СИНТЕТИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ ГИПЕРГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ПРОТЕАЗО-РЕЗИСТЕНТНОГО ПОЛИПЕПТИДА, ПЕРОРАЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ ТАКИХ ВАРИАНТОВ Российский патент 2010 года по МПК A61K38/21 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств на основе гликозилированных, протеазоустойчивых и гликозилированных протеазоустойчивых протеинов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Применение протеинов в качестве терапевтических средств приобрело клиническое значение. Однако сохраняются различные сложности и недостатки для их применения, включая иммуногенность; разрушение терапевтических протеинов ферментами, которые вырабатываются организмом-хозяина; недостаточные фармакокинетические свойства; и т.п. Например, иммуногенность терапевтического протеина может привести к нейтрализации активности протеина нейтрализующими антителами, которые со временем вырабатываются у субъекта, получающего лечение. Также, иммуногенность терапевтического протеина может привести к развитию воспалительной реакции. Разрушение терапевтического протеина ферментами организма-хозяина может исключить применение некоторых путей его введения. Например, пероральное введение терапевтических протеинов может быть пригодным для лечения некоторых заболеваний; однако терапевтический протеин может быть разрушен ферментами в желудочно-кишечном тракте индивидуума, получающего лечение. Кроме того, терапевтический протеин может иметь короткое время полувыведения из сыворотки, вследствие, например, быстрой элиминации протеина ретикулоэн-дотелиальной системой хозяина; в результате, фармакокинетический профиль терапевтического протеина может быть таким повторяющимся, что существует необходимость его многократного введения.

[0003] Многие протеины с лечебным действием включают один или более центры гликозилирования, например, аминокислотные последовательности, которые гликозилированы эукариотической клеткой. Сделано несколько сообщений о попытках повышения степени гликозилирования терапевтических протеинов для того, чтобы обеспечить 1) снижение иммуногенности; 2) не многократное введение протеина; 3) повышение время полувыведения из сыворотки; и 4) снижение вредных побочных эффектов, таких как воспаление.

[0004] Разрушение терапевтического протеина ферментами организма-хозяина может исключить применение некоторых путей его введения. Например, пероральное введение терапевтических протеинов может быть пригодным для лечения некоторых заболеваний; однако терапевтический протеин может быть разрушен ферментами в желудочно-кишечном тракте и/или в сыворотке индивидуума, получающего лечение. Такие протеолитические ферменты включают, например, α-химотрипсин, карбоксипептидазу, эндопротеиназу Arg-C, эндопротеиназу Asp-N, эндопротеиназу Glu-С, эндопротеиназу Lys-C и трипсин.

[0005] Существует необходимость для терапевтических протеинов в лекарственных формах для перорального применения, имеющих пригодные фармокинетические свойства. Заявленное изобретение направлено на решение данной необходимости.

Источники информации

[0006] Патент U.S. No. 6685933; Патент U.S. No. 4695623 и 4897471; Патент U.S. No. 6703225; Патент U.S. No. 6569420; Патент U.S. No. 6299877; Патент U.S. No. 6586398; Патент U.S. No. 6531122; Патент U.S. No. 6646110; Egrie and Brown, Br J Cancer. 2001 Apr; 84 Suppi 1:3-10; Патент U.S. No. 6127332; WO 00/26354; WO 02/081507; WO 01/36001; Патент U.S. No. 5041376; Патент U.S. No. 5520911; Патент U.S. No. 6673580; Патент U.S. No. 5853724; Заявка на изобретение EU No. 640619; WO 04/022747; и WO 004/0222593. Nyman et al. (1998) Eur. J. Biochem. 253:485-493; Runkel et al. (1998) Pharmaceutical Research 15:641; Adolfet al. (1990) J. Biol. Chem. 265:9290-9295.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение дает представление о ненативных центрах гликозилирования, пероральных лекарственных формах вариантов протеазоустойчивых полипептидов и протеазоустойчивых или вариантов протеазоустойчивых, гипергликозилированных полипептидов, где варианты полипептидов содержат, по меньшей мере, один видоизмененный протеолитический сайт расщепления в месте нативного протеолитического сайта расщепления, найденного в родительском полипептиде, что, таким образом, проявляется повышение устойчивости к действию протеаз по сравнению с исходным полипептидом, где полипептидные варианты, кроме того, включают (1) углеводородную группу, ковалентно связанную, по меньшей мере, с одним ненативным сайтом гликозилирования, не найденного в исходном терапевтическом белке или (2) углеводородную группу, ковалентно связанную, по меньшей мере, с одним нативным сайтом гликозилирования, найденного, но не гликозилированного в исходном терапевтическом белке. Настоящим изобретением далее обеспечиваются композиции, включающие пероральные лекарственные композиции, содержащие гликозилированные или протеазоустойчивые, или протеазоустойчивые гипергликозилированные полипептидные варианты. Далее настоящее изобретение предоставляет нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептидные агонисты субъекта; и клетки организма-хозяина, содержащие нуклеиновые кислоты субъекта. Настоящее изобретение далее предоставляет способы лечения вирусных инфекций, способы лечения фиброзных нарушений и способы лечения пролиферативных нарушений, способы, как правило, включающие введение субъекту, при необходимости этого, эффективного количества рассматриваемого полипептидного агониста. Далее настоящее изобретение предоставляет емкости, устройства и наборы, содержащие гипергликозилированные или протеазоустойчивые или протеазоустойчивые, гипергликозилированные полипептидные варианты. Далее настоящее изобретение предоставляет способы лечения, включающие введение субъекту эффективного количества пероральной фармацевтической композиции, содержащей гипергликозилированный или протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант, при необходимости в этом.

ОТЛИЧИТЕЛЬНЫЕ ПРИЗНАКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] С одной стороны, изобретение представляет пероральные фармацевтические композиции, содержащие известный гипергликозилированный или протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант исходного терапевтического протеина.

[0009] С другой стороны, изобретение представляет пероральную фармацевтическую композицию, которая содержит первое число молей известного гипергликозилированного или протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного варианта в первой стандартной форме, где подтверждается, что парентеральная фармацевтическая композиция, содержащая второе количество молей исходного терапевтического протеина, является эффективной в лечении заболевания у пациента при применении пациенту путем подкожной болюсной инъекции в количестве, в которой пациент получил второе количество молей исходного терапевтического протеина, выбранного интервала между приемами, где первое количество молей больше, чем второе количество молей, и где после перорального введения первой стандартной формы пациенту, время, требующееся для выделения первого количества молей гипергликозилированного или протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного варианта, не больше, чем период времени выбранного дозированного интервала.

[0010] В другом аспекте, изобретением предоставляется пероральная композиция, которая содержит первичную дозу известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта в первой стандартной форме, где парентеральная фармацевтическая композиция, содержащая вторую дозу исходного терапевтического протеина, подтверждает, что является эффективной для лечения заболевания у пациента, при введении пациенту путем подкожной болюсной инъекции второй дозы из выбранного интервала между приемами, где количество известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта в молях лекарства на килограмм массы тела пациента в первой дозе больше, чем количество исходного терапевтического протеина в молях лекарства на килограмм массы тела пациента во второй дозе, когда первая и вторая дозы рассчитаны по среднему значению массы тела пациента в общей группе пациентов, страдающих заболеванием, и где после орального введения первой дозы пациенту, время, требующееся для выделения всего протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта при первой дозе, не больше, чем период времени между дозами в выбранном интервале между приемами. В некоторых примерах осуществления изобретения подтверждается, что парентеральная фармацевтическая композиция является эффективной для лечения заболевания у пациента при введении пациенту в дозе, рассчитанной по массе тела, из выбранного интервала между приемами, т.е. вторая доза является дозой, рассчитанной по массе тела, и парентеральная фармацевтическая композиция соответствует форме, которая предусматривает дозировку, рассчитанную по массе тела.

[0011] Далее настоящим изобретением предоставляются способы лечения, включающие введение эффективного количества пероральной фармацевтической композиции, содержащей известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант, субъекту, при необходимости в этом.

