КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА (SARS) Российский патент 2011 года по МПК A61K39/395 A61K38/16 A61P31/14 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для лечения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS). Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим ингибиторы фактора некроза опухоли (TNF), включая рекомбинантные рецепторы TNF, малые молекулы и антитела, для использования в лечении SARS.

Предпосылки изобретения

Тяжелый острый респираторный синдром (SARS) представляет собой респираторное заболевание, о котором в последнее время появились сообщения в разных странах. Первые сообщения о SARS как о потенциальной угрозе здоровью человека появились в конце 2002 года. Было признано, что он является недавно возникшим инфекционным заболеванием, которое является высоко контагиозным и приводит к высокой болезненности и смертности. Этот вирус происходит из юго-восточной Азии, и по состоянию на 30 апреля 2003 года им было инфицировано примерно 5663 человек в 26 различных странах мира. M.M.W.R., 52(17):388-90 (2 мая 2003). Из этих случаев заражения 372 (примерно 6,6%) привели к летальному исходу. SARS представляет существенную угрозу здоровью и благополучию населения по всему миру, и в настоящее время предпринимаются попытки разработать способы лечения этого заболевания.

SARS в общем виде характеризуется инкубационным периодом, типично составляющим 2-7 дней, при этом у инфицированных субъектов типично наблюдается сильное лихорадочное состояние, иногда сопровождающееся ознобом, головной болью, недомоганием и миалгией. При прогрессировании заболевания возникает сухой, непродуктивный кашель или одышка, сопровождающиеся или переходящие в гипоксемию. В 10-20% случаев необходима интубация или механическая вентиляция. Более того, на пике респираторного заболевания примерно у 50% инфицированных развивается лейкопения и тромбоцитопения. M.M.W.R., 52(12):255-256 (28 мая 2003).

Картина распространения SARS предполагает капельный или контактный путь передачи вирусного патогена. Poutanen et al., New England Journal of Medicine, published online March 31, 2003, www.nejm.org. Недавно SARS был ассоциирован этиологически с новым вирусом, SARS-ассоциированным коронавирусом (SARS-CoV), членом семейства коронавирусов, включающим внутриоболочечные вирусы, репликация которых происходит в цитоплазме клеток инфицированного животного-хозяина. Коронавирусы в общем виде характеризуются как одноцепочечные РНК-вирусы, имеющие геномы из примерно 30000 нуклеотидов. Rota et al., Sciencexpress, published online May 01, 2003, 10.1126/science.1085952. Коронавирусы попадают в три известные группы: первые две группы вызывают коронавирусные инфекции у млекопитающих, а третья группа вызывает коронавирусные инфекции у птиц. Считается, что коронавирусы являются агентами, вызывающими некоторые тяжелые заболевания у многих животных, например, вирус инфекционного бронхита, кошачий вирус инфекционного перитонита и передающийся вирус гастроэнтерита считаются в ветеринарии серьезными патогенами. Такие известные коронавирусы вызывают лишь слабые симптомы у человека.

SARS-CoV имеет геном, состоящий в длину из 29727 нуклеотидов, с 11 открытыми рамками считывания и геномную ДНК, состоящую из 41% G-C. В результате филогенетического анализа было обнаружено, что SARS-CoV представляет новую группу коронавирусов, отличную от ранее известных трех групп коронавирусов. Секвенирование SARS-CoV изолятов из организма инфицированных пациентов в других местах его обнаружения по всему миру подтверждает такое выделение его в отдельную группу. Marra, M.A., et al., Sciencexpress, published online May 01, 2003, 10.1126/science.1085953. В отличие от трех известных групп, SARS-CoV вызывает тяжелое заболевание у людей, как описано выше.

В последнее время проводились исследования, в которых изучали вирулентность SARS-CoV. Согласно определению Всемирной Организации Здравоохранения, SARS-CoV является устойчивым в фекалиях при комнатной температуре в течение, по меньшей мере, 1-2 дней и является устойчивым в стуле пациентов с диареей примерно в течение 4 дней. Кроме того, SARS-CoV был устойчивым в супернатанте клеточной культуры с минимальным снижением концентрации вируса через 21 день при 4°С и при -80°С, и SARS-CoV утрачивал лишь один log концентрации вируса при устойчивой комнатной температуре в течение 2 дней в супернатанте клеточной культуры. Действительно, SARS-CoV демонстрирует восприимчивость к обычно используемым дезинфицирующим средствам и фиксаторам. Данные ВОЗ по устойчивости и резистентности SARS. Однако эти данные ясно указывают на то, что SARS-CoV способен сохранять вирулентность вне организма хозяина-человека в течение длительных периодов времени.

Есть подозрения, что помимо SARS-CoV также и другие возбудители инфекции вовлечены в SARS. Например, метапневмовирус человека также был выделен у пациентов, страдающих SARS. Poutanen et al., New England Journal of Medicine, published online March 31, 2003, www.nejm.org. Возможно, что ответственной за SARS является комбинация патогенов. Также возможно, что SARS включает инфекцию, вызываемую условно-патогенными организмами, которая вызвана вторичным условно-патогенным организмом или несколькими вторичными условно-патогенными организмами.

По состоянию на 25 марта 2003 года Центр по контролю и профилактике заболеваний США постановил, что “по состоянию на указанную дату не было предложено никаких конкретных рекомендаций”. CDC SARS Treatment, www.cdc.gov/ncidod/sars/treatment. Один терапевтический метод, применяемый в настоящее время в Гонконге, комбинация стероидов и противовирусного средства рибавирина, подвергся критике как неэффективный и даже опасный для реципиентов. D. Cyranoski, Nature, 423:4 (2003). Другие испробованные терапевтические методы включали введение антибиотиков или оселтамивира. Poutanen et al., New England Journal of Medicine, published online March 31, 2003, www.nejm.org. В отсутствие эффективного лечения работники здравоохранения ограничены в применении поддерживающих мер, таких как внутривенные (IV) вливания, кислород и, если необходимо, механическая вентиляция и интубация, для лечения пациентов с SARS.

Для контроля распространения SARS были предприняты различные меры. Такие меры включают ограничения туризма/консультации, карантины, SARS-специфический скрининг в учреждениях здравоохранения и подробное объяснение населению правильных мер, связанных с контролем инфекции. Для медицинского персонала и работников здравоохранения были рекомендованы такие меры предосторожности, как респираторы, перчатки, защитные очки и халаты, в целях ограничения распространения SARS. Хотя некоторые страны сообщили, что пик распространения инфекции миновал, в других странах, таких как Китай, неконтролируемое распространение SARS продолжается.

Эксперты предсказывают, что вакцина для этого заболевания вряд ли будет доступна в течение нескольких лет. Действительно, согласно заявлению ведущего специалиста правительства США в области инфекционных заболеваний, потребуется “несколько лет” усиленной исследовательской работы, прежде чем вакцина может стать общедоступной. Nesmith, New York Times Syndicate; Published online April 7, 2003; www.nlm.nih.gov/medlineplus/print/news/full story_12280.html. Кроме того, способность коронавирусов быстро мутировать может создать серьезное препятствие для разработки эффективной вакцины. Более того, даже если вакцина будет получена, эта вакцина может вызывать иммунитет у пациентов и фактически снижать иммунный ответ на SARS. Таким образом, это заболевание остается серьезной угрозой для населения по всему миру и, по-видимому, будет оставаться ею в течение еще какого-то времени.

Следовательно, существует потребность в эффективном лечении пациентов, у которых диагностировали SARS, пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с SARS, например пациентов, инфицированных SARS-CoV, или пациентов, которые подвергаются неизбежному риску заражения SARS, например субъекты, подвергаемые, или которые, возможно, будут подвержены в ближайшем будущем воздействию возбудителя инфекции, ассоциированного с SARS.

Краткое описание изобретения

Настоящим изобретением обеспечиваются композиции и способы для лечения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS).

Один вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает композицию, включающую: терапевтически эффективное количество ингибитора SARS-ассоциированного воспалительного цитокина в фармацевтически приемлемом носителе.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает композицию, включающую: растворимый рекомбинантный рецептор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, антитело к SARS-ассоциированному воспалительному цитокину, малую молекулу, влияющую на активность SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, SARS-ассоциированный антисмысловой олигонуклеотид или их сочетание.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает композицию, включающую: первое вещество, выбранное из группы, включающей растворимый рекомбинантный рецептор TNF, малую молекулу, влияющую на активность TNF, антисмысловой олигонуклеотид TNF или их сочетание; второе вещество, выбранное из группы, включающей ингибитор вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор кодируемой вирусом протеазы, воздействующей на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности, ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в гликопротеине вирусного пика, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетание.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает композицию, полученную способом, включающим: введение средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с SARS, в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля; мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина и включение терапевтически эффективного ингибитора SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, идентифицированного таким образом, в композицию с фармацевтически приемлемым носителем.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает композицию, полученную способом, включающим: введение средства-кандидата на ингибитор фактора некроза опухоли (TNF) группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля; мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор TNF и включение терапевтически эффективного ингибитора TNF, идентифицированного таким образом, в композицию с фармацевтически приемлемым носителем.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает способ лечения пациента, страдающего тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), включающий: введение пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора SARS-ассоциированного воспалительного цитокина.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает способ лечения пациента, страдающего тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), включающий: введение пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора TNF.

Следующий вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает способ скрининга на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, включающий: введение средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля и мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина для идентификации терапевтически эффективного ингибитора SARS-ассоциированного воспалительного цитокина.

И еще один вариант воплощения согласно изобретению обеспечивает способ скрининга на композицию, эффективную для лечения пациента, страдающего SARS, включающий: введение средства-кандидата на ингибитор фактора некроза опухоли (TNF) группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля и мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор TNF, для идентификации терапевтически эффективного ингибитора TNF.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение обеспечивает соединения, композиции и способы для лечения пациентов, включая людей, инфицированных патогенным агентом, ассоциированным с SARS, включая подозреваемые, вероятные и подтвержденные случаи SARS. В целях удобства изложения, термины “болезнь”, “заболевание”, “медицинское состояние”, “аномальное состояние” и т.п. используются взаимозаменяемым образом с термином “медицинское расстройство”, как относящиеся к респираторному дистресс-синдрому, особенно, когда дистресс-синдром вызван коронавирусом.

Термины “рецептор TNF ” и “TNFR” относятся к белкам, имеющим аминокислотную последовательность, по существу аналогичную природному рецептору TNF млекопитающих или аминокислотным последовательностям белков, связывающихся с TNF, и которые способны связываться с молекулами TNF и ингибировать связывание TNF с TNFR, связанным с клеточной мембраной.

Термины “выделенный” или “очищенный”, как они используются в контексте в данном описании для обозначения чистоты белка TNFR или белковых композиций, означают, что белок или композиция белка по существу не содержат других белков природного или эндогенного происхождения и содержат менее примерно 1 мас.% белковых остаточных примесей от процессов получения. Однако такие композиции могут содержать другие белки, добавленные в качестве стабилизаторов, наполнителей, эксципиентов или сопутствующих терапевтических средств. TNFR является выделенным, если он детектируется в виде одной полосы белка в полиакриламидном геле при окрашивании серебром.

“Рекомбинантный”, как этот термин используется в настоящем описании, означает, что белок получен из рекомбинантных (например, микробных или от млекопитающих) систем экспрессии. “Микробный” относится к рекомбинантным белкам, полученным в бактериальных или грибковых (например, дрожжи) системах экспрессии. Как продукт, “рекомбинантный микробный” означает белок, продуцируемый в микробной системе экспрессии, который по существу не содержит природных эндогенных веществ. Белок, экспрессируемый в большинстве бактериальных культур, например E.coli, не содержит гликана. Белок, экспрессированный в дрожжах, может иметь картину гликозилирования, отличную от картины при экспрессии в клетках млекопитающих.

“Биологически активный”, как этот термин используется повсеместно в данном описании для характеристики рецепторов TNF, означает, что конкретная молекула имеет достаточную схожесть в аминокислотной последовательности с вариантами воплощения согласно изобретению, раскрытыми в настоящей заявке, чтобы быть способной к связыванию детектируемых количеств TNF, передаче TNF стимула клетке, например, в виде компонента гибридной рецепторной конструкции, или перекрестному взаимодействию с анти-TNFR антителами, направленными против TNFR, из природных (т.е. нерекомбинантных) источников. Предпочтительно биологически активные рецепторы TNF в рамках согласно изобретению способны к связыванию более чем 0,1 нмоль TNF на нмоль рецептора, и более предпочтительно более чем 0,5 нмоль TNF на нмоль рецептора, в стандартных анализах связывания.

Как он используется в данном описании, термин “антигенсвязывающий участок” относится к части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и сообщающие антителу его специфичность и сродство к данному антигену. Такой участок антитела включает аминокислотные остатки “рамки считывания”, необходимые для поддержания должной конформации антигенсвязывающих остатков.

Как он используется в данном описании, термин “химерное антитело” включает моновалентные, дивалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер (HL)), образованный химерной Н-цепью, связанной через дисульфидные мостики с химерной L-цепью. Дивалентное химерное антитело представляет собой тетрамер (H₂L₂), образованный двумя HL димерами, связанными через, по меньшей мере, один дисульфидный мостик. Поливалентное химерное антитело также может быть образовано, например, с участием области С_н, которая агрегирует (например, из Н-цепи или µ-цепи IgM).

Как он используется в данном описании, термин “SARS пациент” относится к пациенту-млекопитающему, такому как человек, у которого было подтверждено заболевание SARS, или которого можно на основании эпидемиологических показателей классифицировать как случай возможного заражения SARS или с подозрением на SARS. SARS пациенты включают тех, у кого был диагностирован SARS, тех, у кого была положительная проба на инфекцию, вызванную возбудителем инфекции (патогенном), ассоциированным с SARS (например, SARS-CoV), тех, у кого на основании эпидемиологических показателей можно подозревать SARS, или тех, кто подвержен неизбежному риску заражения SARS (например, кто был подвержен или, вероятно, будет подвержен в ближайшем будущем риску заражения SARS). Термин “SARS пациент” используется в данном описании взаимозаменяемо с терминами “пациент с заболеванием SARS”, “пациент, инфицированный SARS”, “пациент с SARS”, “пациент, страдающий SARS” и другими выражениями.

Фраза “терапевтически эффективное количество”, как она используется в настоящем описании, относится к количеству, которое необходимо ввести млекопитающему-хозяину (предпочтительно человеку) в каждой отдельной дозе (как часть серии доз) для того, чтобы вызвать у подвергаемого лечению пациента ответную реакцию, снижающую клиническое действие инфекции. Это может варьировать в пределах от минимального снижения патогенной нагрузки до предотвращения инфекции. Идеально, у подлежащего лечению пациента больше не должно быть серьезных клинических проявлений инфекции. Размер дозы может варьировать в зависимости от конкретного состояния пациента. Конкретное необходимое для введения количество можно определить при рутинном экспериментировании или другим путем, что известно специалистам в данной области, руководствуясь указаниями, представленными в настоящей заявке.

Фраза “введение терапевтически эффективного количества” терапевтического средства, как она используется в настоящем описании, означает, что пациента лечат средством, используемым в количестве и в течение времени, достаточном, чтобы вызвать стабильное улучшение относительно базовой линии, по меньшей мере, одного показателя, отражающего тяжесть заболевания. Улучшение считается “стабильным”, если пациент демонстрирует улучшение, по меньшей мере, в двух случаях, разделенных одной или несколькими неделями. Степень улучшения определяют на основании проявлений или симптомов, и при определении можно также использовать опросные листы, которые выдают пациентам, например опросные листы по качеству жизни. Как он используется в данном описании, термин “фактор некроза опухоли” или “TNF” означает TNF-α и/или TNF-β.

Цитокины представляют собой молекулы белка, высвобождаемые клетками при активации антигенами, и считается, что они участвуют в межклеточном взаимодействии, действуя в качестве медиаторов иммунного ответа через взаимодействие со специфическими клеточно-поверхностными рецепторами на лейкоцитах. Существуют различные типы цитокинов, включая интерлейкины, лимфокины, интерфероны и фактор некроза опухоли (TNF).

Моноциты и макрофаги секретируют цитокины, известные как фактор некроза опухоли-α (TNF-α) и фактор некроза опухоли-β (TNF-β), в ответ на эндотоксин и другие стимулы. TNF-α представляет собой растворимый гомотример, состоящий из белковых субъединиц массой 17 кДа (Smith, et al., J. Biol. Chem. 262:6951-6954 (1987)). Также существует форма предшественника TNF, который имеет массу 26 кДа (Kriegler, et al., Cell 53:45-53 (1988)). Обзор TNF см. в Beutler, et al., Nature 320:584 (1986), Old, Science 230:630 (1986), а также Le, et al., Lab. invest. 56:234.

