РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pBM И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БЕЗМАРКЕРНЫХ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ ЦЕЛЕВЫЕ ПРОДУКТЫ Российский патент 2011 года по МПК C12N15/82 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии растений, а именно к селекции растений, и может быть использовано для создания биологически и экологически безопасных трансгенных растений с заданными свойствами.

В результате генетической трансформации растений только в незначительную часть клеток эксплантов или клеток суспензионной культуры проникают и интегрируют в их геном молекулы рекомбинантной ДНК. В связи с этим отбор трансформированных клеток растений проводят на соответствующих селективных средах с помощью включения в геном растений наряду с целевым геном также селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам [1].

Скрининг трансформированных клеток растений можно проводить также с помощью более трудоемкого способа, основанного на использовании генов-репортеров, кодирующих легко детектируемые по их активности белки, например цветные флуоресцентные белки [2].

Однако после отбора трансформированных клеток и их регенерантов с помощью селективных генов или генов-репортеров их присутствие в трансгенных растениях становится нежелательным или даже биологически опасным при культивировании таких растений в коммерческих целях в окружающей среде. Это связано с возможностью неконтролируемого переноса генов устойчивости к антибиотикам в другие растения или микроорганизмы. Современное поколение коммерческих трансгенных растений содержит селективные гены или гены-репортеры в качестве такого нежелательного "генетического мусора".

В настоящее время существует несколько стратегий удаления селективных маркеров из растений.

Известен способ создания безмаркерных трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. и риса Oryza sativa L., который основан на способе котрансформации с использованием векторов для трансформации растений серии pSB с двумя участками Т-ДНК, один из которых содержит ген интереса gusA, а другой - селективный маркерный ген aphIV [3]. При этом использовали супервирулентный штамм Agrobacterium tumefaciens A281. Первоначально на селективной среде отбирали трансгенные растения, содержащие оба гена. В дальнейшем отобрали потомство, не содержащее селективный ген aphIV.

Однако необходимыми условиями этого способа являются высокая частота трансформации, а также встраивание селективного гена и гена интереса в разные локусы, что не всегда достижимо.

Известен способ создания безмаркерных трансгенных растений томата Lycopersicon esculentum, включающий удаление селективных маркеров из генома трансгенных растений с использованием транспозонов. При этом использовали штамм Agrobacterium tumefaciens GV311SE. В этом способе селективный ген неомицинфосфотрансферазы nptII был фланкирован инвертированными повторами транспозона Ds-элемента кукурузы. Селективный ген выщеплялся при повторной трансформации растений томата геном транспозазы [4].

Таким образом, необходимо проводить дополнительную стадию, что усложняет способ. Кроме того, недостатком этого способа является то, что каждый трансформант может содержать несколько вставок генов. Необходимо проводить гибридизационный анализ ДНК трансформантов и потомства, что усложняет способ отбора безмаркерных растений.

Известен способ создания безмаркерных трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L. [5]. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens GV3111(pTiB6S3SE), содержащий плазмиды pED53::pED37 и pBIN19::pED23.

Для создания безмаркерных растений при этом использовались возможности сайт-специфической рекомбинации на основе системы Cre/lox бактериофага P1 [6]. Эта система состояла из двух компонентов: рекомбиназы Cre (38 кД) и ее сайтов-мишеней 1ох размером 34 пн. Рекомбиназа Cre катализировала вырезание ДНК между двумя прямыми повторами сайтов-мишеней 1ох.

Выщепление селективного гена из трансгенных растений табака с помощью такого способа впервые показано в 1991 году [5], однако до последнего времени он не находил применения для получения безмаркерных коммерческих растений.

Известен также способ создания безмаркерных трансгенных растений кукурузы Zea mays L. сорта LY038, основанный на применении рекомбинационной системы Cre/lox [7]. При этом растения кукурузы были получены методом биолистической трансформации (без использования бактерий Agrobacterium tumefaciens). Маркерный ген nptII был удален из растений потомства с использованием системы Cre/lox.

Недостаток этого метода состоит в необходимости повторной трансформации растений или скрещивании с растениями, содержащими ген cre. Этот трудоемкий процесс занимает длительное время из-за необходимости получения растений, содержащих только целевой ген после расщепления признаков у потомства.

Известен также способ создания безмаркерных трансгенных растений арабидопсиса Arabidopsis thaliana, основанный на упрощенном варианте предыдущего способа. Использовались индуцибельные промоторы для экспрессии гена cre [8, 9].

Известен способ создания безмаркерных трансгенных растений табака Nicotiana tabacum L., основанный на временной экспрессии рекомбиназы [10]. Исходные растения были трансформированы штаммом Agrobacterium tumefaciens, содержащим вектор pGNG.

Недостатком способа является то, что для вырезания маркерного гена nptII из генома растений требовалось дополнительно заразить растения вирусом табачной мозаики, содержащим рекомбиназу Cre.

Известен способ создания безмаркерных трансгенных растений табака (Nicotiana tabacum cv. xanthi) и гибрида тополя (Populus sieboldii x Populus grandidentata), основанный на использовании векторной системы MAT (Multi-Auto-Transformation) [11]. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens P022, содержащий вектор pNPI106. В этом способе использовали агробактериальный ген ipt в качестве селективного маркера роста трансформированных растений на средах без специфических гормонов. Для вырезания гена ipt использовали транспозон Ас.

Недостатком способа является то, что необходимо встраивание маркерного гена только в одной копии. Из-за этого эффективность отбора безмаркерных растений падает. Необходимы дополнительные анализы для отбора растений с одной копией гена.

Известен способ создания безмаркерных трансгенных растений картофеля Solanum tuberosum L., основанный на использовании селективных генов для позитивной (ген неомицинфосфотрансферазы nptII) и негативной (ген цитозиндезаминазы codA) селекции на одной плазмиде и целевого гена - на другой [12]. Для трансформации растений использовали штамм Agrobacterium tumefaciens AGL0, содержащий вектор PROGMO. Временная позитивная селекция трансформированных растений на среде с канамицином сменялась этапом негативной селекции на среде с 5-фторцитозином, что приводит к отбору растений, содержащих с частотой до 15% только целевой ген.