[0012] В другом аспекте, изобретением обеспечивается способ лечения заболевания у пациента, включающий ведение пациенту пероральной фармацевтической композиции, содержащей известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического протеина, где пероральная фармацевтическая композиция вводится перорально в количестве, при котором пациент получает первую дозу известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта при первом интервале между приемами, где доказано, что парентеральная фармацевтическая композиция, содержащая исходный терапевтический протеин, является эффективной в лечении заболевания у пациента, когда применяется для пациента путем подкожной болюсной инъекции в количестве, при котором пациент получает вторую дозу исходного терапевтического протеина, при втором интервале между приемами, где первая доза в молях протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта на килограмм массы тела пациента больше, чем вторая доза в молях исходного терапевтического протеина на килограмм массы тела пациента, когда первая и вторая дозы рассчитаны для одинаковой массы тела пациента, и где после перорального введения пациенту первой дозы, время, необходимое для высвобождения протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипер-гликозилированного полипептидного варианта в первой дозе не больше периода времени между дозами во второй период между приемами. В некоторых примерах, доказывается, что парентеральная фармацевтическая композиция является эффективной при введении пациенту в дозе, рассчитанной по массе тела, при втором интервале между приемами, т.е. вторая доза соответствует дозе, рассчитанной по массе тела, и парентеральная фармацевтическая композиция представлена в форме, которая предполагает дозировку, рассчитанную по массе тела. В некоторых вышеуказанных примерах, первая доза представляет собой дозу, рассчитанную по массе тела, и пероральная фармацевтическая композиция представлена в форме, которая предполагает дозировку, рассчитанную по массе тела.

[0013] В другом аспекте, изобретение представляет способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту пероральной фармацевтической композиции, содержащей известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического протеина, где пероральная фармацевтическая композиция вводится перорально в количестве, в котором пациент получил первую дозу известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта при первом интервале между дозами, где доказывается, что парентеральная фармацевтическая композиция, содержащая родительский терапевтический протеин, является эффективной в лечении заболевания у пациента при введении пациенту путем подкожной болюсной инъекции в количестве, в котором пациент получил вторую дозу исходного терапевтического протеина при втором интервале между дозами, где первая доза в молях протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта на килограмм массы тела пациента больше, чем вторая доза в молях исходного терапевтического протеина на килограмм массы тела пациента, в то время как первая и вторая дозы рассчитаны на одинаковую массу тела пациента, и где временной период между дозами в первый интервал между приемами является таким же или короче, чем временной период между дозами во второй интервал между приемами. В некоторых примерах доказывается, что парентеральная фармацевтическая композиция является эффективной для лечения заболевания у пациента при введении ее пациенту в дозе, рассчитанной по массе тела, во второй интервал между дозами, т.е. вторая доза является дозой, рассчитанной по массе тела, и парентеральная фармацевтическая композиция представлена в форме, которая допускает дозирование по массе. В некоторых вышеуказанных примерах, первая доза является дозой, рассчитанной по массе, и пероральная фармацевтическая композиция представлена в форме, которая допускает дозирование по массе.

[0014] В другом аспекте, изобретение представляет способ лечения заболевания у пациента, включающий введение пациенту пероральной фармацевтической композиции в первой стандартной форме, содержащей первое количество молей известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта родительского терапевтического протеина, где первое количество молей протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта больше, чем второе количество молей родительского терапевтического протеина в парентеральной фармацевтической композиции, где парентеральная фармацевтическая композиция является лекарственной формой немедленного высвобождения, пригодной для подкожного болюсного введения, где первая стандартная форма вводится перорально пациенту в первом интервале между приемами, что соответствует таковому или короче, чем второй интервал между приемами, и где доказывается, что родительский терапевтический протеин является эффективным в лечении заболевания у пациента при введении пациенту путем подкожной болюсной инъекции парентеральной фармацевтической композиции в количестве, при котором пациент получает второе количество молей родительского терапевтического протеина во второй интервал между дозами.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ.

[0015] Фигура 1 представляет аминокислотную последовательность человеческого зрелого IFN-α2a.

[0016] Фигура 2 представляет аминокислотную последовательность человеческого зрелого IFN-α2b.

[0017] Фигура 3 представляет аминокислотную последовательность человеческого IFN-β.

[0018] Фигура 4 представляет аминокислотную последовательность зрелого, нативного человеческого IFN-γ.

[0019] Фигура 5 представляет аминокислотную последовательность G-CSF.

[0020] Фигура 6 представляет аминокислотную последовательность гормона роста человека.

[0021] Фигура 7 представляет аминокислотную последовательность эритропоэтина.

[0022] Фигура 8 представляет аминокислотную последовательность GM-CSF.

[0023] Фигура 9 представляет аминокислотную последовательность консенсусного IFN-α

[0024] Фигура 10 представляет аминокислотную последовательность IFN-αс.

[0025] Фигура 11 представляет аминокислотную последовательность IFN-α2с.

[0026] Фигура 12 представляет аминокислотную последовательность IFN-αd.

[0027] Фигура 13 представляет аминокислотную последовательность IFN-α5.

[0028] Фигура 14 представляет аминокислотную последовательность IFN-α6.

[0029] Фигура 15 представляет аминокислотную последовательность IFN-α4.

[0030] Фигура 16 представляет аминокислотную последовательность IFN-α4b.

[0031] Фигура 17 представляет аминокислотную последовательность IFN-α1.

[0032] Фигура 18 представляет аминокислотную последовательность IFN-αJ.

[0033] Фигура 19 представляет аминокислотную последовательность IFN-αН.

[0034] Фигура 20 представляет аминокислотную последовательность IFN-αF.

[0035] Фигура 21 представляет аминокислотную последовательность IFN-α8.

[0036] Фигура 22 представляет аминокислотную последовательность IFN-β1

[0037] Фигура 23 представляет аминокислотную последовательность IFN-β2а.

[0038] Фигура 24 представляет сравнение аминокислотных последовательностей Infergen (SEQ ID NO:**) и видов Интерферона 1 типа (человеческий IFN-α2b, SEQ ID NO:2; человеческий IFN-α14, SEQ ID NO:**; человеческий IFN-β1, SEQ ID NO:**; человеческий IFN-ω1, SEQ ID NO:**), которые, как сообщалось, гликозилированы по природе. Аминокислотные остатки, где имеет место гликозирование, помечены обведенным полужирным курсивом клетками. Аспарагиновые остатки являются участками связывания для N-связанных центров гликозилирования и треониновый остаток является участком связывания для O-связанных центров гликозилирования. Фигура 24 также представляет доминирующую последовательность (SEQ ID NO:**) с учетом сравнения.

[0039] Фигура 25 представляет сравнение аминокислотных последовательностей аминокислот 61-120 Infergen (SEQ ID NO:**) и типичных синтетических полипептидных агонистов рецептора интерферона 1 типа. Сайты 1, 2 и 3 являются примерами положений, где формируются центры гликозилирования. N-связанные центры гликозилирования формируются на Сайтах 1 и 2. Оба N-связанный и O-связанный центры гликозилирования формируются на Сайте 3.

[0040] Фигура 26 представляет синтетическую последовательность нуклеиновых кислот Infergen млекопитающих с преимущественным использованием человеческого кодона; и транслированную открытую рамку считывания (SEQ ID NO:**). Открытая рамка считывания свидетельствует о транслированной аминокислотной последовательности Infergen (SEQ ID NO:1). Шесть пар комплиментарных праймеров от А до F показаны в чередующемся курсивном и жирном тексте. Верхние смысловые нити пар праймеров отождествляют с нечетным числом и нижние несмысловые нити отождествляют с четным числом. В области 3'-5' направления стартового ATG-кодона сконструирована короткая последовательность GCCACC, консенсусная последовательность Kozak, для повышения эффективности эукариотической трансляции. Два тандемных стоп-кодона - ТАА и TGA - используются для обеспечения завершения терминации трансляции.

[0041] Фигура 27 представляет сравнение последовательности нуклеиновой кислоты млекопитающих Infergen и их гликозилированных мутантов. Нуклеотиды, которые отличаются, представлены в клетках. Кодоны, применяемые с учетом использования предпочтительного кодона, представлены в Таблице 8.

[0042] Фигура 28 представляет сравнение аминокислотных последовательностей аминокислот 81-140 человеческого IFN-β1 (SEQ ID NO:**) и примерных гликозилированных вариантов человеческого IFN-β1. Сайты 1 и 2 соответствуют позициям, где образованы гликозилированные мутанты. Обычно, только N-связанные центры гликозилирования формируются на Сайте 1. Оба N-связанный и O-связанный центры гликозилирования формируются на Сайте 2. Естественные N-связанные центры гликозилирования в человеческом IFN-β1 и мутантах представлены в клетках.

[0043] Фигура 29 представляет сравнение аминокислотной последовательности аминокислот 81-140 человеческого IFN-ω1 (SEQ ID NO:**) и примерных гликозилированных вариантов человеческого IFN-col. Сайты 1 и 2 соответствуют позициям, где формируются гликозилированные мутанты. В общем, только N-связанные центры гликозилирования формируются на Сайте 1. Оба N-связанный и O-связанный центры гликозилирования формируются на Сайте 2. Естественные N-связанные центры гликозилирования в человеческом IFN-ω1 мутантах представлены в клетках.

