СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 1998 года по МПК A61K35/20 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, прежде всего кишечной группы, человека, сельскохозяйственных и домашних животных.

Известно, что основными средствами борьбы с бактериальными инфекционными заболеваниями являются антибиотики широкого спектра действия и подобные им препараты.

Однако использование их при лечении инфекционных заболеваний влечет за собой ряд нежелательных последствий: патогенные микроорганизмы быстро приобретают к ним устойчивость; часто наблюдаются случаи повышенной чувствительности больных к данным препаратам; возникает нарушение биоценоза кишечника и, как следствие, дисбактериоз. Применение кишечных вакцин для создания активного иммунитета ограничено реактивностью корпускулярных антигенов, кратковременностью вызываемого ими иммунитета, недостаточной эффективностью химических вакцин.

Большую проблему представляет собой лечение вирусных кишечных заболеваний (ротовирус), особенно у новорожденных и детей младшего детского возраста.

Важной практической задачей является разработка безвредных для макроорганизма, физиологичных и высокоэффективных препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека и животных.

В настоящее время все чаще в медицинской практике в качестве средств пассивной энтеральной иммунизации для профилактики и лечения бактериальных и вирусных кишечных заболеваний находят применение препараты иммунного молока и молозива коровы, представляющие собой очищенную от примесей фракцию иммуноглобулинов G, М и А.

Эти препараты не дают отрицательных побочных эффектов и не угнетают нормальную микрофлору кишечника. Для производства этих препаратов необходимо иметь достаточно простой и высокоэффективный метод выделения иммуноглобулинов.

Известен способ получения иммуноглобулиновых препаратов молока, предложенный фирмой Мерье: после удаления жира и казеина лактосыворотку подвергают двухступенчатой ионообменной хроматографии. Данный метод обладает рядом существенных недостатков: длительность процедуры; низкая, мало отвечающая требованиям промышленности скорость нанесения и снятия элюата с сорбента; значительное конечное разведение белка после каждого деления и, как следствие, необходимость многократного концентрирования и проведения диализа; приготовление больших количеств различных буферов; необходимость наличия большого количества дорогих ионообменников; более высокая себестоимость данных иммуноглобулиновых препаратов по сравнению с предлагаемым способом.

Кроме того, существует способ получения иммуноглобулиновых препаратов молока и молозива, предложенный Ростовским-на-Дону НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены, где антиколипротейный и против условнопатогенных бактерий лактоглобулиновые препараты получали методом спиртового осаждения иммуноглобулинов по сокращенному варианту "А" метода Кона и используемого для изготовления противокоревого гамма-глобулина (Холчев Н.В. Методика получения очищенной гамма-глобулиновой фракции, 1947). После удаления жира и казеина лактосыворотку охлаждали до 0^oС, доводили рН до минус 5,75-5,85^oС, добавляли 50% этанол из расчета 1 л спирта на 1 л сыворотки. Затем снижали температуру до минус 6-8^oС и устанавливали зН 6,2-6,25. Иммуноглобулины выпадали в осадок, после чего их растворяли, осветляли, проводили стерилизующую фильтрацию и сушили.

Из выше изложенного видно, что использование спиртового метода Кона для получения иммуноглобулиновых препаратов из молока и молозива коровы ограничено трудоемкостью, длительностью процедуры, необходимостью большого количества дорогого холодильного оборудования и расходом большого объема этилового спирта.

Цель изобретения - способ получения иммуноглобулиновых препаратов из молока и молозива коровы, упрощение технологии производства и степени очистки иммуноглобулиновой фракции, снижение себестоимости продукции.

Указанная цель достигается тем, что в качестве сырья для получения иммуноглобулиновых препаратов используются молоко и молозиво коровы, а осаждение балластных белков и липидов проводят каприловой кислотой.

В сыворотку молока или молозива коровы после удаления жира и казеина при pН 4,0-5,0 медленно через шприц или делительную воронку при постоянном интенсивном перемешивании добавляют каприловую кислоту из расчета 2,0-10,0 мл на 100 мл обрабатываемой жидкости. После прекращения добавления реагента перемешивание продолжается в течение 1-2 ч. Далее проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 50-60 мин, после чего осадок удаляют, а иммуноглобулины остаются в растворе. После проведения фильтрации устанавливают рН раствора в пределах 7,0-7,5 1 М едким натрием при интенсивном перемешивании. Затем проводят концентрирование и диализ.

Каприловая кислота, потребляемая людьми ежедневно вместе с пищей, входит в состав триглицеридов молочных жиров и составляет 4-8% (по данным разных авторов) от общей массы жирных кислот. Между тем, она обладает антибактериальным действием, что также может являться положительным фактором. При доведении рН до нейтральной большая часть образующегося из оставшейся каприловой кислоты каприлата натрия выходит из раствора при диализе. Как стабилизатор белка каприлат натрия добавляется в препараты крови (Русанов В.М., Скобелев Л. И. , 1983), в частности, во внутривенные (авт.св. ЧССР N 24854 и N 248956).