Недостатком способа является значительная длительность проведения из-за необходимости дополнительных анализов ДНК безмаркерных растений методами ПЦР и ДНК-гибридизации по Саузерну.

Все перечисленные способы не дают возможности отбора безмаркерных трансгенных растений за короткий промежуток времени (не более, чем за два месяца) и одновременной возможности прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена.

Задачей изобретения является разработка способа получения безмаркерных трансгенных растений.

Технический эффект изобретения заключается в том, что обеспечивается экологическая и биологическая безопасность трансгенных растений, экспрессирующих гены целевых белков без дополнительных селективных генов или генов-репортеров, а также сокращение времени проведения способа и появляется одновременно возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена.

Предлагается способ получения безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевой продукт, который включает генетическую трансформацию эксплантов растений in vitro кокультивацией со штаммом бактерий Agrobacterium tumefaciens, несущим рекомбинантную плазмиду только с целевым геном, после которой помещают трансформированные экспланты растений на питательную среду, не содержащую антибиотиков, для инициации побегов, полученные побеги выращивают на свежей среде до фертильных трансгенных растений, имеющих ген целевого продукта и сохраняющих все признаки исходного сорта.

При этом отбор трансгенных растений проводят с помощью иммуноферментного анализа или вестерн-блот анализа продукта целевого гена.

Для трансформации используют штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404), содержащий плазмиду рВМ.

При этом в состав кассеты экспрессии плазмиды рВМ входят генетические конструкции, выбранные из ряда: промотор CaMV 35SS - ген HBsAg - терминатор pACaMV; промотор CaMV 35S - ген cecP1 - терминатор pACaMV; промотор TR1' - ген CryIA(b) - терминатор pAocs; промотор pNOS - ген M.EcoRII- терминатор pAnos.

Плазмида рВМ с репликоном широкого круга хозяев RK2 (Фиг.1) была сконструирована для использования в качестве вектора в агробактериальной бинарной системе генетической трансформации растений. При этом плазмида была укорочена на 2600 п.н. по сравнению с исходным вектором pBIN19, что дает преимущества при трансформации растений, так как может снизить нежелательный эффект длинных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и соответственно на экспрессию целевого гена.

В качестве целевых генов используют сконструированные при участии авторов предлагаемого изобретения гены поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) [13], антимикробного пептида млекопитающих цекропина Р1 (cecP1) [14], дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryIA(b) [15], бактериальной ДНК-метилтрансферазы M.EcoRII [16].

Однако ряд целевых генов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничивается указанными генами.

Преимущества предложенного способа заключаются в прямой селекции трансгенных растений по синтезируемым ими целевым продуктам, а также в сопряженной с ней одновременной возможности прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена.

Это позволяет опустить обязательные этапы анализа присутствия целевого гена и его РНК в первичном скрининге трансформантов растений, что значительно упрощает способ получения трансгенных растений.

В ранее разработанных способах отбора безмаркерных трансгенных растений происходил опосредованный отбор растений по специальным селективным маркерным генам или генам-репортерам с необходимостью их последующего удаления. В предложенном нами способе нет необходимости удалять маркерные и селективные гены из полученных трансгенных растений, что также упрощает способ получения трансгенных растений.

Известно, что не всегда целевой ген экспрессируется при экспрессии маркерного гена или гена-репортера. Процесс генетической трансформации растений сопровождается "замолканием" трансгенов с частотой до 30-60% [17]. Данные количественного анализа синтеза мРНК целевого гена с помощью метода РНК-ДНК-гибридизации не всегда коррелируют с количеством синтезируемого клеткой целевого белка, что может быть связано с деградацией РНК или белка. Предлагаемый нами способ позволяет прямой отбор растений по целевым генам.

Предлагаемый способ позволяет снизить продолжительную антибиотическую или гербицидную стрессовую нагрузку на растения в процессе отбора трансформантов. У растений, выращиваемых на средах с антибиотиками, ДНК подвергается гиперметилированию [18], что может приводить к "замолканию" или снижению экспрессии целевых генов [19]. Отбор трансгенных растений на бесстрессовой среде создает условия для нормального роста и развития растений без аномального изменения метилирования их генома.

В предлагаемом нами способе трансформации растений используется сконструированный нами вектор с Т-ДНК, укороченной на 2600 п.н., что может снизить нежелательный эффект длинных векторных последовательностей на плотность упаковки ДНК в хроматин и соответственно на экспрессию целевого гена.

Имеются данные об улучшении экспрессии трансгенов в случае трансформации клеток безвекторными генетическими конструкциями [20]. Чем меньше размер вектора, тем выше частота трансформации и меньше вероятность "замолкания" целевого гена.

Для трансформации используют растения, выбираемые из группы: табак (Nicotiana), картофель (Solanum), томат (Lycopersicon), масличный рапс (Brassica), капуста (Brassica).

Примеры в детальном описании приводятся для табака сорт Самсун, томата сорт Субарктик Пленти и рапса сорт Галант.

Однако перечень растений для использования в данном изобретении не ограничивается указанными растениями.

В качестве эксплантов для трансформации, в частности, используют сегменты листьев табака и картофеля и фрагменты гипокотилей томата, рапса и капусты.

Примеры в детальном описании приводятся для генов поверхностного антигена вируса гепатита В HBsAg, антимикробного пептида млекопитающих cecP1, дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryIA(b), бактериальной ДНК-метилтрансферазы M.EcoRII.

Для отбора трансгенных растений табака и томата с геном HBsAg применяют иммуноферментный анализ, позволяющий проводить скрининг трансформированных регенерантов по развитию специфического окрашивания в иммунной реакции их клеточных экстрактов с антителами к HBs-антигену. Этот весьма чувствительный метод позволяет определять в экстрактах трансгенных растений HBs-антиген в концентрации 0,5 нг/мл, что позволяет детектировать присутствие HBs-антигена даже при 2000-кратном его разбавлении экстрактами нетрансформированных растений.

Для отбора трансгенных растений рапса с геном cecP1 и табака с геном M.EcoRII используют вестерн-блот анализ.