[0044] Фигура 30 представляет сравнительный анализ первичной аминокислотной последовательности Infergen (SEQ ID NO:**), человеческого IFN-α14 (SEQ ID NO:**), человеческого IFN-β1 (SEQ ID NO:**) и примерных слитых белков с человеческим IFNα14 и человеческим IFN-β сигнальными пептидами (SEQ ID NOs:** и **, соответственно). Большинство последовательностей показаны выше (SEQ ID NO:**).

[0045] Фигура 31 представляет аминокислотную последовательность зрелого, нативного человеческого IFN-γ (SEQ ID NO:**).

[0046] Фигура 32 представляет анализ Western blot примерных пептидов, синтезированных клетками линии Cos-7.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

[0047] Термин "полипептид" относится к полимерам аминокислот и не относится к специфической длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин также не относится к или исключает посттрансляционные модификации полипептида, например, гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п. Включаются в термин "полипептид", например, полипептиды, содержащие один или более аналоги аминокислот (включая, например, неприродные аминокислоты, некодирующие аминокислоты и др.), полипептиды с замещенными связями, также как и другие модификации, известные из уровня техники, как природные, так и не встречающиеся в природе. Термин "полипептид" включает слитые белки, включая, но не ограничиваясь, слитые белки с гетерологичной аминокислотной последовательностью, слияния с гетерологичными и гомологичными лидерными последовательностями, с или без N-концевыми метиониновыми остатками; иммунологически меченые белки; и т.п.

[0048] Термины "полинуклеотид" и "молекула нуклеиновой кислоты" используются здесь как взаимозаменяемые, для обозначения полимерных форм нуклеотидов любой длины. Полинуклеотиды могут состоять из дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и/или их аналогов. Нуклеотиды могут иметь любую пространственную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Термин "полинуклеотид" включает одно-, двухспиральные и трехспиральные молекулы. "Олигонуклеотид" обычно относится к полинуклеотидам с между около 5 и около 100 нуклеотидами одно- или двухспиральной ДНК. Однако в контексте данной сущности изобретения, нет верхнего предела для длины олигонуклеотида. Олигонуклеотиды также известны как олигомеры или олиги и могут быть выделены из генов, или химически синтезированы с помощью способов, известных из уровня техники. Термин "полинуклеотид" включает двухспиральную ДНК, найденную, в частности, в линейных ДНК молекулах (напр., рестрикционные фрагменты), вирусах, плазмидах, и хромосомах.

[0049] Следующие являются неограничивающими примерами полинук-леотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированная ДНК любой последовательности, изолированная РНК любой последовательности, зонды для нуклеиновой кислоты и примеры. Молекула нуклеиновой кислоты может также содержать модифицированные молекулы нуклеиновой кислоты, например такие, как молекулы метилированной нуклеиновой кислоты и аналоги молекул нуклеиновой кислоты. Аналоги пуринов и пиримидинов известны из уровня техники. Нуклеиновые кислоты могут быть природными, например ДНК или РНК, или могут являться синтетическими аналогами, что известно из уровня техники. Такие аналоги могут быть предпочтительными для применения в качестве зондов из-за лучшей стабильности при аналитических условиях. Модификации нативных структур, включая альтерации остова, полисахаридных или гетероциклических оснований, показывают увеличение внутриклеточной стабильности и сродства к связыванию. Среди применимых химических альтераций остова являются фосфоротиоаты; фосфородитиоаты, где оба немостиковых кислорода заменены на серу; фосфорамидиты; алкил фосфотриэфиры и боранофосфаты. Ахиральные фосфатные дериваты включают 3'-O'-5'-S-фосфоротиоат, 3'-S-5'-O-фосфоротиоат, 3'-СН₂-5'-O-фосфонат и 3'-NH-5'-O-фосфороамидат. У пептидных нуклеиновых кислот весь рибозо-фосфодиэфирный остов заменен пептидной связью.

[0050] Полинуклеотид или полипептид имеет определенный процент "идентичности последовательностей" к другому полинуклеотиду или полипептиду, означая, что, при выравнивании, процент оснований или аминокислот является одинаковым, при сравнении двух последовательностей. Сходность последовательностей может быть определена целым рядом различных способов. Для определения идентичности последовательностей, последовательности могут быть выравнены при использовании способов и компьютерных программ, включая BLAST, которая общедоступна во всем мире на веб-сайте ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Смотри, напр., Altschul etal. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10. Другим алгоритмом выравнивания является программа FASTA, доступная в Genetics Computing Group (GCG), от Madison, Wisconsin, США, дочернее предприятие Oxford Molecular Group, Inc. Другие способы выравнивания описаны в Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., раздел Harcourt Brace & Co., San Diego, California, США. Заслуживают внимания программы выравнивания, которые позволяют делать интервалы в последовательностях. Алгоритм Смита-Ватермана является однотипным алгоритмом, который позволяет делать интервалы в выравниваемых последовательностях. Смотри Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Также, программа GAP, использующая способ выравнивания Needleman и Wunsch, может использоваться для выравнивания последовательностей. Смотри J Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

[0051] Термин "клетка-хозяин" включает индивидуальную клетку или культуру клеток, которые могут быть или являются реципиентом любого(ых) рекомбинантного(ых) вектора(ов) или синтетического или экзогенного полинуклеотида. Клетки хозяина включают потомство единичной клетки хозяина, и потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по набору тотальной ДНК) с первоначальной родительской клеткой вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения. Клетка-хозяин включает клетки, трансинфицированные или инфицированные in vivo или in vitro рекомбинантным вектором или синтетическим или экзогенным полинуклеотидом. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор, в изобретении называется "рекомбинантная клетка-хозяин". В некоторых примерах, клеткой-хозяином является прокариотическая клетка. В других примерах, клеткой-хозяином является эукариотическая клетка.

[0052] Термины "регуляторные последовательности ДНК" и "регуляторные элементы", использующиеся здесь как взаимозаменяемые, относятся к транскрипционным и трансляционным регуляторным последовательностям, например, промоторам, энхансерам, сигналам полиаденилирования, терминаторам, сигналам разрушения протеина и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют экспрессию кодирующей последовательности и/или продукцию кодированного полипептида в клетке-хозяине.

[0053] Термин "трансформация" используется здесь как равнозначный с термином "генетическая модификация" и относится к постоянному или транзиторному генетическому изменению, индуцированному в клетке, следующему за введением новой нуклеиновой кислоты (напр., экзогенной ДНК в клетку). Генетическое изменение ("модификация") может быть осуществлено либо путем включения новой ДНК в геном клетки-хозяина, либо путем временного или постоянного поддержания новой ДНК как эписомного элемента. Если клетка является клеткой млекопитающих, постоянное генетическое изменение обычно достигается путем включения ДНК в геном клетки.

[0054] Термин "функционально связанный", использованный здесь, относится к связи, в которой компоненты, изображенные таким образом, находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать установленным образом. Например, промотор является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если промотор воздействует на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.

[0055] Термин "конструкция", использующийся здесь, относится к рекомбинантной нуклеиновой кислоте, в особенности к рекомбинантной ДНК, которая сформирована в целях проявления специфической нуклеотидной последовательности(ей), или подлежит использованию в конструкции других рекомбинантных нуклеотидных последовательностей.

[0056] Для настоящего изобретения, термины "лечение", "подвергающийся обработке" и другие похожие, относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим в виде полного или частичного предупреждения болезни или ее симптома, и/или может быть лечебным в виде частичного или полного излечения болезни и/или побочного повреждения, присущего заболеванию. "Лечение", использованное здесь, охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, особенно у человека, и включает: (а) повышение времени жизни; (б) уменьшение риска смертельного исхода из-за заболевания; (в) профилактику возникновения заболевания у субъекта, который может иметь предрасположенность к заболеванию, но которому еще не вынесен диагноз, как имеющему такое заболевание; (г) подавление заболевания, т.е. подавление его развития (напр., снижение скорости прогрессирования заболевания); и (д) облегчение заболевания, т.е. ослабление симптомов заболевания.

[0057] Термины "индивидуум", "хозяин", "субъект" и "пациент", использующиеся здесь как равнозначные, относятся к млекопитающему, включая приматов, грызунов, домашний скот, домашних животных, лошадей, др. В некоторых примерах, индивидуумом является человек.

[0058] Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество терапевтического вещества или расход терапевтического вещества, достаточное для оказания желаемого терапевтического действия. Точное желаемое терапевтическое действие будет отличаться в зависимости от состояния лечащегося, композиции, которая применяется, и различных других факторов, которые являются понятными для среднего специалиста в данной области техники.

