Способ получения трансгенных растений картофеля Советский патент 1992 года по МПК A01H1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано для получения растений с заданными свойствами.

В настоящее время разработаны методы трансформации протопластов, листовых дисков, тканей стеблевых л корневых сегментов, а также дисков клубней картофеля. Однако некоторые важные виды сельскохозяйственных культур не могут быть регенерированы из протопластов или ткани листьев, стеблей, клубней. Обычно трансформированные растения получают через 2-3 мес. При ,пом вследствие длительной селекции трг.нсформиррванного каллуса высока потенциальная возможность сомак- лональной вариабельности е растениях, регенерированных из этого каллуса, Это явление нежелательно в тех случаях, когда необходимо сохранить первоначальную генетическую целостность тр.чнсгенных растений.

Целью изобретония является создание способа трансформации картофеля, обеспечивающего сокращение срока получения трансгенных растений и сохранение их первоначальной генетической целостности

Поставленная цель достигается тем, что применили способ трансформации картофеля, заключающийся в отборе стерил ны зксплантов, помещении их в згаризованную среду, инокуляции жидкой культурой агро- бактерии, отмывании эксплантов от агро- бактерии, культивировании на соответсп вующей среде, черенковании выросших по бегов и их укоренении проверке встраивания чужеродной ДНК в ДНК полученных растений и проверке экспрессии трансформационного маркера - неомицинфосфотран- сферазы-П. В к ачестве эксплантов использовали сегменты стеблей с одной не пошедшей в рост пазушной почкой В збла сти пазушной почки делали насечку иноку ляцию проводили в течение 12 36 iVI00

to 4

00

4

культивирование проводили на агаризован- ной среде, содержащей канамицин (25-50 мкг/мл) и цефотакисм (250-500 мкг/мл), выросшие побеги высаживали в среду, содержащую 25-50 мкг/мл канамицина и не содержащую антибиотиков, подавляющих рост агробактерии, проводили выбраковку растений, проводящая система и/или система межклетников которых заражена згро- бактерией.

Пример. Брали сегмент стебля картофеля с одной пазушной почкой, не пошедшей в рост, в области пазушной почки делали насечку и на насечку наносили жидкую культуру агробактерии. После инокуля- ции 150 пазушных почек картофеля Agrobacterlum tumefaciens, несущей разоруженную плазмиду pGA472, втечение32 ч черенки отмывали от агробактерии и высаживали в агаризовэнную среду, содержа- щую 50 мкг/мп канамицина и 500 мкг/мл цефотаксима. Через 2 нед было получено 102 побега картофеля Все выросшие растения были расчеренкованы и высажены в агаризованную среду, содержащую 50 мкг/мл канамицина и не содержащую антибиотиков для подавления роста агробактерии. При этсм 38 пробирок (вариантов) заросли агробактерией. Эти растения были отбракованы. Из оставшихся 64 растений 3 укоренились. Из укоренившихся растений была выделена и проанализирована методом блот-гибридизации по Саузерну суммарная ДНК. Во всех препаратах ДНК. выделенной изтргнсформированныхрасте- ний, имелись вставки чужеродной ДНК. Трансгенная природа полученных растений

была также доказана наличием экспрессии трансформационного маркера-неомицин- фосфотрансферазы-П. Весь опыт занял 4 нед.

В результате предлагаемого способа трансформации с использованием пазушных почек снижается время получения трансгенных растений картофеля и сохраняется первоначальная генетическая целостность трансформированных растений, появляется возможность трансформации важных сельскохозяйственных культур, которые не могут быть регенерированы из протопластов или тканей листьев, стеблей, клубней.

Формула изобретения Способ получения трансгенных растений картофеля, предусматривающий помещение экспланта растения на агаризованную среду, нанесение на экс- плант жидкой культуры агробактерии, проведение инокуляции, отмывание, культивирование на селективной среде с ка- намицином и цефотаксимом и проведение отбора трансгенных растений, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа и сохранения генетической целостности трансгенных растений, в качестве экспланта используют черенок с одной, не пошедшей в рост пазушной почкой, агробактерии наносят на надрез в пазушной почке, инокуляцию проводят в течение 12- 36ч, полученные после культивирования побеги укореняют на среде без антибиотиков, подавляющих рост агробактерии, и отОира- ют незараженные агробактериями растения.

Использование: в сельском хозяйстве для создания растений с заданными свойст вами. Сущность изобретения: введение чужеродной генетической информации в меристематические клетки пазушных почек и получение трансформированных побегов, минуя стадии каллусо- и морфогенеза. Способ обеспечивает возможность трансформации растений, которые не могут быть регенерированы из протопластов или тканей листьев, стеблей, клубней, сникает время получения трансгенных растений и дает возможность сохранить первоначальную генетическую целостность трансформированных растений