Для отбора трансгенных растений табака с геном CryIA(b) применяют радиоиммунологический анализ белковых экстрактов листьев трансгенных растений с поликлональными антителами против белка CryIA(b).

На фиг.1. представлена схема плазмиды рВМ. Жирным отмечена область Т-ДНК, интегрирующая в геном растений и не содержащая генетических селективных маркеров.

На фиг.2 представлен вестерн блот-анализ экстрактов листьев отдельных растений табака с геном cecP1.

Возможность осуществления предлагаемого способа подтверждается представленными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Конструирование плазмиды рВМ.

Плазмиду рВМ, не содержащую маркерных генов для отбора трансгенных растений, получают на основе бинарного вектора для трансформации растений pBIN19 [21]. Из этого вектора удаляют маркерный ген устойчивости к канамицину nptII вместе с промотором и сигналом полиаденилирования агробактериального гена нопалинсинтазы. Для этого плазмиду pBIN19 гидролизуют эндонуклеазой рестрикции SphI. Из агарозного геля выделяют фрагмент размером 9190 п.н. и сшивают концы ДНК-лигазой фага Т4. В результате получают плазмиду рВМ без селективного гена nptII устойчивости к канамицину, содержащую полилинкер с несколькими сайтами для клонирования (Фиг.1). Плазмида рВМ содержит репликон широкого круга хозяев RK2, начало репликации ori V, начало репликации из плазмиды ColE1, практически полностью сохранившийся полилинкер вектора pBIN19 с различными сайтами для клонирования генов (EcoRl, KpnI, SmaI, BamHI, SalI, SphI) и последовательности TL, TR агробактериальной Т-ДНК, необходимые для ее интеграции в растительный геном. В плазмиде рВМ присутствует ген устойчивости к канамицину nptIII для отбора рекомбинантного вектора в бактериальных клетках [22], однако он расположен вне области Т-ДНК, не включается в геном растений и не используется для отбора трансгенных растений.

Пример 2. Конструирование плазмиды pBM-Ag.

В полученную плазмиду рВМ по сайту SphI встраивают ген HBsAg под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Источником гена HBsAg служит рекомбинантная плазмида pSS-HBsAg, содержащая синтетический ген, кодирующий полипептид HBsAg/mayw [13]. Полученный рекомбинантный вектор pBM-Ag переносят в штамм бактерии Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404) [23] методом прямой трансформации [24].

Анализ ДНК полученных клонов проводят методом гибридизации по Саузерну с меченным 32Р ПЦР-продуктом гена HBsAg [25].

Полученные бактерии Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag) используют для трансформации растений табака и томата.

Пример 3. Конструирование плазмиды pBM-cecP1.

Синтетический ген цекропина P1 (cecP1) под контролем одинарного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) вырезают с помощью эндонуклеазы рестрикции SphI и встраивают в вектор рВМ по сайту SphI. Источником гена сесР1 служит плазмида pRT103-cecP1 [14]. Полученную конструкцию переносят в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404). Анализ ДНК полученных клонов проводят методом гибридизации по Саузерну с меченным 32Р ПЦР-продуктом гена cecP1.

Полученные бактерии A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, рВМ-сесР1) используют для трансформации растений.

Пример 4. Конструирование плазмиды pBM-bt.

Ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryIA(b) под контролем промотора TR1' гена маннопинсинтазы вырезают с помощью эндонуклеазы рестрикции SphI и встраивают в вектор рВМ по сайту SphI. Источником гена CryIA(b) служит плазмида рВТР40 [15]. Полученную конструкцию переносят в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404). Анализ ДНК полученных клонов проводят методом гибридизации по Саузерну с меченным 32Р ПЦР-продуктом гена CryIA(b).

Полученные бактерии A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-bt) используют для трансформации растений.

Пример 5. Конструирование плазмиды рВМ-M.EcoRII.

Ген бактериальной ДНК-метилтрансферазы M.EcoRII под контролем промотора гена нопалинсинтазы вырезают с помощью эндонуклеазы рестрикции SphI и встраивают в вектор рВМ по сайту SphI. Источником гена M.EcoRII служит плазмида pLGV2382-M.EcoRII [15]. Полученную конструкцию переносят в штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404). Анализ ДНК полученных клонов проводят методом гибридизации по Саузерну с меченным 32Р ПЦР-продуктом гена M.EcoRII.

Полученные бактерии A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, рВМ-M.EcoRII) используют для трансформации растений.

Пример 6. Подготовка штаммов бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag), A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1), A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-bt) и A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-M.EcoRII) для трансформации растений.

Клетки штаммов бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, рВМ-Ag), A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1), A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-bt) и A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-M.EcoRII) штрихом высевают на агаризованную питательную среду LB [25], содержащую селективные антибиотики рифампицин (100 мг/л) и канамицин (50 мг/л) и инкубируют 2-3 суток при 28°С.

Для трансформации растений используют ночную культуру бактерий A. tumefaciens. Для этого отдельные колонии бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag), бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1), A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-bt) и A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-M.EcoRII) помещают стерильной микробиологической петлей в 10 мл жидкой питательной среды LB и инкубируют в течение ночи на термостатируемом орбитальном шейкере при 28°С и 120-150 об/мин.

Пример 7. Трансформация растений табака клетками бактерий А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag).

А) Подготовка растительного материала.

Полученными агробактериальными штаммами трансформируют листовые экспланты табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун. Растения табака выращивают в 0.5-1-литровых культуральных сосудах на агаризованной среде МС [26] без фитогормонов при 24-26°С, освещенности 2 клк и относительной влажности воздуха 65%.

Б) Генетическая трансформация эксплантов растений табака

Трансформацию листовых эксплантов табака проводят по стандартной методике [27]. Для этого листовые экспланты кокультивируют в течение двух суток с ночной культурой бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag), а затем переносят на среду МС с гормонами (1 мг/л 6-бензиламинопурина, 0.1 мг/л нафтилуксусной кислоты) и цефотаксимом (500 мг/л). Регенерированные побеги пассируют на безгормональной среде МС.

В результате трансформации листовых эксплантов табака бактериями A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag) получили 600 регенерантов табака на бесселективной среде МС, которые проанализировали с помощью иммуноферментного анализа и вестерн-блот анализа. Все регенеранты табака не отличались от исходных растений по морфологическим признакам.