[0059] Под использующимися здесь терминами "доказанные как эффективные" в контексте лекарственной терапии для лечения заболевания, или любыми иными выражениями сходного значения, следует подразумевать значение, которое в лекарственной терапии, описанной таким образом, считалось, что является безопасным и эффективным, самостоятельно или в комбинации с одним или более дополнительным фармацевтическим средством(ами), для лечения заболевания в клиническом исследовании в контролируемых условиях или назначенном клиническом исследовании, которые обеспечивают один или более ранние клинические результаты исследования(ий) со статистической достоверностью р<0,05. Обычно исследования лекарственных средств, которые доказывают, что являются эффективными для лекарств, включают: (1) любое исследование показания(й) для лекарственного средства, обозначенного в лицензии к продаваемому лекарственному средству, выданной органом власти; и (2) любое исследования показания(й) для лекарственного средства, описанного в бюллетене, выпущенного общепризнанным органом медицинских экспертов (напр., NIH Consensus Statement).

[0060] Термин "связан специфически", в контексте связывания антител, относится к высокоавидному и/или высокоаффинному связыванию антитела с определенным участком полипептида, т.е. эпитопом полипептида, напр., рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. Например, связывание антитела со специфическим эпитопом рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа или его фрагментом является более сильным, чем связывание такого антитела с любым другим эпитопом, в особенности таким, которое может быть представлено в молекулах в ассоциации с, или в таком образце, как исследуемый специфический полипептид, например, связывается более сильно со специфическим эпитопом рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, чем с любыми другими эпитопами полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, так, что при подборке связующих условий, антитело связывается почти исключительно со специфическим эпитопом рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, а не с любым другим эпитопом полипептидного агониста рецептора интерферона I Типа, или с любым другим полипептидом, который не содержит эпитоп. Антитела, которые связываются специфически с полипептидом, могут быть способны к связыванию с другими полипептидами на слабом, едва детектируемом, уровне (напр., показано 10% или менее связывания к исследуемому полипептиду). Такое слабое связывание, или фоновое связывание, является легко заметным при специфическом связывании антител с рассматриваемым полипептидом, напр., при использовании адекватных контролей. Обычно, специфические антитела связываются с данным полипептидом с связывающим средством 10^-7 М или более, напр., 10^-8 М или более (напр., 10^-9 М, 10^-10 М, 10^-11 М и др.). Обычно, антитело со связующим сродством в 10^-6 М или менее не является пригодным для этого, т.к. оно не будет связывать антиген на детектируемом уровне, при использовании общепринятой методологии, применяющейся в настоящее время.

[0061] "Фиброзное состояние", "фиброзная болезнь" и "фиброзное нарушение" используются равнозначно для обозначения состояния, болезни или нарушения, которое является восприимчивым к лечению путем введения композиции, имеющей противофиброзную активность. Фиброзные нарушения включают, но не ограничиваются, фиброз легких, включая идиопатический фиброз легких (ИФЛ) и фиброз легких невыясненной этиологии, фиброз печени и фиброз почки. Другие примерные фиброзные состояния включают фиброз опорно-двигательного аппарата, фиброз сердца, послеоперационные спайки, склеродермию, глаукому и поражения кожи, как например келоиды.

[0062] Термин "пролиферативное нарушение" и "пролиферативное заболевание" используются равнозначно для обозначения любого заболевания или состояния, характеризующегося патологическим увеличением клеток или пролиферацией, в частности рака.

[0063] Термины "рак", "новообразование" и "опухоль" используются с равнозначным значением для обозначения клеток, которые проявляют относительно автономное размножение, таким образом, что они представляют нарушенный культуральный фенотип, характеризующийся существенной потерей контроля над клеточной пролиферацией. Раковые клетки могут быть доброкачественными либо злокачественными.

[0064] Термин "вирусная инфекция гепатита" относится к инфекции одного или более вирусов гепатита А, В, С, D, или Е, к вирусной инфекции гепатита, передаваемой с кровью, привлекающей особенный интерес, особенно вирусная инфекция гепатита С.

[0065] Термин "устойчивый вирусологический ответ" (УВО; также относится и к "устойчивому ответу" или "стойкому ответу "), который используется здесь, относится к реакции индивидуума на режим лечения инфекции HCV, в виде титра сыворотки HCV. Обычно, "устойчивый вирусологический ответ" относится к не детектированным HCV РНК (напр., менее чем около 500, менее чем около 200, или менее чем около 100 геномных копий на миллилитр сыворотки), найденным в сыворотке пациентов в период, по меньшей мере, около одного месяца, по меньшей мере, около двух месяцев, по меньшей мере, около трех месяцев, по меньшей мере, около четырех месяцев, по меньшей мере, около пяти месяцев, или, по меньшей мере, около шести месяцев, следующих за прекращением лечения.

[0066] Термин "лечение пациентов, не отвечающих" (или "лечение не отвечающих"), как используется здесь, обычно относится к HCV-инфицированным пациентам, которые не были в состоянии воспринимать предшествующее лечение HCV (относится, например, к "не-реагирующим") или которые изначально отвечали на предшествующее лечение, но у которых восприимчивость на лекарственную терапию не сохранилась (относится, например, к "рецидивным"). Предшествующее лечение обычно может включать лечение только IFN-α или комбинированную терапию IFN-α , где комбинированная терапия может включать применение IFN-α и противовирусного средства, такого как рибавирин.

[0067] Термин "процесс дозирования", как используется здесь, относится к введению противовирусного средства пациенту, при необходимости в этом, где процесс может осуществляться при одном или более высвобождении противовирусного средства из лекарства, дозированного средства. Таким образом, термин "процесс дозирования", как используется здесь, включает, но не ограничивает, установку постоянного средства доставки (напр., помпового или другого контролирующего высвобождение инъецируемого устройства); и однократное подкожное введение, следующее за установкой постоянного средства доставки.

[0068] "Системный" или "временный", которые используются в связи с лекарственной доставкой, предназначено для системы доставки лекарства, обычно в основном регулярной системы, в течение предварительно выбранного периода времени (напр., иной период, связанный, например, с инъекцией ударной дозы вещества). "Системная" или "временная" доставка лекарств означает осуществление доставки лекарств при увеличенной, сниженной, почти постоянной или пульсирующей скорости или диапазоне скоростей (напр., количество лекарства на единицу времени или объем лекарственной композиции в единице времени), и дальнейшее осуществление доставки, которая является постоянной или почти постоянной, или затяжной.

[0069] Термин "устройство, контролирующее доставку лекарств" предназначено для обозначения любого устройства, которое осуществляет высвобождение (напр., скоростное, временное высвобождение) лекарства или другого необходимого вещества, содержащегося в нем, контролируемого или измеряемого самим устройством и не значительно влияющим использующейся системой, или выделяемой при скорости, которая является воспроизводимой в использующейся системе.

[0070] Под "по существу постоянной", как здесь использовано, например, в контексте "по существу постоянная инфузия" или "по существу постоянная доставка" подразумевается обозначение доставки лекарственного средства таким образом, что является по существу беспрерывным в течение предварительно выбранного периода доставки лекарства, где количество лекарственного средства, полученного пациентом в течение любого 8 часового интервала в предварительно выбранный период, никогда не доходит до нуля. Кроме того, "по существу постоянной" доставкой лекарств также может включаться доставка лекарств при, по существу, постоянной, предварительно выбранной скорости или диапазоне скоростей (напр., количество лекарства на единицу времени или объем лекарства в единице времени), которые являются по существу беспрерывным в течение предварительно выбранного периода доставки лекарства.

[0071] Для целей настоящего изобретения, термин "пирфенидон" относится к 5-метил-1-фенил-2-(1Н)-пиридону. Как здесь используется, термин "аналог пирфенидона" относится к любой композиции Формулы I, IIА, или IIB, нижеследующих. "Специфический аналог пирфенидона" и все грамматические производные от него относятся, и ограничиваются, к любому и каждому аналогу пирфенидона, указанному в таблице 10.

[0072] Термин "антифиброзное" вещество, лекарственное средство или композиция предназначены для обозначения веществ, которые препятствуют или уменьшают фиброз, включая: агонисты рецептора интерферона II типа (напр., интерферона-гамма); пирфенидон и аналоги пирфенидона; антиангиогенные вещества, такие как антагонисты VEGF, антагонисты рецептора VEGF, bFGF антагонисты, антагонисты рецептора bFGF, антагонисты TGF-бета, и антагонисты рецептора TGF-бета; и противовоспалительные вещества, включая антагонисты фактора некроза опухоли (TNF), такие как анти-TNF антитела (напр., REMICADE^TM анти-TNF моноклональное антитело) и растворимый рецептор TNF (напр., ENBREL^TM TNF Ig рецептор иммуноадгезин), и антагонисты ИЛ-1, такие как ИЛ-1Ra.