Клетки, отличные от моноцитов и макрофагов, также продуцируют TNF-α. Например, немоноцитные клеточные линии опухоли человека продуцируют TNF (Rubin, et al., J. Exp. Med. 164:1350 (1986); Spriggs, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6563 (1987)), CD⁴+ и CD⁸.+ периферийные T-лимфоциты крови и некоторые культивируемые T- и В-клеточные линии (Cuturi, et al., J. Exp. Med. 165:1581 (1987); Sung, et al., J. Exp. Med. 168:1539 (1988)) также продуцируют TNF-α.

TNF вызывает провоспалительное действие, приводящее к поражению ткани, например, индуцируя прокоагулирующую активность на клетках сосудистого эндотелия (Pober, et al., J. Immunol. 136:1680 (1988)), повышая адгезию нейтрофилов и лимфоцитов (Pober, et al., J. Immunol. 138:3319 (1987)) и стимулируя выделение фактора активации тромбоцитов из макрофагов, нейтрофилов и клеток сосудистого эндотелия (Camussi, el al., J. Exp. Med. 166:1390(1987)).

Полученные в последнее время данные говорят о связи TNF с инфекциями (Cerami, et al., Immunol. Today 9:28 (1988)), иммунными расстройствами, опухолевыми патологиями (Oliff, et al., Cell 50:555 (1987)), аутоиммунными патологиями и патологиями трансплантат против хозяина (Piguet, et al., J. Exp. Med. 166:1280 (1987)). Связь TNF с раком и патологиями, вызванными инфекциями, часто относят к катаболическому состоянию хозяина.

TNF также играет центральную роль в грамотрицательном сепсисе и эндотоксическом шоке (Michie, et al., Br. J. Surg. 76:670-671 (1989); Debets, et al., Second Vienna Shock Forum, p.463-466 (1989); Simpson, et al., Crit. Care Clin. 5:27-47 (1989)), включая лихорадочное состояние, недомогание, анорексию и кахексию. Эндотоксин сильно активирует продукцию моноцитов/макрофагов и секрецию TNF и других цитокинов (Kornbluth, et al., J. Immunol. 137:2585-2591 (1986)). TNF и другие продуцируемые моноцитами цитокины опосредуют метаболический и нейрогормональный ответы на эндотоксин (Michie, et al., New. Engl. J. Med. 318:1481-1486 (1988)). Введение эндотоксина пациентам-добровольцам вызывает острое заболевание с симптомами, подобными гриппу, включая лихорадку, тахикардию, повышенную скорость метаболизма и выделение гормона стресса (Revhaug, et al., Arch. Surg. 123:162-170 (1988)). Циркуляция TNF усиливается у пациентов, страдающих грамотрицательным сепсисом (Waage, et al., Lancet 1:355-357 (1987); Hammerle, et al., Second Vienna Shock Forum p. 715-718 (1989); Debets, et al., Crit. Care Med. 17:489-497 (1989); Calandra, et al., J. Infect. Dis. 161:982-987 (1990)).

Предполагаемый участок связывания с рецептором у hTNF был раскрыт Eck и Sprang (J. Biol. Chem. 264(29), 17595-17605 (1989), они идентифицировали участок связывания с рецептором у TNF-α как состоящий из аминокислот 11-13, 37-42, 49-57 и 155-157. В публикации PCT WO91/02078 (1991) описаны лиганды TNF, способные связываться с моноклональными антителами, которые имеют следующие эпитопы: по меньшей мере один из 1-20, 56-77 и 108-127; по меньшей мере один из 1-20, 56-77, 108-127 и 138-149; все из 1-18, 58-65, 115-125 и 138-149; все из 1-18 и 108-128; все из 56-79, 110-127 и 135- или 136-155; все из 1-30, 117-128 и 141-153; все из 1-26, 117-128 и 141-153; все из 22-40, 49-96 или 49-97, 11,0-127 и 136-153; все из 12-22, 36-45, 96-105 и 132-157; оба из 1-20 и 76-90; все из 22-40, 69-97, 105-128 и 135-155; все из 22-31 и 146-157; все из 22-40 и 49-98; по меньшей мере один из 22-40, 49-98 и 69-97, оба из 22-40 и 70-87.

Различные биологические эффекты TNF-α и ближайшего родственного цитокина TNF-β (лимфотоксин) опосредованы двумя трансмембранными рецепторами TNF, оба из которых были клонированы. p55-рецептор (также называемый TNF-R55, TNF-RI или TNFR-α) представляет собой гликопротеин с массой 55 кДа, который, как было показано, осуществляет сигнальную трансдукцию, результатом чего является цитотоксическая, противовирусная и пролиферативная активность TNF-α. p75-рецептор (называемый также TNF-R75, TNF-RII или TNFR-α) представляет собой гликопротеин с массой 75 кДа, который, как было показано, осуществляет трансдукцию цитотоксических и пролиферативных сигналов, а также сигналов, приводящих к секреции GM-CSF. Более подробное обсуждение см. у Aderka, et al., Isrl. J. Med, Sci. 28:126-130 (1992) (Seckinger, et al., J. Exp. Med. 167:1511-1516 (1988); Engelmann, et al., J. Biol. Chem. 264:11974-11980 (1989)); Loetscher et al., Cell 61:351-359 (Apr. 20, 1990); Schall et al., Cell 61:361-370 (Apr. 20, 1990); Nophar, et al., EMBO J. 9(10):3269-3278 (1990); Engelmann, et al., J. Biol. Chem. 265(3):1531-1536 (1990); Engelmann, et al., J. Biol. Chem. 264(20):11974-11980 (1989)); Европейская патентная публикация № 0 433 900 AI; публикация РСТ WO 92/13095; Европейская патентная публикация № 0 526 905 A2; публикация РСТ WO 92/07076; Европейская патентная публикация № 0 412 486 А1; Европейская патентная публикация № 0 398 327 A1; Европейская патентная публикация № 0 308 378 A2; переиздание США № 36755 и патенты США №№ 5395760 и 5605690.

Применение ингибиторов TNF для лечения различных заболеваний уже было описано. В частности, в области инфекционных заболеваний были сделаны попытки лечения сепсиса ингибиторами TNF. Такие попытки лечения сепсиса не были успешными. Однако ингибиторы TNF неожиданно оказались эффективными в лечении нового инфекционного заболевания SARS.

Настоящее изобретение направлено на композиции, являющиеся эффективными при лечении SARS. В частности, настоящее изобретение направлено на соединения и композиции для лечения SARS, способы идентификации соединений и композиций, эффективных для лечения SARS, и использование соединений согласно изобретению в способах лечения SARS.

В соответствии со способом воплощения настоящее изобретения включает в себя терапевтически эффективное количество ингибитора SARS-ассоциированного воспалительного цитокина в фармацевтически приемлемом носителе. Ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина предпочтительно представляет собой растворимый рекомбинантный рецептор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, антитело к SARS-ассоциированному воспалительному цитокину, малую молекулу, воздействующую на активность SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, SARS-ассоциированный антисмысловой олигонуклеотид или их сочетание. Более предпочтительно ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина представляет собой растворимый рекомбинантный рецептор. Рецептор-ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина предпочтительно можно идентифицировать в соответствии со способами скрининга согласно изобретению, которые описаны ниже. Следуя указаниям, представленным в настоящем описании, специалист в данной области сможет легко идентифицировать такое соединение или композицию в соответствии со способом воплощения согласно изобретению.

В соответствии со способом воплощения согласно изобретению композиции согласно изобретению включают в себя композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ингибитора воспалительного цитокина в фармацевтически приемлемом носителе и терапевтически эффективное количество противовирусного соединения в фармацевтически приемлемом носителе.

В соответствии с другим способом воплощения композиции согласно изобретению включают в себя первое вещество, выбранное из группы, включающей в себя растворимый рекомбинантный рецептор TNF, антитело к TNF, малую молекулу, воздействующую на активность TNF, антисмысловой олигонуклеотид TNF или их сочетание. Это первое вещество необязательно объединяют со вторым веществом, выбранным из группы, включающей в себя ингибитор вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор кодируемой вирусом протеазы, которая воздействует на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности и ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в гликопротеине вирусного пика, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетание.

Композиции согласно изобретению также охватывают композиции, полученные способом, включающим в себя введение средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с SARS, в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля и мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина. Предпочтительно рандомизированное исследование с использованием плацебо в качестве контроля представляет собой слепой метод исследования с использованием плацебо в качестве контроля или двойной слепой метод с контролем плацебо. Также настоящим изобретением охватывается композиция, полученная способом, включающим в себя введение средства-кандидата на ингибитор фактора некроза опухоли (TNF) группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля и мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор TNF.

Растворимые рекомбинантные рецепторы TNF

В соответствии со способом воплощения композиция согласно изобретению включает в себя растворимый рецептор TNF, предпочтительно TNFR-Ig. Известно, что существует два разных типа TNFR: TNFR типа I (TNFRI) и TNFR типа II (TNFRII). Зрелый полноразмерный TNFRII человека представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 75-80 килодальтон (кДа). Зрелый полноразмерный TNFRH человека представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 55-60 килодальтон (кДа). Предпочтительными TNFR согласно изобретению являются растворимые формы TNFRI и TNFRII, а также растворимые TNF-связывающие белки.

Молекулы растворимого TNFR включают в себя, например, аналоги или субъединицы нативных белков, содержащих по меньшей мере 20 аминокислот, которые проявляют по меньшей мере некоторую биологическую активность, общую с TNFRI, TNFRII или TNFR-связывающими белками. Конструкции растворимого TNFR лишены трансмембранной области (и секретируются из клетки), но сохраняют способность связывания TNF. Различные биоэквивалентные белковые и аминокислотные аналоги имеют аминокислотную последовательность, соответствующую всей внеклеточной области нативного TNFR или ее части.

Эквивалентные растворимые TNFR включают в себя полипептиды, отличающиеся от этих последовательностей одним или несколькими замещениями, делециями или добавлениями, и которые сохраняют способность связывать TNF или ингибировать осуществляемую TNF сигнальную трансдукцию через связанные на клеточной поверхности белки рецепторов TNF. Аналогичные делеции можно осуществить для muTNFR. Ингибирование сигнальной трансдукции TNF можно определить путем трансфекции клеток рекомбинантными ДНК TNFR с получением экспрессии рекомбинантного рецептора. Затем осуществляют контакт клеток с TNF и изучают полученный метаболический эффект. Если в результате получают эффект, который можно отнести к действию лиганда, тогда считают, что рекомбинантный рецептор обладает активностью сигнальной трансдукции. Процедуры определения того, обладает ли полипептид активностью сигнальной трансдукции, которые можно привести в качестве примера, раскрыты у Idzerda et al., J. Exp. Med. 171:861 (1990); Curtis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3045 (1989); Prywes et al., EMBO L. 5:2179 (1986) и Chou et al., J. Biol. Chem. 262:1842 (1987). Альтернативно, можно также использовать первичные клетки или клеточные линии, которые экспрессируют эндогенный рецептор TNF и имеют детектируемый биологический ответ на “INF.

Номенклатура для аналогов TNFR, используемая в настоящей заявке, использует изменения к наименованию белка (например, TNFR), которые включают предшествующие этому наименованию hu (для человека) или mu (для мыши) и последующее добавление Δ (для обозначения делеции) и номер С-концевой аминокислоты. Например, huTNFRΔ 235 означает человеческий TNFR, имеющий Asp235 в качестве С-концевой аминокислоты. В отсутствие какого-либо видового обозначения человека или мыши, TNFR в родовом смысле означает TNFR млекопитающего. Подобным образом, в отсутствие какого-либо конкретного обозначения мутанта с делецией, термин TNFR означает все формы TNFR, включая мутанты и аналоги, обладающие биологической активностью TNFR.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения TNFR-Ig представляет собой TNFR:Fc, который можно вводить в форме фармацевтически приемлемой композиции, как описано в настоящей заявке. Заболевания, описанные в настоящей заявке, можно лечить путем введения TNFR:Fc один или несколько раз в неделю при помощи подкожной инъекции, хотя, если это желательно, можно использовать и другие пути введения. Одна схема введения для лечения взрослых пациентов (человека), которую можно привести в качестве примера, включает 25 мг TNFR:Fc, вводимые путем подкожной инъекции два раза в неделю или три раза в неделю в течение одной или нескольких недель, и предпочтительно в течение четырех или более недель. Альтернативно, дозу 5-12 мг/м² или просто дозу 50 мг вводят путем подкожной инъекции один или два раза в неделю в течение одной или нескольких недель. В других вариантах осуществления изобретения SARS лечат при помощи TNFR:Fc, который используют в виде формы замедленного высвобождения, например TNFR:Fc, инкапсулированный в биосовместимом полимере, TNFR:Fc, смешанный с биосовместимым полимером (например, гидрогели для местного нанесения), и TNFR:Fc, заключенный в полупроницаемый имплантат.

Совместно с композициями, включающими в себя ингибиторы TNF-α, такие как TNFR:Fc, можно вводить и различные другие лекарственные средства. Такие лекарственные средства включают в себя НСПВЛС; DMARDs; аналгетики; стероиды для местного применения; стероиды для системного применения (например, преднизон); другие цитокины; антагонисты воспалительных цитокинов; антитела против белков поверхности Т-клеток; ретиноиды для перорального введения; салициловую кислоту и гидроксимочевину. Подходящие для таких комбинаций аналгетики включают в себя ацетаминофен, кодеин, пропоксфен напсилат, оксикодон гидрохлорид; гидрокодон битартрат и трамадол. Подходящие для таких комбинаций DMARDs включают в себя азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, гидроксихлорокин сульфат, метотрексат, лефлуномид, миноциклин, пенициламин, сульфазалазин, золото для перорального введения, золото-натрий тиомалат и ауротиоглюкозу. Подходящие для лечения с использованием таких комбинаций НСПВЛС включают в себя салициловую кислоту (аспирин) и производные салицилата; ибупрофен; индометацин; целекоксиб (CELEBREX, Pharmacia и Pfizer); рофекоксиб (VIOXX, Merck & Co. Inc.); кеторолак; намбуметон; пироксикам; напроксен; оксапрозин; сулиндак; кетопрофен; диклофенак и другие ингибиторы СОХ-1 и СОХ-2, производные пропионовой кислоты, производные уксусной кислоты, производные карбоновых кислот, производные масляной кислоты, оксикамы, пиразолы, пиразолоны, включая недавно разработанные противовоспалительные лекарственные средства.

Если антагонист воспалительного цитокина вводят совместно с TNFR:Fc, подходящие мишени для таких антагонистов включают в себя TGF β, II-6 и II-8.

Кроме того, TNFR:Fc можно использовать в сочетании со стероидами для местного применения, стероидами для системного применения, антагонистами воспалительных цитокинов, антителами против белков поверхности Т-клеток, метотрексатом, циклоспорином, гидроксимочевиной и сульфасалазином.

Подходящую дозу можно определить в соответствии с весом тела животного. Например, можно использовать дозу 0,2-1 мг/кг. Альтернативно, дозу определяют в соответствии с площадью поверхности животного, в качестве примера можно указать дозу в пределах 0,1-20 мг/м² или больше, предпочтительно 5-12 мг/м². Для небольших животных, таких как собаки или кошки, подходящая доза составляет 0,4 мг/кг, в предпочтительном варианте осуществления изобретения TNFR:Fc (предпочтительно сконструированный из генов, происходящих из того же вида, что и пациент) или другой растворимый TNFR миметик вводят путем инъекции или другим подходящим путем, один или несколько раз в неделю, пока не улучшится состояние животного.

Белки, являющиеся антагонистами TNF, вводят млекопитающим, предпочтительно человеку, для лечения SARS. Поскольку интерлейкины, например IL-1, IL-2 и IL-6, играют основную роль в продукции TNF, комбинированная терапия, использующая TNFR в сочетании с IL-1R и/или IL-2R, может быть предпочтительной для лечения связанных с TNF клинических показаний. При лечении человека предпочтительным является растворимый человеческий TNFR. В соответствии с настоящим изобретением для лечения TNF-зависимых воспалительных заболеваний, таких как артрит, можно использовать любой из IL-1R типа I или IL-2R типа II или их сочетание. Подобным образом, можно использовать и другие типы TNF-связывающих белков.

Представленные в настоящей заявке способы включают в себя введение пациенту антагониста растворимого TNF, способного уменьшать эффективное количество эндогенного биологически активного TNF, например, путем уменьшения количества продуцируемого TNF или путем предотвращения связывания TNF с его рецептором клеточной поверхности. Антагонисты, способные ингибировать такое связывание, включают связывающиеся с рецептором пептидные фрагменты TNF, антисмысловые олигонуклеотиды или рибозимы, которые ингибируют продуцирование TNF, антитела против TNF, и рекомбинантные белки, включающие все или части рецепторов для TNF, или их модифицированные варианты, включая генетически модифицированные мутеины, мультимерные формы и композиции замедленного высвобождения.

