ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ С МУТИРОВАННЫМИ КОСТИМУЛЯТОРНЫМИ ДОМЕНАМИ CD28 Российский патент 2023 года по МПК C07K14/705 C07K16/28 C12N5/71 A61K39/00 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данной заявкой испрашивается приоритет относительно предварительной заявки на патент США №62/529919, поданной 7 июля 2017 года и полностью включенной в данный документ посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Эта заявка содержит перечень последовательностей, поданных в электронной форме как файл ASCII.txt, названный «320803_2160_Sequence_Listing_ST25», который создан 7 июля 2018 года. Содержание перечня последовательностей полностью включено в данный документ.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хирургия, лучевая терапия и химиотерапия являются общепринятыми стандартными подходами при лечении рака, включая лейкоз, солидные опухоли и метастатические поражения. Иммунотерапия (иногда называемая биотерапией, или терапией модификаторами биологического отклика), при которой задействована иммунная система организма, позволяет непосредственно или косвенно ограничить или излечить опухоль, в течение многих лет исследовалась как дополнение к традиционной терапии рака. Предполагается, что иммунная система человека представляет неиспользованный ресурс для терапии рака и что при надлежащем применении компонентов иммунной системы могут быть разработаны эффективные терапевтические агенты.

Достигнут значительный успех в противоопухолевой терапии Т-клетками с химерным антигенным рецептором (CAR), который является одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), который получен из антитела, сплавленного с сигнальными доменами Т-клеточного рецептора (TCR) (Davila, M.L., et al., Oncoimmunology, 2012. 1 (9): 1577-1583).

Внутриклеточный домен первого поколения CAR включает только CD3ζ, в то время как CAR второго поколения также включают костимуляторные домены, такие как CD28 или 41ВВ. Эти домены CAR второго поколения продемонстрировали высокую эффективность относительно цитотоксической активности у мышей, что стало основой для клинической оценки Т-клеточной терапии CAR у пациентов. Потенциал CAR таргетных CD19 Т-клеток был подтвержден отчетами о полной ремиссии у 90% пациентов с острым В-клеточным лимфобластным лейкозом (B-ALL) (Davila, M.L., et al., Sci Transl Med, 2014. 6(224):224ra25; Maude, S.L, et. al., N Engl J Med, 2014. 371(16):1507-17).

Однако слабая персистенция CAR Т-клетками и чрезмерная активация Т-клеток способствуют рецидивам и тяжелой токсичности, соответственно, существует критическая необходимость в понимании биологии CAR Т-клеток (Gangadhar, Т.С.and R.H. Vonderheide, Nat Rev Clin Oncol, 2014. 11(2):91-9). Кроме того, рецидивы и токсичность сообщали для всех поколений CAR, предполагается, что дополнение CAR костимуляторными доменами повысит эффективность, но в ущерб биологическим осложнениям.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как описано в данном документе, CAR Т-клетки с костимуляторным доменом CD28 участвуют в тонической передаче сигналов низкого уровня и в «истощении» фенотипа злокачественных клеток, а мутирование определенных субдоменов CD28, не устраняет активацию сигнальных путей CAR или продукцию цитокина. Поэтому, усовершенствование функции CAR-T-клеток второго поколения может быть достигнуто, модулированием костимуляции CD28.

В данном документе описаны полипептиды химерного антигенного рецептора (CAR), которые могут использоваться с адоптивным переносом клетки к мишеням для уничтожения опухолевых клеток. Описанные в данном документе CAR содержат кости мул яторный сигнальный домен, который включает мутированную форму цитоплазматического домена CD28, который усиливает функцию клетки с CAR-T. В некоторых вариантах воплощения изобретения мутированная форма снижает «истощение» клетки с CAR-T. Этот домен CD28 включает 3 внутриклеточных субдомена (YMNM идиотоп (ID) №:1 SEQ), PRRP (ID №:2 SEQ), и PYAP (ID №:3 SEQ), которые регулируют сигнальные пути после стимуляции TCR. В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные в данном документе CAR включают мутацию или делецию одного или более из этих субдоменов, которые усиливают функцию CAR-T клетки, например, снижая «истощение» CAR-Т-клетки. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептиды CAR дополнительно включают одну или более делеций или мутаций в CD3-zeta и/или 41ВВ, которые усиливают функцию CAR-T-клеток.

Как и другие CAR, описанные в данном документе полипептиды CAR содержат в эктодомене лигандсвязывающий участок, такой как агент, который может связывать опухолевые клетки, которые экспрессируют опухолеассоциированный антиген (ТАА). Описанные в данном документе полипептиды могут также содержать трансмембранный домен, который на эндодомене способен активировать эффектор иммунных клеток. Например, эндодомен может содержать внутриклеточный сигнальный домен и, необязательно, один или более костимуляторных участков передачи сигнала.

Лигандсвязывающий домен, например, анти-ТАА связывающий агент, является в некоторых вариантах воплощения изобретения фрагментом антитела, который специфически связывает ТАА. Например, антигенсвязывающий домен может быть представлен Fab или одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv) антитела, которое специфично связывает ТАА. Агент, связывающий анти-ТАА, является в некоторых вариантах воплощения изобретения аптомером, который специфически связывает ТАА. Например, анти-ТАА связывающий агент может быть аптомер пептидом, который отобран из случайного пула последовательностей, на основании его способности связывать ТАА. Агент, связывающий анти-ТАА, может также быть естественным лигандом ТАА, или вариантом и/или его фрагментом, который способен связываться с ТАА.

В некоторых вариантах воплощения изобретения внутриклеточным сигнальным доменом является CD3-zeta (CD3Q сигнальный домен. В некоторых случаях костимуляторный участок передачи сигнала содержит 1,2,3, или 4 цитоплазматических домена одной или более из внутриклеточных сигнальных молекул.

Также в данном документе описаны отдельные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие описываемые полипептиды CAR, векторы, включающие эти отдельные нуклеиновые кислоты, и клетки, содержащие эти векторы. Например, такая клетка может быть иммунной эффекторной клеткой, выбранной из группы, состоящей из альфа-бета Т-клеток, гамма-дельта Т-клеток, клеток естественных киллеров (NK), естественных киллеров Т-клеток (NKT), В-клеток, врожденных лимфоидных клеток (ILC), цитокин-индуцированных клеток киллеров (CIK), цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL), лимфокин-активизированных клеток киллеров (LAK) и регуляторных Т-клеток.

В некоторых вариантах воплощения изобретения эти клетки демонстрируют противоопухолевый иммунитет, когда антигенсвязывающий домен CAR связывается с ТАА на опухоли.

Также в данном документе описан способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у субъекта с формой рака, экспрессирующей ТАА, который задействует применение у этого субъекта эффективного количества клеток иммунного эффектора, с генетически модифицированным описываемым ТАА-специфическим CAR, включающим мутированный костимуляторный домен CD28. Детали одного или более вариантов воплощения изобретения сформулированы в сопровождающих рисунках и в описании, представленном ниже. Другие особенности, объекты, и преимущества изобретения будут очевидны из описания и фигур, и из формулы изобретения.

ОПИСАНИЕ ФИГУР.

Фигура 1 является схематическим представлением конструкции антимышиного CAR CD19. Ретровирусные конструкции включают aнти-mCD19 scFv (VHA/L) с шарнирным участком CD8 (Н) и трансмембранный домен (ТМ), за которым следует CD28 (m1928z) или 41ВВ (m19-musBBz) и CD3ζ или только CD3ζ (m19z). Отрицательный контроль CAR не включает сигнальных доменов (m19Δz). G/S является глицин-сериновым линкером. CAR скрепляется с репортером флуоресцентного белка (GFP или Cherry). LTR является длинным кольцевым повтором, SD является донором сплайсированного фрагмента, SA является акцептором сплайсированного фрагмента и у является сигналом упаковки.

Фигура 2А является схематическим представлением мутаций субдомена CD28, которые поддерживают передачу сигнала CAR в Nur77^GFP, происходящего из CAR Т-клеток. Представлены YMNM (ID SEQ NO: 1), PRRP (ID NO: 2 SEQ), и PYAP (ID NO: 3 SEQ), замещенные последовательности AAAA (ID NO: 4 SEQ).

Фигура 2B является гистограммой, демонстрирующей Nur77^GFP (процент GFP+) С019-таргетных CAR Т-клеток, стимулируемых 3Т3-mCD19. Спустя 24 часа после стимуляции Nur77^GFP были оценены методом проточной цитометрии.

Фигуры. 3А и 3В являются гистограммами, которые демонстрируют секрецию IFN-γ (Фиг. 3А) и IL-2 (Фиг. 3В) после того как CD28, субдомен мутанта СD19-таргетных CAR Т-клеток, стимулировался 3Т3 клетками, которые экспрессируют мышиный CD19 (3T3-mCD19). Фигуры. 3С и 3D являются гистограммами, которые демонстрируют субпопуляции СМ и ЕМ, оцененные методом проточной цитометрии.

Фигура 4 является графиком на котором продемонстрирована выживаемость CD28 мутированных CAR Т-клеток и немутированных CAR Т-клеток. CAR Т-клетки были получены из мышиной линии C57BL/6 дикого типа и выживаемость клеток измерялась при окраске трипановым синим на автоматизированном счетчике клеток (ВIO-RAD).

Фигура 5 является графиком, на котором продемонстрирована пролиферация CAR Т-клеток с мутантным CD28 и немутированные CAR Т-клетки. CAR Т-клетки были получены из мышиной линии C57BL/6 дикого типа и пролиферация была измерена по кратности изменения от количества первичных клеток до заключительной наработки клеток на 5 день.

Фигуры от 6А до 6D являются гистограммами, которые демонстрируют уровни IFN-γ (Фиг. 6А), IL-6 (Фиг. 6 В), IL-12 (Фиг. 6С), и TNF-α (Фиг. 6D), которые продуцируются мутированными и немутированными CAR Т-клетками. CAR Т-клетки были активизированы клетками 3T3-mCD19 в соотношении 10:1. Затем через 24 часа были отобраны супернатанты и измерены цитокины с помощью набора Luminex.

Фигуры 7А и 7В являются графиками, на которых продемонстрирована цитотоксическая активность клеток-мишеней мутированных CD28 и немутированных CAR Т-клеток, которые совместно культивировались с клетками мишенями 3T3-mCD19 в соотношении 10:1 или 1:6. Цитотоксичность клеток мишеней определялась с помощью анализатора клеток в режиме реального времени (RTCA).

Фигуры от 8А до 8Н являются графиками, на которых продемонстрирована цитотоксическая активность in vivo В-клеток (Фиг. 8А, 8С, 8Е, 8G) и количества CAR Т-клеток (Фиг. 8В, 8D, 8F, 8Н). 1×10⁶ CAR Т-клеток (CD3+ CAR+), которые были в/в введены в цитоксане (300 мг/кг), предварительно обработанным мышам дикого типа C57BL/6. Через одну неделю (Фиг. 8А, 8В), 2 (Фиг. 8С, 8D), 4 (Фиг. 8Е, 8F), и 6 недель (Фиг. 8G, 8Н) у мышей были взяты образцы крови и количество В-клеток и CAR Т-клеток были проанализированы методом проточной цитометрии.

Фигуры от 9А до 9D являются графиками, на которых продемонстрирована цитотоксическая активность В-клеток (Фиг. 9А и 9С) и количество CAR Т-клеток (Фиг. 9В и 9D) в костном мозге (Фиг. 9А и 9В), и селезенке (Фиг. 9С и 9D). 1×10⁶ CAR Т-клеток (CD3+ CAR+) были в/в введены в цитоксане (300 мг/кг), предварительно обработанным мышам дикого типа C57BL/6. На 8 неделю были забраны образцы костного мозга (ВМ) и селезенки и количество В-клеток и CAR Т-клеток был проанализированы методом проточной цитометрии.

Фигура 10 является графиком, на котором продемонстрирована выживаемость мышей с опухолью Eu-ALL после лечения CAR Т-клетками. Спустя шесть дней после внутрибрюшинного введения клеток Eu-ALL дикому типу мышей C57BL/6, в/в вводили через 1 день 3×10⁵ клеток CAR-T в цитоксане (300 мг/кг).

Фигуры 11А и 11В являются графиками, на которых продемонстрирована пролиферация (Фиг. 11А) и выживаемость (Фиг. 11В) CD28 мутированных и немутированных CAR Т-клеток. CAR Т-клетки были получены из нормальных донорских монокулярных клеток периферической крови (PBMCs), выживаемость клеток измерялась при окрашивании трипановым синим на автоматизированном счетчике клеток (BIO-RAD). Пролиферация была оценена по кратности изменения от исходного количества клеток до конечного прироста клеток на 5-й день.