Пример 8. Трансформация растений табака клетками бактерий А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-bt). Трансформацию проводят аналогично примеру 7.

Пример 9. Трансформация растений табака клетками бактерий А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-M.EcoRII). Трансформацию проводят аналогично примеру 7.

Пример 10. Отбор трансформантов табака с геном HBsAg методом иммуноферментного анализа.

А) Выделение белка из тканей растений.

Взвешивают листья анализируемых растений (100-500 мг). Образцы разрушают пестиком в фарфоровой ступке с жидким азотом, затем добавляют буфер для экстракции (0,05 М Na-фосфатный буфер, рН 7,5, 0,15 М NaCl, 0,001 М ЭДТА, 0,3% твин 20, 0,2 мг/мл леупептина, 0,0004 М фенилметилсульфонилфторид, 1% аскорбата натрия) и продолжают растирать. Полученную однородную массу переносят в пластиковую центрифужную пробирку, смывая остатки экстракта со стенок ступки и пестика указанным буфером, учитывают конечный объем полученного гомогената. Приготовленные образцы центрифугируют 10 минут в микроцентрифуге Eppendorf при 4°С.

В результате получают растительные экстракты из листьев анализируемых растений табака, в которых определяют количество белка.

Б) Определение белка в растительных экстрактах.

Белок в полученных после центрифугирования растительных экстрактах табака определяют методом Брэдфорд [29]. Реагент Брэдфорд готовят следующим образом: 100 мг кумасси G-250 растворяют в 50 мл 96%-ного этанола, добавляют 100 мл ортофосфорной кислоты, доводят до 1 л дистиллированной водой и фильтруют через бумажный фильтр. К 100 мкл разбавленного в 20-100 раз растительного экстракта добавляют 1 мл реагента Брэдфорд и хорошо перемешивают. Не ранее чем через 5 мин и не позднее чем через 1 ч измеряют поглощение при 595 нм - относительно чистого реагента на спектрофотометре Spekol 221. Концентрацию белка находят по градуировочному графику, построенному для бычьего сывороточного альбумина.

В результате получили растительные экстракты из листьев табака е концентрацией 2-10 мг белка/мл.

Эти растительные экстракты анализировали с помощью иммуноферментного анализа и вестерн-блот анализа на наличие в них поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg).

В) Иммуноферментный анализ (ИФА) растительных экстрактов из листьев табака на наличие HBsAg.

Содержание антигена HBsAg в трансгенных растениях определяют при помощи иммуноферментной тест-системы для выявления HBsAg с использованием рекомбинантного антигена «HBsAg-ИФА-Бест», (ЗАО «Вектор-Бест», Кольцово).

Тест-система предназначена для выявления HBsAg в сыворотке (плазме) крови человека методом иммуноферментного анализа (ИФА) и комплектуется всеми необходимыми реагентами: планшеты с иммобилизованными моноклональными антителами к HBsAg; контрольная положительная и слабоположительная инактивированная сыворотка крови человека (К+ и Ксл+), содержащие рекомбинантный антиген HBsAg; контрольная отрицательная сыворотка крови человека (К-), не содержащая HBsAg; раствор конъюгата №1 - биотинилированные поликлональные антитела к HBsAg; раствор конъюгата №2 - конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена; раствор конъюгата моноклональных антител против HBsAg с пероксидазой хрена (конъюгат); растворы для разведения конъюгатов (РКК №1 и 2); субстратный буферный раствор (СБР); субстрат - тетраметилбензидин (ТМБ); стоп-реагент (2 М H₂SO₄); фосфатно-солевой буферный раствор с твином (ФСБ-Т) для промывания лунок планшета. Чувствительность тест-системы не менее 0,1 нг/мл.

Образцы растительных экстрактов из листьев табака наносят в лунки планшета следующим образом. Лунка А1 на планшете - бланк (контроль субстрата). В остальные лунки вносят по 100 мкл каждого образца в нескольких разведениях: 1:100, 1:50, 1:20, без разведения. В качестве отрицательного контроля используют прилагаемую к тест-системе контрольную отрицательную сыворотку крови человека (К-), не содержащую HBsAg, а также экстракт нетрансгенного растения, не содержащий HBsAg. В качестве положительного контроля используют контрольные положительные сыворотки крови человека (К+ и Ксл+) тест-системы, содержащие рекомбинантный HBsAg. Для построения калибровочной кривой используют рекомбинантный белок HBsAg, полученный в дрожжах (НПК "Комбиотех", Москва), в количествах 0,5-1-2-2,5-3-4-5 нг/мл.

Далее в каждую лунку, кроме А1, добавляют 50 мкл раствора конъюгата №1, разведенного согласно инструкции к тест-системе. Планшет закрывают и инкубируют в течение 40 мин при 42°С или 60 мин при 37°С в термостатируемом шейкере Biosan PCT-60HL plus (Россия) с интенсивностью перемешивания 700-800 об/мин.

Затем содержимое лунок удаляют. Не промывая планшет, вносят лунки по 100 мкл раствора конъюгата №2 и инкубируют в течение 30 мин при 37 или 42°С в термошейкере с интенсивностью перемешивания 700-800 об/мин. Планшет промывают 5 раз раствором ФСБ-Т и два раза дистиллированной водой, добавляя во все лунки не менее 400 мкл промывочного раствора. Жидкость из лунок удаляют, планшет подсушивают 5 мин при комнатной температуре.

Во все лунки вносят по 100 мкл свежеприготовленного раствора тетраметилбензидина и инкубируют при комнатной температуре (18-25°С) в течение 25-30 мин в защищенном от света месте. Реакцию останавливают добавлением в лунки по 100 мкл стоп-реагента.

Учет результатов проводят на иммуноферментном анализаторе «Униплан» (ЗАО «Пикон», Россия) при длине волны 450 нм не позднее 10 мин после добавления стоп-реагента. Значение оптической плотности А1 вычитают из значений оптической плотности каждой пробы. Количество HBsAg в образцах растительных экстрактов табака оценивают по точкам калибровочной кривой.