В предпочтительных варианте воплощения согласно изобретению в качестве антагониста TNF используют растворимые TNFR. Растворимые формы TNFR могут включать в себя мономеры, гибридные белки (также называемые “химерными белками”), димеры, тримеры или мультимеры более высокого порядка. В некоторых вариантах воплощения согласно изобретению производное растворимого TNFR представляет собой производное, имитирующее TNFR с массой 75 кДа или TNFR с массой 55 кДа, которое связывается с TNF в организме пациента. Растворимые миметики TNFR можно получить из TNFR р55 или р75 или их фрагментов. TNFR, отличные от р55 и р75, также могут быть полезны для получения растворимых соединений для лечения медицинских расстройств, описанных в настоящей заявке, например TNFR, описанный в WO 99/04001. Молекулы растворимого TNFR, используемые для конструирования миметиков TNFR, например аналоги или фрагменты нативных TNFR, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот, у которых отсутствует трансмембранная область нативного TNFR и которые способны к связыванию TNF. Антагонисты, полученные из TNFR, конкурируют за TNF с рецепторами на клеточной поверхности, ингибируя, таким образом, TNF от связывания с клетками, предотвращая посредством этого проявление им биологической активности. Связывание растворимых TNFR с TNF или LT (лимфотоксин-α, который используют взаимозаменяемо с TNF-β) можно исследовать при помощи анализа ELISA или любого другого удобного для этого анализа. Настоящим изобретением обеспечивается использование растворимых рецепторов TNF для изготовления лекарственных средств для лечения заболевания.

Растворимые полипептиды или фрагменты TNFR согласно изобретению могут быть гибридизованы со вторым полипептидом с образованием химерного белка. Второй полипептид может осуществлять промоцию спонтанного образования химерным белком димера, тримера или мультимера более высокого порядка, который способен связываться с молекулой TNF-α или LT-α и предотвращать ее связывание со связанными с клетками рецепторами. Химерные белки, используемые в качестве антагонистов, включают в себя, например, молекулы, образованные из константной области молекулы антитела и внеклеточной части TNFR. Такие молекулы в данном описании указаны как гибридные белки TNFR-Ig. Предпочтительным гибридным белком TNFR-Ig, подходящим для лечения заболеваний человека и других млекопитающих, является рекомбинантный TNFR:Fc, название, которое используют в настоящем описании, относится к “этанерсепту”, представляющий собой димер, образованный из двух молекул внеклеточной части рецептора TNF-α р75, где каждая молекула состоит из Fc части человеческого IgG1, состоящей из 235 аминокислот. Этанерсепт в настоящее время продается фирмой Immunex Corporation под торговой маркой ENBREL^TM. Поскольку белковый рецептор р75, который он включает, связывается не только с TNF-α, но также и с воспалительным цитокином LT-α, этанерсепт может действовать как конкурирующий ингибитор не только TNF-α, но также и LT-α. В этом состоит отличие от антител, направленных против TNF-α, которые не могут ингибировать LT-α.

Также настоящим изобретение охватываются способы лечения, использующие соединение, включающее внеклеточную часть TNFR 55 кДа, слитую с Fc частью IgG, а также композиции и комбинации, включающие такую молекулу. Также охватываются терапевтические способы, включающие введение растворимых TNFR, полученных из внеклеточных областей молекул рецептора TNFRα, отличных от TNFR р55 и р75, например, таких как описаны в WO 99/04001, включая TNFR-Ig, полученные из такого TNFR. Другие подходящие ингибиторы TNF-α включают гуманизированное анти-TNF-α антитело, адалимумаб, доступное от Abbott Laboratories под торговой маркой HUMIRA (ранее поставлялся на рынок Knoll Pharmaceutical/BASF под торговой маркой D2E7). Композиции согласно изобретению могут включать одно или несколько из следующих лекарственных средств: инфликсимаб (также известный как Ремикад (Centocor Inc.), Трокад (Hoffmann-La Roche, RO-32-3555). Лефлуномид (также известный как Арава от фирмы Hoechst Marion Roussel), Кинерет (антагонист IL-1 рецептора, также известный как Анакинра от фирмы Amgen, Inc.).

В одном предпочтительном варианте воплощения согласно изобретению используют формы замедленного высвобождения растворимых TNFR, включая формы с замедленным высвобождением TNFR:Fc. Формы замедленного высвобождения, подходящие для использования в раскрываемых в данном описании способах, включают, но не ограничиваются этим, TNFR:Fc, инкапсулированные в медленно растворимом биосовместимом полимере (таком как микрочастицы альгината, описанные в патенте США № 6036978, или композиции полиэтилен-винилацетата и полимера молочной-глюколевой кислоты, описанные в патенте США № 6083534), смешанные с таким полимером (включая гидрогели для местного нанесения) и/или заключенные в биосовместимый полупроницаемый трансплантат. Кроме того, растворимый TNFR типа I или типа II для использования в описанных в данной заявке способах лечения может быть конъюгирован с полиэтиленгликолем (пегилированный) для продления его периода полужизни в сыворотке или для повышения количества доставляемого белка.

Малые молекулы

Другие соединения, подходящие для лечения заболеваний, описанных в настоящей заявке, включают малые молекулы, такие как талидомид или аналоги талидомида, пентоксифеллин или ингибиторы металлопротеиназы матрикса (ММР) или другие малые молекулы. Подходящие ингибиторы ММР включают, например, ингибиторы, описанные в патентах США №№ 5883131, 5863949 и 5861510, а также меркаптоалкилпептидильные соединения, описанные в патенте США № 5872146. Другие малые молекулы, способные снижать продукцию TNF, включают, например, молекулы, описанные в патентах США №№ 5508300, 5596013 и 5563143, любую из которых можно вводить в сочетании с ингибиторами TNF, такими как растворимые TNFR или антитела против TNF. Дополнительные малые молекулы, полезные для лечения TNF-опосредованных заболеваний, описанных в настоящей заявке, включают ингибиторы ММР, описанные в патентах США №№ 5747514, 5691382, а также описанные как производные гидроксамовой кислоты в патенте США № 5821262. Заболевания, описанные в настоящей заявке, также можно лечить с использованием малых молекул, которые ингибируют фосфодиэстеразу IV и продукцию TNF, например замещенных оксимных производных (WO 96/00215), хинолинсульфонамидов (патент США № 5834485), арилфурановых производных (WO99/18095) и гетеробициклических производных (WO 96/01825; GB 2291422 А). Полезными также являются производные тиазола, которые подавляют TNF и IFNδ (WO 99/15524), а также производные ксантина, которые подавляют TNF и другие провоспалительные цитокины (см., например, патент США № 5118500, патент США № 5096906 и патент США № 5196430). Дополнительные малые молекулы, полезные для лечения описанных в настоящей заявке состояний, включают молекулы, описанные в патенте США № 5547979.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Ингибиторы TNF согласно изобретению также включают антисмысловые олигонуклеотиды, действие которых направлено на непосредственное блокирование трансляции мРНК путем гибридизации с мишеневой мРНК и предотвращения трансляции полипептида. Антисмысловые олигонуклеотиды пригодны для использования в лечении любых медицинских расстройств, описанных в настоящей заявке, либо отдельно, либо в сочетании с другими ингибиторами TNF, или в сочетании с другими средствами для лечения такого состояния. Антисмысловые молекулы согласно изобретению могут препятствовать трансляции TNF, рецептора TNF или фермента в путях метаболизма для синтеза TNF. Абсолютная комплементарность хотя и является желательной, но необязательна. Последовательность, “комплементарная” части нуклеиновой кислоты, как указано в настоящем описании, означает последовательность, обладающую достаточной комплементарностью, чтобы быть способной гибридизоваться с нуклеиновой кислотой, образуя стабильный дуплекс (или триплекс, как это подходяще). Способность гибридизоваться зависит как от степени комплементарности, так и от длины антисмысловой нуклеиновой кислоты. Олигонуклеотиды, комплементарные 5'-концу матрицы (message), например 5'-нетранслируемой последовательности вплоть до и включая кодон инициации AUG, должны проявлять наиболее эффективное действие по ингибированию трансляции. Однако можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные либо 5'-, либо 3'-нетранслируемой, некодирующей области мишеневого транскрипта. Олигонуклеотиды, комплементарные 5'-нетранслируемой области мРНК, должны включать комплемент стартового кодона AUG.

Антисмысловые нуклеиновые кислоты должны быть, по меньшей мере, шесть нуклеотидов в длину, и они предпочтительно представляют олигонуклеотиды, имеющие длину в пределах от 6 до около 50 нуклеотидов. В конкретных аспектах, олигонуклеотид состоит из, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, по меньшей мере, 17 нуклеотидов, по меньшей мере, 25 нуклеотидов или, по меньшей мере, 50 нуклеотидов. Наиболее предпочтительно они должны содержать 18-21 нуклеотидов.

Основная цепь антисмысловых олигонуклеотидов может быть химически модифицирована для продления периода полужизни олигонуклеотида в организме. Подходящие для этой цели модификации известны из уровня техники, например, такие, которые описаны в патенте США № 114517, который описывает использование для этой цели фосфоротиоатов, фосфородитиоатов, сложных фосфориловых эфиров, аминоалкилфосфотриэфиров, метил- и других алкилфосфонатов, различных фосфонатов, фосфинатов и фосфорамидатов и т.д.

Олигонуклеотиды могут представлять собой ДНК или РНК или их химерные смеси или производные или модифицированные варианты, одноцепочечные или двухцепочечные. Олигонуклеотиды могут быть модифицированы по фрагменту основания, фрагменту сахара или фосфатной основной цепи, например, для улучшения стабильности молекулы, гибридизации и т.д. Олигонуклеотид может включать другие боковые группы, такие как пептиды (например, для нацеливания на рецепторы клеток хозяина in vivo), или агенты, способствующие транспорту через клеточную мембрану (см., например, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:648-652; публикацию РСТ NO. WO 88/09810, опубл. 15 декабря 1988), или агенты запускаемого гибридизацией расщепления или интеркалирующие агенты (см., например, Zon, 1988, Pharm.Res. 5:539-549). Антисмысловые молекулы должны доставляться к клеткам, которые экспрессируют мишеневый транскрипт.

Антисмысловые олигонуклеотиды можно вводить парентерально, включая внутривенные или подкожные инъекции, или их можно вводить в композициях, подходящих для перорального введения. Для доставки антисмысловых ДНК или РНК к клеткам было разработано множество способов, например, антисмысловые молекулы можно вводить путем инъекции непосредственно в ткань или место происхождения клетки, или модифицированные антисмысловые молекулы, разработанные для направленной доставки к желаемым клеткам (например, антисмысловой фрагмент, связанный с пептидами или антителами, которые специфически связываются с рецепторами или антигенами, экспрессируемыми на поверхности клетки-мишени), можно вводить системно. Однако внутриклеточные концентрации антисмыслового олигонуклеотида, достаточные для подавления трансляции эндогенных мРНК, часто трудно достижимы. Поэтому предпочтительный подход включает использование рекомбинантной ДНК конструкции, в которой антисмысловой олигонуклеотид находится под контролем сильного pol III или pol II промотора. Использование такой конструкции для трансфекции клеток-мишеней в организме пациента приведет к транскрипции достаточных количеств одноцепочечных РНК, которые будут образовывать комплементарные пары оснований с эндогенными мишеневыми генными транскриптами и, таким образом, предотвращать трансляцию мишеневой мРНК. Например, может быть введен вектор in vivo так, чтобы он захватывался клеткой и направлял транскрипцию антисмысловой РНК. Такой вектор может оставаться эписомным или быть интегрированным в хромосому, пока может осуществляться его транскрипция с продуцированием желаемой антисмысловой РНК. Такие векторы могут быть сконструированы методами рекомбинантной ДНК, являющимися стандартными в существующем уровне техники. Векторы могут быть плазмидными, вирусными или другими, известными из области техники, используемыми для репликации и экспрессии в клетках млекопитающих. Антисмысловые олигонуклеотиды, подходящие для лечения заболеваний, связанных с повышенным уровнем TNF, включают, например, анти-TNF олигонуклеотиды, описанные в патенте США № 6080580, который предлагает использование таких олигонуклеотидов в качестве кандидатов для испытания на животных моделях сахарного диабета, ревматоидного артрита, контактной чувствительности, болезни Крона, рассеянного склероза, панкреатита, гепатита и трансплантации сердца.

Молекулы рибозимов, разработанные для каталитического расщепления транскриптов мРНК, также можно использовать для предотвращения трансляции мРНК, кодирующих TNF, рецепторы TNF или ферменты, вовлеченные в синтез TNF или TNFR (см., например, РСТ WO 90/11364; патент США № 5824519). Рибозимы, которые можно использовать для этих целей, включают молотоголовые рибозимы (Haseloff и Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591), РНК эндорибонуклеазы (далее “рибозимы Cech-типа”), такие как рибозим природного происхождения из Tetrahymena thermophila (известный как IVS или РНК L-19 IVS) (см., например, WO 88/04300; Been и Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Рибозимы могут состоять из модифицированных олигонуклеотидов (например, для лучшей стабильности, таргетирования и т.д.) и должны доставляться к клеткам, которые экспрессируют мишеневый пептид in vivo. Предпочтительный способ доставки включает использование ДНК конструкции, кодирующей рибозим под контролем сильного конститутивного промотора pol III или pol II, так, чтобы трансфицированные клетки могли продуцировать достаточное количество рибозима для разрушения эндогенной мишеневой мРНК, ингибируя таким образом трансляцию.

В соответствии с вариантом воплощения согласно изобретению антисмысловые молекулы содержат олигодезоксинуклеотидные структуры, комплементарные последовательностям генов в вирусе, который является мишенью. Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, комплементарные вирусной РНК, продемонстрировали ингибирование репликации вируса в клеточных культурах. ISIS 2922 представляет собой фосфоротиоатный олигонуклеотид с сильной антивирусной активностью против CMV; он комплементарен РНК области 2 предранней единицы транскрипции CMV и ингибирует синтез белка. Он был исследован как средство для лечения CMV ретинита. Неблагоприятные побочные эффекты включают витреит и точечную пигментацию ретинального эпителия.

Альтернативно, экспрессию генов, участвующих в продуцировании TNF или TNFR, можно снизить путем точного нацеливания дезоксирибонуклеотидных последовательностей, комплементарных регуляторной области гена-мишени (т.е. промотору и/или энхансерам гена-мишени) с образованием структур тройной спирали, которые предотвращают транскрипцию гена-мишени (см., например, Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6(6), 569-584; Helene et al., 1992, Ann.N.Y.Acad.Sci., 660, 27-36; и Maher, 1992, Bioassays 14(12), 807-815).

Антисмысловые РНК и ДНК, рибозим, молекулы, имеющие структуру тройной спирали, и т.д. согласно изобретению можно получить способом, известным из уровня техники как способ синтеза молекул ДНК и РНК, включая, например, химический твердофазный синтез с использованием фосфорамидита. Олигонуклеотиды можно синтезировать стандартными методами, известными из уровня техники. Например, с использованием автоматизированного синтезатора ДНК (например, коммерчески доступного от Biosearch, Applied Biosystems, и т.п.). В качестве примера, фосфоротиоатные олигонуклеотиды можно синтезировать методом Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16:3209, а метилфосфонатные олигонуклеотиды можно получить, как описано Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451. Альтернативно, молекулы РНК могут быть получены путем транскрипции последовательностей ДНК in vitro и in vivo, кодирующих антисмысловую молекулу РНК. Такие последовательности ДНК могут быть включены в различные векторы, которые включают подходящие РНК-полимеразные промоторы, такие как Т7 или SP6 полимеразные промоторы. Альтернативно, антисмысловые кДНК конструкции, которые синтезируют антисмысловую РНК конститутивно или индуцибельно, в зависимости от используемого промотора, могут быть стабильно введены в клеточные линии.

Экспрессию эндогенного гена-мишени можно также снизить путем инактивации или “нокаута” гена-мишени или его промотора, используя нацеленную гомологичную рекомбинацию (см., например, Smithies, et al., 1985, Nature 317, 230-234; Thomas и Capecchi, 1987, Cell 51, 503-512; Thompson, et al., 1989, Cell 5, 313-321). Например, можно использовать мутант, нефункциональный ген-мишень (или абсолютно неродственную последовательность ДНК), фланкированный ДНК, гомологичной эндогенному гену-мишени (либо кодирующим областям, либо регуляторным областям гена-мишени), с использованием определяемого маркера и/или негативного определяемого маркера или без него, для трансфекции клеток, которые экспрессируют ген-мишень in vivo. Вставка ДНК конструкции через нацеленную гомологичную рекомбинацию приводит к инактивации гена-мишени. Такие подходы являются особенно подходящими в сельскохозяйственной области, где модификации ES (эмбриональных стволовых) клеток можно использовать для генерации потомства животных с инактивированным геном-мишенью (см., например, Thomas и Capecchi, 1987 and Thompson, 1989, выше), или в модельных организмах, таких как Caenorhabditis elegans, где прием “вмешательство РНК” (“RNAi”) (Grishok A, Tabara H, and Mello C C, 2000, Science 287 (5462): 2494-2497) или введение трансгенов (Dernburg et al., 2000, Genes Dev. 14 (13): 1578-1583) используют для ингибирования экспрессии конкретных генов-мишеней. Такой подход можно адаптировать для использования для человека при условии, что рекомбинантные ДНК конструкции непосредственно вводятся или нацеливаются на нужный участок in vivo при помощи подходящих векторов, таких как вирусные векторы.