Фигура 12 является графиком, на котором продемонстрирована пролиферация CAR Т-клеток человека в условиях in vitro. 1×10⁵ CAR Т-клеток человека совместно культивировались с клетками 3T3-hCD19 в соотношении 10:1 на 5-й день, а количество клеток измерялось в течение 10 дней.

Фигура 13 является графиком, на котором продемонстрирована цитотоксическая активность CAR Т-клеток mut06 человека и немутированных CAR Т-клеток. CAR Т-клетки совместно культивировались с клетками-мишенями 3T3-hCD19 в соотношении 5:1. Цитотоксическая активность была измерена с помощью RTCA.

Представленные Таблицы 1, 2 предоставляют некоторые примеры комбинации ТАА-связанного участка, кости мул яторных сигнальных участков и внутриклеточного сигнального домена, которые могут встречаться в описанных CAR.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ.

В данном документе описаны химерные антигенные рецепторы (CAR), которые могут специфически распознавать опухолеассоциированные антигены (ТАА) на злокачественных клетках, которые включают мутированную форму цитоплазматического домена CD28, снижающая «истощение» клеточного CAR-T. Также в данном документе описаны иммунные клетки-эффекторы, такие как Т-клетки или клетки естественных киллеров (NK), которые сконструированы для экспрессии этих CAR. Соответственно, также описаны подходы по обеспечению противоопухолевого иммунитета у субъекта при формах рака, экспрессирующих ТАА, которые задействуют адоптивный перенос описанных иммунных клеток с эффекторными функциями, которые сконструированы для экспрессии описанных CAR.

Химерные антигенные рецепторы (CAR) с мутированными доменами CD28.

CAR схематично включают домен распознавания антигена из одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) моноклонального антитела (mAb) с трансмембранными сигнальными мотивами, вовлеченными в активацию лимфоцита (Sadelain М, et al., Nat Rev Cancer 2003 3:35-45). описанный в данном документе химерный антигенный рецептор (CAR), который может экспрессироваться в иммунных клетках-эффекторах для повышения их противоопухолевой активности.

Описанные в данном документе CAR в общем сконструированы из трех доменов: эктодомена, трансмембранного домена и эндодомена. Эктодомен включает ТАА-связывающий участок и ответственен за распознавание антигена. Он также необязательно содержит сигнальный пептид (SP) для гликозирования CAR и его фиксации в мембране эффекторной иммунной клетки. Трансмембранный домен (TD), уже на основании его названия предполагает, что он соединяет эктодомен с эндодоменом и при экспрессии клеткой локализуется в пределах мембраны клетки. Эндодомен является важным элементом CAR, который передает активирующий сигнал на иммунные эффекторные клетки после распознания антигена. Например, эндодомен может содержать внутриклеточный сигнальный домен (ISD) и костимуляторный сигнальный участок (CSR).

Описанные CAR содержат CSR, включающий мутированную форму CD28, которая снижает «истощение» CAR-T клетки. Домен CD28 включает 3 внутриклеточных субдомена (YMNM (ID №:1 SEQ), PRRP (ID №:2 SEQ), и PYAP (ID №:3 SEQ)), которые регулируют сигнальные пути после стимуляции проводящих путей TCR. В некоторых вариантах воплощения изобретения, описанный CAR включает мутацию или делецию одного или более из этих субдоменов.

В некоторых вариантах воплощения изобретения, описанный CAR определен следующей формулой:

SP-TAA-HG-TM-CSR-ISD; в которой «SP» представляет собой необязательный сигнальный пептид;

в которой «ТАА» представляет собой ТАА-связывающий участок, в которой «HG» представляет собой необязательный шарнирный домен;

в которой «ТМ» представляет собой трансмембранный домен;

в которой «CSR» представляет собой костимуляторный сигнальный домен;

в которой «ISD» представляет собой внутриклеточный сигнальный домен и

в которой "-" представляет собой соединение пептида или линкер.

Представлены дополнительные конструкции CAR, (например, в Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81), которые включены в документ полностью посредством ссылки, которая содержит информацию об этих CAR моделях.

Например, CAR могут быть представлены следующими моделями: TRUCK, универсальный CAR, CAR с функцией самостоятельного управления, «бронированные» CAR, CAR с функцией самостоятельного уничтожения, CAR с условным нокаутированием, CAR с меткой, тандемные CAR, двойные CAR, или безопасные CAR (sCAR).

TRUCKs (Т-клетки, повторно нацеленные на универсальную цитокиновую цитотоксичность), осуществляют коэкспрессию химерного антигенного рецептора (CAR) и противоопухолевого цитокина. Экспрессия цитокина может быть конститутивной или индуцированной активацией Т-клеток.

Специфичность CAR адресована на ограниченную продукцию противовоспалительных цитокинов с вовлечением эндогенных иммунных клеток на опухолевые участки и может усиливать действие противоопухолевого ответа.

Универсальные, аллогенные CAR Т-клетки представлены конструктами, которые ингибируют эндогенный рецептор Т-клеток (TCR) и/или молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), таким образом, предотвращая реакцию «трансплантат против хозяина» (GVHD) или отторжение, соответственно.

CAR с функцией самостоятельного управления коэкспрессируют CAR и рецептор хемокина, который связывается с лигандом опухоли, таким образом, увеличивая хоуминг опухоли.

CAR Т-клетки представлены конструктами, которые резистентны к иммуносупрессии («бронированные» CAR), могут быть генетически модифицированы для ингибирования экспрессии молекул различных контрольных молекул иммунного ответа (например, цитотоксический антиген, лимфоцит-ассоциированный с Т-клетками 4 (CTLA4) или белок программированной клеточной гибели 1 (PD1)), с рецептором выключателя контрольных точек иммунного ответа, или могут применяться с моноклональным антителом, которое блокирует передачу иммунного сигнала в контрольных точках.

CAR с функцией самостоятельного уничтожения сконструированы при использовании РНК, введенной электропорацией для кодирования CAR. Альтернативно, индуцибельный апоптоз Т-клеток может быть достигнут при применении ганцикловира, который связывается с тимидин киназой в ген-модифицированных лимфоцитах, или с системой активации каспазы 9 человека низкомолекулярным белком димеризации, представленной недавно.

CAR Т-клетки с условным нокаутированием исходно устойчивы, или выключены, до включения низкомолекулярных агентов для завершения цикла полной трансдукции, включая сигнал 1 и сигнал 2, таким образом, активируя CAR Т-клетку. Альтернативно, Т-клетки могут быть сконструированы для экспрессии адаптер-специфического рецептора с аффинностью к впоследствии применяемым вторичным антителам, направленным на таргетный антиген.

Маркированные CAR Т-клетки экспрессируют CAR плюс эпитоп опухоли в котором применяемое моноклональное средство связывается с антителом. Для регулирования тяжелых отрицательных воздействий вводятся моноклональные антитела очищенных CAR Т-клеток, что устраняет симптомы без дополнительных эффектов вне опухоли.

Тандемные CAR (TanCAR), Т-клетки, которые экспрессируют один CAR, состоящий из двух связанных одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFvs), которые обладают различным сродством при присоединении к внутриклеточному костимуляторному домену (ам) и домену CD3ζ.

Активация TanCAR Т-клеток достигается только когда таргетные клетки повторно экспрессируются на обеих клетках мишенях.

Двойные CAR Т-клетки экспрессируют два отдельных CAR с различными мишенями связывания лигандов; один CAR включает только домен CD3ζ, и другой CAR включает только костимуляторный домен(ы). Двойная активация CAR Т-клеток требует коэкспрессии на опухоли обеих мишеней.

Безопасные CAR (sCAR) состоят из внеклеточного scFv, сплавленного с внутриклеточным ингибирующим доменом. sCAR Т-клетки, коэкспрессирующие стандартный CAR, становятся активизированными только сталкиваясь с клетками мишенями, которым присуще стандартное связывание с CAR мишенью, но они слабо связываются с мишенями для sCAR.

Доменом распознавания антигена описанного CAR обычно является scFv. Однако существует много альтернатив. Представлены домены распознавания антигена от нативного Т-клеточного рецептора (TCR) одноцепочечными альфа и бета с простыми эктодоменами (например. CD4 эктодомен, для распознания ВИЧ-инфицированных клеток) и более экзотические компоненты распознания, такие как связывающие цитокин (которые распознают клетки, несущие рецептор цитокина). Фактически почти все агенты, которые связываются с данной мишенью с высоким сродством, могут использоваться как участок распознавания антигена.

Эндодомен является важным участком CAR, через который после распознания антигена передается сигнал на иммунную клетку с эффекторными функциями, активизируя по меньшей мере одну из нормальных функций иммунной эффекторной клетки. Эффекторная функция Т-клетки, например, может выражаться цитолитической или хелперной активностью, включая секрецию цитокинов. Поэтому эндодомен может включать «внутриклеточный сигнальный домен» рецептора Т-клеток (TCR) и необязательные корецепторы. Однако, как правило, могут использоваться все звенья внутриклеточного сигнального домена, но участие всего сигнального каскада во многих случаях необязательно. В случаях, связанных с использованием сокращенной части внутриклеточного сигнального домена, может использоваться такая укороченная часть вместо интактной цепи, пока она преобразовывает сигнал эффекторной функции. Цитоплазматические сигнальные последовательности, которые регулируют первичную активацию комплекса TCR и действуют как стимуляторы, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как иммунорецепторные мотивы, активирующие тирозин (ITAMs).

Примеры ITAM, содержащие цитоплазматические сигнальные последовательности, включают полученные из CD8, CD3ζ CD3δ, CD3γ, CD3ζ, CD32 (Fc-gamma RIIa), DAP 10, DAP12, CD79a, CD79b, FcγRIγ, FcyRIIIγ, FcsRiβ (FCERIB), и FcεRIγ (FCERIG).

В отдельных вариантах воплощения изобретения внутриклеточный сигнальный домен получен из CD3-zeta (CD3ζ (TCR-zeta, GenBank accno. BAG36664.1). Т-клеточный поверхностный гликопротеин CD3-zeta (цепь CD3ζ, также известный как цепь Т-клеточного рецептора Т3-zeta) или CD247 (кластер дифференцирования 247), является белком, который у человека кодируется геном CD247.

Для CAR первого поколения типичным был внутриклеточный домен цепи CD3ζ, который является первичным передатчиком сигналов от эндогенных TCR. В CAR второго поколения к эндодомену CAR добавлены внутриклеточные сигнальные домены от различных костимуляторных белковых рецепторов (например, CD28, 41ВВ, ICOS), для обеспечения дополнительных сигналов к Т-клеткам. Доклинические исследования показали, что второе поколение CAR конструктов демонстрирует более высокую противоопухолевую активность Т-клеток. В новых CAR третьего поколения комбинируются несколько сигнальных доменов для усиления потенции. Т-клетки, трансплантированные с этими CAR, продемонстрировали более высокое развитие, активность, стабильность и противоопухолевую эффективность, независимую от костимуляторного взаимодействия рецептора/лиганда (Imai С, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5).

Например, эндодомен CAR может быть сконструирован для включения только CD3ζ сигнального домена отдельно или в комбинации с любым другим желательным цитоплазматическим доменом(ами), полезным в контексте CAR изобретения. Например, цитоплазматический домен CAR может включать часть цепи CD3ζ и костимуляторный сигнальный участок.

Этот костимуляторный сигнальный участок относится к участку CAR, который включает внутриклеточный домен костимуляторной молекулы.

Такая костимуляторная молекула является молекулой клеточной поверхности кроме рецептора антигена или их лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, ICOS, антиген, связанный с функцией лимфоцитов 1 (LFA-1), CD2, CD7, СВЕТ, NKG2C, В7-Н3, и лиганд, который специфично связывается с CD83, CD8, CD4, b2c, CD80, CD86, DAP10, DAP12, MyD88, BTNL3 и NKG2D. Таким образом, в то время как описанный CAR иллюстрируется, прежде всего, CD28 как костимуляторный сигнальный элемент, могут использоваться другие костимуляторные элементы одни или в комбинации с другими костимуляторными сигнальными элементами.

В некоторых вариантах воплощения изобретения CAR включает гибкую последовательность. Гибкая последовательность является короткой последовательностью аминокислот, которая облегчает подвижность антитела (см, например, Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)).

Гибкая последовательность может быть помещена между мотивом распознания антигена и трансмембранным доменом. Гибкая последовательность может быть любой подходящей последовательностью, доставленной или полученной из любой подходящей молекулы. В некоторых вариантах воплощения изобретения, например, гибкая последовательность получена из молекулы CD8a или молекулы CD28.