В результате получили, что в выборке из 600 регенерантов табака, первоначально разбитых на группы, представляющие смесь эксплантов из 20-63 проростков, наличие HBsAg постоянно выявлялось в нескольких группах. В некоторых случаях в положительно детектируемой HBsAg-группе было выявлено до 3-5 индивидуальных трансформированных растений. Эффективность трансформации определяли как процентную долю HBs-положительных регенерированных проростков по отношению ко всем регенерантам. В проведенных экспериментах эффективность трансформации табака составила 2.5%. Это относительно высокая величина для отбора трансформантов без применения вспомогательных селективных генов. С помощью проведенного иммуноферментного анализа получено 15 линий трансгенных растений табака без селективных маркеров, синтезирующих антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка. Полученные растения поколения F0 были высажены в закрытый грунт для получения семян методом самоопыления. Семена, полученные от трансгенных растений табака, экспрессирующих HBsAg под контролем двойного промотора CaMV 35SS, были простерилизованы и высажены на среду МС без селективных агентов. Спустя месяц у проростков отбирали листья и анализировали их на наличие антигена HBsAg. Проведен анализ поколения F1 нескольких линий трансгенных растений табака и показано наличие у потомства поверхностного антигена вируса гепатита В.

Пример 11. Подтверждение синтеза HBsAg в листьях трансгенных растений табака методом вестерн-блот анализа.

А) Иммунопреципитация HBs-антигена.

Экстракты из трансгенных растений табака готовят следующим образом. Листья растирают в жидком азоте до получения пудры, затем смешивают с фосфатным буфером для экстракции (1:2) и растирают до однородного состояния. Полученный гомогенат центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин в микроцентрифуге Eppendorf при комнатной температуре. Осветленный экстракт осаждают реакцией иммунопреципитации на сорбенте белокА-Сефароза CL-4B («LKB Pharmacia», Швеция). В пробирки Eppendorf добавляют 50 мкл суспензии белокА-Сефароза, 1 мл осветленного экстракта и 2 мкл мышиных моноклональных антител к нативному HBs-антигену. Реакцию иммунопреципитации проводят при легком перемешивании на качалке при 40°С в течение 18 ч.

Иммунопреципитированные фракции центрифугируют 2 мин при 12000 об/мин в микроцентрифуге Eppendorf. Супернатант удаляют и осадок HBs-антиген-белокА-Сефарозы промывают пять раз буфером для отмывки, каждый раз осаждая его центрифугированием в тех же условиях.

Затем к осадку HBs-антиген-белокА-Сефароза добавляют 40 мкл однократного буфера для образцов (62,5 мМ Tris-HCl, pH 6,8; 10% глицерина (по объему); 2% ДСН; 2% дитиотреитола; 0,05% бромфенолового синего) и кипятят 5 мин, затем белки фракционируют электрофорезом в 15%-ном ПААГе с ДСН по Лэммли [31].

Б) Вестерн-блот анализ экстрактов растений табака с геном HBsAg.

После электрофореза белки табака переносят на поливинилидин-дифторидную мембрану ImmobilonTM PVDF («Millipore», США) электроблоттингом с помощью прибора MiniTrans-blot® («Bio-Rad») в буфере, содержащем 0,025 М Tris-HCl, 0,193 М глицин и 20% этанола, в течение 2 ч при 100 В. Отмывание мембраны проводят в буфере TBS-T (0,01 М Трис-HCl, pH 7,5; 9% NaCl; 0,1% Твин-20 («Sigma», США), забивку проводят в том же буфере с 5%-ным сухим обезжиренным молоком в течение 12 ч. Мембрану обрабатывают специально полученными кроличьими поликлональными антителами к мономеру HBsAg в разведении 1:5000. В качестве вторичных антител используют козлиные антитела (1:10000), конъюгированные с пероксидазой хрена («Pierce», США). Проявку мембраны производят с помощью хемилюминесцентной системы ECL («Pierce»).

В результате этого анализа в экстрактах из листьев отобранных ранее методом ИФА трансгенных растений табака обнаружен поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg). В этом анализе помимо мономерных форм HBsAg выявляются также его димерные формы, что может быть связано с неполной деградацией мультимерного комплекса HBsAg в условиях наших экспериментов. В этом анализе молекулярная масса мономерной формы HBs-антигена, выделенного из синтезирующих его растений табака, определена равной 24 кДа.

Пример 12. Трансформация растений рапса клетками бактерий А. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1).

А) Подготовка растительного материала.

Семена рапса (Brassica napus var. oleifera D.C.) стерилизуют гипохлоритом натрия в течение 30 мин с последующей 3-4-кратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Семена проращивают на чашках Петри с агаризованной безгормональной средой МС [26], содержащей стандартный набор солей, включающей 7 г/л агара и 30 г/л сахарозы (рН 5,8) при температуре 22-24°С, 16-часовом дне и освещенности 2 клк.

Полученные проростки растений используют в качестве источника эксплантов - гипокотилей (участок проростка между кончиком корня и семенем). За два дня до трансформации гипокотили рапса отрезают от десятидневных стерильных проростков, разрезают на 8-10 мм сегменты и помещают на чашки Петри, содержащие 25 мл агаризованной питательной среды для регенерации, дополненной регуляторами роста - 1 мг/л БАП и 0.1 мг/л НУК. Через двое суток экспланты гипокотилей рапса используют для трансформации штаммом бактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1).

Б) Генетическая трансформация эксплантов рапса штаммом бактерий Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1).

1. Промывают ночную культуру бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1): осаждают бактериальные клетки методом центрифугирования при 4 тыс.об/мин в течение 5-10 мин, разводят полученный осадок в 10 мл свежей жидкой среды LB.

2. Заливают в чашки Петри 1:100 (OD₆₃₀=0.25) разведенную суспензию клеток штамма бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1), помещают в суспензию агробактерий растительные экспланты гипокотилей рапса.

Кокультивацию проводят в течение 10-15 мин. После этого экспланты рапса подсушивают на стерильной фильтровальной бумаге и равномерно раскладывают на агаризованной питательной среде МС для регенерации, дополненной регуляторами роста 1 мг/л БАП и 0.1 мг/л НУК.