Антитела против TNF

Настоящим изобретением охватываются поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), химерные антитела, антиидиотипические (анти-Id) антитела к антителам, которые могут быть меченными в растворимой или связанной форме, а также их фрагменты, участки или производные, полученные любыми известными способами, такими как, но не ограничиваясь этим, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные методы. Такие антитела против TNF согласно изобретению способны связываться с частями TNF, ингибирующими связывание TNF с рецепторами TNF.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, которые получены из сыворотки животных, иммунизированных антигеном. Моноклональное антитело включает по существу гомогенную популяцию антител, специфических к антигену, при этом такая популяция содержит по существу схожие участки связывания с эпитопом. mAb могут быть получены способами, известными специалистам в данной области. См., например, Kohler и Milstein. Nature 256:495-497 (1975); патент США № 4376110; Ausubel et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1987, 1992); Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988); Colligan et al., eds., Current Propocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), содержание которых включено в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, GILD и любой их подкласс. Гибридому, продуцирующую mAb согласно изобретению, можно культивировать in vitro, in situ или in vivo. Продукция высоких титров mAb in vivo или in situ делает этот способ получения предпочтительным на настоящее время.

Химерные антитела представляют собой молекулы, разные части которых происходят из разных видов животных, например, можно использовать такие, которые содержат вариабельную область, происходящую из мышиного mAb, и константную области человеческого иммуноглобулина, которые в основном используют для снижения иммуногенности при введении и для увеличения выхода при получении, например, когда мышиные mAb имеют более высокий выход из гибридом, но более высокую иммуногенность у человека, например человеческие мышиные химерные mAb. Химерные антитела и способы их получения известны из уровня техники (Cabilly et al, Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (194), Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., Европейская патентная заявка 125023 (опубликована 14 ноября 1984); Neuberger et al., Nature 314:268-270 (1985); Taniguchi et al., Европейская патентная заявка 17/496 (опубликована 19 февраля 1985); Morrison et al., Европейская патентная заявка 173494 (опубликована 5 марта 1986); Neuberger et al., заявка PCT WO 86/01533, (опубликована 13 марта 1986); Kudo et al., Европейская патентная заявка 184187 (опубликована 11 июня 1986); Morrison et al., Европейская патентная заявка [73494 (опубликована 5 марта 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066-1074 (1986): Robinson et al., Международная патентная заявка #PCT/US86/02269 (опубликована 7 мая 1987); Liu et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Better et al., Science 240:1041-1043 (1988); Harlow and Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).

Поликлональные мышиные антитела к TNF описаны Cerami et al. (патентная публикация EPO 0212489, 4 марта 1987).

Rubin et al. (патентная публикация EPO 0218868, 22 апреля 1987) раскрывают мышиные моноклональные антитела к человеческому TNF, гибридомы, секретирующие такие антитела, способы получения таких мышиных антител и использование таких мышиных антител в иммуноанализе TNF.

Yone et al. (патентная публикация EPO 0288088, 26 октября 1988) раскрывает мышиные антитела против TNF, включая mAbs, и их применение в иммуноанализе для диагностики патогенов, в частности патологии Kawasaki и бактериальной инфекции.

Другие исследователи описали mAb грызунов, или рутинные mAb, специфические в отношении рекомбинантного человеческого TNF, которые обладали нейтрализующей активностью in vitro (Liang, et al., (Biochem. Biophys.Res. Comm. 137:847-854 (1986); Meager, et al., Hybridoma 6:305-311 (1987); Fendly et al., Hybridoma 6-359-369(1987); Bringman, et al., Hybridoma 6:489-507 (1987); Hirai, et al., J.Immunol.Meth. 96:57-62 (1987) Moiler, et al., (Cytokine 2:162-169 (1990)).

Как было показано, нейтрализующая антисыворотка или mAbs к TNF у млекопитающих, отличных от человека, нейтрализуют неблагоприятные физиологические изменения и предотвращают гибель после летального контрольного заражения в экспериментальной эндотоксиемии и бактериемии. Такой эффект был продемонстрирован, например, в исследованиях летальности у грызунов и модельных системах патологий приматов (Mathison, et al., J.Clin.Invest. 81:1925-1937 (1988); Beutler, et al., Science 229:869-871 (1985); Tracey, et al., Nature 330:662-664 (1987); Shimamoto, et al., Immunol. Lett. 17:311-318 (1988); Silva, et al., J. Infect. Dis. 162:421-427 (1990); Opal et al., J. Infect. Dis. 161:1148-1152 (1990); Hinshaw, et al., Circ. Shock 30:279-292 (1990)).

Антитела против TNF согласно изобретению могут включать, по меньшей мере, одну из константной области тяжелой цепи (Н_с), вариабельной области тяжелой цепи (H_v), вариабельной области легкой цепи (L_v) и константных областей тяжелой цепи (L_c), при этом поликлональные Ab, моноклональные Ab, поликлональные Ab, их фрагменты и/или участки включают, по меньшей мере, одну вариабельную область тяжелой цепи (H_v) или вариабельную область легкой цепи (L_v), которая связывается с частью TNF и ингибирует и/или нейтрализует, по меньшей мере, один вид биологической активности TNF.

Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, с которой может связываться антитело, которая, кроме того, может индуцировать у животного продукцию антитела, способного к связыванию с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один эпитоп или более одного эпитопа.

Специфическая реакция, о которой говорилось выше, означает, что антиген будет взаимодействовать, очень избирательно, с его соответствующим антителом, а не с различными другими антителами, которые могут быть индуцированы другими антигенами. Предпочтительно, когда антигены, связывающиеся с антителами, фрагментами или участками антител против TNF согласно изобретению, включают, по меньшей мере, 5 аминокислот, составляющих, по меньшей мере, один из аминокислотных остатков 87-108 или оба остатка 59-80 и 8-108 hTNF-α (SEQ ID NO:1). Предпочтительные антигены, которые связываются с антителами, фрагментами и участками антител против TNF согласно изобретению, не включают аминокислоты из аминокислот 11-13, 37-42, 49-57 или 155-157 hTNF-α (SEQ ID NO:1).

Эпитоп представляет собой ту часть какой-либо молекулы, которая может распознаваться и связываться антителом на одном или нескольких связывающих антиген участков антитела. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп в молекулах, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и имеют специфические пространственные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Под “ингибирующим и/или нейтрализующим эпитопом” подразумевается эпитоп, который при связывании с антителом приводит к утрате биологической активности молекулы или организма, содержащего такой эпитоп, in vivo, in vitro или in situ, более предпочтительно in vivo, включая, например, связывание TNF с рецептором TNF. Например, такие эпитопы включают описанные в патенте США № 6277969, который включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

Как он используется в данном описании, термин “химерное антитело” включает моновалентные, дивалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер (HL)), образованный химерной Н-цепью, связанной через дисульфидные мостики с химерной L-цепью. Дивалентное химерное антитело представляет собой тетрамер (H₂L₂), образованный двумя HL-димерами, связанными через, по меньшей мере, один дисульфидный мостик. Поливалентное химерное антитело также может быть образовано, например, с участием С_н области, которая агрегирует (например, из Н-цепи или µ-цепи IgM).

Мышиные и химерные антитела, фрагменты и участки согласно изобретению включают отдельные тяжелую (Н) и/или легкую (L) цепи иммуноглобулина. Химерная Н-цепь включает участок связывания антигена, полученный из Н-цепи нечеловеческого антитела, специфического в отношении TNF, который связан с, по меньшей мере, частью С области Н-цепи (С_Н) человека, например СН₁ или СН₂.

Химерная L-цепь в соответствии с настоящим изобретением включает участок связывания антигена, полученный из L-цепи ram-человеческого антитела, специфического в отношении TNF, связанный с, по меньшей мере, частью С области L-цепи (C_L) человека.

Антитела, фрагменты или производные, имеющие химерные Н-цепи и L-цепи одинаковой или разной специфичности связывания вариабельной области, также можно получать путем соответствующего связывания отдельных полипептидных цепей, используя известные стадии методов, например описанных ниже методов Ausubel, Harlow и Colligan.

Анти-TNF иммунорецепторные пептиды

Иммунорецепторные пептиды согласно изобретению могут связываться с TNF-α и/или TNF-β. Иммунорецептор включает, по меньшей мере, одну тяжелую или легкую цепь иммуноглобулина, ковалентно связанную с, по меньшей мере, частью TNF рецептора. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения изобретения константная область тяжелой цепи включает, по меньшей мере, часть СН₁. Конкретно, когда в иммунорецепторный пептид включена легкая цепь, тяжелая цепь должна включать область СН₁, ответственную за связывание с константной областью легкой цепи.

Иммунорецепторный пептид согласно изобретению предпочтительно может включать, по меньшей мере, одну константную область тяжелой цепи и, в некоторых вариантах воплощения, по меньшей мере, одну константную область легкой цепи, при этом молекула рецептора ковалентно связана с, по меньшей мере, одной из цепей иммуноглобулина. Некоторые варианты воплощения согласно изобретению включают вариабельные области легкой или тяжелой цепей. Поскольку молекула рецептора может быть связана на внутреннем участке цепи иммуноглобулина, одна цепь может иметь вариабельную область и слияние с молекулой рецептора.

Часть рецептора TNF, связанная с молекулой иммуноглобулина, способна связывать TNF-α и/или TNF-β. Поскольку внеклеточная область рецептора TNF связывает TNF, часть иммунорецептора, связанная с молекулой иммуноглобулина, состоит из, по меньшей мере, части внеклеточной области рецептора TNF.

Иммуноглобулиновый ген может происходить из любого источника позвоночных, такого как мышь, но предпочтительно он кодирует иммуноглобулин, имеющий существенный набор последовательностей, имеющих то же происхождение, что и конечный реципиент иммунорецепторного пептида. Например, если человека лечат введением молекулы согласно изобретению, предпочтительно иммуноглобулин имеет человеческое происхождение.

TNF-рецепторные конструкции для связывания с тяжелой цепью можно синтезировать, например, используя ДНК, кодирующую аминокислоты, присутствующие в клеточном домене рецептора. Предполагаемые участки рецептора для связывания с hTNF были представлены Eck и Sprange, J. Biol. Chem. 264(29), 17595-17605 (1989), которые идентифицировали участки рецептора, связывающиеся с TNF-α, как состоящие из аминокислот 11-13, 37-42, 49-57 и 155-157. В заявке PCT WO 91/02078 (дата приоритета 7 августа 1989) описаны TNF-лиганды, которые могут связываться с моноклональными антителами, имеющими следующие эпитопы, включающие в себя по меньшей мере один из 1-20, 56-77 и 108-127; по меньшей мере два из 1-20, 56-77, 108-127 и 138-149; все из 1-18, 58-65, 115-125 и 138-149; все из 1-18 и 108-128; все из 56-79, 110-127 и 135- или 136-155; все из 1-30 и 117-128 и 141-153; все из 1-26, 117-128 и 141-153; все из 22-40, 49-96 или-97, 11-127 и 136-153; все из 12-22, 36-45, 96-105 и 132-157; оба 1-20 и 76-90; все из 22-40, 69-97, 105-128 и 135-155; все из 22-31 и 146-157; все из 22-40 и 49-98; по меньшей мере один из 22-40, 9-98 и 69-97, оба 22-40 и 70-87. Таким образом, специалист в данной области, ознакомленный с настоящим описанием, сможет создать гибридные белки рецептора TNF, используя части рецептора, которые, как известно, связывают TNF.

Преимущества использования иммуноглобулинового гибридного белка (иммунорецепторного пептида) согласно изобретению включают в себя одно или несколько из следующих преимуществ: (1) возможную повышенную авидность для мультивалентных лигандов благодаря полученной бивалентности димерных гибридных белков, (2) более долгий период полужизни в сыворотке, (3) способность активировать эффекторные клетки через Fc-домен, (4) простоту очистки (например, путем хроматографии с использованием белка А), (5) сродство к TNF-α и TNF-β и (6) способность блокировать цитотоксичность TNF-α или TNF-β.

Хотя секреция гибридного белка в отсутствие легкой цепи Ig обычно возможна, основной вариант воплощения согласно изобретению предусматривает включение СН₁-домена, который может давать такие преимущества, как (1) увеличенное расстояние и/или гибкость между двумя молекулами рецептора, что обеспечивает большее сродство к TNF, (2) способность создавать гибридный белок с тяжелой цепью и гибридный белок с легкой цепью, которые будут объединяться друг с другом и димеризоваться, с образованием тетравалентной (двойное слияние) молекулы рецептора, и (3) тетравалентный гибридный белок может обладать повышенным сродством и/или нейтрализующей способностью в отношении TNF по сравнению с бивалентной (одно слияние) молекулой.

Антиидиотипические антитела

В дополнение к моноклональным или химерным антителам против TNF, настоящее изобретение также направлено на антиидиотипическое (анти-Id) антитело, специфическое в отношении антитела против TNF согласно изобретению. Анти-Id антитело представляет собой антитело, распознающее уникальные детерминанты, в основном, ассоциированные с антигенсвязывающим участком другого антитела. Антитело, специфическое в отношении TNF, называют идиотипическим или Id антителом. Анти-Id можно получить иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, мышиная линия), что источник Id антитела, Id антителом или его антигенсвязывающим участком. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детермининты иммунизирующего антитела и продуцировать анти-Id антитело. Анти-Id антитело также можно использовать как “иммуноген” для индукции иммунного ответа у следующего животного для продуцирования так называемого анти-анти-Id антитела. Анти-анти-Id может быть эпитопно идентичным исходному антителу, которое индуцировало анти-Id. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам mAb, можно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела одинаковой специфичности. См., например, патент США № 4699880, который включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки.

Антиидиотипическое (анти-Id) антитело представляет собой антитело, которое распознает уникальные детерминанты, в основном, ассоциированные с антигенсвязывающим участком антитела. Анти-Id антитело можно получить иммунизацией животного того же вида и генетического типа (например, мышиная линия), что и источник mAb, моноклональным антителом, против которого хотят получить анти-Id. Иммунизированное животное будет распознавать и отвечать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антитела к этим идиотипическим детерминантам (анти-Id антитело).

Следовательно, mAb, образованные против TNF, согласно изобретению можно использовать для индукции анти-Id антител у подходящих животных, таких как мыши BALB/c. Клетки селезенки таких иммунизированных мышей можно использовать для получения анти-Id гибридом, секретирующих анти-Id mAbs. Кроме того, анти-Id mAbs можно соединять с носителем, таким как гемоцианин моллюска морское блюдечко, и использовать для иммунизации других мышей BALB/c. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-анти-Id антитела, обладающие свойствами связывания исходного mAb, специфического в отношении эпитопа TNF.

Следовательно, любое подходящее нейтрализующее TNF соединение можно использовать в способах согласно изобретению. Примеры таких TNF-нейтрализующих соединений можно выбрать из группы, состоящей из антител или их частей, специфических в отношении нейтрализации эпитопов TNF, рецепторов р55, рецепторов р75 или их комплексов, частей рецепторов TNF, связывающих TNF, пептидов, связывающих TNF, любых лекарственных средств, являющихся пептидомиметиками, которые связывают TNF, и любых лекарственных средств, являющихся органомиметиками, которые блокируют TNF.

Такие нейтрализующие TNF соединения может определить специалист в данной области путем рутинного экспериментирования, исходя из раскрытия и указаний, содержащихся в настоящей заявке.

Структурные аналоги антител против TNF и анти-TNF пептидов

Структурные аналоги антител против TNF (включая их фрагменты и участки) и антигенов (также называемых в данном описании “пептидами”), которые генерируют указанные антитела согласно изобретению, обеспечиваются при помощи известных стадий способов исходя из раскрытия и указаний, содержащихся в настоящей заявке.

Сведения о пространственной структуре белков являются существенно важными для понимания того, как они функционируют. Сведения о пространственной структуре более чем 400 белков в настоящее время доступны из баз данных о структуре белков (в отличие от примерно 15000 известных последовательностей белков в базах данных последовательностей). Анализ этих структур показывает, что они попадают в распознаваемые классы мотивов. Таким образом, можно смоделировать пространственную структуру белка исходя из гомологии белков с родственным белком известной структуры. Известно множество примеров, когда два белка, которые имеют относительно низкую гомологию последовательностей, могут иметь очень схожие пространственные структуры или мотивы.

В последнее время стало возможным определить пространственную структуру белков массой до около 15 кДа методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Для этого метода требуется только концентрированный раствор чистого белка. Не требуются никакие кристаллы или изоморфные производные. Этим методом были определены структуры различных белков. Детали определения структуры методом ЯМР хорошо известны из уровня техники (см., например, Wuthrich., NMR of Proteins and Nucleic Acids, Wiley, New York, 1986; Wuthrich, K. Science 243:45-50 (1989); Clore et al., Crit.Rev. Bioch, Molec.Biol. 24:479-564 (1989); Cooke et al., Bioassays 8:52-56 (1988)).