Трансмембранный домен может быть получен из естественного или из синтетического источника. При получении из естественного источника, домен может быть получен из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Например, трансмембранный участок может быть получен из (то есть включать, по меньшей мере, трансмембранный участок(и) альфа, бета, или зета цепей Т-клеточного рецептора, CD28, эпсилона CD3, CD45, CD4, CD5, CD8 (например, CD8-alpha, бета CD8-beta), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, или CD154, KIRDS2, ОХ40, CD2, CD27, LFA-1 (CD11a, CD18), ICOS (CD278), 4-1ВВ (CD137), GITR, CD40, BAFFR, HVEM (LIGHTR), SLAMF7, NKp80 (KLRF1), CD160, CD19, IL2R-beta, IL2R-gamma, IL7R-alpha, ITGA1, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, TNFR2, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, (тактильный) CD96, CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, и PAG/Cbp.

Альтернативно, трансмембранный домен может быть синтетическим и включать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых случаях, может обнаруживаться триплет фенилаланина, триптофана и валина на каждом конце синтетического трансмембранного домена. Короткие олиго- или полипептидные линкеры, такие как длиной от 2 до 10 аминокислот, могут сформировать связь между трансмембранным и эндоплазматическим доменами CAR.

В некоторых вариантах воплощения изобретения CAR имеет более одного трансмембранного домена, которые могут быть повторами одного и того же трансмембранного домена, или представлять различные трансмембранные домены.

В некоторых вариантах воплощения изобретения CAR является многоцепочечным CAR, как описано в WO 2015/039523, который включен для ознакомления посредством ссылки. Многоцепочечный CAR может включать отдельный внеклеточный связывающий лиганд и сигнальные домены в различных трансмембранных полипептидах. Сигнальные домены могут быть сконструированы таким образом, что они собираются в околомембранном пространстве, в котором формируется гибкая архитектура, приближенная к естественным рецепторам, способствующая оптимальной трансдукции сигнала. Например, многоцепочечный CAR может включать часть альфа-цепи FCERI и часть бета цепи FCERI таким образом, что цепи FCERI спонтанно димеризируются вместе для формирования CAR.

Представленные ниже две таблицы предоставляют некоторые примеры комбинации ТАА-связанного участка, костимуляторных сигнальных участков и внутриклеточного сигнального домена, которые могут встречаться в описанных CAR.

В некоторых вариантах воплощения изобретения агенты, связывающие анти-ТАА, являются фрагментом антитела одноцепочечной вариабельной цепи (scFv). Сродство/специфичность анти-ТАА scFv является в значительной степени зависимым от специфических последовательностей в пределах определяющей комплементарной области (CDR) в тяжелых (V_H) и легких (V_L) цепях. Для каждой последовательности (V_H) и (V_L) должны секвенироваться три CDR (CDR1, CDR2, CDR3).

В некоторых случаях, агенты, связывающие анти-ТАА, являются аффинными к созревшей scFv. В некоторых случаях, у анти-ТАА есть константа диссоциации (K_d) для ТАА, которая составляет менее 50 нм, 40 нм, 30 нм, 25 нм, 20 нм, 15 нм или 10 нм.

В некоторых вариантах воплощения изобретения агенты, связывающие анти-ТАА, получены из естественных антител, таких как моноклональные антитела. В некоторых случаях, антитело является человеческим. В некоторых случаях, антитело подвергалось альтерации для снижения иммуногенности при применении у человека. Например, альтерация включает один или более способов, отобранных из группы, состоящей из химеризации, гуманизации, переноса CDR, деиммунизации и мутации основы аминокислот для наибольшего приближения к человеческой последовательности зародышевого типа.

Антигены опухоли являются белками, которые продуцируются опухолевыми клетками, демонстрирующими иммунный ответ, в частности иммунный ответ, опосредованный Т-клетками. Дополнительный домен, связывающий антиген, может быть антителом или естественным лигандом опухолевого антигена. Выбор дополнительного домена, связывающего антиген, будет зависеть от формы рака, которая будет подвергаться терапии. Известны современные опухолевые антигены, которые включают, например, связанный с глиомой антиген, карциноэмбриональный антиген (СЕА), EGFRvIII, IL-IIRa, IL-13Ra, EGFR, FAP, B7H3, Kit, CA LX, CS-1, MUC1, BCMA, bcr-abl, HER2, β-хорионический гонадотропин человека, альфа-фетопротеин (AFP), ALK, CD19, CD123, циклин BI, лектин реактивный AFP, антиген 1, связанный с Fos, ADRB3, тироглобулин, EphA2, RAGE-1, RUI, RU2, SSX2, АКАР-4, LCK, OY-TESI, РАХ5, SART3, CLL-1, фукозил GM1, GloboH, MN-CA IX, ЕРСАМ, EVT6-AML, TGS5, обратную транскриптазу теломеразы человека, плайсиаловую кислоту, PLAC1, RUI, RU2 (AS), интерстициальную карбоксил эстеразу, lewisY, sLe, LY6K, mut hsp70-2, M-CSF, MYCN, RhoC, TRP-2, CYPIBI, BORIS, простату, простато-специфический антиген (PSA), РАХ3, PAP, NY-ESO-1, LAGE-1α, LMP2, NCAM, p53, мутантный p53, мутантный Ras, белок, gp100, OR51E2, PANX3, PSMA, PSCA, Her2/neu, hTERT, HMWMAA, HAVCR1, VEGFR2, PDGFR-бета, сурвивин и теломеразу, легумаин, HPV Е6,Е7, белок спермы 17, SSEA-4, тирозиназу, TARP, WT1, опухолевый антиген карциномы простаты 1 (РСТА-1), ML-IAP, MAGE, MAGE-A1,MAD-CT-1, MAD-CT-2, Мелан A/MART 1, XAGE1, ELF2M, ERG (TMPRSS2 ETS ген слияния), NA17, эластазу нейтрофилов, точки разрыва транслокации саркомы, NY-BR-1, ephnnB2, CD20, CD22, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44v6, CD97, CD171, CD179a, рецептор андрогена, FAP, фактор роста инсулина (IGF)-I, IGFII, рецептор IGF-I, GD2, о-ацетил-602, GD3, GM3, GPRC5D, GPR20, CXORF61, рецептор фолата (FRa), рецептор фолата бета, ROR1, Flt3, TAG72, TN Ag, Tie 2, TEM1, TEM7R, CLDN6, TSHR, UPK2, и мезотелин. В предпочтительном варианте воплощения изобретения опухолевый антиген выбран из группы, состоящей из рецептора фолата (FRa), мезотелина, EGFRvIII, IL-13Ra, CD123, CD19, CD33, ВСМА, GD2, CLL-1, CA-IX, MUCI, HER2 и любой их комбинации.

Неограничивающие примеры опухолевых антигенов включают следующее: антигены дифференцирования, такие как тирозиназа TRP-1, TRP-2 и опухолеспецифические мультилинейные антигены, такие как MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, pi 5; сверхэкспрессируемый эмбриональный антиген, такой как, СЕА; сверхэкспрессируемые онкогены и мутированные гены опухолевых супрессоров, такие как: р53, Ras, HER-2/neu; единицы опухолевых антигенов, являющиеся результатом транслокации хромосом, такие как BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR; и вирусные антигены, такие как, антигены вируса Эпштейна-Барра, антигены вируса EBVA и антигены папиломатозного вируса человека (HPV) Е6 и Е7. Другие большие антигены на основе белков включают: TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, pl80erbB-3, с-met, nm- 23H1, PSA, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, бета-катенин, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, альфа-фетопротеин, бета-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM, HTgp- 175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCASI, SDCCAG1 6, ТА-90\Mac-2 связывающий белок/циклофильм С-ассоциированный белок, TAAL6, TAG72, TLP, TPS, GPC3, MUC16, LMP1, EBMA-1, BARF-1, CS1, CD319, HER1, B7H6, L1CAM, IL6 и MET.

Нуклеиновые кислоты и векторы

Также описанными являются полинуклеотиды и векторы полинуклеотида, кодирующие описанные CAR, которые позволяют экспрессию CAR в описанных иммунных клетках с эффекторной функцией.

Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие описанные CAR и их участки могут быть получены с использованием известных современных рекомбинантных способов, таких как, например, скрининг библиотек клеток, экспрессирующих ген, получая ген из известного вектора для его включения, или выделяя непосредственно из клеток и, содержащих его тканей, с использованием стандартных методов. Альтернативно, интересующий ген может быть получен искусственно, а не путем клонирования.

Экспрессия нуклеиновых кислот, кодирующих CAR, обычно достигается функциональной связкой нуклеиновой кислоты, кодирующей этот CAR полипептид с промотором, и включением этой конструкции в вектор экспрессии. Типичные клонированные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, инициированные последовательности и промоторы, полезные для регулирования экспрессии желательной последовательности нуклеиновой кислоты. Описанная нуклеиновая кислота может быть клонирована во многие типы векторов. Например, нуклеиновая кислота может быть клонирована в вектор, включая, но не ограничиваясь плазмидой, фагемидой, производной бактериофага, вирусом животных, и космидой. Особый интерес представляют векторы экспрессии, векторы репликации, векторы семейства зондов и векторы сиквенса.

Далее, экспрессируемый вектор может быть доставлен в клетку в форме вирусного вектора. Современная технология для векторов вирусов широко известна и представлена, например, в Sambrook et al.(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), и в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые успешно используются как векторы, включают, но не ограничиваются следующим: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В общем, подходящий вектор содержит точку начала репликационного функционала по меньшей мере для одного микроорганизма, промоторную последовательность, приемлемые сайты рестрикционной эндонуклеазы и один или более отобранных маркеров. В некоторых вариантах воплощения изобретения полинуклеотидными векторами являются лентивирусные или ретровирусные векторы.

Разработано множество систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, ретровирусы обеспечивают удобную платформу для систем доставки генов. Выбранный ген может быть вставлен в вектор и упакован в ретровирусные частицы при применении известных современных методов. Затем рекомбинантный вирус может быть выделен и инкорпорирован в клетки субъекта in vivo или ex vivo.

Примером подходящего промотора является немедленно-ранняя промоторная последовательность вируса цитомегалии (CMV). Эта промоторная последовательность является сильной конститутивной промоторной последовательностью, которая характеризуется высоким уровнем экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, связанной с ней функционально. Другим примером подходящего промотора является элонгированный фактор роста-1α (EF-1α). Однако могут также использоваться другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь, ранний промотор вируса обезьян 40 (SV40), промотор миелопролиферативного вируса саркомы (MND), промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотор длинного терминального повтора (LTR) вируса иммунодефицита человека (HIV), промотор MoMuLV, промотор вируса лейкоза у птиц, немедленно-ранний промотор вируса Эпштейна-Барра, промотор вируса саркомы Rous, а так же включают, но не ограничиваются такими, как промоторы вирусов человека, такие как промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. Альтернативно промотор может быть индуцибельным. Примеры индуцибельных промоторов включают, но не ограничены, промотор металлотионина, промотор глюкокортикоида, промотор прогестерона и промотор тетрациклина.

Дополнительные промоторные элементы, например, энхансеры, регулируют частоту инициирования транскрипции. Как правило, они расположены в участке 30-110 bp на входе начала транскрипции, хотя многие промоторы, как недавно показано, также содержали функциональные элементы ниже участка начала транскрипции.

Расстояние между элементами промотора часто является перестраиваемым, что способствует сохранению промоторной функции при инвертировании или перемещении элементов.

Для оценки экспрессии полипептида CAR или его фрагментов, доставляемый в клетку экспрессионный вектор может также содержать выбранный маркерный ген или ген репортер или оба из них, для облегчения идентификации и отбора экспрессированных клеток из популяции клеток, которые были трансфицированы или инфицированы посредством вирусных векторов. В других аспектах выбираемый маркер может быть представлен на отдельном фрагменте ДНК и использоваться в процедуре котрансфекции. И к выбираемым маркерам и к генам репортера могут присоединяться соответствующие регуляторные последовательности для запуска экспрессии в клетках организма. Полезные выбираемые маркеры включают, например, гены резистентности к антибиотикам.

Гены-репортеры используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональных возможностей регуляторных последовательностей. В общем, геном репортером может быть ген, который либо не присутствует либо экспрессируется организмом реципиента или тканью, и он кодирует полипептид, экспрессия которого успешно выявляется с помощью свойств, которые легко поддаются обнаружению, например, по ферментативной активности. Экспрессия гена-репортера анализируется в надлежащее время после введения ДНК в клетки реципиента. Подходящие гены-репортеры могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфеникол ацетил трансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу, или ген зеленого флуоресцентного белка. Подходящие системы экспрессии широко известны и могут быть подготовлены с использованием известных методов или получены коммерчески. В общем, конструкт с минимальным 5' фланкирующим участком продемонстрировал самый высокий уровень экспрессии гена-репортера и идентифицирован как промотор. Такие промоторные участки могут быть связаны с геном-репортером и использоваться для оценки агентов, которые способны модулировать транскрипцию, обеспечиваемую промотором.