В контрольном варианте используют вместо суспензии клеток бактерий такое же количество жидкой питательной среды LB.

3. На третий день экспланты помещают на питательную среду МС для регенерации, дополненную регуляторами роста 1 мг/л БАП, 0.1 мг/л НУК и антибиотиком цефотаксимом (Cf), подавляющим развитие штамма бактерий A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1), в концентрации 500 мг/л.

Через каждые 14 дней экспланты переносят на свежую среду МС для регенерации того же состава. При появлении регенерантов на среде, не содержащей селективного антибиотика, проводят бесселективный отбор трансформантов рапса.

В результате трансформации эксплантов гипокотилей рапса бактериями A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-cecP1), получили 2000 регенерантов рапса на бесселективной среде МС, которые подвергли анализу методами вестерн-блот анализа и ПЦР. Все регенеранты не отличались от исходных растений по морфологическим признакам.

Пример 13. Вестерн-блот анализ экстрактов растений рапса с геном cecP1.

Для бесселективного отбора трансформантов отбирают по одному листовому экспланту у каждого из 50 регенерантов рапса, объединяют их в группы (всего 40 групп) и используют для приготовления исходных тестируемых образцов растительного экстракта.

Прямой поиск в этих группах индивидуальных растений рапса, синтезирующих антимикробный пептид цекропин Р1, проводят методом вестерн-блот анализа. Для этого растения трех таких групп отделяют от эксплантов, пересаживают в отдельные пробирки, подращивают в течение 3 недель и проводят анализ экстрактов из листьев, содержащих около 100 мкг общего белка. Концентрацию общего белка определяют по методу Бредфорд.

Ткани трансформированных и контрольных растений замораживают в жидком азоте и разрушают растиранием в ступке. К полученным лизатам добавляют экстрагирующий буфер 1:1 (вес : объем) состава 4% ДСН, 20 мМ Трис-HCl, рН 6.8. Гомогенат выдерживают 10 мин при 95°С и центрифугируют 4 мин при 14000 g.

Для электрофоретического разделения белков трансгенных растений используют SDS-трициновую систему в 16%-ном ПААГе [32]. Для переноса белков используют PVDF-мембрану ("Porablot", Германия). Электроперенос проводят в течение 2 ч при 200 мА или ночь при 20 мА в буфере (25 М Трис-НС1, 250 мМ глицина) с добавлением 20% метанола. Мембрану сначала инкубируют с антителами к гену cecP1, затем с вторичными кроличьими поликлональными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Иммунодетекцию проводят с помощью набора реактивов хемилюминесцентной системы ECL ("Amersham", Великобритания). Синтетический цекропин Р1 получают методом твердофазного синтеза.

В экспериментах проанализировали 2000 растений рапса. В результате анализа в экстрактах некоторых растений рапса был обнаружен искомый пептид с молекулярной массой 3,4 кДа, соответствующий зрелой форме цекропина Р1 (Фиг.2). В каждой из трех исследованных групп было выявлено от одного до трех цекропин P1-положительных растений. В группах с антибактериальной активностью в количестве 150 индивидуальных растений их прямой анализ на присутствие цекропина Р1 выявил 4 таких растения рапса.

Пример 14. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Присутствие гена cecP1 в трансгенных растениях рапса подтверждают методом ПЦР с праймерами, специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции.

Для ПЦР-анализа генома растений на наличие гена cecP1 используют праймеры, последовательность которых конструируют на основе данных о последовательности гена цекропина Р1 [33]:

1) 5'-CGGGATCCATGGGCTCTTG-3' и

2) 5'-CGAGATCTCTACTTAGCGCGGC-3'.

Для ПЦР анализа трансгенных растений ДНК выделяют из листьев трехнедельных растений [34]. Листья (около 100 мг) растирают в 2 мл-пробирках, добавляют 0,4 мл буфера для экстракции (0.2 М трис-HCl, рН 7.5; 0.25 М NaCl; 25 мМ ЭДТА; 0.5% ДСН), перемешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Далее экстракты осветляют центрифугированием при 12000 об/мин. ДНК осаждают равным объемом изопропанола и осадок растворяют в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl, рН 8.0; 1 мМ ЭДТА).

Полученную растительную ДНК используют в качестве матрицы в ПЦР-анализах. Реакционная смесь содержит 0,1 мкг плазмидной ДНК рВМ-сес в качестве матрицы, 10 мМ трис-HCl, рН 8.8 (при 25°С), 50 мМ KCl, 0.1% Тритон Х-100, 1.5 мМ MgCl₂, 0.2 мМ смеси дНТФ (USB, США), по 50 пикомолей каждого праймера и 2.5 ед. ДНК полимеразы Taq ("Promega", США). Реакцию проводят в объеме 25 мкл при следующих условиях: 94°С - 5 мин; 30 циклов: 94°С - 1 мин, 55°С - 30 с, 72°С - 30 с, затем 72°С - 7 мин на амплификаторе Gene Amp® PCR System 2400 (Perkin Elmer, США).

Продукты амплификации анализируют с помощью электрофореза в 6%-ном ПААГе в трис-боратном буфере при напряженности электрического поля 6 В/см с последующим окрашиванием геля бромистым этидием (концентрация красящего раствора - 2 мкг/мл в воде, время окрашивания - 20 минут при комнатной температуре). Гель фотографируют в ультрафиолете при длине волны 260-280 нм.

Появление продукта ПЦР (ДНК размером 104 н.п.) при использовании указанных праймеров, а также при условии отсутствия его в реакциях, поставленных на контрольной ДНК, свидетельствует о присутствии искомого гена в ДНК исследуемых растений (Фиг.3).

Учитывая результаты исходного анализа 2000 регенерантов растений рапса на присутствие в их экстрактах антибактериальной активности, эффективность выявления трансформированных регенерантов составляет около 1%.

Эффективность трансформации растений рапса определялась как отношение цекропин P1-положительных регенерантов ко всем исследуемым регенерированным проросткам. Чувствительность метода позволяет детектировать в образцах экстрактов трансгенных растений рапса цекропин Р1 в количестве от 1 до 10 нг.