Применяя такой подход, собирают различные наборы данных ¹Н-ЯМР 2D для антител против TNF и/или анти-TNF пептидов согласно изобретению. Такие данные делятся на два основных типа. Один тип, COSY (Conetated Spectroscopy) определяет резонансы протонов, связанных химическими связями. Такие спектры дают информацию о протонах, которые связаны тремя или менее ковалентными связями. NOESY (nuclear Overhauser enhancement spectroscopy) определяет протоны, пространственно близкие (менее чем 0,5 нм). На основании интерпретации полной системы спина вторичную структуру определяют методом NOESY. Пересекающиеся пики (ядерные эффекты Overhauser или NOE) обнаружены между остатками, являющимися смежными в первичной последовательности пептида, и могут наблюдаться для протонов, находящихся на расстоянии менее чем 0,5 нм друг от друга. Данные последовательных NOE в сочетании с константами взаимодействия амидных протонов и NOE от несмежных аминокислот, которые являются смежными с вторичной структурой, используют для характеристики вторичной структуры полипептидов. Помимо предсказания вторичной структуры NOE показывает расстояние, разделяющее протоны в пространстве, как в первичной аминокислотной последовательности, так и во вторичных структурах. Получив данные, предсказывающие третичную структуру, все данные рассматривают, экстраполируя их методом “наилучшей подгонки”.

Типы аминокислот сначала идентифицируют по химической связи. Второй этап включает определение конкретных аминокислот по пространственным связям с соседними остатками, используя для этого также известную аминокислотную последовательность. Данные о структуре затем табулируют, и они представляют собой три основных типа: NOE идентифицирует пары протонов, которые являются пространственно близкими, константы взаимодействия дают информацию о двухгранных углах, а медленно обменивающиеся амидные протоны дают информацию о положении водородных связей. Ограничения используют для компьютерного расчета структуры, используя стереометрический тип расчетов, с последующим доведением структуры с использованием ограниченной молекулярной динамики. Результатом использования таких компьютерных программ является семейство структур, которые сопоставимы с экспериментальными данными (т.е. для комплекта, включающего пару, ограничения расстояния составляют <0,5 нм). Лучше, когда структуру определяют на основании данных, и лучше, когда семейство структур может быть наложено друг на друга (т.е. лучшее разрешение структуры). В структурах, наиболее хорошо определяемых методом ЯМР, положение большой части основной цепи (т.е. амид, С-α и карбонильные атомы) и боковых цепей тех аминокислот, которые лежат схороненными в ядре молекулы, можно определить также четко, как и в структурах, полученных кристаллографией. Однако боковые цепи аминокислотных остатков, которые экспонированы на поверхности, часто хуже определяются. Возможно, это является отражением того факта, что эти поверхностные остатки являются более подвижными, и могут не иметь зафиксированного положения. (В структуре кристалла это может быть видно как плотность диффундирующих электронов.)

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, использование данных спектроскопии ЯМР сочетают с компьютерным моделированием для выхода на структурные аналоги, по меньшей мере, частей анти-TNF антител и пептидов на основании структурного представления топографических данных. Используя такую информацию, специалисту в данной области будет понятно, как выйти на структурные аналоги анти-TNF антител и/или пептидов, например, путем рациональных замещений аминокислот, что позволяет получить пептиды, в которых сродство связывания с TNF можно модулировать в соответствии с требованиями, налагаемыми ожидаемым терапевтическим или диагностическим использованием такой молекулы, предпочтительно с достижением лучшей специфичности в отношении связывания TNF.

Альтернативно, соединения, имеющие структурные и химические особенности, подходящие в качестве терапевтических и диагностических средств против TNF, дают структурные аналоги с селективным сродством к TNF. Исследования методом молекулярного моделирования связывающихся с TNF соединений, таких как рецепторы TNF, антитела против TNF или другие связывающиеся с TNF молекулы, с использованием такой программы, как MACROMODEL (Strodinger LLC), INSIGHT (Accelrys Inc.) и DISCOVER (Accelrys Inc.), выявляют такие пространственные характеристики и ориентацию анти-TNF Abs и/или пептидов согласно изобретению. Таким образом, такие структурные аналоги согласно изобретению обеспечивают селективное количественное и качественное действие против TNF in vitro, in situ и/или in vivo.

Противовирусные соединения

В следующем варианте воплощения композиции согласно изобретению включают противовирусное соединение. Предпочтительно противовирусное соединение представляет собой антикоронавирусное соединение. Антикоронавирусное соединение предпочтительно представляет собой антитело (моноклональное, поликлональное, химерное и т.д.), ингибитор вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор кодируемой вирусом протеазы, воздействующей на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, например, такой, который влияет на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности (например, ингибитор связывания hAPN с HCoV-229E) или ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в гликопротеине вирусного пика, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетание. Более предпочтительно противовирусное соединение представляет собой моноклональное антитело против SARS-ассоциированного вируса, такого как SARS-CoV. В соответствии с вариантом воплощения согласно изобретению моноклональное антитело согласно изобретению (имеющее период полужизни около 20 дней) вводят субъекту для профилактики SARS инфекции.

Противовирусные соединения включают, например, нуклеозидные/нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (NRTIs), ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (NNRTIs), и/или ингибиторы протеазы (PIs). NRTIs, которые можно вводить в сочетании с композициями согласно изобретению, включают, но не ограничиваются этим, РЕТРОВИР (Glaxo Smith Kline Inc., зидовудин/AZT), ВИДЕКС (Bristol-Myers Squibb Inc.)диданозин/ddI), ГИВИД (Hoffmann-La Roche)(залцитабин/ddC), ЗЕРИТ (Bristol-Myers Squibb, ставудин/d4T), ЭПИВИР (Glaxo Smith Kline ламивудин/3ТС, и КОМБИВИР (Glaxo Smith Kline, зидовудин/ламивудин). NNRTIs, которые можно вводить с композициями согласно изобретению, включают, но не ограничиваются этим, ВИРАМУН (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc., невирапин), РЕСКРИПТОР (Pharmacia/Upjohn, делавирдин) и СУСТИВА (Dupont Pharma Co., эфавиренц). Ингибиторы протеазы, которые можно вводить в сочетании с композициями согласно изобретению, включают, но не ограничиваются этим, КРИКСИВАН (Merck & Co., индинавир), НОРВИР (Abbott Labs., ритонавир), ИНВИРАЗУ (Hoffmann-La Roche, саквинавир) и ВИРАСЕПТ (Agouron Pharma Inc., нелфинавир). В специальном варианте воплощения изобретения антиретровирусные средства, нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы и/или ингибиторы протеазы можно вводить в сочетании с композициями согласно изобретению для лечения СПИДа и/или ВИЧ-инфекции.

NRTIs включают ЛОДЕНОЗИН (F-ddA; кислотостойкий аденозин NRTI, Triangle/Abbott); КОВИРАЦИЛ (эмтрицитабин/FTC); структурно родственный ламивудину (3TC), но обладающий в 3-10 раз большей активностью in vitro, Triangle/Abbott); dOTC (BCH-10652, также структурно родственный ламивудину, сохраняет активность против существенной части тамивудин-резистентных изолятов; Biochem Pharma); Адефовир (не одобрен FDA для анти-ВИЧ терапии; Gilead Sciences); ПРЕВЕОН (Gilead Sciences Inc.) (адефовир дипивоксил, активное пролекарство адефовира, его активная форма - PMEA-pp); ТЕНОФОВИР, (bis-POC PMPA, ПРОЛЕКАРСТВО PMPA; Gilead); DAPD/DXG (АКТИВНЫЙ МЕТАБОЛИТ DAPD; Triangle/Abbott); DD4FC (родственный 3TC, обладает активностью против AZTT3C-резистентного вируса); GW420867X (Glaxo Wellcome); ЗИАГЕН (абакавир/159U89: Glaxo Wellcome Inc.); CS-87 (3'азидо-2',3'-дидезоксиуридин: WO 99/66936); и S-ацит-2-тиоэтил (SATE)-содержащие пролекарственные формы β-L-FD4C и β-L-FddC (WO 98/17281).

Другие NNRTIs включают КОЭКШН (Эмивирин/MKC-442, сильный NNRTI класса HEPT; Triangle/Abbott); КАПРАВИРИН, (AG-1549/S-1153, следующее поколение NNRTI с активностью против вирусов, содержащих K103N мутацию; Agouron); PNU-142721 (обладает в 20-50 раз большей активностью, чем его предшественник делавирдин, и является активным против K103N мутантов; Pharmacia & Upjohn); DPC-961 и DPC-963 (производные эфавиренца второго поколения, разработанные как обладающие активностью против вирусов с K103N мутацией; DuPont); GW-420867X (обладает в 25 раз большей активностью, чем HBY097, и является активным против K103N мутантов: Glaxo Wellcome), КАЛАНОЛИДA (вещество природного происхождения из каучукового дерева; активный против вирусов, содержащих одну из или обе мутации Y11C и K103N) и Прополис (WO 99/49830).

Дополнительные ингибиторы протеазы включают ЛОПИНАВИР (авт378/R; (Abbott Laboratories); BMS-232632 (азапептид; Bristol-Myers Squibb); ТИПРАНАВИР (PNU-140690, непептидный дигидропирон; Pharmacia&Upjohn); PD-178390 (непептидный дигидропирон; Parke-Davis); BMS 232-632 (азапептид; Bristol-Myers Squibb); L-756,423 (аналог индинавира; Merck); DMP-450 (циклическое соединение мочевины; Avid & DuPont 7: AG-1776 (пептидомиметик с in vitro активностью против резистентных к ингибитору протеазы вирусов; Agouron); VX-175/GW-433908 (фосфатное пролекарство ампренавира; Vertex & Glaxo Welcome); CGP61755 (Ciba) и АГЕНЕРАЗУ (ампренавир; Glaxo Wellcome Inc,).

Следующие антиретровирусные средства включают ингибиторы слияния/агенты связывания gp41. Ингибиторы слияния/агенты связывания gp41 включают T-20 t, пептид из остатков 643-678 трансмембранного белкового эктодомена gp41 ВИЧ, который связывается с gp41 в его состоянии покоя и предотвращает трансформацию в фузогенное состояние: Тримерис и Т-1249 (ингибитор слияния второго поколения; Тримерис).

Следующие антиретровирусные средства включают ингибиторы слияния/антагонисты хемокиновых рецепторов. Ингибиторы слияния/антагонисты хемокиновых рецепторов включают антагонисты CXCR4, такие как AMD 3100 (бициклам), SDF-1 и его аналоги и ALX40-4С (катионный пептид), Т22 (пептид из 18 аминокислот; Тримерис) и аналоги Т22-Т134 и TI40; антагонисты CCR5, такие как RANTES (9-68), АОР-RANTES, NNY-RANTES и ТАK-779; и антагонисты CCR5/CXCR4, такие как NSC 651016 (аналог дистамицина). Кроме того, они включают ФУЗЕОН (родовое название эуфувиртида; доступен от Hoffmann-La Roche; который блокирует способность ВИЧ инфицировать здоровые клетки CD4). Они также включают антагонисты CCR2B, CCR3 и CCR6. Агонисты хемокиновых рецепторов, такие как RANTES, SDF-1, MIP-1α, MIP-1β, также могут ингибировать слияние.

Следующие антиретровирусные средства включают ингибиторы интегразы. Ингибиторы интегразы включают дикофеоилхинные (DFQA) кислоты: L-цикориевую кислоту (дикофеоилвинная (DCTA) кислота); хинализарин (QLC) и родственные антрахиноны; ЗИНТЕВИР (Aronex Pharmaceuticals Inc.) (AR 177, олигонуклеотид, который, вероятно, действует на клеточной поверхности, а не является действительным ингибитором интегразы: Арондекс); нафтолы, такие как описанные в WO 98/50347.

Следующие антиретровирусные средства включают соединения гидроксимочевинного типа, такие как ВСХ-34 (Biocryst Pharma, Inc., ингибитор пуриннуклеозидфосфорилазы); ингибиторы рибонуклеотидредуктазы, такие как DIDOX (молекулы для Health Inc.): ингибиторы инозинмонофосфатдегидрогеназы (IMPDH), такие как VX-497 (Vertex Pharmaceutical Inc.); и микофоловые кислоты, такие как CellCept (Hoffmann-La Roche, микофенолят мофетил).

Следующие антиретровирусные средства включают ингибиторы вирусной интегразы, ингибиторы ядерной транслокации вирусного генома, такие как соединения арилен бис(метилкетон): ингибиторы проникновения ВИЧ, такие как АОР-RANTES, NNY-RANTES, гибридный белок RANTES-IgG, растворимые комплексы RANTES и гликозаминогликанов (GAG), и AMD-3100 (AnorMed Inc.); ингибиторы нуклеокапсидных цинковых пальцев, такие как дитиановые соединения: мишенями являются HIV Tat и Rev; умеренные фармакоэнхансеры, такие как АВТ-378.

В соответствии с вариантом воплощения изобретения композиции согласно изобретению могут включать другие антиретровирусные соединения, включая цитокины и лимфокины, такие как MIP-1.α, MIP-1β, SDF-1.α, IL-2; ПРОЛЕЙКИН (Chiron Corp.) (алдезлейкин/L2-7001; Chiron), IL-4, IL-10, IL-12 и IL-13; интерфероны, такие как IFN-α2a; антагонисты TNF. NF.каппа.В. GM-CSF, M-CSF и IL-10; средства, модулирующие иммунную активацию, такие как циклоспорин и преднизон; вакцины, такие как Remune (HIV Immunogen), рекомбинантный gp120 и фрагменты, бивалентный (В/Е) рекомбинантный оболочечный гликопролеин, rgp120CM235, MN rgp120, SF-2 rgp 120, gp 120/растворимый комплекс CD4, Дельта JR-FL протеин, разветвленный синтетический пептид, полученный из прерывистого gp120 C3/C4-домена, способные к слиянию (fusion-competent) иммуногены и Gag, Pol, Nef и Tat вакцины; генную терапию, например генетические супрессорные элементы (GSEs; WO 98/54366) и интракины (генетически модифицированные СС хемокины, нацеленно действующие на ER для блокирования экспрессии вновь синтезированного CCR5 (Yang et al., PNAS 94:11567-72 (1997); Chen et al., Nat. Med. 3:111-16 (1997)); антитела, такие как анти-CXCR4 антитело 12G5, анти-CCR5 антитела 2D7, 5С7, РА8, РА9, РА10, РА11, РА12 и PA14, анти-CD4 антитела Q4120 и RPA-T4, анти-CCR3 антитело 7B11, анти-gpl20 антитела 17b, 48d, 447-52D, 257-D, 268-D и 50-1, анти-Tat антитела, анти-TNF-α антитела и моноклональное антитело 33A; агонисты и антагонисты арилуглеводородных (AH) рецепторов, такие как TCDD, 3,3',4,4',5-пентахлорбифенил, 3,3'4,4'-тетрахлорбифенил и α-нафтофлавон (WO 98/30213); и антиоксиданты, такие как гамма.-L-глутамил-L-цистеинэтиловый эфир (γ-GCE; WO 99/56764).

В следующих вариантах воплощения изобретения, композиции согласно изобретению включают средства против условно-патогенных инфекций. Средства против условно-патогенных инфекций включают, но не ограничиваются этим, ТРИМЕТОПРИМ-СУЛЬФАМЕТОКСАЗОЛ (Hoffmann-La Roche) ДАПСОН (Jacobus Pharmaceuticals), ПЕНТАМИДИН (American Pharmaceuticals Partners), АТОВАХИНОН (Glaxo SmithKline), ИЗОНИАЗИД (Becton Dickinson Microbiology System), РИФАМПИН (Bedford Labs), ПИРАЗИНАМИД (Pharmascience Inc.), ЭТАМБУТОЛ (Cadila Pharma Inc.), РИФАБУТИН (Adria Labs Inc.), КЛАРИТРОМИЦИН (Ind-Swift Labs, Ltd), АЗИТРОМИЦИН (Pfizer, Inc.), ГАНЦИКЛОВИР, ФОСКАРНЕТ (Astra Pharmaceuticals Inc.), ЦИДОФОВИР (Gilead Sciences Inc.), ФЛУКОНАЗОЛ (Pfizer Inc.) ИТРАКОНАЗОЛ (Jansseen Pharmaantica) КЕТОКОНАЗОЛ (Novopharm Ltd.), АЦИКЛОВИР (Glaxo Wellcome), ФАМЦИКЛОВИР, ПИРИМЕТАМИН (Glaxo Wellcome Inc.), ЛЕУКОВОРИН (Immunex/Amgen Inc.), НЕУПОГЕН (Amgen Inc.) (филграстим/G-CSF) и ЛЕЙКИН (Berlex Labs Inc.) (саргамостим/GM-CSF).