Известны современные подходы внедрения и экспрессии генов в клетке. В контексте вектора экспрессии, такой вектор может успешно вводиться в клетку организма, например, млекопитающих, бактериальную, дрожжей, или в клетки насекомого любым известным способом. Например, такой вектор экспрессии может быть введен в клетку организма физическими, химическими, или биологическими способами.

Физические методы введения полинуклеотида в клетку организма включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию, и т.п. Известны современные подходы для получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты. Смотрите, например, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

Биологические способы введения интересующего полинуклеотида в клетку организма включают использование векторов ДНК и РНК. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, являются наиболее широко используемым подходом для введения генов в клетки млекопитающих, например, в клетки человека.

Химические средства для введения полинуклеотида в клетку организма включают коллоидные дисперсные системы, такие как комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии масла в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Образцовой коллоидной системой для использования в качестве носителя в системах in vitro и in vivo являются липосомы (например, искусственные мембранные везикулы).

В случае, когда используется невирусная система доставки, удобным носителем являются липосомы. В другом аспекте, с липидом может быть связана нуклеиновая кислота. Нуклеиновая кислота, связанная с липидом, может быть инкапсулирована в гидрофильный фрагмент липосомы, вкраплена в липидный бислой липосомы, присоединена к липосоме через молекулу для связи, которая связана с липосомой и олигонуклеотидом, иммобилизирована на липосоме, комплексирована с липосомой, диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, объединена с липидом, помещена как суспензия в липид, содержится или комплексирована с мицеллой, или связана с липидом другим способом. Составы, ассоциированные с липидом, липидом/ДНК или липидом/ вектором экспрессии не ограничены какой-либо специфической структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в структуре бислоя, как мицеллы, или с «деформированной» структурой. Они также могут быть просто вкраплены в раствор, возможно формируя агрегаты, которые не являются унифицированными по размеру или форме. Липиды являются жировыми субстанциями естественного происхождения или представлены синтетическими липидами. Например, липиды включают капельки жиров, которые естественно встречаются в цитоплазме, а также в классе составов, которые содержат длинную цепь алифатических углеводородов и их производных, таких как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды. Липиды, подходящие для использования, могут быть получены из коммерческих источников. Например, димиристил фосфатидилхолин («DMPC») может быть получен от компании Сигма, St. Louis, Mo.; дицетил фосфат («DCP») может быть получен из К&К Laboratories (Plainview, Нью-Йорк); холестерин («Choi») может быть получен из Calbiochem-Behring; димиристил фосфатидилглицерол («DMPG») и другие липиды могут быть получены из Avanti Polar Lipids, Inc, (Birmingham, Ala.).

Иммунные клетки с эффекторной функцией.

Также в данном документе описаны иммунные клетки с эффекторной функцией, которые сконструированы для экспрессии описанных CAR (также упоминаются в документе как «CAR Т-клетки» Эти клетки предпочтительно получать у субъекта, который будет проходить терапию (то есть, аутогенные). Однако в некоторых вариантах воплощения изобретения используются линии иммунных клеток с эффекторной функцией или донорские (аллогенные) клетки с эффекторной функцией. Иммунные клетки с эффекторной функцией могут быть получены из многих источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатического узла, кровь пуповины, ткань тимуса, ткань из участка инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. Иммунные клетки с эффекторной функцией могут быть получены из крови, собранной у субъекта, используя любые подходы, известные специалисту в данной области, такие как разделение в градиенте Фиколла™. Например, клетки из циркулирующей крови человека могут быть получены аферезисом. В некоторых вариантах воплощения изобретения иммунные клетки с эффекторной функцией выделяются из лимфоцитов периферической крови, лизируя эритроциты и истощая моноциты, например, центрифугированием в градиенте Перколла™ или на счетчике при проточном элютрационном центрифугировании. Специфическая субпопуляция иммунных клеток с эффекторной функцией может быть далее разделена с применением положительных или отрицательных методов отбора. Например, иммунные клетки с эффекторной функцией могут быть выделены с использованием комбинации антител, с внедренными селективными маркерами, уникальными для положительно отобранных клеток, например, инкубацией со сферами с конъюгированным антителом в течение определенного периода времени, достаточного для положительного отбора желательных иммунных клеток с эффекторной функцией. Альтернативно, обогащение популяции иммунных клеток с эффекторной функцией может быть достигнуто отрицательным выбором, используя комбинацию антител, с уникальными маркерами для отрицательно отобранных клеток.

В некоторых вариантах воплощения изобретения иммунные клетки с эффекторной функцией включают любой лейкоцит, вовлеченный в защиту организма против инфекционного заболевания и чужеродных агентов. Например, иммунные клетки с эффекторной функцией могут включать лимфоциты, моноциты, макрофаги, дендритные клетки, тучные клетки, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, или любые их комбинации. Например, иммунные клетки с эффекторной функцией могут включить Т-лимфоциты.

Т-клетки или Т-лимфоциты отличаются от других лимфоцитов, таких как В-клетки и естественные клетки киллеры (клетки NK), по наличию Т-клеточного рецептора (TCR) на поверхности клетки. Их называют Т-клетками, потому что они созревают в тимусе (хотя некоторые также созревают в миндалинах). Существует несколько субпопуляций Т-клеток, которые различаются функционально.

Т-клетки хелперы (клетки Т_н) помогают другим лейкоцитам в иммунологических процессах, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и В-клетки памяти, в активации цитотоксических Т-клеток и макрофагов. Эти клетки также известны как CD4+ Т-клетки, потому что они экспрессируют гликопротеид CD4 на своей поверхности. Т-хелперы становятся активированными, когда они презентуют пептидные антигены молекул класса II МНС, которые экспрессированы на поверхности антиген-презентующих клеток (АРС). После активации они быстро делятся и секретируют малые белки, названные цитокинами, которые регулируют или способствуют активации иммунного ответа. Эти клетки могут дифференцироваться в одни из нескольких подтипов, включая Тн1, Тн2, Тн3, Тн17, Тн9, или TFH которые секретируют различные цитокины для проявления различных типов иммунного ответа.

Цитотоксические Т-клетки (клетки Тс, или CTL) разрушают инфицированные вирусом клетки и опухолевые клетки, и также вовлечены в отторжение трансплантата. Эти клетки также известны как CD8⁺Т-клетки, так как они экспрессируют на своей поверхности гликопротеид CD8. Эти клетки распознают свои мишени при связывании с антигеном, ассоциированным с молекулами МНС класса I, которые присутствуют на поверхности всех клеток, содержащих ядро. Через IL-10, аденозин и другие молекулы, секретированные регуляторными Т-клетками, CD8+ клетки могут быть инактивированы в неактивную форму для предотвращения развития аутоиммунных заболеваний.

Т-клетки памяти являются субпопуляцией антиген-специфических Т-клеток, которые длительно персистируют после излечения инфекционного процесса. Их количество быстро нарастает как Т-клеток с эффекторной функцией, которые повторно экспонируются на свой родственный антиген, таким образом, предоставляя иммунной системе «память» о прошедших инфекциях. Клетки памяти могут быть CD4⁺ или CD8⁺. Т-клетки памяти обычно экспрессируют на клеточной поверхности белок CD45RO.

Регуляторные Т-клетки (клетки T_reg), ранее известные как супрессорные Т-клетки, являются критическими для поддержки иммунологической толерантности. Их главная роль заключается в подавлении иммунитета, опосредованного Т-клетками до окончания иммунной реакции и в подавлении автореактивных Т-клеток, которые избежали процесса отрицательной селекции в тимусе. Два главных класса CD4+ T_reg-клеток были описаны, это естественно встречающиеся T_reg-клетки и адаптивные T_reg-клетки

Т-клетки естественные киллеры (NKT) (не путать с клетками естественных киллеров (NK)) являются «мостом» между адаптивной иммунной системой и врожденной иммунной системой. В отличие от обычных Т-клеток, которые распознают пептидные антигены, представленные комплексом молекул основного комплекса гистосовместимости (МНС), клетки NKT распознают гликолипидный антиген, представленный молекулой с названием CD1d.

В некоторых вариантах воплощения изобретения Т-клетки включают смесь CD4+ клеток. В других вариантах воплощения изобретения Т-клетки обогащены одной или более субпопуляций, на основании их экспрессии на поверхности клетки. Например, в некоторых случаях, Т включают, цитотоксические CD8⁺Т-лимфоциты. В некоторых вариантах воплощения изобретения Т-клетки включают γδ Т-клетки, которые обладают явно выраженным Т-клеточным рецептором (TCR), имеющим одну γ цепь и одну δ цепь вместо α и β цепей.

Клетки естественных киллеров (NK) являются CD56⁺CD3 ~ большие зернистые лимфоциты, которые обладают цитотоксическим эффектом по отношению к вирусам и трансформированным клеткам и составляют критическую клеточную субпопуляцию врожденной иммунной системы (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676). В отличие от цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов, клетки NK проявляют цитотоксичность против опухолевых клеток без необходимости предварительной сенсибилизации, и могут также удалять отрицательные клетки MHC-1-(Narni-Mancinelli Е, et al. Int Immunol 2011 23:427-431). Клетки NK являются более безопасными клетками с эффекторной функцией, поскольку они могут избежать потенциально летальных осложнений от воздействия цитокина (Morgan RA, et al. Mol Ther2010 18:843-851), синдрома лизиса опухоли (Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733) и нетаргетных эффектов за пределами опухоли. При том, что NK клеткам присуща известная функция киллера опухолевых клеток, часто сообщалось об их повреждении, как о критическом состоянии для прогрессии множественной миеломы (MM) (Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676; Fauriat C, et al. Leukemia 2006 20:732-733), до описанных CAR существовали, по большей части неисследованные, агенты, которые могли бы модулировать активность против ММ, опосредованную клетками NK.

Терапевтические способы

Иммунные клетки с эффекторной функцией, экспрессирующие эти описанные CAR, могут проявлять противоопухолевый иммунный ответ против опухолевых клеток, экспрессирующих ТАА. Противоопухолевый иммунный ответ, выявляемый этими описаными модифицированными CAR клетками с эффекторной функцией, может быть активным или пассивным иммунным ответом. Кроме того, опосредованный CAR иммунный ответ может быть частью способа воплощения адаптивной иммунотерапии, в котором модифицированные CAR-иммунные клетки с эффекторной функцией, вызывают специфический для ТАА иммунный ответ.

Адаптивный перенос иммунных клеток с эффекторной функцией, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы является многообещающей противоопухолевой терапией. После накопления иммунных клеток с эффекторной функцией, клетки субъекта могут быть генетически сконструированы на экспрессию описанных CAR, а затем введены обратно субъекту.

Описанные модифицированные CAR иммунные клетки с эффекторной функцией могут применяться самостоятельно, или как фармацевтическая форма в комбинации с растворителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2, IL-15, или с другими цитокинами или группами клеток. Кратко, фармацевтические составы могут включать популяцию клеток-мишеней, как изложено в данном документе, в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемых носителей, растворителей или наполнителей. Такие составы могут включать буферные растворы, такие как нейтральный буферный солевой раствор, забуференный фосфатный солевой раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза, или декстраны, маннитол; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глютатион; вспомогательные факторы (например, гидроокись алюминия) и консерванты. Используемые составы в описанных способах представлены в некоторых вариантах воплощения изобретения в форме для внутривенного назначения. Фармацевтические составы могут применяться в любой адекватной форме для лечения ММ. Количество и частота введения будут определены такими факторами, как состояние пациента, и серьезность заболевания пациента, хотя адекватные дозировки могут быть определены в клинических испытаниях.

Когда указано «иммунологически эффективное количество», «противоопухолевое эффективное количество», «эффективное количество для ингибирования опухоли», или «терапевтическое количество», тогда вводится точное количество составов настоящего изобретения, которое, может быть определено врачом при рассмотрении индивидуальных различий в возрасте, массе, размере опухоли, распространении инфекции или метастазов, и состояния пациента (субъекта). В общем, может быть заявлено, что фармацевтический состав, включающий Т-клетки, описанные здесь, может применяться в дозировке 10⁴-10⁹ клеток/кг массы тела, в частности, 10⁵-10⁶ клеток/кг массы тела, включая все значения целого числа в пределах этих диапазонов. Составы Т-клеток также можно вводить многократно в этих дозировках. Эти клетки можно вводить с использованием известных в иммунотерапии протоколов инфузии (см., например, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988).

Оптимальная дозировка и режим лечения для конкретного пациента могут с готовностью определяться квалифицированным клиническим специалистом, контролируя симптомы пациента при заболевании и соответственно регулируя лечение.

