH 2,7. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,40 кг продукта, содержащего 87% пептидов и 9% аминокислот.

Пример №8

35 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН^- форме, объем анионита 1,8 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды и получают 35,5 л раствора с pH 1,9. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3% аммиаком. Получают 3 л элюата (pH 10,2), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационнной сушилке. Получают 0,39 кг продукта, содержащего 85% пептидов и 9% аминокислот.

Пример №9

35 л проскока с pH 1,2, полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в H+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, и поступают, как в примере №1. Получают 0,15 кг продукта, содержащего 91% пептидов и 8% аминокислот.

Пример №10

28 л проскока (pH 1,2), полученного после автолиза и извлечения аминокислотного продукта «Полифармин» из 50 кг пекарских дрожжей, пропускают через колонну с анионитом Purolite А830 в ОН^- форме, объем анионита 1,6 л, подача 0,7 л/ч, затем анионит промывают 0,5 л дистиллированной воды. Получают 28,5 л раствора с pH 2,3. Полученный раствор фильтруют через колонну с макропористым сульфокатионитом Dowex MSC-1C в Н+ форме, объем катионита 10 л, объемная подача 10 л/ч, затем промывают катионит 4 л подкисленной (pH 1-2) воды и проводят десорбцию 3%>аммиаком. Получают 2,9 л элюата (pH 10,1), аммиак отгоняют на вакуум-выпарной установке до получения pH 8,5, полученный раствор сушат на сублимационной сушилке. Получают 0,33 г продукта, содержащего 90% пептидов и 7% аминокислот.

Пример №11

Продукт «Поликардин», полученный по примеру №2, использовали для изучения биологической активности при экспериментальном инфаркте миокарда. Моделирование инфаркта миокарда проводили перевязкой левой коронарной артерии крыс. Препаратом сравнения служил стандартный лекарственный препарат - антигипоксант «Ренитек». Препараты вводили интрагастрально 1 раз в сутки курсом 5 дней до экспериментального инфаркта миокарда и курсом 7 дней после, в виде водных растворов, Ренитек в дозе 1 мг/кг. Поликардин в дозе 100 мг/кг. Обнаружено, что БАД «Поликардин» достоверно обладает противоишемическим действием, сопоставимым с таковым у препарата «Ренитек», препятствует формированию очага некроза и достоверно повышает выживаемость экспериментальных животных в условиях острой гипоксии.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ получения пептидов. Проводят автолиз дрожжей. Отделяют клеточные оболочки центрифугированием. Очищают автолизат на гелевом сульфокатионите в водородной форме, содержащем 12-16% дивинилбензола. Полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с рН 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит. Преимуществом заявленного способа является получение пептидов высокой степени очистки, которые обладают биологической активностью. 11 пр.

Способ получения пептидов, включающий автолиз дрожжей, отделение клеточных оболочек центрифугированием, очистку автолизата на ионитах и получение водного раствора пептидов, при этом в качестве ионита используют гелевый сульфокатионит в водородной форме, содержащий в качестве сшивающего агента 12-16% дивинилбензола, отличающийся тем, что полученный водный раствор пептидов пропускают последовательно через гелевый анионит до получения раствора с pH 2,0-2,6, а затем через гелевый катионит с содержанием дивинилбензола 1-2% или макропористый катионит.