[0073] Термины "ангиогенное вещество", "ангиогенная композиция" и "ангиогенный фактор" подразумевают обозначение веществ, которые способствуют образованию новых сосудов, такие как VEGF, bFGF, и TGF-бета.

[0074] Термины "анти-ангиогенное" или "ангиостатическое" вещество, лекарственное средство или композиция, или "ингибитор ангиогенеза" подразумевают обозначение веществ, которые препятствуют или уменьшают реваскуляризацию, такие как агнтагонисты VEGF антагонисты, антагонисты рецептора VEGF рецептор, bFGF антагонисты, антагонисты рецептора bFGF, TGF-бета антагонисты и антагонисты рецептора TGF-бета.

[0075] Как здесь используется, термин "нуклеозид" относится к соединению, содержащему любую пентозную или модифицированную пентозную часть, присоединенной к определенному положению гетероцикла или к природному положению пуринов (9-положение), или пиримидинов (1-положение), или к равнозначному положению в аналоге.

[0076] Как здесь используется, термин "нуклеотид" относится к фосфатному эфиру, замещенному на 5'- положении нуклеозидом.

[0077] Использующийся здесь, термин "гетероцикл" относится к одновалентному насыщенному или ненасыщенному изоциклическому радикалу, имеющему, по меньшей мере, один гетеро атом, например, N, О, S, Se или Р, на кольце, каждое имеющееся положение которого может быть при желании замещено, независимо, на, напр., гидроксил, оксо, амино, имино, lower алкил, бромо, хлоро и/или циано. Включаются в термин "гетероцикл" пурины и пиримидины.

[0078] Использующийся здесь, термин "пурин" относится к азотистым бициклическим гетероциклам.

[0079] Использующийся здесь, термин "пиримидин" относится к азотистым моноциклическим гетероциклам.

[0080] Использующийся здесь, термин "L-нуклеозид" относится к нуклеозидному соединению, которое имеет L-рибозную сахарную часть.

[0081] Термин "противоопухолевое" вещество, лекарственное средство или композиция означает отношение к любому веществу, включающее любое химиотерапевтическое вещество, модификатор биологической реакции (включая без ограничений (1) белковые, т.е. пептидные, молекулы, способные развивать или изменять биологические реакции и (2) не-белковые, т.е. не-пептидные, молекулы, способные развивать или изменять биологические реакции), цитотоксическое вещество, или цитостатическое вещество, которое снижает пролиферацию неопластических клеток.

[0082] Термин "анти-фиброзное" вещество, лекарственное средство или композиция предназначены для включающих веществ, которые препятствуют или уменьшают фиброз, включая: агонисты рецептора интерферона II Типа (напр., интерферона-гамма); пирфенидон и аналоги пирфенидона; антиангиогенные вещества, такие как антагонисты VEGF, антагонисты рецептора VEGF, bFGF антагонисты, антагонисты рецептора bFGF, антагонисты TGF-бета и антагонисты рецептора TGF-бета; и противовоспалительные вещества, включая антагонисты фактора некроза опухоли (TNF), такие как анти-TNF антитела (напр., REMICADE^TM анти-TNF моноклональное антитело) и растворимый рецептор TNF (напр., ENBREL^TM TNF Ig рецептор иммуноадгезин), и антагонисты IL-I, такие как IL-1Ra.

[0083] Термин "химиотерапевтическое средство" или "химиотерапевтический" (или "химиотерапия", в случае лечения химиотерапевтическим средством) предназначено для обозначения любых небелковых (т.е., не-пептидных) химических соединений, пригодных для лечения рака. Примерами химиотерапевтических средств являются алкилированные вещества, такие как тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN^TM); алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквион, метуредопа, и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включая альтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и буллатацинон); камптотецин (включая синтетический аналог топотекан); бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адолезин, карзелезин и бизелезин); криптофицины (в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и CBI-TMI); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, окись мехлорэтамина гидрохлорида, мелфалан, новембихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацила иприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, форемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как энедииновые антибиотики (напр., калихеамицин, особенно калихеамицин гамма1I и калихеамицин фиI1, см., напр., Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994); динемицин, включая динемицин А; бисфосфонаты, такие как клодронат; эсперамицин; так же, как неокарциностатина хромофор и родственные хромопротеиновые энедииновые антибактериальные хромофоры), аклациномицины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицины, карабицин, карминомицин, карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубинцин (Adramycin^TM) (включая морфолино-доксо-рубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и деоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пиромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозицин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-флуороурацил (5-ФУ); аналоги фолиевой кислоты, такие как демоптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пуринов, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; пиримидиновые аналоги, такие как анцитабин,азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; анти-адренальные, такие как аминоглютетимид, митотан, трилостан; пополнитель фолиевой кислоты, такой как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамида гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бизантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксиуреа; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогвазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; PSK^®; разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2''-трихлортриэтиламин; трихотецены (особенно Т-2 токсин, верракурин А, роридин А и ангвидин); уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид ("Ara-С"); циклофосфамид; тиопета; таксоиды, напр. паклитаксел (TAXOL^®, Bristol Meyers Squibb Oncology, Princeton, NJ) и доцетаксел (TAXOTERE^®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (Gemzar^TM); 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопсиде (VP-16); ифосфамид; митроксантрон; ванкристин; винорелбин (Navelbine^TM); новантрон; тенипозид; эдатрксат; дауномицин; аминоптерин; ксеолода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифлюрометилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин; и фармацевтически приемлимые соли, кислоты или производные любого вышеуказанного. Также, включенными в определение "химиотерапевтического средства" являются антигормональные средства, действие которых направлено на регулирование или ингибирование гормонального эффекта на опухоли, такие как антиэстрогены и селекстивные модуляторы рецепторов эстрогена (SERMs), включая, например, тамоксифен (включая Nolvadex^TM), ралоксифен, дролоксифен, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY1 17018, onapristone и toremifene (Fareston^TM); ингибиторы фермента ароматазы, которая регулирует продукцию эстрогенов в надпочичниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы, аминоглутетимид, мегестрола ацетат (Megace^TM), exemestane, форместан, фадразол, ворозол (Rivisor^TM) , летрозол (Femara^TM), и анастрозол (Arimidex^TM) ; и антиэстрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид, и госе-рилин; и фармацевтически приемлимые соли, кислоты или производные любого вышеуказанного.

[0084] Термин "антибластомное" средство, лекарственное средство или соединение предназначается для обозначения любого средства, включая любое химиотерапевтическое средство, модификатор биологической реакции (включая без ограничения (i) белковоподобные, т.е. пептидные, молекулы, способные к развитию или изменению биологических реакций и (ii) небелковоподобные, т.е. непептидные, молекулы, способные к развитию или изменению биологических реакций), цитотоксическое средство, или цитотоксическое средство, которое замедляет пролиферацию опухолевых клеток.

[0085] Термин "модификатор биологической реакции" относится к любой белковоподобной (т.е., пептидной) молекуле или любой небелковоподобной (т.е., непептидной) молекуле, способной к развитию или изменению биологической реакции, имеющей отношение к лечению рака. Примеры модификаторов биологических реакций включают антагонисты опухолеассоциированных антигенов, такие как антитела к противоопухолевым антигенам, антагонисты клеточных рецепторов, способные к индуцированию клеточной пролиферации, агонисты клеточных рецепторов, способные к индуцированию апоптоза, такие как Аро-2 лиганды, агонисты рецепторов интерферона 1 типа, такие как молекулы интерферона-α и молекулы интерферона-β, агонисты рецепторов интерферон II Типа, такие как молекулы интерферон-γ, агонисты рецепторов интерферона III Типа, такие как ИЛ-28А, ИЛ-28 В, и ИЛ-29, антагонисты воспалительных цитокинов, включая антагонисты фактора некроза опухоли (ФНО), такие как анти-ФНО антитела (напр., REMICADE^TM анти-ФНО моноклональное антитело) и растворимый рецептор ФИО (напр., ENBREL^TM ФНО рецептор-Ig иммуноадгезин), фактор роста цитокинов, такие как гематопоэтические цитокины, включая эритропоэтины, такой как EPOGEN эпоэтин альфа, гранулоцитарные колониестимулирующие факторы (G-CSFs), такой как NEUPOGEN^TM филгастрим, гранулоцитарно-моноцитарные колониестимулирующие факторы (GM-CSFs), и тромбопоэтины, лимфоцитарный фактор роста цитокинов, такой как интерлейкин-2, и антагонисты фактора роста цитокинов, включая антагонисты ангиогенных факторов, напр. антагонисты эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), такой как AVASTIN^TM bevacizumab (анти-VEGF моноклональное антитело).