В определенных вариантах воплощения изобретения может быть желательно введение активизированных Т-клеток пациенту, а затем повторно провести забор крови (или провести аферезис), активизировать Т-клетки согласно описанным способам, и повторно инфузировать пациенту эти активизированные и обогащенные Т-клетки. Этот процесс может быть выполнен многократно через каждые несколько недель. В определенных вариантах воплощения изобретения Т-клетки могут быть активированы в объеме крови от 10 до 400 см³. В определенных вариантах воплощения изобретения Т-клетки могут быть активизированы в объеме крови 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, или 100 см³. При использовании таких многократных заборов крови / многократных реинфузий может быть полезным протокол для селекции специфических популяций Т-клеток.

Введение описанных составов может быть выполнено любым удобным способом, включая инъекции, трансфузии или имплантации. Составы, описанные здесь, могут вводиться пациенту подкожно, внутрикожно, интратуморально, интранодально, интрамедулярно, внутримышечно, внутривенной (i.v) инъекцией, или интраперитонеально. В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные составы вводятся пациенту внутридермально или подкожной инъекцией. В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные составы применяются в/в инъекцией. Составы могут также быть введены непосредственно в опухоль, лимфатический узел, или в область инфицирования.

В определенных вариантах воплощения изобретения описанные модифицированные CAR иммунные клетки с эффекторной функцией применяются пациенту в конъюгатах (например, прежде, одновременно или после) с любым количеством соответствующих протоколов лечения, включая, но не ограничиваясь, такими как талидомид, дексаметазон, бортезомид и леналидомид. В дальнейших вариантах воплощения изобретения, модифицированные CAR иммунные клетки с эффекторной функцией могут использоваться в комбинации с химиотерапией, лучевой терапией, иммуносупрессивными агентами, такими как циклоспорин, имуран, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами, или другими иммунодеструктивными агентами, такими как САМРАТН (алентузумаб), антителами анти-CD3 или с терапией другими антителами, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофеноловой кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. В некоторых вариантах воплощения изобретения модифицированные CAR иммунные клетки с эффекторной функцией применяются пациенту в сочетании (например, до, одновременно или после) с пересадкой костного мозга, терапией аблативными Т-клетками, использованием химиотерапевтических агентов таких как, флударабин, с наружной дистанционной лучевой терапией (XRT), циклофосфамидом, или антителами, такими как ОКТ3 или САМРАТН. В другом варианте воплощения изобретения клеточные фармакологические формы предлагаемого изобретения применяются после В-клеточной абляционной терапии, такими агентами, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном. Например, в некоторых вариантах воплощения изобретения, пациенты могут пройти стандартный протокол высокодозовой химиотерапии, сопровождаемой трансплантацией стволовых клеток периферической крови. В определенных вариантах воплощения изобретения, после трансплантации, пациенты получают инфузию обогащенных иммунных клеток предлагаемого изобретения. В дополнительном варианте воплощения изобретения, обогащенные клетки применяются до или после хирургического вмешательства.

При онкопатологии в описанных способах могут применяться любые ТАА-экспрессирующие клетки у субъектов с неконтролируемым ростом, инвазией, или метастазами. В небольшом количестве аспектов злокачественное новообразование может быть любой неоплазмой или злокачественной опухолью для терапии которой в настоящее время используется лучевая терапия. Альтернативно, злокачественное новообразование может быть любой неоплазмой или злокачественной опухолью, которая не достаточно чувствительна к стандартным протоколам лучевой терапии. Таким образом, злокачественное новообразование может быть саркомой, лимфомой, лейкемией, карциномой, бластомой, или гермиальной опухолью. Представлен, но не ограничивается перечень злокачественных новообразований, при которых для терапии могут применяться описанные составы, включая лимфому, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, фунгоидный микоз, болезнь Ходжкина, миелоидную лейкемию, рак мочевого пузыря, рак мозга, рак нервной системы, рак головы и шеи, плоскоклеточный рак головы и шеи, рак почек, рак легкого, такие как мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, нейробластому/глиобластому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак кожи, рак печени, меланому, плоскоклеточные карциномы рта, горла, гортани и легкого, внутриматочный рак, цервикальный рак, цервикальную карциному, рак молочной железы, эпителиальный рак, почечный рак, рак мочеполовой системы, рак легкого, карциному желудка, карциномы головы и шеи, рак толстой кишки, рак гематопоетических тканей; тестикулярный рак; рак толстой и прямой кишки, рак предстательной железы и рак поджелудочной железы.

Описанные CAR могут использоваться в комбинации с любым составом, компонентом или группой, которые проявляют цитотоксический или цитостатический эффект. Фрагменты лекарственной формы включают химиотерапевтические средства, которые могут функционировать как ингибиторы микротубулина, ингибиторы митоза, ингибиторы топоизомеразы, или интеркаляторы ДНК, и особенно те, которые используются для терапии рака.

Описанные CAR могут использоваться в комбинации с ингибитором контрольной точки иммунного ответа. Два известных ингибитора сигнальных путей контрольной точки иммунного ответа вовлекают передачу сигналов через цитотоксический Т-лимфоцитарный антиген 4 (CTLA-4) и рецепторы белка программируемой смерти 1 (PD-1). Эти белки являются членами семейства косигнальных молекул CD28-B7, которые играют важную роль для всех стадий функционирования Т-клеток. PD-1 рецептор (также известный как CD279) экспрессируется на поверхности активизированных Т-клеток. Его лиганды, PD-L1 (В7-Н1; CD274) и PD-L2 (B7-DC; CD273), экспрессированы на поверхности АРС, таких как дендритные клетки или макрофаги. PD-L1 является доминирующим лигандом, в то время как у PD-L2 представлено намного больше структур, которые ограничивают экспрессию. При связывании лигандов с PD-1, ингибирующий сигнал передается на Т-клетку, которая снижает продукцию цитокина и ингибирует Т-клеточную пролиферацию. Ингибиторы контрольной точки иммунного ответа включают, но не ограничены антителами, которые блокируют PD 1 (Ниволумаб (BMS-936558 или MDX1106), СТ 011, МК-3475), PD-L1 (MDX-1105 (BMS-936559), MPDL3280A, MSB0010718C), PD-L2 (rHlgM12B7), CTLA-4 (Ипилимумаб (MDX-010), Тремелимумаб (СР-675 206)), IDO, В7-Н3 (MGA271), В7-Н4, TIM3, LAG-3 (BMS-986016).

Человеческие моноклональные антитела к рецептору программируемой смерти 1 (PD-1) и способы терапии онкологических заболеваний с использованием только антител анти-PD-l или в комбинации с другими способами иммунотерапии описаны в патенте США №8008449, который включен для этих антител посредством ссылки. Антитела анти-PD-LI и их использование для этого описаны в патенте США №8552154, который включен для этих антител посредством ссылки. Противоопухолевые агенты, включающее антитело анти-PD-l или антитело анти-PD-LI представлены в патенте США №8617546, который включен для этих антител посредством ссылки.

В некоторых вариантах воплощения изобретения ингибитор PDL1 включает антитела, которые специфично связывают PDL1, такие как BMS-936559(Bristol-Myers Squibb) или MPDL3280A (Roche). В некоторых вариантах воплощения изобретения ингибитор PD1 включает антитела, которые специфично связывают PD1, такие как ламбролизумаб (Merck), ниволюмаб (Bristol-Myers Squibb), или MEDI4736 (AstraZeneca).

Человеческие моноклональные антитела к рецептору программируемой смерти 1 (PD-1) и способы терапии онкологических заболеваний с использованием только антител анти-PD-l или в комбинации с другими способами иммунотерапии описаны в патенте США №8008449, который включен для этих антител посредством ссылки. Антитела анти-PD-LI и их применение описаны в патенте США №8552154, который включен для этих антител посредством ссылки. Противоопухолевые агенты, включающее антитело анти-PD-l или антитело анти-PD-LI представлены в патенте США №8617546, который включен для этих антител посредством ссылки.

Описанные CAR могут использоваться в комбинации с другими протоколами иммунотерапии рака. Существуют два различных типа иммунотерапии: пассивная иммунотерапия использует компоненты иммунной системы для таргетной цитотоксической активности против опухолевых клеток, без обязательного иммунного ответа пациента, в то время как активная иммунотерапия активно инициирует эндогенный иммунный ответ. Пассивные стратегии включают использование моноклональных антител (mAb), вырабатываемых В-клетками в ответ на специфический антиген. Разработка технологии гибридомы в 1970-х годах и идентификация опухолеспецифических антигенов привели к развитию фармацевтических форм mAb, которые инициировали имунную систему к разрушению опухолевых клеток, делая их мишенями. К настоящему времени, mAb являются наиболее успешным подходом для иммунотерапии; лучшими тремя затребованными противоопухолевыми препаратами в 2012 году были mAb. Среди них ритуксимаб (Ритуксан, Genentech (Дженентех)), который связывается с белком CD20, который экстенсивно экспрессируется на поверхности В-клеточных злокачественных новообразований, таких как не - Ходжкинская лимфома (НХЛ). Ритуксимаб одобрен FDA для лечения НХЛ и хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL) в комбинации с химиотерапией. Другим важным mAb является трастузумаб (Герцептин; Genentech), которое сконструировано для лечения HER2 (рецептора эпидермального фактора роста 2 человека)-рак молочной железы с положительной экспрессией HER2.

Генерирование оптимальных «киллеров» CD8 Т-клеточного ответа также требует активации Т-клеточного рецептора плюс костимуляция, которая может быть обеспечена лигадированием рецепторов семейства фактора некроза опухоли, включая ОХ40 (CD134) и 4-1ВВ (CD137). ОХ40 особенно интересен как терапевтический подход с активацией (агонист) анти-ОХ40 mAb, повышая дифференцировку Т-клеток и цитолитическую функцию, что усиливает противоопухолевый иммунитет для множества опухолей.

В некоторых вариантах воплощения изобретения такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из антиметаболитов, таких как метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, флударабин, 5-фтороурацил, декарбазин, оксимочевина, аспарагиназа, гемцитабин или кладрибин.

В некоторых вариантах воплощения изобретения такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из алкилирующих агентов, таких как мехлорезамин, тиоэпа, хлорамбуцил.мелфалан, кармустин (BSNU), ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромоманитол, стрептозотоцин, дакарбазин (DTIC), прокарбазин, митомицин С, цисплатин и другие производные платины, например, карбоплатин.

В некоторых вариантах воплощения изобретения такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из антимитотических агентов, таких как таксаны, например доцетаксел и паклитаксел, алкалоиды барвинка, например виндезин, винкристин, винбластин и винорелбин.

В некоторых вариантах воплощения изобретения такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из ингибиторов топоизомеразы, таких как топотекан или иринотекан, или цитостатических препаратов, таких как этопозид и тенипозид.

В некоторых вариантах воплощения изобретения такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из ингибиторов фактора роста, таких как ингибитор ErbBI (EGFR) (таких как антитела EGFR, например, залутумумаб, сетуксимаб, панитулумаб, или нимотузумаб или другие ингибиторы EGFR, такие как гефитиниб или эрлотиниб), из других ингибиторов ErbB2 (HER2/neu) (таких как антитела HER2, например, трастузумаб, трастузумаб-DM I или пертузумаб) или ингибитора EGFR и HER2, такого как лапатиниб).

В некоторых вариантах воплощения изобретения такой дополнительный терапевтический агент может быть выбран из ингибиторов тирозин киназы, таких как иматиниб (Glivec, Gleevec STI571) или лапатиниб.

Поэтому, в некоторых вариантах воплощения изобретения, используются описанные антитела в комбинации с офатумумабом, занолимумабом, даратумумабом, ранибизумабом, нимотузумабом, панитумумабом, hu806, даклицумабом (Zenapax), басиликсимабом (Simulect), инфликсимабом (Remicade), адалимумабом (Humira), натализумабом (Tysabri), омализумабом (Xolair), эфализумабом (Raptiva), и/или ритуксимабом.

В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтическими агентами для использования в комбинации с CAR для лечения нарушений, представленных выше, могут быть противоопухолевые цитокины, хемокины или их комбинация. Примеры подходящих цитокинов и факторов роста включают IFNγ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (например, INFα2b), IFN, GM-CSF, CD40L, лиганд Flt3, фактор стволовой клетки, анцестим и TNFα. Подходящие хемокины могут включать Glu-Leu-Arg (ELR)- отрицательные хемокины, такие как IP-10, МСР-3, MIG, и SDF-la из человеческого СХС и семейства хемокина С-С. Подходящие цитокины включают производные цитокина, варианты цитокина, фрагменты цитокина, и белки слияния цитокина.