Полученные нами сесР1-растения рапса синтезировали цекропин Р1 на среднем уровне около 0.005% от общего растворимого белка клетки, что делает возможным надежное применение использованного способа обнаружения таких растений в выборке из нескольких сотен регенерантов.

Полученные растения рапса поколения F0 с геном сесР1 были высажены в закрытый грунт для получения семян методом самоопыления. Семена, полученные от трансгенных растений, простерилизованы и высажены на среду МС без селективных агентов. Спустя месяц у проростков отбирали листья и анализировали их на наличие цекропина.

Проведен анализ поколения F1 нескольких линий трансгенных растений и показано наличие у потомства цекропина Р1. Все регенеранты не отличаются от исходных растений по морфологическим признакам.

Пример 15. Вестерн-блот анализ экстрактов растений табака с геном М.EcoRII.

Для бесселективного отбора трансформантов отбирают по одному листовому экспланту у каждого из 30 регенерантов табака, объединяют их в группы (всего 10 групп) и используют для приготовления исходных тестируемых образцов растительного экстракта.

Детекцию в этих группах индивидуальных растений табака, синтезирующих бактериальную метилазу EcoRII, проводят методом вестерн-блот анализа. Для этого растения двух таких групп отделяют от эксплантов, пересаживают в отдельные пробирки, подращивают в течение 3 недель и проводят анализ экстрактов из листьев, содержащих около 100 мкг общего белка. Концентрацию общего белка определяют по методу Бредфорд.

Ткани трансформированных и контрольных растений замораживают в жидком азоте и разрушают растиранием в ступке. К полученным лизатам добавляют экстрагирующий буфер 1:1 (4% ДСН, 20 мМ Трис-HCl, рН 6.8). Гомогенат выдерживают 10 мин при 95°С и центрифугируют 5 мин при 14000 g. Затем к осадку добавляют 40 мкл однократного буфера для образцов (62,5 мМ Трис-HCl, рН 6,8; 10% глицерина (по объему); 2% ДСН; 2% дитиотреитола; 0,05% бромфенолового синего) и кипятят 5 мин, затем белки фракционируют электрофорезом в 15%-ном ПААГе с ДСН по Лэммли [31]. После электрофореза белки табака переносят на мембрану ImmobilonTM PVDF («Millipore», США) электроблоттингом с помощью прибора MiniTrans-blot® («Bio-Rad») в буфере, содержащем 0,025 М Трис-HCl, 0,193 М глицин и 20% этанола, в течение 2 ч при 100 В. Отмывание мембраны проводят в буфере TBS-T (0,01 М Трис-HCl, рН 7,5; 9% NaCl; 0,1% Твин-20 («Sigma», США), забивку проводят в том же буфере с 5%-ным сухим обезжиренным молоком в течение 12 ч. Мембрану обрабатывают специально полученными кроличьими поликлональными антителами к бактериальной метилазе EcoRII в разведении 1:5000. В качестве вторичных антител используют козлиные антитела (1:10000), конъюгированные с пероксидазой хрена («Pierce», США). Проявку мембраны производят с помощью хемилюминесцентной системы ECL («Pierce»).

В результате этого анализа в некоторых объединенных экстрактах из листьев трансгенных растений табака обнаружена бактериальная метилаза EcoRII. В каждой из исследованных групп было выявлено от одного до трех растений с геном М.EcoRII.

Пример 16. Отбор трансформантов табака с геном дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryIA(b) с помощью радиоиммунологического анализа.

Для анализа взвешивают листья анализируемых растений (100-500 мг). Образцы разрушают пестиком в фарфоровой ступке с жидким азотом, затем добавляют буфер для экстракции (0,05 М Na-фосфатный буфер, рН 7,5, 0,15 М NaCl, 0,001 М ЭДТА, 0,3% твин 20, 0,2 мг/мл леупептина, 0,0004 М фенилметилсульфонилфторид) и продолжают растирать. Полученную однородную массу переносят в пластиковую центрифужную пробирку, смывая остатки экстракта со стенок ступки и пестика указанным буфером, учитывают конечный объем полученного гомогената. Приготовленные образцы центрифугируют 10 минут в микроцентрифуге Eppendorf при 4°С. В результате получают растительные экстракты из листьев анализируемых растений табака, в которых определяют количество белка методом Брэдфорд [29]. Полученные растительные экстракты анализируют с помощью радиоиммунологического анализа на наличие в них дельта-эндотоксина. Для этого используют специально полученные поликлональные антитела против белка CryIA(b). В каждую лунку прибора Hybry-Dot Manifold (BRL. США) наносят по 25-50 мкг общего растворимого белка, переносят белки на мембрану PVDF и инкубируют с поликлональными антителами к CryIA(b) и белком А, меченным иодом-125. Детекцию дельта-эндотоксина в экстрактах трансгенных растений проводит с помощью радиоавтографии. В результате в каждой группе из объединенных 20 экстрактов трансгенных растений табака обнаружено по 1-2 растения, содержащих ген CryIA(b) Bacillus thuringiensis.

Пример 17. Получение трансгенных безмаркерных растений томата с геном HBsAg.

Все стадии способа проводятся аналогично описанному в примерах 1, 3-7, за исключением того, что в качестве эксплантов используют части гипокотилей томата (Lycopersicon esculentum Mill.) сорта Субарктик Пленти, растущие in vitro. Семена томата стерилизуют 30 с в 70%-ном этаноле, 15 мин в 20%-ном растворе гипохлорита натрия с добавлением твин-20 до 0.1% и промывают 5-кратным объемом стерильной дистиллированной воды. Семена проращивают в течение 7-10 суток на агаризованной среде МС.

Трансформацию эксплантов гипокотилей томата проводят по стандартной методике [28] с модификациями. Через двое суток после кокультивирования с бактериями A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag) экспланты гипокотилей помещают на среду МС с 2 мг/л зеатинрибозида, 0.5 мг/л индолилуксусной кислоты, 500 мг/л цефотаксима.