[0086] Использованный здесь, термин "ингибитор фермента HCV" относится к любому средству, которое ингибирует ферментативную активность фермента, кодируемого HCV. Термин "ингибитор фермента HCV" включает, но не ограничивает, средства, которые ингибируют активность протеазы NS3 HCV; средства, которые ингибируют активность геликазы NS3 HCV; и средства, которые ингибируют активность РНК-зависимой РНК полимеразы NS5B HCV.

[0087] Использованные здесь, термины "ингибитор протеазы NS3 HCV" и "ингибитор протеазы NS3" относится к любому средству, которое ингибирует активность протеазы комплекса NS3/NS4A HCV. За исключением иного специального назначения, термин "ингибитор NS3" используется равнозначно с термином "ингибитор протеазы NS3 HCV" и "ингибитор протеазы NS3".

[0088] Использованные здесь, термины "ингибитор NS5B HCV", "ингибитор NS5B", "ингибитор РНК-зависимой РНК полимеразы NS5B HCV", "ингибитор RDRP HCV" и "ингибитор RDRP" относятся к любому средству, которое ингибирует активность РНК-зависимой РНК полимеразы NS5B HCV.

[0089] Перед дальнейшим изложением настоящего изобретения, необходимо отметить, что данное изобретение не ограничивается описанными конкретными примерами, которые, по существу, конечно, могут включать изменения. Также, необходимо отметить, что используемая здесь терминология предназначена только с целью описания частных примеров и не предназначена для ограничения, поскольку объем охраны настоящего изобретения будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения.

[0090] Где представляется область значений, то является очевидным, что каждое промежуточное значение, до десятой единицы измерения нижнего ограничения, если только под контекстом четко не обусловлено обратное, между верхним и нижним ограничением такой области и любое другое установленное или промежуточное значение в данном установленном интервале, охватывается данным изобретением. Верхний и нижний пределы этих узких диапазонов могут быть независимо включены в узкие диапазоны, и также охватываются данным изобретением, допуская любой определенно исключенный предел в установленном диапазоне. Где установленный диапазон включает один или оба предела, диапазоны, ислючающие каждый или оба таких включающих пределов, также включены в изобретение.

[0091] Кроме переделенных других случаев, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют такое же значение, как обычно понимается каким-либо специалистом в данной области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны здесь, могут также применяться в практике или тастировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы теперь описаны. Все публикации, указанные здесь, подкреплены здесь ссылкой на раскрытие сущности и описание способов или материалов, в связи с которыми публикации цитируются.

[0092] Необходимо указать, что использующиеся здесь и в прилагаемых пунктах формулы изобретения, единичные формы "а", "и" и "the" включают множественные обозначения, если только контекст не подразуемвает противоположного. Так, например, ссылка на "протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант" включает множественность таких полипептидных вариантов и ссылка на "пероральная композиция" включает отношение к одной или более пероральным композициям и их аналогам, известным специалисту в данной области техники, и прочее.

[0093] Публикации, обсуждаемые здесь, предоставлены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Ничего не может здесь быть истолковано в качестве подтверждения, что настоящее изобретение подлежит более ранней дате такой публикации преимуществено более ранним изобретением. Далее, даты публикации, представленные, могут быть отличными от истинных дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0094] Настоящее изобретение представляет пероральные фармацевтические композиции, содержащие известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического протеина. Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант содержит (1) углеводную часть, ковалентно присоединенную, по крайней мере, к одному ненативныму сайту гликозилирования, который не присутствует в родительском терапевтическом протеине, или (2) углеводную часть, которая ковалентно присоединена, по крайней мере, к одному нативному сайту гликозилирования, который присутствует, но не гликозилирован, в родительском терапевтическом протеине. Также, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант содержит, по меньшей мере, один мутантный протеазный сайт расщепления в месте нативного сайта расщепления, найденного в родительском терапевтическом протеине, и, таким образом, проявляет повышенную устойчивость к действию протеазы по сравнению с родительским терапевтическим протеином.

[0095] Настоящее изобретение далее представляет терапевтические способы для лечения заболевания у пациента, включающие пероральное введение пациенту известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта в форме для перорального применения и в интервале дозирования, который обеспечивает доставку большего количества лекарственного средства (в молярном выражении) на дозу и, по меньшей мере, доказано, что такое большее количество доз на единицу времени, которые получены пациентом в способе, являются эффективными для лечения заболевания при использовании подкожной болюсной инъекции родительского полипептида в форме для парентерального введения.

[0096] Настоящее изобретение далее представляет синтетические полипептидные агонисты рецептора интерферона 1 типа, которые содержат один или более сайты гликозилирования; и композиции, включая фармацевтические композиции, содержащие агонисты. Настоящее изобретение далее представляет нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие рассматриваемые полипептидные агонисты; и клетки-хозяины, включающие нуклеиновые кислоты субъекта. Настоящее изобретение далее представляет емкости и наборы, содержащие рассматриваемый полипептидный агонист.

[0097] Рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит гибридный или консенсусный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа, содержащий, по меньшей мере, один сайт гликозилирования. Сайт(ы) гликозилирования представляет собой такой сайт для связывания углеводной части с рассматриваемым синтетическим полипептидным агонистом, что, когда рассматриваемый синтетический полипептидный агонист продуцируется в эукариотической клетке, способной к гликозилированию, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист гликозилируется. Гликозилирование дает одно или более преимуществ для рассматриваемого синтетического полипептидного агониста по отношению к родительскому полипептидному агонисту рецептора интерферона 1 типа или по сравнению с природным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа. К таким преимуществам относятся увеличенное время полувыведения из сыворотки; сниженная иммуногенность; увеличенное активное in vivo время полувыведения; сниженное расщепление в условиях желудочно-кишечного тракта; и увеличенная скорость всасывания эпителиальными клетками кишечника. Увеличенная скорость всасывания эпителиальными клетками кишечника и сниженное расщепление в условиях желудочно-кишечного тракта являются важными для парентеральных (напр., пероральных) лекарственных форм рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа.

[0098] Рассматриваемые синтетические полипептидные агонисты рецептора интерферона 1 типа являются пригодными для лечения различных болезней, включая вирусные инфекции, фиброзные нарушения, и пролиферативные нарушения. В связи с чем, настоящее изобретение далее представляет способы лечения вирусных инфекций, способы лечения фиброзных нарушений и способы лечения пролиферативных нарушений, способы, как правило, включающие введение индивидууму, при необходимости, эффективного количества рассматриваемого синтетического полипептидного агониста. В некоторых примерах, рассматриваемый способ лечения далее включает введение, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического вещества для лечения вирусной инфекции, фиброзного нарушения, или пролиферативного нарушения. В некоторых примерах, рассматриваемый способ лечения далее включает введение, по меньшей мере, одного вещества, управляющего побочными эффектами, для снижения побочных эффектов, вызванных одним или более терапевтическми веществами.

[0099] В другом аспекте, синтетические полипептидные агонисты рецептора интерферона 1 типа изобретения находят применение в качестве реагентов для обнаружения и выделения рецептора интерферона 1 типа рецептор, таких как обнаружение экспрессии рецептора интерферона 1 типа в различных типах клетках и тканях, включая определение плотности рецепторов интерферона 1 типа и распределение в популяции клеток, и сортировке клеток на основе экспрессии рецепторов интерферона 1 типа. В еще другом аспекте, рассматриваемые синтетические агонисты рецепторов интерферона 1 типа являются пригодными для разработки веществ, способных к связыванию с рецептором интерферона 1 типа рецептор или активации типов, сходных с рассматриваемыми синтетическими агонистами рецепторов интерферона 1 типа. Синтетические агонисты рецепторов интерферона 1 типа изобретения могут быть использованы в методах сигнальной трансдукции рецепторов интерферона 1 типа для исследования для небольших молекул агонистов или антагонистов рецепторов интерферона 1 типа проведения сигнала.

ПОЛИПЕПТИДНЫЕ ВАРИАНТЫ

[00100] Настоящее изобретение относится к протеазо-резистентным или протеазо-резистентным, гипергликозилированным полипептидным вариантам. Протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные полипептидные варианты содержат, по меньшей мере, один мутантный сайт для расщепления протеазой в месте нативного сайта для расщепления протеазы, присутствующий у родительского терапевтического протеина, и, вследствие чего, проявляет повышенную устойчивость к действию протеазы в сравнении с родительским терапевтическим протеином.

[00101] Сайт для расщепления протеазы, который присутствует в родительском терапевтическом протеине и который мутирован в протеазо-резистентном или протеазо-резистентном, гипергликозилированном поли-пептидном варианте, такой как сайт не является расщепленным, или проявляет повышенную устойчивость к расщеплению (т.е., является худшим субстратом, чем нативный сайт для протеолитического процессинга) протеазой, которая расщепляет сайт для расщепления протеазы в родительском протеине, относится к так называемому здесь "мутированному сайту для расщепления протеазы" или "мутантному сайту расщепления". Сайт для расщепления протеазы, который найден в родительском терапевтическом протеине, относится к так называемому здесь "нативному сайту для расщепления протеаз".