В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтический агент для использования в комбинации с CAR для терапии нарушений, представленных выше, может быть регулятором контроля/апоптоза клеточного цикла (или «регуляторным агентом»). Регуляторы контроля/апоптоза клеточного цикла могут включать молекулы, которые являются мишенями и модулируют регуляторы контроля/апоптоза клеточного цикла такие как (i) cdc-25 (такого как NSC 663284), (ii) циклин-зависимые киназы, которые гиперактивируют клеточный цикл (такие как флаворипидол (L868275, HMR1275) 7-гидроксистауроспорин (UCN-01, KW-2401), росковитин (R-росковитин, CYC202)), и (iii) модуляторы теломеразы (такие как BIBR1532, SOT-095, GRN163 и составы, описанные, например в патентах США №6440735 и №6 713 055). Неограниченные примеры молекул, которые сталкиваются с апоптотическими проводящими путями, включают апоптоз-индуцирующий лиганд семейства TNF (ТРА11_)/апоптозный лиганд-2 (Apo-2L), антитела, которые активизируют рецепторы TRAIL, IFN и антисенсорный Bcl-2.

В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтический агент для использования в комбинации с CAR для терапии нарушений, представленных выше, может быть гормональным регуляторным агентом, таким как препараты, которые используются в антиэстрогенной и антиандрогенной терапии. Примерами таких гормональных регуляторных агентов являются тамоксифен, идоксифен, фулвестрант, дролоксифен, торемифен, ралоксифен, диэтилстильбестрол, этинил эстрадиол/эстинил, антиандрогены, такие как (флутамидин/эулексин), прогестины (такие как гидроксипрогестерон капроат, медрокси-прогестерон/провера, медестрол ацепат /мегасе), адренокортикостероиды (такие как гидрокортизон, преднизон), рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (и его аналоги и другие агонисты LHRH, такие как бузерелин и госерелин), ингибиторы ароматазы (такие как анастразол/аримидекс, аминоглютетимид/цитраден, эксеместан) или гормональный ингибитор (такой как остреотидид/сандостатин).

В некоторых вариантах воплощения изобретения терапевтическими агентами для использования в комбинации с CAR для терапии нарушений, представленных выше, могут быть противоопухолевые нуклеиновые кислоты или противоопухолевые ингибиторы молекул РНК.

Комбинированное введение, как описано выше, может быть совместным, раздельным, или последовательным. Для одновременного введения эти агенты, в зависимости от обстоятельств, могут применяться как один состав или как отдельные составы.

В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные CAR применяются в комбинации с лучевой терапией. Лучевая терапия может включать облучение, или связана с назначением пациенту подобранных радиофармацевтических препаратов. Источник излучения может быть внешним или внутренним для пациента (лучевая терапия может, например, быть в форме наружной дистанционной лучевой терапии (EBRT) или брахитерапии (ВТ)). Радиоактивные элементы, которые могут использоваться в осуществлении таких подходов, включают, например, радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт-57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111.

В некоторых вариантах воплощения изобретения описанные CAR применяются в комбинации с хирургией.

CAR Т-клетки могут быть получены несколькими способами со свойствами повышенной цитотоксичности и специфичности к опухоли, уклонения от иммуносупрессии опухоли, без отторжения организмом хозяина, и с пролонгированием терапевтического периода полувыведения. TRUCK (Т-клетки, переориентированные для универсальной цитотоксической цитокиновой активности), например Т-клетки, с CAR, также сконструированы для высвобождения цитокинов, таких как IL-12, которые промотируют цитотоксическую активность к опухоли. Поскольку эти клетки сконструированы для высвобождения молекулярной нагрузки при активации CAR, которая ограничена средой опухоли, эти CAR Т-клетки иногда также упоминаются «как бронированные CAR». Несколько цитокинов, с противоопухолевой активностью, исследуются в доклинических и клинических испытаниях, они могут также оказаться полезными при включении в форму TRUCK терапии CAR-T. К ним относятся IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, M-CSF, GM-CSF, IFN-α, IFN-γ, TNF-α, TRAIL, лиганд FLT3, лимфотактин и TGF-p (Dranoff 2004). «Автономные» или «самоуправляемые» CAR Т-клетки сконструированы для экспрессии рецептора хемокина в дополнение к этим CAR. Поскольку определенные хемокины могут положительно регулироваться в опухолях, инкорпорация рецептора хемокина помогает их миграции в опухоль и инфильтрации адоптивными Т-клетками, таким образом, повышая специфичность и функциональные возможности CAR-T (Moon 2011). Универсальные CAR Т-клетки также содержат CAR, но они сконструированы таким образом, что они не экспрессируют эндогенный TCR (Т-клеточный рецептор) или белки МНС (основного комплекса гистосовместимости). Удаление этих двух белков из сигнальной популяции при адоптивной Т-клеточной терапии защищает организм от реакции «трансплантат против хозяина» и отторжения, соответственно. «Бронированные» CAR Т-клетки названы так на основании своей способности уклоняться от иммуносупрессии опухоли, и индуцированной опухолью гипофункции CAR. Эти специфические CAR Т-клетки сохраняют CAR, и могут быть сконструированы, чтобы не экспрессировать ингибиторы контрольных точек иммунного ответа. Альтернативно, эти CAR Т-клетки можно совместно использовать с моноклональным антителом (mAb), которое блокирует передачу сигналов иммунных контрольных точек. Назначение антител анти-PDLI значительно ограничивает цитотоксическую способность CAR TIL (лимфоциты, инфильтрующие опухоль). После исследования сигнальных проводящих путей PD1-PDL1 и CTLA-4-CD80/CD86 рассматривается возможный вариант их использования как сигнальных молекул контрольных точек иммунного ответа в дизайне «бронированных» CAR, включая LAG-3, Tim-3, IDO-1,2 В4 и KIR. Другие внутриклеточные ингибиторы TIL включают фосфатазы (SHP1), убиквитин-лигазы (то есть cbl-b), и киназы (то есть киназа диацилглицерола). «Бронированные» CAR-T также могут быть сконструированы для экспрессии белков или рецепторов, которые защищают их против цитокинов или делают их устойчивыми к эффектам секретированных опухолью цитокинов. Например, CTL (цитотоксические Т-лимфоциты), преобразованные с двойной отрицательной формой TGF-β, являются рецепторами, которые устойчивы к иммуносупрессии лимфомой, секретирующей TGF-β. Эти преобразованные клетки продемонстрировали высокую противоопухолевую активность в условиях in vivo, по сравнению с их контрольными аналогами.

Тандемные и двойные CAR Т-клетки являются уникальными в том, что они обладают двумя различными антигенсвязывающими доменами. Тандемный CAR содержит два последовательных антигенсвязывающих домена, располагающихся перед экстрацеллюлярным пространством, связанных с внутриклеточными костимуляторными и стимуляторными доменами. Двойной CAR является конструктом, в котором один внеклеточный антигенсвязывающий домен связан с внутриклеточным костимуляторным доменом и второй отличающийся экстрацеллюлярный антигенсвязывающий домен соединен с внутриклеточным стимуляторным доменом. Поскольку стимуляторные и костимуляторные домены разделены между двумя отдельными антигенсвязывающими доменами, двойные CAR также упоминаются как «расщепленные CAR». Такая конструкция тандемных и двойных CAR, которая соединяет оба антигенсвязывающих домена, является необходимой для передачи сигналов из цикла CAR в Т-клетки. Поскольку эти два дизайна CAR обладают связывающей способностью с различными отличающимися антигенами, они также упоминаются как «биспецифические» CAR.

Одним из основных беспокойств относительно CAR Т-клеток как формы «терапевтической жизнеспособности» является их манипулируемость в условиях in vivo и потенциальное стимулирование иммунных побочных эффектов. Для оптимизации контроля терапии CAR-T и предотвращения нежелательных побочных эффектов, были сконструированы формы с различными функциональными характеристиками, включая отключение, механизмы безопасности, и условные контрольные механизмы. Например, сконструированы самоликвидирующиеся и маркированные/меченные CAR Т-клетки для обеспечения «отключения» поддержки клиренса этих CAR-экспрессирующих Т-клеток. Самоликвидирующиеся CAR-T содержат CAR, но также сконструированы для экспрессии проапоптотического суицидального гена или «гена элиминации», индуцибельного при введении экзогенной молекулы. Для этой цели может использоваться множество суицидальных генов, включая HSV-TK (тимидин киназу вируса простого герпеса), Fas, iCasp9 (индуцибельную каспазу 9), CD20, MYC tag, и укороченный EGFR (рецептор эндотелиального фактора роста). Например, HSK может преобразовывать неактивную форму ганцикловира (GCV) в GCV-трифосфат, который включается непосредственно в реплицирующуюся ДНК, в конечном счете, приводя к гибели клетки. iCasp9 является химерным белком, который содержит фрагменты РК506-связанного белка, который связывает малую молекулу АР1903, вызывая димеризацию каспазы 9 и апоптоз. Маркированные/меченные CAR Т-клетки содержат CAR, но также сконструированы для экспрессии селективного маркера. Введение mAb против этого селективного маркера будет промотировать клиренс CAR Т-клеток. Укороченный EGFR является одним из наводимых антигенов при анти-EGFR mAb терапии, поэтому введение цетуксимаба промотирует элиминацию этих CAR Т-клеток. CAR, сконструированные с такими функциональными характеристиками, также упоминаются как sCAR для «переключаемых» CAR и RCARs для «регуляторных» CAR. «Безопасные CAR», также известные как «ингибирующие CAR» (iCAR), сконструированы для экспрессии двух антигенсвязывающих доменов. Один из этих внеклеточных доменов направлен против опухолесвязывающего антигена и связывается с внутриклеточным костимуляторным доменом и стимуляторным доменом. Однако второй внеклеточный антигенсвязывающий домен является специфическим для нормальной ткани и связан с внутриклеточными доменами контрольной точки иммунного ответа, такими как CTLA4, PD1, или CD45. Также возможна инкорпорация множественных внутриклеточных ингибирующих доменов в iCAR. Некоторые молекулы-ингибиторы, которые могут быть включены в эти ингибирующие домены, включают В7-Н1, В7-1, CD160, PIH, 2 В4, СЕАСАМ (СЕАСАМ^-1, СЕАСАМ^-3, и/или СЕАСАМ^-5), LAG-3, TIGIT, BTLA, LAIR1, и TGFβ-R. В присутствии нормальной ткани стимуляция этого второго антигенсвязывающего домена будет направлена на ингибирование CAR. Необходимо отметить, что вследствие этой двойной специфичности антигена, iCAR являются также формой биспецифических CAR Т-клеток. Разработка безопасных CAR-T повышает специфичность CAR Т-клеток для ткани опухоли, и выгодна в ситуациях, когда специфические нормальные ткани могут экспрессировать очень низкие уровни опухольассоциированного антигена, что может привести к нивелированию таргетных эффектов при применении стандартных CAR (Morgan 2010). Экспрессируемые условные CAR Т-клетки на внеклеточном антигенсвязывающем домене связываются с внутриклеточным костимуляторным доменом и отдельно с внутриклеточным костимулятором. Эти последовательности костимуляторного и стимуляторного домена сконструированы так, что при введении экзогенных молекул таким способом, получаем в результате белки, которые объединятся внутриклеточно для завершения цикла CAR. Таким образом, активация CAR может модулироваться, и может быть даже «точно подогнана» или специально персонифицирована для конкретного пациента. Подобно дизайну двойных CAR, стимуляторные и костимуляторные домены являются физически разделенными, когда условные CAR находятся в неактивном состоянии; по этой причине они также как называются «расщепленные» CAR.

В некоторых вариантах воплощения изобретения две или более из этих характеристик конструктов могут быть объединены для создания обогащенных многофункциональных CAR-T. Например, возможно создать CAR Т-клетку с двойным- или с условным- CAR дизайном, при котором также высвобождаются предпочтительные TRUCK цитокины. В некоторых вариантах воплощения изобретения условно двойная CAR Т-клетка может быть сконструирована такой, что она экспрессирует два CAR с двумя отдельными антигенсвязывающими доменами против двух различных опухолевых антигенов, каждый из которых связан со своими соответствующими костимуляторными доменами. Этот костимуляторный домен может быть функциональным со стимуляторным доменом только после введения активирующих молекул. В этой CAR Т-клетке для противоопухолевой эффективности должны экспрессироваться опухолевый антиген и стимуляторная молекула при введении субъекту, таким образом этот конструкт включает функциональные характеристики как двойных, так и условных CAR Т- клеток.

Как правило, клетки CAR-T созданы с использованием α-β Т-клеток, однако могут также использоваться γ-δ Т-клетки. В некоторых вариантах воплощения изобретения представленный конструкт CAR, домены и подходы генной инженерии для генерации CAR Т-клеток могут подобным образом использоваться для генерации других типов иммунных клеток, экспрессирующих CAR, включая клетки NK (естественных киллеров), В-клетки, тучные клетки, фагоциты миелоидного происхождения и клетки NKT. Альтернативно, может быть создана CAR-экспрессирующая клетка со свойствами Т-клетки и клеток NK. В дополнительном варианте воплощения изобретения трансдукция CAR может быть аутогенной или аллогенной.