В результате трансформации эксплантов гипокотилей томата бактериями A. tumefaciens LBA4404 (pAL4404, pBM-Ag) получили 500 регенерантов томата на бесселективной среде МС, которые подвергли анализу методом иммуноферментного анализа. Все регенеранты томата не отличались от исходных растений по морфологическим признакам. Результаты иммуноферментного анализа показали, что в выборке из 500 регенерантов томата, первоначально разбитых на группы, представляющие смесь эксплантов из 20-50 проростков, наличие антигена HBsAg постоянно выявлялось в нескольких группах. Эффективность трансформации определяли как процентную долю HBs-положительных регенерированных проростков по отношению ко всем регенерантам томата. В проведенных экспериментах эффективность трансформации томата составила 2%. С помощью проведенного иммуноферментного анализа получено 10 линий томата без селективных маркеров, синтезирующих антиген на уровне 0.01-0.05% от общего растворимого белка. Полученные растения поколения F0 были высажены в закрытый грунт для получения семян методом самоопыления. Семена, полученные от трансгенных растений томата, экспрессирующих HBsAg под контролем двойного промотора CaMV 35SS, были простерилизованы и высажены на среду МС без селективных агентов. Спустя месяц у проростков томата отбирали листья и анализировали их на наличие HBsAg. Проведен анализ поколения F1 нескольких линий трансгенных растений томата и показано наличие у потомства поверхностного антигена вируса гепатита В.

Преимущества предложенного способа заключаются в прямой селекции трансгенных растений по синтезируемым ими целевым продуктам и в сопряженной с ней одновременной возможностью прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена. Это позволяет опустить обязательные этапы анализа присутствия целевого гена и его РНК в первичном скрининге трансформантов. В предложенных ранее способах проводили опосредованный отбор по специальным селективным маркерным генам или генам-репортерам с необходимостью их последующего удаления при создании безмаркерных трансгенных растений. Кроме того, не всегда целевой ген экспрессировался при экспрессии маркерного гена или гена-репортера. Данные количественного анализа синтеза мРНК целевого гена с помощью метода РНК-ДНК гибридизации не всегда коррелируют с количеством синтезируемого клеткой целевого белка. Эффективность трансформации растений также может зависеть от размера вектора, чем меньше размер вектора, тем выше частота трансформации и меньше вероятность замолкания целевого гена.

Таким образом, предлагается способ получения безмаркерных трансгенных растений табака, рапса и томата, который обеспечивает экологическую и биологическую безопасность трансгенных растений, экспрессирующих гены целевых белков без дополнительных селективных генов или генов-репортеров, являющихся «генетическим мусором», а также сокращение времени проведения способа и одновременно возможность прямой количественной оценки синтеза продукта целевого гена.

Кокультивируют экспланты растений со штаммом бактерии Agrobacterium tumefaciens, содержащим рекомбинантную плазмиду рВМ, несущую ген целевого продукта и свободную от селективных маркерных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Трансформированные экспланты помещают на среду, не содержащую антибиотики, для инициации побегов. Полученные побеги выращивают на свежей среде до фертильных трансгенных растений, несущих целевой ген и имеющих признаки исходного сорта, и затем ведут прямую селекцию растений по синтезируемым ими целевым продуктам. Для трансформации используют штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404). Отбор трансформантов ведут после регенерации побегов растений иммуноферментным или вестерн-блот анализом непосредственно, анализируя экстракты молодых проростков растений, образовавшихся на питательной среде, не содержащей селективные антибиотики, и экспрессирующих ген целевого продукта. Ген целевого продукта выбирают из группы, состоящей из гена, кодирующего антиген вируса гепатита В, гена, кодирующего антимикробный пептид млекопитающих цекропин Р1, гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryIA(b) и гена бактериальной ДНК-метилтрансферазы M.EcoRII. Способ позволяет получить безмаркерные трансгенные растения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Рекомбинантная плазмида рВМ, содержащая ген целевого продукта, репликон широкого круга хозяев RK2, и свободную от селективных маркерных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам область Т-ДНК, интегрируемую в геном растений, при этом в состав кассеты экспрессии указанной плазмиды входит генетическая конструкция, выбранная из ряда: промотор CaMV 35SS - ген HBsAg -терминатор pACaMV, промотор CaMV 35S - ген сесР1 - терминатор pACaMV, промотор TR1' - ген CrylA(b) - терминатор pAocs, промотор pNOS - ген M.EcoRII - терминатор pAnos.

2. Рекомбинантная плазмида по п.1, отличающаяся тем, что в качестве гена целевого продукта она содержит ген, выбранный из ряда: ген, кодирующий антиген вируса гепатита В, ген, кодирующий антимикробный пептид млекопитающих цекропин Р1, ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CrylA(b), ген бактериальной ДНК-метилтрансферазы M.EcoRII.

3. Способ получения безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевой продукт, включающий кокультивирование эксплантов растений со штаммом бактерии вида Agrobacterium tumefaciens, несущим рекомбинантную плазмиду с геном целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве рекомбинантной плазмиды используют рекомбинантную плазмиду по п.1, помещают трансформированные экспланты растений на среду, не содержащую селективные антибиотики, для инициации побегов, полученные побеги выращивают на свежей среде до фертильных трансгенных растений, несущих целевой ген и имеющих признаки исходного сорта, затем ведут прямую селекцию растений по детекции синтезируемых ими целевых продуктов.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что в качестве штамма бактерии вида Agrobacterium tumefaciens используют штамм Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pAL4404), содержащий рекомбинантную плазмиду рВМ.

5. Способ по п.3, отличающийся тем, что отбор трансформантов ведут после регенерации побегов растений иммуноферментным или вестерн-блот анализом непосредственно, анализируя экстракты молодых проростков растений, образовавшихся на питательной среде, не содержащей селективной антибиотики, и экспрессирующих ген целевого продукта.

6. Способ по п.3, отличающийся тем, что рекомбинантная плазмида рВМ в качестве гена целевого продукта содержит ген, выбранный из ряда: ген, кодирующий поверхностный антиген вируса гепатита В, ген, кодирующий антимикробный пептид млекопитающих цекропин Р1, ген дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis CryIA(b), ген бактериальной ДНК-метилтрансферазы M.EcoRII.

7. Способ по п.3, отличающийся тем, что для трансформации используют растение, выбранное из ряда: табак (Nicotiana), картофель (Solanum), томат (Lycopersicon), масличный рапс (Brassica), капуста (Brassica).