В соответствии с вариантом воплощения изобретения композиции согласно изобретению включают ТРИМЕТОПРИМ-СУЛЬФАМЕТОКСАЗОЛ (Hoffmann-La Roche), ДАПСОН (Jacobus Pharmaceuticals), ПЕНТАМИДИН (American Pharmaceuticals Partners) и/или АТОВАХИНОН (Glaxo SmithKline) для профилактики или предотвращения инфекционной пневмонии, вызванной условно-патогенным вирусом Pneumocystis carinii. В других конкретных вариантах воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с ИЗОНИАЗИДОМ (Becton Dickinson Microbiology System), РИФАМПИНОМ (Bedford Labs), ПИРАЗИНАМИДОМ (Pharmascience Inc.) и/или ЭТАМБУТОЛОМ (Cadila Pharma Inc.) для профилактики или предотвращения инфекции, вызванной условно-патогенным Mycobacterium avium complex. В других конкретных вариантах воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с РИФАБУТИНОМ (Adria Labs Inc.), КЛАРИТРОМИЦИНОМ (Ind-Swift Labs, Ltd) и/или АЗИТРОМИЦИНОМ (Pfizer, Inc.) для профилактики или предотвращения условно-патогенной инфекции Mycobacterium tuberculosis. В других конкретных вариантах воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с ГАНЦИКЛОВИРОМ, ФОСКАРНЕТОМ (Astra Pharmaceuticals Inc.) и/или ЦИДОФОВИРОМ (Gilehead Sciences Inc.) для профилактики или предотвращения инфекции, вызванной условно-патогенным цитомегаловирусом. В других конкретных вариантах воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с ФЛУКОНАЗОЛОМ (Pfizer Inc.), ИТРАКОНАЗОЛОМ (Jansseen Pharmaantica) и/или КЕТОКОНАЗОЛОМ (Novopharm Ltd.) для профилактики или предотвращения условно-патогенной грибковой инфекции. В другом конкретном варианте воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с АЦИКЛОВИРОМ (Glaxo Wellcome) и/или ФАМЦИКЛОВИРОМ для профилактики или предотвращения инфекции, вызванной условно-патогенным вирусом простого герпеса типа I и/или типа II. В следующем конкретном варианте воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с ПИРИМЕТАМИНОМ и/или ЛЕУКОВОРИНОМ (Immunex/Amgen Inc.) для профилактики или предотвращения условно-патогенной инфекции, вызванной Toxoplasma gonidii. Еще в одном конкретном варианте воплощения изобретения композиции согласно изобретению используют в любом сочетании с ЛЕУКОВОРИНОМ (Immunex/Amgen Inc.) и/или НЕУПОГЕНОМ (Amgen Inc.) для профилактики или предотвращения условно-патогенной бактериальной инфекции.

В следующем варианте воплощения изобретения композиции согласно изобретению включают антибиотик. Антибиотики, которые можно вводить, включают, но не ограничиваются этим, амоксициллин, β-лактамазы, аминогликозиды, беталактам (гликопептид), βлактамазы, клиндамицин, хлорамфеникол, цефалоспорины, ципрофлоксацин, эритромицин, флуорохинолоны, макролиды, метронидазол, пенициллины, хинолоны, рапамицин, рифампин, стрептомицин, сультонамид, тетрациклины, тримтетоприм, триметоприм-сульфаметоксазол и ванкомицин.

В соответствии с вариантом воплощения изобретения композиции согласно изобретению включают иммуностимулирующие средства. Иммуностимулирующие средства можно вводить в сочетании с терапевтическими средствами согласно изобретению, и они включают, но не ограничиваются этим, левамизол (например, ЭРГАМИЗОЛ), изопринозин (например, ОСИПЛЕКС), интерфероны (например, интерферон α) и интерлейкины (например, IL-2).

В соответствии с вариантом воплощения изобретения композиции согласно изобретению включают иммуносупрессоры. Иммуносупрессоры, которые можно вводить в сочетании с терапевтическими средствами согласно изобретению, включают, но не ограничиваются этим, стероиды, циклоспорин, аналоги циклоспорина, циклофосфамид метилпреднизон, преднизон, азатиоприн, FK-506, 15-дезоксипергуалин и другие иммуносупрессоры, действие которых заключается в подавлении функции иммунореактивных Т-клеток. Другие иммуносупрессоры, которые можно вводить в сочетании с композициями согласно изобретению, включают, но не ограничиваются этим, преднизолон, метотрексат, талидомид, метоксален, рапамицин лефлуномид, мизорибин (БРЕДНИН) (Boehringer-Ingelheim Inc.), бреквинар, дезоксиспергуалин и азаспиран (SKF 105685), ОРТОКЛОН OKT (OrthoBiotech Products L.P.) 3 (муромонаб-CD3), САНДИММУН, НЕОРАЛ (Novartis Inc.), САНГДИА (Sangstat Medical Corp.) циклоспорин), ПРОГРАФ (Fujisawa Healthcare Inc.) (FK506, tacrolimus), ЦЕЛСЕПТ (Hoffmann-La Roche) (микофенолят мотефил, в котором активным метаболитом является микофеноловая кислота), IMURAN (Glaxo SmithKline) (азатиоприн), глюкокортикостероиды, адренокортикостероиды, такие как ДЕЛЬТАЗОН (UpJohn/Pharmacia) (преднизон) и ГИДЕЛЬТРАЗОЛ (DuPont, Merck & Co. Inc.) (преднизолон), ФОЛЕКС (Adria Laboratories, Inc.) и МЕКСАТ (Lederle Laboratories Inc.) метотрексат), ОКССОРАЛЕН-УЛЬТРА (ICN Pharmaceuticals, Inc.) (метокссален) и РАПАМУН (Wyeth Inc.) (сиролимус). В специальном варианте воплощения изобретения иммуносупрессоры можно использовать для предотвращения отторжения трансплантата органа или костного мозга.

В соответствии с вариантом воплощения изобретения композиции согласно изобретению включают внутривенные препараты иммуноглобулина. Внутривенные препараты иммуноглобулина, которые можно вводить, включают, но не ограничиваются этим, ГАММАР, ИВИГАМ (Baxter Inc.), САНДОГЛОБУЛИН (Novartis, Inc.) ГАММАГАРД (Baxter Corp.) S/D, АТГАМ (Pharmacia/Upjohn/Pfizer), (антитимоцитарный глобулин) и ГАММИМУН (Bayer Inc.). В соответствии с вариантом воплощения изобретения композиции согласно изобретению вводят в сочетании с внутривенными препаратами иммуноглобулина при трансплантационной терапии (например, трансплантации костного мозга).

В некоторых вариантах воплощения изобретения композиции согласно изобретению включают противовоспалительное средство. Противовоспалительные средства, которые можно вводить, включают, но не ограничиваются этим, кортикостероиды (например, β-метазон, будезонид, кортизон, дексаметазон, гидрокортизон, метилпреднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон), нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, диклофенак, дифлунизал, этодолак, фенопрофен, флоктафенин, флурбипрофен, ибупрофен, индометацин, кетопрофен, меклофенамид, мефенамовая кислота, мелоксикам, набуметон, напроксен, оксапрозин, фенилбутазон, пироксикам, сулиндак, теноксикам, тиапрофеновая кислота и толметин), а также антигистаминные средства, производные аминоарилкарбоновой кислоты, производные арилуксусной кислоты, производные арилмасляной кислоты, производные арилкарбоновой кислоты, производные арилпропионовой кислоты, пиразолы, пиразолоны, производные салициловой кислоты, тиазинкарбоксамиды, ε-ацетамидокапроновую кислоту, S-аденозилметионин, 3-амино-4-гидроксимасляную кислоту, амиксетрин, бендазак, бензидамин, буколом, дифенпирамид, дитазол, эморфазон, гвайазулен, набуметон, нимесулид, орготеин, оксасепрол, паранилид, перизоксал, пифоксим, проквазон, проксазол и тенидап.

Иммуноглобулины

Было показано, что гипериммунный CMV иммуноглобулин аттенуирует CMV заболевание, связанное с трансплантацией почек, но он не был признан полезным для профилактики CMV заболевания у ВИЧ-инфицированных субъектов. Человеческое моноклональное антицитомегаловирусное антитело может быть полезным в качестве вспомогательного средства, используемого вместе с фоскаметом или ганцикловиром для лечения CMV ретинита.

Интерфероны

Интерфероны представляют собой природные клеточные продукты, высвобождаемые из инфицированных клеток хозяина в ответ на вирусные или другие чужеродные нуклеиновые кислоты. Они определяются уже через 2 часа после инфицирования. Их сложный механизм действия еще не полностью установлен, но интерферон селективно блокирует трансляцию и транскрипцию вирусной РНК, останавливая репликацию вируса, не нарушая при этом функцию нормальных клеток хозяина.

Рекомбинантная форма эндогенного интерферона-α в настоящее время изучается на избранных пациентах, страдающих такими заболеваниями, как волосистоклеточный лейкоз, саркома Капоши, папиломавирус человека и респираторные вирусы. Ее прежде всего используют в случаях гепатита В и С. Такая терапия может помочь пациентам с активной формой HBV или гепатита С (HCV) с детектируемыми вирусными нагрузками и аномальной функцией печени.

У пациентов с HBV, соответствующих определенным критериям, 2,5-5 Ед., вводимых подкожно (sc) или внутримышечно (IM) в течение 4-6 месяцев, могут индуцировать выведение ДНК HBV и е антигена гепатита В (HBeAg) из сыворотки и привести к улучшению аномальных показателей теста функции печени и гистологии печени у 25-40% пациентов. Для случаев хронического гепатита дельта необходимы более высокие дозы от 9 до 10 млн Ед. 3 раза в неделю, и случаи рецидивов достаточно типичны. Для случаев HCV введение в течение 3-6 месяцев 3 млн Ед. до 6 млн Ед. 3 раза в неделю в течение 6-12 месяцев типично снижает уровень РНК HCV и приводит к улучшению показателей тестов функции печени и гистологии печени в 10-25% случаев. Неблагоприятные побочные эффекты включают лихорадку, озноб, слабость и миалгию, типично начинающиеся с 7-12 часов после первой инъекции и продолжающиеся в течение 12 часов. Более низкие дозы в случаях HCV дают не такие тяжелые побочные эффекты, но при этом были сообщения об ухудшении состояния, связанного с развитием гепатита. Добавление рибавирина к интерферону для лечения HCV может иметь перспективу.

Терапевтическое введение

Способы согласно изобретению включают введение пациенту композиций согласно изобретению. В соответствии с вариантом воплощения согласно изобретению пациентам, страдающим SARS, вводят ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина. В соответствии с другим вариантом воплощения согласно изобретению пациентам, страдающим SARS, вводят ингибитор TNF. Анти-TNF рекомбинантные рецепторы, mAbs, антисмысловые олигонуклеотиды, пептиды, их фрагменты или производные и малые молекулы согласно изобретению, описанные в настоящей заявке, можно вводить как отдельные терапевтические средства или в сочетании с другими терапевтическими средствами. Их можно вводить как таковые, но, как правило, их вводят с фармацевтическим носителем, выбираемым в зависимости от избранного пути введения и на основании стандартной фармацевтической практики.

Вводимая доза, конечно, будет разной, в зависимости от известных факторов, таких как фармакодинамические характеристики конкретного средства и способ и путь его введения; возраст, состояние здоровья и вес реципиента; характер и тяжесть симптомов, тип сопутствующего лечения, частота приема и желаемый эффект. Обычно суточная доза активного ингредиента может составлять от 0,01 до 100 миллиграмм на килограмм веса тела. Обычно, доза 1,0-5, и предпочтительно 1-10 миллиграмм на килограмм веса тела в день, которую вводят в раздельных дозах 1-6 раз в день или в форме замедленного высвобождения, является эффективной для достижения желаемых результатов.

В качестве не ограничивающего изобретение примера, лечение SARS обеспечивается введением анти-TNF пептидов, моноклональных химерных и/или рутинных антител согласно изобретению, доза которых составляет 1-100 мг/кг, например 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 мг/кг, при введении, по меньшей мере, в один из дней 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 или 40 или, альтернативно, по меньшей мере, в одну из недель 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20, или возможна любая их комбинация с использованием единых или раздельных доз каждые 24, 12, 8, 6, 4 или 2 часа, или любая их комбинация.

Поскольку концентрации TNF в кровотоке обычно чрезвычайно низкие, в пределах около 10 пг/мл у несептических субъектов, и достигают около 50 пг/мл у септических пациентов и около 100 пг/мл у пациентов с синдромом сепсиса (Hammerle, A. F. et al., 1989, ниже), или их можно только обнаружить на участках с TNF-опосредованной патологией, предпочтительно использование высокоаффинных и/или активных in vivo TNF-ингибирующих и/или нейтрализующих антител, их фрагментов или участков как для иммуноанализов TNF, так и для лечения TNF-опосредованной патологии. Такие антитела, фрагменты или участки предпочтительно должны обладать сродством к hTNF-α, экспрессироваться как Ka, с по меньшей мере, 10⁸ M^-1, более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁹ M^-1, например, 10⁸-10¹⁰ M^-1, 5×10⁸ M^-1, 8×10⁸ M^-1, 2×10⁹ M^-1, 4×10⁹ M^-1, 6×10⁹ M^-1, 8×10⁹ M^-1, или возможен любой интервал или значение в пределах указанных.

Для терапии, когда пациентом является человек, предпочтительно использование высокоаффинных мышиных и химерных антител и фрагментов, участков и производных согласно изобретению, обладающих сильной TNF-α-ингибирующей и/или нейтрализующей активностью in vivo, которые блокируют TNF-индуцируемую секрецию IL-6. Также для терапии, когда пациентом является человек, предпочтительно использование таких высокоаффинных мышиных и химерных анти-TNF-α-антител и их фрагментов, участков и производных, которые блокируют TNF-индуцируемую прокоагулирующую активность, включая блокирование TNF-индуцируемой экспрессии молекул клеточной адгезии, таких как ELAM-I и ICAM-I, и блокирование митогенной активности TNF in vivo, in situ и in vitro.

Композиции согласно изобретению предпочтительно включают фармацевтически приемлемый носитель. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и/или разбавители включают любые традиционные растворители, диспергирующие среды, наполнители, твердые носители, водные растворы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты, придающие изотоничность и задерживающие абсорбцию, и т.п. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, например, один или несколько из следующих веществ: вода, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, декстроза, глицерин, этанол и т.п., а также их сочетания. Фармацевтически приемлемые носители могут также включать минорные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, консерванты или буферы, которые обеспечивают более длительный срок хранения или большую эффективность композиции. Получение и использование фармацевтически приемлемых носителей хорошо известно из уровня техники. Настоящим изобретением предусматриваются использование в композициях согласно изобретению любых традиционных сред или веществ, если они совместимы с активным ингредиентом.

Композиции согласно изобретению можно вводить любым удобным путем, включая парентеральный, например, путем инъекции, либо подкожной, либо внутримышечной, а также пероральный или интраназальный пути введения. Способы для внутримышечной инъекции описаны Wolff et al. и Sedegah et al. Для других путей введения используют пероральные препараты, легочные препараты, суппозитории и препараты для чрескожного введения, например, без ограничения. Пероральные препараты, например, включают такие обычно используемые эксципиенты, как, например, фармацевтической чистоты маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, натрий сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.д., без ограничения.

Лекарственные формы (композиции), подходящие для внутреннего введения, обычно содержат от около 0,1 мг до около 500 мг активного ингредиента на единицу лекарственной формы. В таких фармацевтических композициях активный ингредиент обычно присутствует в количестве примерно 0,5-95 мас.% в расчете на общую массу композиции.

Для парентерального введения ант-TNF пептиды или антитела могут быть сформулированы в композицию раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка вместе с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем. Примеры таких носителей включают воду, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин. Можно также использовать липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Носитель или лиофилизированный порошок могут содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Композиции стерилизуют обычными методами.

Подходящие фармацевтические носители описаны в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, A.Osol, который является стандартным справочником в данной области. Композиции и способы согласно изобретению можно использовать в сочетании с другими видами лечения, такими как поддерживающая терапия, например, в соответствии с вариантом воплощения согласно изобретению.

В соответствии с вариантом воплощения согласно изобретению композицию согласно изобретению можно вводить пациенту вместе с внутривенными (IV) жидкостями. Например, композиции согласно изобретению могут содержаться внутри мешка, содержащего внутривенный (IV) препарат, или их можно инжектировать в систему для внутривенного (IV) вливания.

В соответствии с другим вариантом воплощения согласно изобретению композиции согласно изобретению можно вводить пациенту вместе с кислородом или другим таким лечением. Композиции согласно изобретению, например, можно вводить через распылитель.

Например, парентеральную композицию, подходящую для введения путем инъекции, получают растворением 1,5 мас.% активного ингредиента в 0,9% растворе хлорида натрия.