Могут использоваться несколько различных подходов для экспрессии CAR, включая ретровирусную трансдукцию (включая γ-ретровирусы), лентивиральную трансдукцию, транспозоны/транспозазы (системы Sleeping Beauty и PiggyBac), и экспрессию генов, опосредованную переносом месенджеров РНК. Редактирование генов (инсерция, делеция/деструкция генов) является также важной процедурой относительно возможности конструирования CAR Т-клеток. Системы CRISPR-Cas9, ZFN (цинк-пальцевая нуклеаза) и TALEN (эффекторная нуклеаза, подобная активаторам транскрипции) являются тремя потенциальными подходами, с помощью которых могут быть сконструированы CAR Т-клетки.

Определения.

Термин «аминокислотная последовательность» относится к перечню сокращений, букв, символов или слов, представляющих остатки аминокислоты. Используемые в данном документе сокращения аминокислоты являются обычными кодами одной буквой для аминокислот и представлены следующим образом: А, аланин; В, аспарагин или аспарагиновая кислота; С, цистеин; D аспарагиновая кислота; Е, глутамат, глутаминовая кислота; F, фенилаланин; G, глицин; Н, гистидин; I, изо-лейцин; K, лизин; L, лейцин; М, метионин; N, аспарагин; Р, пролин; Q, глютамин; R, аргинин; S, серии; Т, треонин; V, валин; W, триптофан; Y, тирозин; Z, глютамин или глутаминовая кислота.

Термин «антитело» относится к иммуноглобулину, его производным, которые поддерживают специфическую связывающую способность, и к белкам, имеющим домен связывания, который является гомологичным или в значительной степени гомологичным к домену связывания иммуноглобулина. Эти белки могут быть получены из естественных источников, или частично или полностью получены искусственно. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть членом любого класса иммуноглобулина от любых видов, включая любой из классов иммуноглобулинов человека: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. В иллюстративных вариантах воплощения изобретения антитела, используемые со способами и составами, представленными в данном документе, являются производными класса IgG. В дополнение к интактным молекулам иммуноглобулина, также включены в термин «антитела» фрагменты или полимеры этих молекул иммуноглобулина, человеческих или гуманизированных версий молекул иммуноглобулина, которые избирательно связывают таргетный антиген.

Термин «аптамер» относится к олигонуклеиновой кислоте или молекулам пептида, которые связываются со специфической таргетной молекулой. Эти молекулы обычно отобраны из пула случайных последовательностей. Отобранные аптамеры способны адаптироваться к уникальным третичным структурам и опознавать молекулы-мишени с высокой аффинностью и специфичностью. «Аптамер нуклеиновой кислоты» представлен олигонуклеотидной кислотой ДНК или РНК, которая связывается с таргетной молекулой благодаря своей конформации и таким образом ингибирует или подавляет функции такой молекулы. Аптамер нуклеиновой кислоты может быть составлен из ДНК, РНК, или их комбинации. «Пептидный аптамер» является комбинаторной белковой молекулой с вариабельной пептидной последовательностью, включенной в пределах постоянного белкового каркаса. Идентификация пептидных аптамеров типично выполняется под строгим контролем условий дигибридизации в дрожжевых грибках, что повышает вероятность стабильности экспрессии аптамеров выбранного пептида и их корректного сворачивания во внутриклеточной среде.

Термин «носитель» означает компонент, состав, субстанцию или структуру, которая в комбинации с компонентом или составом, помогает или облегчает подготовку, хранение, введение, доставку, эффективность, селективность, или любую другую характеристику компонента или состава для его намеченного использования или цели. Например, носитель может быть выбран для минимизации любой деградации активного компонента и минимизировать любые неблагоприятные побочные эффекты у субъекта.

Термин «химерная молекула» относится к одной молекуле, созданной при присоединении к двум или более молекул, которые существуют отдельно в их исходном состоянии. Одна химерная молекула обладает желательными функциональными возможностями всех составляющих ее молекул. Одной из форм химерной молекулы является слитый белок.

Термин «слитый белок» относится к полипептиду, сформированному присоединением двух или более полипептидов через пептидный мостик, образованный между терминальным концом аминокислоты одного полипептида и карбоксильным терминальным концом аминокислоты другого полипептида. Слитый белок может быть сформирован химической конъюгацией составляющих полипептидов, или может быть экспрессирован как одиночный полипептид из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей один сопряженный слитый белок. Одна цепь слитого белка является слитым белком, имеющим один сопряженный полипептидный остов. Слитые белки могут быть получены при использовании традиционных методов молекулярной биологии, для присоединения к этим двум генам в структуре одной нуклеиновой кислоты, а затем экспрессироваться на нуклеиновой кислоте в адекватной клетке организма при условиях, в которых получен слитый белок.

Термин «идентичность» относится к идентичной последовательности между двумя молекулами нуклеиновой кислоты или полипептидами. Идентичность может быть определена при сравнении положения каждой последовательности, которая может быть нормирована для целей сравнения. Если положение в сравниваемой последовательности занято тем же основанием, тогда в этом положении молекулы идентичны. Степень подобия или идентичности между нуклеиновой кислотой или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных или соответствующих нуклеотидов в положениях, разделенных последовательностями нуклеиновой кислоты.

Могут использоваться различные алгоритмы нормирования и/или программы для расчета идентичности между двумя последовательностями, включая FASTA, или BLAST, которые доступны как часть пакета для анализа последовательности GCG (University of Wisconsin, Madison, Wis.). Они могут использоваться, например, с нормированием по умолчанию. Например, рассматриваются полипептиды, имеющие по меньшей мере 70, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичности к определенным полипептидам, представленным в данном документе и демонстрирующие предпочтительно те же самые функции, что и полинуклеотид, кодирующий такие рассмотренные полипептиды. Если иначе не указано оценка подобия основывается на использовании BLOSUM62. Когда используется BLASTP, процент идентичности основан на оценке положительных BLASTP, а процент идентичности последовательности на оценке идентичных BLASTP. BLASTP «идентичности» демонстрируют количество и фракцию общих остатков с высокой оценкой идентичных пар последовательностей; и «положительная» BLASTP оценка демонстрирует количество и фракцию остатков, для которых оценка нормирования является положительным значением и которые идентичны между собой. Аминокислотные последовательности, которые характеризуются такой же степенью идентичности или подобия, или любой промежуточной степенью идентичности подобия последовательностям аминокислоты, описанной в данном документе, рассмотрены и охвачены этим описанием. Полинуклеотидные последовательности подобных полипептидов выведены с использованием генетических кодов и могут быть получены обычными средствами, в частности, обратной трансляцией их аминокислотных последовательностей, используя генетический код.

Термин «нуклеиновая кислота» относится к естественной или синтетической молекуле, включающей один нуклеотид или два или более нуклеотида, связанных через фосфатную группу в 3' положении одного нуклеотида к 5' концам другого нуклеотида. Нуклеиновая кислота не ограничена длиной, и таким образом нуклеиновая кислота может включать дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК).

Термин «функционально связанный с» относится к функциональным взаимодействиям нуклеиновой кислоты с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Промоторы, энхансеры, транскрипционные и трансляционные стоп сайты и другие сигнальные последовательности являются примерами последовательностей нуклеиновой кислоты, функционально связанными с другими последовательностями. Например, функциональная связь ДНК с транскрипционным контрольным элементом относится к физической и функциональной взаимосвязи между ДНК и промотором таким образом, что транскрипция такой ДНК начата от промотора РНК полимеразой, которая специфично узнает, связывает и транскрибирует ДНК.

Термины «пептид», «белок» и «полипептид» использованы попеременно, чтобы обратиться к естественной или синтетической молекуле, включающей две или более аминокислот, связанных карбоксильной группой одной аминокислоты с альфа-аминогруппой другой аминокислоты.

Термин «фармацевтически приемлемый» относится к таким компонентам, материалам, составам, и/или формам дозировки, которые являются с медицинской точки зрения приемлемыми для использования в контакте с тканями человека и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции, или других проблем или осложнений, соразмерных с обоснованным соотношением польза/риск.

Термин «белковый домен» относится к части белка, частям белка, или всему белку, показывая структурную целостность; это определение может быть основано на аминокислотном составе части белка, частей белка, или всего белка.

Термин «спейсер», используемый в данном документе, ссылается на пептид, который присоединяется к белкам, включающим слитые белки. Обычно спейсер не обладает специфической биологической активностью кроме присоединения к белкам или сохранения некоторого минимального расстояния или других пространственных взаимосвязей. Однако аминокислоты в составе спейсера могут быть выбраны для влияния на некоторые свойства молекулы, такие как скручивание, суммарный заряд или гидрофобность этой молекулы.

Термин «специфично связывается», используется в данном документе, когда ссылаются на полипептид (включая антитела) или рецептор, и относится к реакции связывания, которая является определяющей наличие белка, полипептида или рецептора в гетерогенной популяции белков и других биологически активных веществ. Таким образом, при определенных условиях (например, в условиях иммунологического анализа в случае антител), указанный лиганд или антитело «специфично связывается» со своей специфической «мишенью» (например, антитело специфично связывается с эндотелиальным антигеном), если с мишенью не связываются в значительном количестве другие белки, присутствующие в образце, или другие белки, с которыми лиганд или антитело могут сталкиваться в организме. Как правило, первая молекула, которая «специфично связывает» вторую молекулу, имеет константу аффинности (Ка) больше чем приблизительно 10⁵ М^-1 (например, 10⁶ М^-1, 10⁷ М^-1, 10⁸ М^-1, 10⁹ М^-1, 10¹⁰ М^-1, 10¹¹ М^-1, и 10¹² М^-1, или больше) с той второй молекулой.

Термин «специфическая доставка», используемый в данном документе, относится к предпочтительной связи молекулы с клеткой или тканью, носящей специфическую молекулу-мишень или маркер, но не с клетками или тканями, в которых отсутствует эта молекула-мишень. Общепризнано, что определенная степень неспецифического взаимодействия может встречаться между молекулой и нетаргетной клеткой или тканью. Однако специфическая доставка возможна при специфическом узнавании молекулы-мишени. Как правило, специфическая доставка приводит к намного более сильной ассоциации между доставляемой молекулой и клетками, несущими таргетную молекулу, по сравнению с доставляемой молекулой и клетками, которые обладают слабым сродством к молекуле-мишени.

Термин «субъект» относится к любому индивидууму, который является целью назначения или терапии. Субъект может быть позвоночным, например, млекопитающим. Таким образом, субъектом может быть пациент человек или ветеринарный пациент. Термин «пациент» относится к субъекту при его клиническом лечении, например, врачом.

Термин «терапевтически эффективное» относится к такому количеству используемой фармацевтической формы, которая способна улучшить одну или более причин или симптомов заболевания или нарушения. Такое улучшение требует только уменьшения или изменения, но не обязательно устранения.

Термины «трансформация» и «трансфекция» означают введение нуклеиновой кислоты, например, вектора экспрессии, в клетку реципиента, включая введение нуклеиновой кислоты в ДНК хромосом заявленной клетки.

Термин «лечение» относится к клиническому контролю пациента с намерением его излечить, повысить качество жизни, стабилизировать, или предотвратить заболевание, патологическое состояние или расстройство. Этот термин включает активное лечение, то есть лечение, направленное специфично на излечение заболевания, патологического состояния, или расстройства, а также включает этиотропную терапию, то есть, лечение, направленное на удаление причины соответствующего заболевания, патологического состояния, или расстройства. Кроме того, этот термин включает паллиативную терапию, то есть лечение, направленное на купирование симптомов, а не на излечение заболевания, патологического состояния или расстройства; профилактическое лечение, то есть лечение, направленное на уменьшение, частичное или полное ингибирование развития соответствующего заболевания, патологического состояния, или расстройства; и поддерживающую терапию, то есть, лечение, используемое для поддержки другой специфической терапии, направленной на излечение заболевания, патологического состояния или расстройства.

Термин «вариант» относится к аминокислоте или пептидной последовательности, имеющей консервативные аминокислотные замены, неконсервативные аминокислотные замены (то есть вырожденный вариант), замены в пределах положения колебания каждого кодона, кодирующего аминокислоту (то есть ДНК и РНК), аминокислотам, добавленным к С-терминальному пептиду, или пептиду, имеющему 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99% идентичности последовательности относительно контрольной последовательности.

Термин «вектор» относится к последовательности нуклеиновой кислоты, способной транспортировать в клетку другую нуклеиновую кислоту, которая связана с векторной последовательностью. Термин «вектор экспрессии» включает любой вектор (например, плазмиду, космиду или хромосому бактериофага), содержащий генную конструкцию в форме, подходящей для экспрессии клеткой (например, связанный с транскрипционным контрольным элементом).