[00102] Также, протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант включает (1) углеводную часть, ковалентно присоединенную, по меньшей мере, к одному ненативному сайту гликозилирования, не найденного в родительском терапевтическом протеине, или (2) углеводную часть, ковалентно присоединенную, по меньшей мере, к одному нативному сайту гликозилирования, найденного, но не гликозилированного, в родительском терапевтическом протеине. Сайт гликозилирования, который не найден в родительском терапевтическом протеине, относится к так называемому здесь "ненативному сайту гликозилирования". Сайт гликозилирования, который найден, но не гликозилирован в родительском терапевтическом протеине, относится к так называемому здесь "нативному сайту гликозилирования". В связи с чем, протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант включает (1) углеводную часть, ковалентно присоединенную, по меньшей мере, к одному ненативному сайту гликозилирования, и/или (2) углеводную часть, ковалентно присоединенную, по меньшей мере, к одному нативному сайту гликозилирования. Протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гиперглико-зилированный вариант полипептида, который включает (1) углеводную часть, ковалентно присоединенную к ненативному сайту гликозилирования или (2) углеводную часть, ковалентно присоединенную к нативному сайту гликозилирования, и который содержит, по меньшей мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы в месте нативного сайта для расщепления протеазы, найденного в родительском терапевтическом протеине, относится к так называемому здесь "протеазо-резистентному или протеазо-резистентному, гипергликозилированному полипептидному варианту".

[00103] Под "известным" протеазо-резистентным или протеазо-резистентным, гипергликозилированным вариантом полипептида подразумевается любой протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант существующий, в настоящее время или создаваемый в будущем, который (1) сохраняет необходимую фармакологическую активность родительского терапевтического протеина и (2) проявляет более долгое время полувыведения из сыворотки или большую площадь под кривой концентрации лекарственного средства в сыворотке как функцию времени (ППК) по сравнению с таковыми, которые проявляет родительский терапевтический протеин при введении пациенту в такой же форме и в одинаковых дозе, частоте введения дозы и способе введении. Настоящее изобретение представляет композиции, включая пероральные фармацевтические композиции, содержащие известные протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные варианты полипептида.

[00104] Известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант предусматривается в составе, пригодном для перорального применения. Родительский терапевтический протеин, как правило, вводится в виде состава немедленного действия, пригодного для подкожного болюсного введения. Обычно, лекарственная форма известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного варианта полипептида для перорального применения содержит первое количество молей; и родительский терапевтический протеин присутствует в лекарственной форме для парентерального применения, которая содержит второе количество молей. В целом, первое количество молей больше, чем второе количество молей. Однако, протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант в лекарственной форме для перорального применения высвобождается через период времени, который продолжается не дольше, чем интервал дозирования при введении родительского терапевтического протеина в режиме, который установлено, что является эффективным для лечения заболевания пациента.

[00105] Родительский терапевтический протеин представлен, как правило, в лекарственной форме для парентерального применения, вводимый путем подкожной болюсной инъекции, которая обеспечивает "пролонгированное " действие, медленно высвобождая терапевтический протеин в кровоток путем диффузии лекарственного средства из тканей, окружающих участок инъекции.

[00106] Рассматриваемый способ изобретения заменяет "пролонгированное" действие подкожной болюсной инъекции на аналогичный фармако-кинетический профиль, достигающийся путем пероральной доставки длительно действующего вещества (известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида с более долгим временем полувыведения из сыворотки и/или ППК, чем у его родительского протеина), не входящего в состав отсроченного или пролонгированного действия. Это значит, что время, требуемое для высвобождения первого количества молей известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида при пероральном введении, не больше, чем период времени между дозами родительского терапевтического протеина при введении путем подкожной болюсной инъекции в способе, который доказано является эффективным для лечения заболевания. Таким образом, в некоторых примерах, известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант вводится, по крайней мере, так часто, или, во многих случаях, более часто, и в более высоких дозах (в молярном значении), чем родительский терапевтический протеин. Структурные признаки

[00107] Протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида имеет аминокислотную последовательность, содержащую один или более мутантный сайт для расщепления протеазы в месте нативного(ых) сайта(ов) для расщепления протеазы, найденного в соответствующем родительском терапевтическом протеине; и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит (1) один или более ненативные сайты гликозилирования и/или (2) один или более нативные сайты гликозилирования. Так, напр., требуемый вариант полипептида имеет аминокислотную последовательность, которая содержит один или более мутентные сайты для расщепления протеазы в месте нативного(ых) сайта(ов) для расщепления протеазы, найденного в родительском терапевтическом протеине; и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском терапевтическом протеине или найдены, но не гликозилированы в родительском терапевтическом протеине. Родительский терапевтический протеин является в некоторых примерах соответсвующим природному полипептиду. В других примерах, родительский терапевтический протеин является не природным полипептидом (напр., синтетическим полипептидом, гибридным полипептидом, консенсусным полипептидом, слитым полипептидом, рекомбинантным полипептидом, или вариантом природного полипептида). Использующиеся здесь, термины " полипептидный вариант" и "вариант полипептида" оба относятся к любому полипептиду, который содержит один или более мутантные сайты для расщепления протеазы в месте нативного(ых) сайта(ов) для расщепления протеазы, найденного в родительском терапевтическом протеине; и который содержит (1) один или более сайтов гликозилирования, не найденных в родительском терапевтическом протеине, или (2) один или более сайтов гликозилирования, найденных, но не гликозилированных в родительском терапевтическом протеине.

[00108] Ненативные и нативные сайты гликозилирования включают N-связанные сайты гликозилирования и О-связанные сайты гликозилирования. TV-связанные сайты гликозилирования включают, напр., Asn-X-Ser/Thr, где аспарагиновый остаток представляет сайт для N-связанного гликозилирования, и где Х соответствует любой аминокислоте. O-связанные сайты гликозилирования включают, по меньшей мере, один сериновый или треониновый остаток. Число О-связанных сайтов гликозилирования является известным из уровня техники и описаны в литературе. Смотри, напр., Ten Hagen et al. (1999) J Biol. Chem. 274(39):27867-74; Hanisch et al. (2001) Glycobiology 11:731-740; и Ten Hagen et al. (2003) Glycobiology 13:1R-16R.

[00109] Во всех примерах, полипептидный вариант является гипергликозилированным, напр., полипептидный вариант содержит (1) а углеводную часть, ковалентно связанную с ненативным сайтом гликозилирования, и/или (2) углеводную часть, ковалентно связанную с нативным сайтом гликозилирования. Во многих примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида содержит углеводную часть, ковалентно связанную с нативным сайтом гликозилирования; и углеводную часть, ковалентно связанную с ненативным сайтом гликозилирования. В некоторых примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант образует O-связанное гликозилирование. В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант образует N-связанное гликозилирование. В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида образуют оба O-связанное и N-связанное гликозилирование.

[00110] В некоторых примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида содержит один, два, три, четыре или пять углеводных частей, каждый из которых сцеплен с разными сайтами гликозилирования. В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида является гликозилированным по ненативному сайту гликозилирования. В некоторых этих примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является гипергликозилированным по одному ненативному сайту гликозилирования. В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является гликозилированным по более чем одному ненативному сайту гликозилирования, напр., известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является гликозилированным по двум, трем или четырем ненативным сайтам гликозилирования.

[00111] В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является гликозилированным по ненативному сайту гликозилирования. В некоторых этих примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является гликозилированным по одному нативному сайту гликозилирования. В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является гипергликозилированным по более чем одному нативному сайту гликозилирования, напр., известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант гликозилирован по двум, трем или четырем нативным сайтам гликозилирования.

[00112] В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант гликозилирован по обоим нативному(ым) сайту(ам) гликозилирования и ненативному(ым) сайту(ам) гликозилирования.