Для терапевтического введения ингибиторов TNF можно использовать любой эффективный путь введения. В случае инъекции ингибиторы можно вводить, например, внутрисуставным, внутривенным, внутримышечным, внутрь участка поражения, внутрибрюшинным или подкожным путем посредством болюсной инъекции или непрерывного вливания. Другие подходящие средства введения включают замедленное высвобождение из имплантатов, аэрозольную ингаляцию, глазные капли, пероральные препараты, включая пилюли, сиропы, таблетки и жевательные резинки, и препараты для местного нанесения, такие как лосьоны, гели, спреи, мази и другие подходящие средства. Альтернативно, белковоподобные ингибиторы TNF, такие как растворимый TNFR, можно вводить путем имплантации культивированных клеток, которые экспрессируют этот белок. Когда ингибитор вводят в сочетании с одним или несколькими другими биологически активными соединениями, их можно вводить одинаковым или разными путями, и можно вводить одновременно, отдельно или последовательно.

TNFR:Fc или другие TNFR, или другие ингибиторы TNF предпочтительно вводят в форме физиологически приемлемой композиции, включающей очищенный рекомбинантный белок в сочетании с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или разбавителями. Такие носители должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях. Обычно получение таких композиций включает объединение антагониста TNF-α с буферами, антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, низкомолекулярными полипептидами (такими как полипептиды, содержащие менее 10 аминокислот), белками, аминокислотами, углеводами, такими как глюкоза, сахароза или декстрины, хелатирующими агентами, такими как EDTA, глутатион, и другими стабилизаторами и эксципиентами. Примером подходящего разбавителя может служить нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный со специфическим сывороточным альбумином. Согласно соответствующим стандартам, принятым в данной области, можно также использовать консерванты, такие как бензиловый спирт. TNFR:Fc предпочтительно формулируют в композицию в виде лиофилизата, используя подходящие растворы эксципиентов (например, сахарозы) в качестве разбавителей. Подходящие компоненты должны быть нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях. Другие примеры компонентов, которые можно использовать в фармацевтических композициях, представлены в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1980.

Подходящие дозы можно определить с использованием стандартных испытаний, и они могут варьировать в зависимости от избранного пути введения. Вводимое количество и частота введения зависят от таких факторов, как характер и тяжесть показаний, подлежащих лечению, желаемый ответ и возраст и состояние пациента и т.п.

В одном варианте воплощения согласно изобретению TNFR:Fc вводят раз в неделю для лечения медицинского расстройства, описанного в настоящей заявке, в другом варианте воплощения согласно изобретению его вводят, по меньшей мере, два раза в неделю, еще в одном варианте воплощения согласно изобретению его вводят, по меньшей мере, три раза в неделю. Взрослым пациентом считается субъект возраста 18 лет или старше. При введении путем инъекции эффективное количество TNFR:Fc в расчете на дозу для взрослого составляет 1-20 мг/м² и предпочтительно около 5-12 мг/м². Альтернативно, можно вводить просто дозу, количество которой составляет 5-100 мг/доза. Примеры такой дозы, которую вводят путем подкожной инъекции, включают 5-25 мг/доза, 25-50 мг/доза и 50-100 мг/доза. В одном варианте воплощения согласно изобретению различные показания, описанные ниже, лечат путем введения препарата, приемлемого для инъекций, содержащего TNFR:Fc в количестве 25 мг/доза, или альтернативно, содержащего 50 мг/доза. Дозы 25 мг или 50 мг можно вводить повторно. Когда используют путь введения, отличный от инъекции, дозу подходяще корректируют в соответствии со стандартной медицинской практикой. Во многих случаях улучшение состояния пациента достигается путем введения инъекцией дозы 25 мг TNFR:Fc один-три раза в неделю в течение, по меньшей мере, трех недель, или дозы 50 мг TNFR:Fc один или два раза в неделю в течение, по меньшей мере, трех недель, хотя для достижения желаемой степени улучшения могут потребоваться более длительные периоды лечения.

Для педиатрических пациентов (возраст 4-17 лет) можно использовать любую подходящую схему. Предпочтительно схема включает введение путем подкожной инъекции 0,4 мг/кг, вплоть до максимальной дозы 25 мг TNFR:Fc один или несколько раз в неделю.

Настоящее изобретение также включает введение растворимого TNFR, такого как TNFR:Fc, совместно с одним или несколькими другими лекарственными средствами, которые вводят этому же пациенту в сочетании с растворимым TNFR, при этом каждое лекарственное средство вводят в соответствии со схемой введения этого лекарственного средства. “Совместное введение” охватывает одновременное или последовательное лечение компонентами комбинации, а также схемы, когда лекарственные средства чередуют или когда один компонент вводят непрерывным путем, а другой (другие) вводят с промежутками. Компоненты можно вводить в одной и той же или в разных композициях и одним и тем же или разными путями введения. Примеры совместно используемых лекарственных средств включают, но не ограничиваются этим, противовирусные средства, антибиотики, аналгетики, кортикостероиды, антагонисты воспалительных цитокинов, DMARDs и нестероидные противовоспалительные лекарственные средства. DMARDs можно вводить в сочетании с ингибиторами TNF-α согласно изобретению, такими как TNFR:Fc, включая азатиоприн, циклофосфамид, циклоспорин, гидроксихлорокин сульфат, метотрексат, лефлуномид, миноциклин, пенициламин, сульфазалазин и соединения золота, такие как пероральное золото, золото-натрий тиомалат и ауротиоглюкоза. Кроме того, TNFR:Fc можно объединять со вторым антагонистом TNF-α, включая антитело против TNF-α или TNFR, полученный из TNF-α пептид, который действует как конкурирующий ингибитор TNF-α (например, описанный в патенте США № 5795859 или патенте США № 6107273), гибридный белок TNFR-IgG, отличный от этанерсепта, такой как белок, содержащий внеклеточную часть рецептора TNF-α р55, растворимый TNFR, отличный от слитого с IgG белка, или другие молекулы, которые снижают уровень эндогенного TNF-α, такие как ингибиторы TNF-α превращающего фермента (см., например, патент США № 5594106), или любые малые молекулы или ингибиторы TNF-α, описанные выше, включая пентоксифилин или талидомид.

Если в качестве ингибитора TNF-α используют антитело против TNF-α, предпочтительная доза составляет 0,1-20 мг/кг, и более предпочтительно 1-10 мг/кг. Другой предпочтительный интервал для дозы анти-TNF-TNF-α- антитела составляет 0,75-7,5 мг/кг массы тела. Гуманизированные антитела являются предпочтительными, т.е. антитела, в которых только антиген-связывающая часть молекулы получена из нечеловеческого источника. Примером гуманизированного антитела для лечения описанных заболеваний является инфликсимаб (поставляемый на рынок фирмой Centocor под названием РЕМИКАД (Centocor Inc.), который является химерным IgG1.каппа моноклональным антителом с молекулярной массой примерно 149100 дальтон. Инфликсимаб состоит из человеческой константной и мышиной вариабельной областей и специфически связывается с человеческим TNF-α. Другие подходящие анти-TNF-α антитела включают гуманизированные антитела D2E7 и CDP571, а также антитела, описанные в ЕР 0 516 785 В1, патенте США № 5656272, ЕР 0 492 448 А1. Такие антитела можно вводить инъекцией или внутривенно.

В одном варианте воплощения согласно изобретению различные медицинские состояния, описанные в настоящей заявке, которые можно лечить ингибиторами TNF-α, лечат в сочетании с другим цитокином или ингибитором цитокинов. Например, растворимый TNFR, такой как TNFR:Fc, можно вводить в композиции, которая также содержит соединение, ингибирующее взаимодействие других воспалительных цитокинов с их рецепторами. Примеры ингибиторов цитокинов, используемых в сочетании с TNFR:Fc, включают, например, антагонисты TGF-β, II-6 или II-8. Ингибиторы TNF-α, такие как TNFR:Fc, также можно вводить в сочетании с цитокинами GM-CSF, IL2 и ингибиторами протеинкиназы А типа 1 для усиления Т-клеточной пролиферации у ВИЧ-инфицированных пациентов, принимающих антиретровирусную терапию. Кроме того, ингибиторы TNF-α можно сочетать с ингибиторами IL-13 для лечения болезни Ходжкина.

Другие комбинации для лечения описанных в настоящей заявке заболеваний включают TNFR:Fc, вводимый совместно с соединениями, являющимися противовирусными средствами.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способы лечения человека, нуждающегося в таком лечении, при этом такой способ включает введение пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора TNF-α и ингибитора IL-6.

Настоящее изобретение также относится к использованию раскрываемых в настоящей заявке ингибиторов TNF-α, таких как TNFR:Fc, для получения лекарственного средства для профилактики или терапевтического лечения SARS.

Настоящее изобретение также обеспечивает анти-TNF соединения и композиции, включающие анти-TNF антитела (Abs) и/или анти-TNF пептиды, ингибирующие и/или нейтрализующие биологическую активность TNF in vitro, in situ или in vivo, как специфические в отношении связывания с нейтрализующими эпитопами человеческого фактора некроза опухоли-α (hTNF-α) и/или человеческого фактора некроза опухоли-β (hTNF,β). Такие анти-TNF Abs или пептиды нашли применение в лечении SARS.

Анти-TNF соединения и композиции согласно изобретению можно адаптировать как терапевтически эффективные, в силу их способности опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) и/или комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), против клеток, имеющих связанный на их поверхности TNF. Для такой активности можно использовать либо эндогенный источник, либо экзогенный источник эффекторных клеток (для ADCC) или компоненты комплемента (для CDC). Мышиные и химерные антитела, фрагменты и участки согласно изобретению их фрагменты и производные можно использовать в терапевтических целях как иммуноконъюгаты (см. обзор: Dillman, R.O., Ann. Int. Med. 111:592-603 (1989)). Пептиды или Abs можно объединять с цитотоксическими белками, включая, но не ограничиваясь этим, рицин-А, токсин Pseudomonas и токсин Diphtheria. Токсины, конъюгированные с антителами или другими лигандами или пептидами, хорошо известны из уровня техники (см., например, Olsnes, S. et al., Immunol. Today 10:291-295 (1989)). Растительные и бактериальные токсины типично убивают клетки путем разрушения механизма синтеза белка.

Анти-TNF соединения и композиции согласно изобретению можно конъюгировать с другими типами терапевтических фрагментов, включая, но не ограничиваясь этим, радионуклиды, терапевтические средства, цитотоксичные вещества и лекарственные средства. Примеры радионуклидов, которые можно сочетать с антителами и доставлять in vivo на участки антигена, включают ²¹²Bi, ¹³²I, ¹⁸⁶Re и ⁹⁰Y, но этот перечень не является ограничивающим. Радионуклиды проявляют свое цитотоксическое действие путем локального облучения клеток, что приводит к различным внутриклеточным поражениям, как это известно в области радиотерапии.

Цитотоксические лекарственные средства, которые можно конъюгировать с анти-TNF пептидами и/или антителами и затем использовать для in vivo терапии, включают, но не ограничиваются этим, даунорубицин, доксорубицин, метотрексат, Митомицин С. Цитотоксические лекарственные средства вмешиваются в критические клеточные процессы, включая синтез ДНК, РНК и белка. Описание таких классов лекарственных средств, которые хорошо известны из уровня техники, и механизм их действия см. в Goodman, et al., Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 8^th Ed., Macmillan Publishing Co., 1990.

Анти-TNF соединения и композиции, такие как пептиды и/или антитела согласно изобретению, можно выгодно использовать в сочетании с другими моноклональными или рутинными mad химерными антителами, фрагментами и участками, или с лимфокинами или гемопоэтическими факторами роста, служащими для повышения количества или активности эффекторных клеток, взаимодействующих с антителами.

Анти-TNF соединения и композиции, такие как пептиды и/или антитела, фрагменты или производные согласно изобретению, можно также использовать в сочетании с TNF терапией для блокирования нежелательных побочных эффектов TNF. Новые подходы к лечению рака включают непосредственное введение TNF пациентам, страдающим раком, или иммунотерапию, применяемую к пациентам, страдающим раком, при помощи лимфокин-активируемых киллерных (LAK) клеток (Rosenberg et al., New Eng.J.Med. 313:1485-1492 (1985)) или опухоль-инфильтрующих лимфоцитов (TIL) (Kurnic et al. (Clin.Immunol Immunopath. 38:367-380 (1986); Kradin et al., Cancer Immunol. Immunother. 24:76-85 (1987); Kradin et al., Transplant. Proc. 20:336-338 (1988)). В настоящее время проходят испытания использования модифицированных LAK клеток или TIL, которые были трансфицированы геном TNF для продуцирования больших количеств TNF. Такие терапевтические подходы, вероятно, ассоциированы с различными нежелательными побочными эффектами, которые вызываются плейотропным действием TNF, как описано в настоящей заявке и известно в соответствующих областях техники. В соответствии с настоящим изобретением такие побочные эффекты можно снизить при одновременном лечении пациента, которому вводят TNF или клетки, продуцирующие большие количества TIL, антителами, их фрагментами или производными согласно изобретению. Эффективные дозы описаны выше. Уровень доз требует корректировки в соответствии с дозой вводимых TNF или TNF-продуцирующих клеток, чтобы блокировать побочные эффекты, не блокируя основной противоопухолевый эффект TNF. Специалисту в данной области известно, как определить такие дозы без ненужного экспериментирования.

Способы скрининга

Настоящее изобретение предусматривает способы скрининга для идентификации ингибитора SARS-ассоциированного воспалительного цитокина. В соответствии с вариантом воплощения согласно изобретению способ скрининга включает в себя введение средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с SARS, в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля; мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина. Предпочтительно средство-кандидат, являющееся ингибитором SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, представляет собой растворимый рекомбинантный рецептор SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, антитело к SARS-ассоциированному воспалительному цитокину, малую молекулу, влияющую на активность SARS-ассоциированного воспалительного цитокина, SARS-ассоциированный антисмысловой олигонуклеотид или их сочетание. Специалист в данной области легко сможет рутинным образом идентифицировать такое соединение, как указано выше, на основании представленных в настоящей заявке указаний.

В соответствии с другим вариантом воплощения согласно изобретению способ скрининга для идентификации композиции, эффективной для лечения SARS пациентов, включает в себя введение средства-кандидата на ингибитор TNF группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с SARS, в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля; мониторинг эффективности средства-кандидата на ингибитор TNF. Предпочтительно средство-кандидат, являющееся ингибитором TNF, представляет собой растворимый рекомбинантный рецептор TNF, антитело к TNF, малую молекулу, влияющую на активность TNF, антисмысловой олигонуклеотид TNF или их сочетание. Специалист в данной области легко сможет рутинным образом идентифицировать такой ингибитор TNF, как указано выше, на основании представленных в настоящей заявке указаний.

В соответствии с другим вариантом воплощения согласно изобретению способ скрининга для идентификации композиции, эффективной для лечения SARS пациентов, включает в себя введение средства-кандидата, являющегося противовирусным соединением, группе пациентов, инфицированных возбудителем инфекции, ассоциированным с SARS, в рандомизированном исследовании с использованием плацебо в качестве контроля; мониторинг эффективности средства-кандидата, являющегося противовирусным соединением. Предпочтительно средство-кандидат, являющееся противовирусным соединением, представляет собой средство-кандидат, являющееся антикононавирусным соединением. Средство-кандидат, являющееся антикононавирусным соединением, предпочтительно представляет собой антитело (например, моноклональное, поликлональное, химерное и т.д.) против вируса, ингибитор вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор кодируемой вирусом протеазы, которая воздействует на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, такой как воздействующий на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности (например, ингибитор связывания hAPN с HcoV-229E), ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в гликопротеине вирусного пика, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетание. Более предпочтительно средство-кандидат, являющееся противовирусным соединением, представляет собой моноклональное антитело против SARS-ассоциированного вируса, например SARS-CoV. Специалист в данной области легко сможет рутинным образом идентифицировать такое противовирусное соединение, эффективное для лечения SARS, как указано выше, на основании представленных в настоящей заявке указаний.

Описание конкретных вариантов воплощения изобретения настолько полно раскрывает общую суть изобретения, что другие смогут, применив специальные знания, относящиеся к данной области (включая содержание ссылочных документов, указанных в данной заявке), легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты воплощения, без излишнего экспериментирования, без отступления от общей концепции согласно изобретению. Поэтому такие адаптации и модификации подразумеваются как эквиваленты раскрываемых в настоящей заявке вариантов воплощения изобретения, основанные на указаниях и раскрытиях, представленных в настоящей заявке. Следует понимать, что фразеология или терминология используются в настоящей заявке только в целях описания, а не ограничения, таким образом, терминология или фразеология, используемая в настоящем описании, должна рассматриваться специалистами в свете раскрытий и указаний, представленных в заявке, в сочетании с знаниями квалифицированного специалиста среднего уровня.