Пример. После удаления жира, а затем казеина путем кислотной коагуляцией в полученную сыворотку молока или молозива при pН 4,0-5,0 медленно через шприц или делительную воронку при постоянном интенсивном перемешивании добавляют каприловую кислоту из расчету 2,0-10 мл на 100 мл обрабатываемой жидкости. После прекращения добавления реагента перемешивание продолжается в течение 1-2 ч. Далее проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 50-60 мин, после чего осадок удаляют, а иммуноглобулины остаются в растворе.

При наличии в полученной смеси после центрифугирования взвешенных частиц необходимо произвести фильтрацию.

Затем устанавливают значение pН в пределах 7,0-7,5 1 М едким натрием при интенсивном перемешивании. Далее проводят концентрирование и диализ на модуле с полыми волокнами против физиологического раствора хлорида натрия.

При концентрировании содержание белка доводится до 60+5 мг/мл. Определение проводят по биуретовому методу (ФС 42-344 ВС-90).

Чистота препарата более 99%. Контроль чистоты проводится в иммуноэлектрофорезе и электрофорезе на ацетатцеллюлозных пленках (РД 42-15-6-12-90).

Состав препарата: JgG - 80-90%, JgA - 0,5-5,0%, JgM - 5-15%. Определение иммуноглобулинов проводят методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с кроличьими моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам молока крупного рогатого скота. Их соотношение между собой по классам в исходном сырье и в готовом препарате должно оставаться примерно на одном уровне. Изначальная концентрация иммуноглобулинов в сырье зависит от времени, прошедшем после отела, здоровья животного, породы и возраста, состава кормов, времени года (Butler, J.E., 1983).

Выход препарата по иммуноглобулинам составляет 90%.

В исходном сырье и готовом препарате определяют титры антител к одному из видов энтеробактерий (сальмонеллы, эшерихии, шигеллы, клебсиеллы, протей, цитробактер), синегнойной палочке, патогенному стафилококку, холерному вибриону, а также к вирусам (ротовирусу) и т.д., а затем к микроорганизмам, вызывающим кишечные заболевания сельскохозяйственных и домашних животных. Титры антител к возбудителям инфекционных заболеваний определяют методам РТГА и РПГА и зависят от специфической активности исходного сырья и в конечном препарате, в пересчете на концентрацию иммуноглобулинов, остаются на прежнем уровне.

Преимущество предлагаемого способа получения высокоиммунохимически чистых иммуноглобулиновых препаратов заключается в простоте, легкости воспроизведения, технологичности, в отсутствии необходимости дорогого специального оборудования и большого расхода химических реагентов, что позволяет получить высокоэффективные препараты для профилактики и лечения кишечных инфекционных заболеваний человека, домашних и сельскохозяйственных животных.

ЛИТЕРАТУРА
1. Холчев Н.В., Колесникова Л.И. Исследования по очистке и концентрации противокоревых сывороток. Сообщение 1. Методика получения очищенной гамма-глобулиновой фракции. - Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 1947, N 5, с.6-16.

2. Иванов Н.Р., Ермолов В.И. Иммунные препараты молока и их применение при острых кишечных инфекциях у детей. Изд. Саратовского университета, 1985.

3. Butler,J.E. Bovine immunoglobulins: an auqmented Raviev. - Veterinary Immunology and Immunopathology, 4 (1983), 43-152.

4. Минаева Л.Д. Иммунологическая характеристика и устойчивость к протеолитическим ферментам препарата колипротейного лактоглобулина. Канд.дисс. Ростовский-на-Дону НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены, 1980.

5. Соболева С.В., Минаева Л.Д., Алексанина Н.В. и др. Экспериментальное изучение препарата лактоглобулина против условно-патогенных бактерий и сальмонелл. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, N 9, 1991, с. 54-55.

Способ может быть использован для профилактики и лечения инфекционных заболеваний, прежде всего кишечной группы человека и сельскохозяйственных и домашних животных. Сыворотку молока или молозива обрабатывают каприловой кислотой, коагулируя белки неиммуноглобулиновой природы и липиды.

Способ получения иммуноглобулинового препарат, содержащего иммуноглобулины G, M и A, включающий использование в качестве исходного продукта молока или молозива иммунных коров, удаление жира путем центрифугирования исходного продукта, получение его сыворотки путем кислотной коагуляции и удаления казеина, отличающийся тем, что затем сыворотку обрабатывают каприловой кислотой из расчета 2 - 10 мл кислоты на 100 мл сыворотки, коагулируя белки неиммуноглобулиновой природы и липиды, после чего удаляют осадок.