Представлены многие варианты воплощения изобретения. Однако предполагается, что могут быть выполнены различные модификации, не отступая от тенденции и в границах объема изобретения. Соответственно, другие варианты воплощения изобретения находятся в границах следующей формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Разработан полный мышиный конструкт против CD19 мыши для валидации B-ALL как таргетный к С019-опосредованным CAR Т-клеткам (Davila et al., 2013 PLoS One 8:e61338). Он включал m1928z CAR 2-го поколения, который содержит CD28 костимуляторный домен (Фиг. 1). Костимуляторный домен CD28, используемый в CAR Т-клетках представлен цитоплазматическим концевым сегментом CD28, который не обладает собственной ферментативной активностью, но содержит субдомены или мотивы, которые регулируют передачу сигналов Т-клеток. Мотив YMNM (ID №:1 SEQ) является связывающим сайтом для р85 субъединицы PI3k и костимуляция CD28 поддерживает активацию PI3k, приводя к прогрессии клеточного цикла, антиапоптозу и клеточному метаболизму (Rudd and Schneider, 2003 Nat Rev Immunol 3:544-556; Sasaki et al., 2000 Science 287:1040-1046; Wang and Rudd, 2008 Trends Cell Biol 18:486-493).

В исследовании на мышах с мутированным доменом YMNM (ID NO: 1 SEQ) блокируется передача сигнала PI3k без нарушений, связанных с эффектами в условия in vivo (Dodson et al., 2009). Мотив PYAP (ID NO: 3 SEQ) CD28 связывает LCK, что приводит к активации Т-клеток и секреции IL2 (Holdorf et al., 1999 J Exp Med 190:375-384; Kim et al., 1998 J Biol Chem 273:296-301). Другие молекулы с доменами SH3, включая Fyn, Grb2 и GADS также связывают мотивы PYAP (SEQ ID NO: 3) PRRP (SEQ ID NO: 2) (Ellis et al., 2000 J Immunol 164:5805-5814; Okkenhaug and Rottapel, 1998 J Biol Chem 273:21194-21202). Мыши с мутациями в домене PYAP (ID NO: 3 SEQ) демонстрировали заметно менее выраженную пролиферацию, зависимую от CD28, секрецию цитокина и адаптивный иммунитет (Burr et al., 2001 J Immunol 166:5331-5335; Dodson et al., 2009 Mol Cell Biol 29:3710-3721; Friend et al., 2006 J Exp Med 203:2121-2133). Совместно эти результаты демонстрируют, что субдомены CD28 опосредуют различную передачу сигналов и функциональных сигнальных путей и являются дифференцированно обязательными для Т-клеточной функции. Кроме того, известно, что CD28 усиливает низкоуровневые сигналы TCR (Acuto and Michel, 2003 Nat Rev Immunol 3:939-951), и эти данные поддерживают модель, где низкоуровневая тоническая сигнальная система CAR усилена в CD28, что приводит в условиях in vivo к истощению CAR Т-клеток. Остается неясным, каким образом эти субдомены и их сигнальные пути регулируют функцию CAR Т-клеток, следовательно, выполнены эксперименты для определения их роли и моделирования оптимального сигнального конструкта для трансляции у человека. В связи с этим, была разработана серия из 7 мутантов в YMNM субдоменах (ID SEQ №: 1), PRRP (ID №:2 SEQ), или PYAP (ID №:3 SEQ) (Фиг. 2A). Эти CAR конструкты включают или нуль-мутации одного субдомена (Mut01-Mut03) или 2 мутированных субдомена, оставляя только один функциональный субдомен (Mut04-Mu06). Также был создан тройной мутант (Mut07) со всеми тремя мутированными субдоменами. Эти CAR CD28Mut были оценены в Т-клетках из Nur77^GFP мышей и определены все сигнальные пути, поддерживаемые CAR, хотя двойные мутанты (Mut04-Mut06) демонстрировали более низкие уровни Nur77^GFP, подобные уровню 1 поколения m19z CAR (Фиг. 14В). Используя эти мутанты CD28 и другие новые модели CAR оценен механизм истощения CAR Т-клеток при костимуляции CD28, а также были идентифицированы подходы, снижающие истощение, с целью увеличения персистенции.

Для определения регулирующей роли костимуляторных субдоменов CD28 для условий функционирования in vitro и in vivo СР19-таргетных CAR Т-клеток, определялся вклад каждого субдомена в функционирование CAR Т-клеток, используя мутанты CD28 (Фиг. 2А). Оценивали выработку цитокина и субпопуляции клеток памяти CAR Т-клеток мутированного CD28, показано, что в двойных мутантах (Mut04-06) повышалась секреция IFN-γ по сравнению с одиночными мутантами (Mut01-03), в то время как все мутированные CD28 также продуцируют более низкие уровни IL2 (Фиг. 3А-В). Субпопуляции CAR Т-клеток СМ и ЕМ были в значительной степени сохранены, но демонстрировали различные эффекты, так Mut04 был ниже в субпопуляции СМ и повышался в субпопуляции ЕМ (Фиг. 3C-D). Эти результаты демонстрируют отличительные исходы в мутантах CD28, которые могут быть связаны с различной индукцией транскрипционных проводящих путей, таких как АР1, NFAT, или NFKB. Такие модификации могут представлять усовершенствованный конструкт CAR для повышения уровня ответа, снижения развития рецидива, и наиболее важно, повышать показатель выживаемости пациентов с формами рака, рефрактерных к терапии.

Пример 2

Для дальнейшей оценки в условиях in vitro и in vivo функции мутированных CD28 CAR Т-клеток мыши, были определены Т-клетки с мутированными CAR и их влияние на выживаемость (Фиг. 4), и пролиферацию (Фиг. 5). Также охарактеризована продукция секретируемых цитокинов в CAR Т-клетках, полученных у нормальных мышей дикого типа и инкубированных с 3T3-mCD19 в течение ночи, с последующим измерением уровней секретируемых цитокинов. CAR Т-клетки Mut06 секретируют значительно меньше цитокинов по сравнению с немутированными клетками 1928z, но значительно больше цитокинов по сравнению с CAR первого поколения (Фиг. от 6А до 6D). Также была охарактеризована таргетная цитотоксичность в CAR Т-клетках, полученных у нормальных мышей дикого типа и инкубированных с 3T3-mCD19, которая измерялась методом RTCA в течение свыше 1 недели. CAR Т-клетки с мутированным CD28 демонстрируют показатели цитотоксичности близкие к немутированным CAR Т-клеткам, в то время как отношения нижнего предела цитотоксичности Е:Т mut06 выше (Фиг. 7А и 7В). CAR Т-клетки (CD3+ CAR+) в количестве 1×10⁶ были в/в введены в цитотоксане (300 мг/кг) предварительно обработанным мышам дикого типа C57BL/6, а затем измерялась В-клеточная цитотоксичность и персистенция CAR Т-клеток с помощью последовательной проточной цитометрии образцов крови. На 1 неделю (Фиг. 8А, 8В), 2 неделю (Фиг. 8С, 8D), 4 неделю (Фиг. 8Е, 8F), и 6 неделю (Фиг. 8G, 8Н) мыши с Mut06 и 1928z CAR Т-клетками демонстрировали подобную цитотоксичность В-клеток и количество CAR Т-клеток in vivo (Фиг. от 8А до 8Н, от 9А до 9D). Сравнивалась также цитотоксичность in vivo при лейкозе различных С019-таргетных CAR Т-клеток. Через шесть дней после введения клеток Eu-ALL мышам дикого типа C57BL/6 внутрибрюшинно, на следующий день в/в введено в цитоксане (300 мг/кг) CAR Т-клетки в количестве 3×10⁵. У мышей с опухолью Eu-ALL, которым вводились mut06 CAR Т-клетки, отмечено значительно более длинный период выживания, по сравнению с теми, которым вводились 1928z Т-клетки CAR-T (Фиг. 10). Такие наблюдения были также характерны для модифицированных CD28 человека, CD19-таргетных CAR Т-клеток человека. Используя Т-клетки, полученные у здоровых доноров и модифицированные С019-таргетными CAR Т-клетками человека была оценена их выживаемость, пролиферация и цитотоксичность. Показатели выживаемости и пролиферации мутированных CD28 CAR Т-клеток человека были сравнимы с немутированными CAR Т-клетками при анализе подсчета клеток с окраской трипановым синим (Фиг. 11А и 11В). Кроме того, все CAR Т-клетки человека демонстрировали подобную пролиферацию в условиях in vitro после стимуляции 3Т3 клеток, которые экспрессируют человеческий CD19 (Фиг. 12). По сравнению с немутированными CAR Т-клетками человеческие mut06 CAR Т-клетки цитотоксичны к 3Т3-человеческим клеткам CD19, с показателями подобными тем, что определялись методом RTCA (Фиг. 13).

Если не обозначено иначе, то все технические и научные термины, использованные в данном документе, представлены в общепринятой современной понятной научной интерпретации, которая требуется описанным изобретением. Публикации, процитированные в данном изобретении и материалы, для которых они процитированы, включены в документ посредством ссылки.

В данном документе описана утвержденная современная научная и экспериментальная терминология, которая традиционно используется и представлена для специфических вариантов воплощения этого изобретения. Такие эквиваленты предназначены для охвата следующей формулой изобретения.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> H. Lee Moffitt Cancer Center

<120> ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ С МУТИРОВАННЫМИ КОСТИМУЛЯТОРНЫМИ

ДОМЕНАМИ CD28

<130> 320803-2160

<150> US 62/529,919

<151> 2017-07-07

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Tyr Met Asn Met

1

<210> 2

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Pro Arg Arg Pro

1

<210> 3

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

Pro Tyr Ala Pro

1

<210> 4

<211> 4

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Ala Ala Ala Ala

1

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к полипептиду химерного антигенного рецептора (CAR), специфически связывающему опухолеассоциированный антиген (TAA), где указанный CAR включает TAA-связывающий домен, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и костимуляторный сигнальный участок, в котором костимуляторный сигнальный участок включает мутированную форму цитоплазматического домена CD28. Также раскрыта иммунная эффекторная клетка, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую вышеуказанный полипептид CAR. Изобретение эффективно для обеспечения противоопухолевого иммунитета у субъекта-млекопитающего с TAA-экспрессирующим злокачественным новообразованием. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Полипептид химерного антигенного рецептора (CAR), специфически связывающий опухолеассоциированный антиген (TAA), где указанный CAR включает TAA-связывающий домен, трансмембранный домен, внутриклеточный сигнальный домен и костимуляторный сигнальный участок,

где костимуляторный сигнальный участок включает мутированную форму цитоплазматического домена CD28, (i) не имеющую субдомена YMNM или имеющую нулевую мутацию в субдомене YMNM, (ii) не имеющую субдомена PRRP или имеющую нулевую мутацию в субдомене PRRP и (iii) имеющую субдомен PYAP; или

где костимуляторный сигнальный участок включает мутированную форму цитоплазматического домена CD28, (i) не имеющую субдомена YMNM или имеющую нулевую мутацию в субдомене YMNM, (ii) не имеющую субдомена PRRP или имеющую нулевую мутацию в субдомене PRRP и (iii) не имеющую субдомена PYAP или имеющую нулевую мутацию в субдомене PYAP.

2. Полипептид CAR по п. 1, где указанная мутированная форма цитоплазматического домена CD28 не имеет субдомена PYAP или имеет нулевую мутацию в субдомене PYAP.

3. Полипептид по п. 1 или 2, где внутриклеточный сигнальный домен включает CD3-zeta (CD3ζ) сигнальный домен.

4. Иммунная эффекторная клетка, экспрессирующая полипептид CAR по п. 1 или 2, включающая молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид CAR по п. 1 или 2.

5. Иммунная эффекторная клетка по п. 4, где указанная иммунная эффекторная клетка представляет собой цитотоксический Т-лимфоцит (CTL).

6. Иммунная эффекторная клетка по п. 5, где указанная иммунная эффекторная клетка демонстрирует противоопухолевый иммунитет, когда TAA-связывающий домен CAR связывается с TAA на клетке злокачественного новообразования.

7. Способ обеспечения противоопухолевого иммунитета у субъекта-млекопитающего с TAA-экспрессирующим злокачественным новообразованием, причем способ включает введение субъекту эффективного количества иммунной эффекторной клетки, генетически модифицированной для экспрессии полипептида CAR по п. 1 или 2, таким образом, обеспечивая противоопухолевый иммунитет у указанного субъекта-млекопитающего.

8. Способ по п. 7, где эффекторная иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки, клетки-естественного киллера (NK), цитотоксического Т-лимфоцита (CTL) и регуляторной Т-клетки.

9. Способ по п. 7 или 8, где способ дополнительно включает введение субъекту ингибитора контрольных точек иммунного ответа.

10. Способ по п. 9, где ингибитор контрольных точек иммунного ответа содержит антитело против PD-1, антитело против PD-L1, антитело против CTLA-4 или их комбинацию.