Для специалиста в данной области должны быть очевидны, или он может убедиться в этом при помощи не более чем рутинного экспериментирования, многие эквиваленты конкретных вариантов воплощения изобретения, описанного в настоящей заявке, основанные на представленных в заявке указаниях. Следующие далее примеры включены в заявку для иллюстрации предпочтительных вариантов воплощения изобретения. Специалистам в данной области должно быть понятно, что приемы и способы, раскрываемые в представленных ниже примерах, представляют собой приемы и способы, которые, как было обнаружено авторами согласно изобретению, хорошо работают при практическом воплощении изобретения, и таким образом, должны рассматриваться как составляющие предпочтительные способы реализации изобретения. Однако специалистам в данной области, в свете настоящего раскрытия, должно быть понятно, что возможно различные изменения конкретных вариантов воплощения изобретения, которые описаны, с достижением при этом такого же или подобного результата, без отступления от сути и объема согласно изобретению. Представленные ниже примеры приведены для иллюстрации изобретения, а не для его ограничения.

Примеры

Пример I: In vivo эффективность растворимых рекомбинантных TNFR при лечении SARS

Растворимый рекомбинантный TNFR испытывали в рандомизированном испытании, включающем группу контроля. У пятидесяти взрослых пациентов (т.е. возраста восемнадцати лет и старше) было лабораторно подтверждено заражение SARS-CoV, и им вводили одну дозу либо 1, 5, 12, либо 20 мг/м² TNFR:Fc. Другие шестьдесят пациентов должны были принимать 100 миллиграмм TNFR:Fc с последующим приемом либо плацебо, либо 1, 5, 12 или 20 мг TNFR:Fc. TNFR:Fc вводили в виде одной инъекции. Клиническую оценку, жизненные показатели и лабораторные параметры определяли до, во время и периодически в течение 28 дней после инфузии.

Клинический мониторинг

За пациентами наблюдали в течение 24 часов после инфузии для выявления гемодинамических изменений, лихорадки или других неблагоприятных эффектов. Исследования клинического ответа включали следующее.

Жизненные показатели регистрировали каждые 15-30 минут во время инфузии и с интервалами после инфузии. Полное физическое обследование проводили при скрининге и завершении курса лечения. Кроме того, за пациентами наблюдали при помощи стандартных лабораторных тестов, включая тесты на полную картину крови, С3 и С4 компоненты комплемента, IgG, IgM и IgA, сывороточные электролиты, креатинин, мочевину, щелочную фосфатазу, аспарагинтрасаминазу и общий билирубин. Также в каждый момент оценки делали анализ мочи и культуры для определения уровня TNF и/или присутствующего SARS-CoV.

Оценка ответа

Пациентов оценивали на ответ на лечение по состоянию на неделю 1, 2, 3, 4, 6 и 8 испытания. Оценки делались в период между 07.00 и 13 часами одним и тем же наблюдателем. Клинические оценки включают следующие параметры: температуру, ощущение субъектом респираторного дистресса, объективный анализ респираторного состояния (т.е. оценка легких), частота кашля в течение определенного периода времени, радиологическое обследование и исследование сыворотки. Кроме того, общую оценку ответа пациентов определяли по 5-бальной шкале (ухудшение, отсутствие ответа, удовлетворительный ответ, хороший ответ, отличный ответ). Позитивы сыворотки, полученные методом иммунофлуоресценции, скринировали на антитела.

Анализ цитокинов

Биоактивный TNF определяли в сыворотке, используя анализ цитотоксичности WEHI 164 clone 13 (Espevik et al., J. Imm. Methods 95:99-105 (1986). Общий IL-6 измеряли в сыворотке, используя коммерческий иммуноанализ (Medgenix Diagnostics, SA, Belgium) и сэндвичевым методом ELISA, используя моноклональные антитела. Микротитровальные планшеты покрывали моноклональным антителом LNI 314-14 при концентрации 3 мкг/мл на 18 часов при 4°С и блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином в 0,1М забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,2. Неразбавленную сыворотку, или стандарты (рекомбинантный hIL-6, 0-8,1 мкг/мл), добавляли в лунки в двух повторах и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. Связанный IL-6 определяли путем инкубации с моноклональным антителом LNI 110-14 после 90 минут при 37°С, а затем с меченным биотином козлиным анти-мышиным IgG2b в течение 90 минут при 37°С. Southern Biotechnology, Birmingham, Ala. Затем анализ продолжали, используя стрептавидин-щелочную фосфатазу (Southern Biotechnology) и п-нитрофенилфосфат в качестве субстрата, и оптическую плотность определяли при 405 нм.

Активность заболевания

Картину ответа для каждой из клинических оценок активности заболевания оценивали в соответствии с типичной клинической оценкой для SARS. Клинические оценки демонстрируют улучшение после лечения. Респираторный дистресс снизился от среднего через 2 дня после проникновения вируса к недели 6. Аналогичным образом, температура и другие симптомы, подобные гриппу, улучшились в течение периода 24 часа-3 недели.

Данные ответа анализировали для каждого отдельного пациента. Хотя это исследование было, прежде всего, разработано для оценки кратковременных эффектов TNF-ингибирующего лечения, мониторинг клинических и лабораторных данных стал возможным для пациентов в течение достаточно длительного периода времени. Продолжительность ответа у этих пациентов определяли как время, в течение которого наблюдали 20% (или больше) среднего улучшения в выбранных измерениях активности. Клинические и лабораторные данные, полученные у пациентов, которых лечили при помощи инфузии TNFR:Fc (каждая 10 мг/кг), сравнивали с данными, полученными от пациентов, которым вводили 4 инфузии (каждая 5 мг/кг), и использовали для иллюстрации разницы скорости и продолжительности ответа. У пациентов, которым вводили соответствующую дозу ингибитора TNF, наблюдали, по меньшей мере, примерно 20%-ное снижение респираторного дистресс-синдрома взрослых (ARDS), включая каждый из таких параметров, как хроническая легочная функция, диффузионная способность и эластичность легкого, при адекватной переносимости пациентом. Также наблюдали примерно 20% снижение смертности.

Иммунологические исследования и цитокины

Сыворотку пациентов также анализировали на присутствие биоактивного TNF, используя анализ цитотоксичности WEHI 164 clone 13 (Espevik et al., J. Imm. Methods 95:99-105 (1986). Кроме того, поскольку, как считается, продукция CRP и SAA большей частью регулируется IL-6, уровни в сыворотке этого цитокина определяли, используя 2 разных анализа: анализ Medgenix и ELISA, в котором измеряли общий IL-6.

Пример II - In vivo эффективность низкомолекулярного ингибитора для лечения SARS

В испытании, включающем группу контроля, получавшую плацебо, пациентам с SARS (у которых было лабораторно подтверждено заражение SARS-CoV) вводили следующие средства. Пятьдесят пациентов с SARS-CoV получали одну дозу либо 100, 200, 300, либо 400 миллиграмм талидомида. Другие шестьдесят пациентов принимали 100 миллиграмм талидомида с последующим приемом либо плацебо, либо 100, 200, 300 или 400 миллиграмм талидомида на килограмм веса тела. Талидомид вводили перорально. Клиническую оценку, жизненные показатели и лабораторные параметры определяли до, во время и периодически в течение 28 дней после инфузии.

Клинический мониторинг

За пациентами наблюдали в течение 24 часов после инфузии для выявления гемодинамических изменений, лихорадки или других неблагоприятных эффектов. Исследования клинического ответа включали следующее. Жизненные показатели регистрировали каждые 15-30 минут во время введения и с интервалами после введения. Полное физическое обследование проводили при скрининге и завершении курса лечения. Кроме того, за пациентами наблюдали при помощи стандартных лабораторных тестов, включая тесты на полную картину крови, С3 и С4 компоненты комплемента, IgG, IgM и IgA, сывороточные электролиты, креатинин, мочевину, щелочную фосфатазу, аспарагинтрасаминазу и общий билирубин. Также в каждый момент оценки делали анализ мочи и культуры для определения уровня TNF и/или присутствующего коронавируса.

Оценка ответа

Пациентов оценивали на ответ на лечение в недели 1, 2, 3, 4, 6 и 8 испытания. Оценки делались в период между 07.00 и 13 часами одним и тем же наблюдателем. Клинические оценки включают следующие параметры: температуру, ощущение субъектом респираторного дистресса, объективный анализ респираторного состояния (т.е. оценка легких), частота кашля в течение определенного периода времени, радиологическое обследование и исследование сыворотки. Кроме того, общую оценку ответа пациентов определяли по 5-балльной шкале (ухудшение, отсутствие ответа, удовлетворительный ответ, хороший ответ, отличный ответ). Позитивы сыворотки, полученные методом иммунофлуоресценции, скринировали на антитела.

Анализ цитокинов

Биоактивный TNF определяли в сыворотке, используя анализ цитотоксичности WEHI 164 clone 13 (Espevik et al., J. Imm. Methods 95:99-105 (1986)). Общий IL-6 измеряли в сыворотке, используя коммерческий иммуноанализ (Medgenix Diagnostics, SA, Belgium), и сэндвичевым методом ELISA, используя моноклональные антитела. Микротитровальные планшеты покрывали моноклональным антителом LNI 314-14 при концентрации 3 мкг/мл на 18 часов при 4°С и блокировали 3% бычьим сывороточным альбумином в 0,1М забуференном фосфатом физиологическом растворе, рН 7,2. Неразбавленную сыворотку, или стандарты (рекомбинантный hIL-6, 0-8,1 мкг/мл), добавляли в лунки в двух повторах и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. Связанный IL-6 определяли путем инкубации с моноклональным антителом LNI 110-14 после 90 минут при 37°С, а затем с меченным биотином козлиным анти-мышиным IgG2b в течение 90 минут при 37°С. Southern Biotechnology, Birmingham, Ala). Затем анализ продолжали, используя стрептавидин-щелочную фосфатазу (Southern Biotechnology) и п-нитрофенилфосфат в качестве субстрата, и оптическую плотность определяли при 405 нм.

Активность заболевания

Картину ответа для каждой из клинических оценок активности заболевания оценивали в соответствии с типичной клинической оценкой для SARS. Клинические оценки демонстрируют улучшение после лечения талидомидом. Респираторный дистресс снижался от среднего через 2 дня после проникновения вируса до недели 6. Аналогичным образом, температура и другие симптомы, подобные гриппу, улучшались в течение периода 24 часа-3 недели.

Данные ответа анализировали для каждого отдельного пациента. Хотя это исследование было, прежде всего, разработано для оценки кратковременных эффектов TNF-ингибирующего лечения, мониторинг клинических и лабораторных данных стал возможным для пациентов в течение достаточно длительного периода времени. Продолжительность ответа у этих пациентов определяли как продолжительность 20%-ного (или больше) среднего улучшения в выбранных измерениях активности. Клинические и лабораторные данные, полученные у пациентов, которых лечили при помощи инфузии талидомида (каждая 10 мг/кг), сравнивали с данными, полученными от пациентов, которым вводили 4 инфузии (каждая 5 мг/кг), и использовали для иллюстрации разницы скорости и продолжительности ответа. У пациентов, которым вводили подходящую дозу ингибитора TNF, наблюдали, по меньшей мере, примерно 20%-ное снижение респираторного дистресс-синдрома взрослых (ARDS), включая каждый из таких параметров, как хроническая легочная функция, диффузионная способность и эластичность легкого, при адекватной переносимости пациентом. Также наблюдали примерно 20% снижение смертности.

Иммунологические исследования и цитокины

Сыворотку пациентов также анализировали на присутствие биоактивного TNF, используя анализ цитотоксичности WEHI 164 clone 13 (Espevik et al., J. Imm. Methods 95:99-105 (1986)). Кроме того, поскольку, как считается, продукция CRP и SAA в большой степени регулируется IL-6, уровни в сыворотке этого цитокина определяли, используя 2 разных анализа: анализ Medgenix и ELISA, в котором измеряли общий IL-6.

Имея полное описание согласно изобретению, специалисту в данной области должно быть очевидно, что возможны его различные изменения и модификации, без отступления от сути и объема изобретения, как оно описано в данной заявке. Выше описаны предпочтительные варианты воплощения согласно изобретению вместе с некоторыми возможными альтернативами. Однако эти варианты воплощения представлены только в качестве примера согласно изобретению и не являются его ограничением.

Изобретение относится к области медицины и касается композиций и способов для лечения острого респираторного синдрома (SARS). Сущность изобретения включает фармацевтическую композицию для лечения тяжелого острого респираторного синдрома SARS, включающую в себя терапевтически эффективное количество рекомбинатного рецептора TNF-α или талидомида в фармацевтически пригодном носителе. Представлен также способ лечения SARS с применением этой композиции, а также способ получения композиции. Преимущество изобретения заключается в разработке средства для лечения SARS. 6 н. и 37 з.п. ф-лы.

1. Фармацевтическая композиция для лечения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), включающая в себя терапевтически эффективное количество растворимого рекомбинантного рецептора TNF-α или талидомида в фармацевтически приемлемом носителе.

2. Композиция по п.1, где указанный растворимый рекомбинантный рецептор TNF-α является слитым с иммуноглобулином (TNFR-Ig).

3. Композиция по п.1, дополнительно включающее антитело к TNF-α.

4. Композиция по п.3, где антитело является моноклональным антителом.

5. Композиция по п.3, где антитело является поликлональным антителом.

6. Композиция по п.3, где антитело является химерным антителом.

7. Композиция по п.3, где антитело является гуманизированным антителом.

8. Композиция по п.7, где антитело представляет собой адалимумаб (HUMIRA).

9. Композиция по п.1, где талидомид воздействует на активность фактора некроза опухоли (TNF), препятствуя связыванию TNF-α с TNFR.

10. Композиция по п.1, дополнительно включающая в себя противовирусное соединение в фармацевтически приемлемом носителе.

11. Композиция по п.10, где противовирусное соединение представляет собой анти-коронавирусное соединение.

12. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение представляет собой ингибитор вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор кодируемой вирусом протеазы, воздействующей на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности, ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в шипе вирусного гликопротеина, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетания.

13. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение является ингибитором вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы.

14. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение является ингибитором кодируемой вирусом протеазы, которая воздействует на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы.

15. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение является ингибитором прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток.

16. Композиция по п.15, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы.

17. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение действует как ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности.

18. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение ингибирует связывание hAPN с HCoV-229E.

19. Композиция по п.11, где анти-коронавирусное соединение действует как ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в шипе вирусного гликопротеина, которые ассоциированы с проникновением вируса.

20. Композиция по п.1, где указанная композиция содержит форму замедленного высвобождения указанного растворимого рекомбинантного рецептора TNF-α.

21. Композиция по п.2, где указанный TNFR-Ig представляет собой TNFR-Fc.

22. Композиция по п.19, где указанный TNFR-Fc представляет собой этанерсепт.

23. Композиция для лечения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), включающая в себя
первое вещество, содержащее растворимый рекомбинантный рецептор TNF-α или талидомид, и
второе вещество, выбранное из группы, состоящей из ингибитора вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитора кодируемой вирусом протеазы, воздействующей на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитора прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитора связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности, ингибитора индуцированных рецептором конформационных изменений в шипе вирусного гликопротеина, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетаний.

24. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства, эффективного для применения при лечении тяжелого острого респираторного синдрома (SARS).

25. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства, эффективного для применения при лечении инфекции SARS-ассоциированного коронавируса (SARS-CoV).

26. Способ лечения пациента, страдающего тяжелым острым респираторным синдромом (SARS), включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.1.

27. Способ получения композиции для лечения тяжелого острого респираторного синдрома (SARS), включающий в себя смешивание терапевтически эффективного количества растворимого рекомбинантного рецептора TNF-α или талидомида с фармацевтически приемлемым наполнителем.

28. Способ по п.27, дополнительно включающий добавление противовирусного соединения.

29. Способ по п.28, где указанное противовирусное соединение представляет собой анти-коронавирусное соединение.

30. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение представляет собой ингибитор вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор кодируемой вирусом протеазы, воздействующей на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы, ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности, ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в шипе вирусного гликопротеина, которые ассоциированы с проникновением вируса, и их сочетания.

31. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение является ингибитором вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы.

32. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение является ингибитором кодируемой вирусом протеазы, которая воздействует на процессинг вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы.

33. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение является ингибитором прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток.

34. Способ по п.33, где ингибитор прорастания или высвобождения коронавируса из инфицированных клеток воздействует на активность гемагглютинин-эстеразы.

35. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение действует как ингибитор связывания вируса со специфическим рецептором клеточной поверхности.

36. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение ингибирует связывание hAPN с HCoV-229E.

37. Способ по п.29, где анти-коронавирусное соединение действует как ингибитор индуцированных рецептором конформационных изменений в шипе вирусного гликопротеина, которые ассоциированы с проникновением вируса.

38. Способ по п.27, дополнительно включающий введение анти-TNF-α антитела.

39. Способ по п.38, где антитело является моноклональным антителом.

40. Способ по п.38, где антитело является поликлональным антителом.

41. Способ по п.38, где антитело является химерным антителом.

42. Способ по п.38, где антитело является гуманизированным антителом.

43. Способ по п.38, где антитело представляет собой адалимумаб (HUMIRA).