[00113] Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида может содержать, по меньшей мере, одну дополнительную углеводную часть, не обнаруженную в родительском терапевтическом протеине, притом что каждый синтезирован в эукариотической клетке, способной к N- и/или O-связанному гликозилированию протеина. Так, напр., в сравнении с родительским терапевтическим протеином, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант может содержать, по крайней мере, одну, по крайней мере, две, по крайней мере, три, или, по крайней мере, четыре или более дополнительных углеводных частей. Например, там, где родительский терапевтический протеин имеет одну ковалентно связанную углеводную часть, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант может иметь две, три, четыре или более ковалентно связанных углеводных частей. В некоторых примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант не имеет углеводную часть, ковалентно связанную с ненативным сайтом гликозилирования; и имеет вместо нее, по крайней мере, одну, по крайней мере, две, по крайней мере, три или, по меньшей мере, четыре или более дополнительных углеводных частей, прикрепленных к нативным сайтам гликозилирования. В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант не имеет углеводную часть, ковалентно связанную с нативным сайтом гликозилирования; и вместо нее содержит, по меньшей мере, две, по меньшей мере, три, или, по меньшей мере, четыре или более углеводных частей, прикрепленных к ненативным сайтоам гликозилирования.

Гликозилированные Интерфероны 1 типа.

[00114] Заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа может включать консенсусную или гибридную аминокислотную последовательность полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, которая содержит один или более ненативные сайты гликозилирования. Так, напр., заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 может иметь аминокислотную последовательность, которая содержит один или более сайты гликозилирования, не обнаруженные у природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, напр., не обнаруженного у любого известного природного естественного IFN-α , IFN-β , или IFN-ω). Использующийся здесь, термин "ненативный сайт гликозилирования" определяется как сайт гликозилирования, находящийся в положении аминокислотной последовательности синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, такой, что сайт гликозилирования/положение не содержит гомологичного сайта гликозилирования/положения, который присутствует в аминокислотной последовательности природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа.

[00115] Альтернативно, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 может иметь консенсусную или гибридную аминокислотную последовательность полипептидного агониста рецептора интерферона 1, которая содержит один или более природные или нативные сайты гликозилирования. Использующийся здесь, термин "нативный сайт гликозилирования" определяется как сайт гликозилирования, находящийся в положении в аминокислотной последовательности синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, такой, что сайт гликозилирования/положение содержит гомологичный сайт гликозилирования/положение, который присутствует, по меньшей мере, в одной аминокислотной последовательности природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа.

[00116] Использующийся здесь, термин "синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа" определяется как любой консенсусный или гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа, который содержит один или более сайты гликозилирования. Так, "синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа" касается любого консенсусного или гибридного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, который содержит один или более сайты гликозилирования, включая любой консенсусный или гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа, который содержит один или более нативные сайты гликозилирования и/или один или более ненативные сайты гликозилирования.

[00117] "Родительским полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа" является полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа, который используется в качестве контрольного ориентира для сравнения. В некоторых примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит, по меньшей мере, один дополнительный сайт гликозилирования, не обнаруженный в родительском полипептидном агонисте рецептора интерферона 1 типа. Например, в некоторых примерах, родительским полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа является консенсусный IFN-α Infergen^® (InterMune, Inc., Brisbane, Calif.). Как показано на Фигуре 25, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит один или более сайты гликозилирования, не обнаруженные в родительском консенсусном IFN-α Infergen^®.

[00118] Заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа имеет длину от около 150 аминокислот до около 200 аминокислот, напр., от около 150 аминокислот до около 155 аминокислот, от около 155 аминокислот до около 160 аминокислот, от около 160 аминокислот до около 165 аминокислот, от около 165 аминокислот до около 170 аминокислот, от около 170 аминокислот до около 175 аминокислот, от около 175 аминокислот до около 180 аминокислот, от около 180 аминокислот до около 185 аминокислот, от около 185 аминокислот до около 190 аминокислот, от около 190 аминокислот до около 195 аминокислот, или от около 195 аминокислот до около 200 аминокислот.

[00119] В некоторых примерах, аминокислотная последовательность природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа изменена включением, по меньшей мере, одного нативного сайта гликозилирования. Как следует по одному неограничивающему примеру, где природный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность KDSS, KDSS последовательность заменена на KNSS. По другому неограничивающему примеру, где природный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность WDET, WDET последовательность заменена на WNET. По следующему неограничивающему примеру, где природный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность VEET, VEET последовательность заменена на VTET. По другому неограничивающему примеру, где природный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность VEET, VEET последовательность заменена на VNET.

[00120] В многих примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован. В некоторых примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа образует O-связанное гликозилирование. В других примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа образует N-связанное гликозилирование. В других примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа образует оба O-связанное и N-связанное гликозилирование.

[00121] В некоторых примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по ненативному сайту гликозилирования. В некоторых этих примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по одному ненативному сайту гликозилирования. В других примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по более чем одному ненативному сайту гликозилирования, напр., заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по двум, трем, или четырем ненативным сайтам гликозилирования.

[00122] В других примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по нативному сайту гликозилирования. В некоторых этих примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по одному нативному сайту гликозилирования. В других примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по более чем одному нативному сайту гликозилирования, напр., заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по двум, трем, или четырем нативным сайтам гликозилирования.

[00123] Заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа гликозилирован по обоим нативному(ым) сайту(ам) гликозилирования и ненативному(ым) сайту(ам) гликозилирования.

[00124] Образует ли рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа N-связанное и/или O-связанное гликозилирование легко определяется путем использования стандартных методов. См, напр., "Techniques in Glycobiology" R. Townsend and A. Hotchkiss, eds. (1997) Marcel Dekker; и "Glycoanalysis Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.76)" E. Hounsell, ed. (1998) Humana Press. Изменение электрофоретической подвижности протеина перед и после обработки химическим или ферментным дегликозилированием (напр., при использовании эндогликозидаз и/или экзогликозидаз) используется по стандартной методике для определения статуса гликозилирования протеина. Ферментное дегликозилирование может осуществляться при использовании различных ферментов, включая, но не ограничиваясь, пептид-N4-(М-ацетил-β-D-глюкозаминил) аспарагин амидазу (PNGase F); эндогликозидазу F1, эндогликозидазу F2, эндогликозидазу F3, α (2→3, 6, 8, 9) нейраминидазу, и т.п. Например, осуществляется анализ протеина путем электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE), как предварительно обработанного с PNGase F, так и необработанного с PNGaseF. Значительное уменьшение ширины бэнда и изменение переходного положения после обработки с PNGaseF считается оценкой N-связанного гликозилирования. Содержание углеводов гликозилированного протеина может быть также определено путем лектинового метода протеиновых пятен (напр., протеинов разделенных путем SDS-PAGE и перенесенных на подложку, такую как нейлоновая мембрана). Лектины, протеины, связанные с углеводом, из различных растительных тканей, имеют и высокую аффинность и узкую специфичность для широкого диапазона специфических углеводных эпитопов, обнаруженных в гликопротеидных гликанах. Cummings (1994) Methods in Enzymol. 230:66-86. Лектины могут быть определенно мечены (каждый прямо или косвенно), что позволяет осуществить определение связывания лектинов с углеводами гликозилированных протеинов. Например, когда сопряжен с биотином или дигоксигенином, лектин, связанный с гликозилированным протеином, может быть легко идентифицирован на мембранных блотах через реакцию утилизирования авидиновых или анти-дигоксигениновых антител, конъюгированных с ферментом, таким как щелочная фосфотаза, β-галактозидаза, люцифераза, или пероксидаза хрена, для выделения обнаруживаемого продукта. Тестирование с помощью панели лектинов с четко-определенной специфичностью предоставляет значительный объем сведений о гликопротеиновом углеводном комплементе.

Консенсусные полипептидные агонисты рецепторов интерферона 1 типа с ненативными сайтами гликозилирования.

[00125) В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит консенсусную аминокислотную последовательность и, по меньшей мере, один ненативный сайт гликозилирования. В других примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит консенсусную аминокислотную последовательность и, по меньшей мере, один нативный сайт гликозилирования.

[00126] Консенсусная последовательность получена путем присоединения трех или более аминокислотных последовательностей и установлением аминокислот, которые являются общими, по меньшей мере, для двух последовательностей. В некоторых примерах, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 Типа содержит консенсусную последовательность, полученную из определяющей консенсусной последовательности природного человеческого IFN-α 2b, природного человеческого IFN-α14 и природного человеческого IFN-β1. В других примерах, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит консенсусные последовательность, полученную из определяющей консенсусной последовательности природного человеческого IFN-α2b, природного человеческого IFN-α l4 и природного человеческого IFN-ω1. В других примерах, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит консенсусную последовательность, полученную из определяющей консенсусной последовательности природного человеческого IFN-α2b, природного человеческого IFN-β1 и природного человеческого IFN-ω1. В других примерах, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит консенсусную последовательность, полученную из определяющей консенсусной последовательности природного человеческого IFN-α14, природного человеческого IFN-β1 и природного человеческого IFN-ω1. В других примерах, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит консенсусную последовательность, полученную из определяющей консенсусной последовательности природного человеческого IFN-α2b, природного человеческого IFN-α14, природного человеческого IFN-β1 и природного человеческого IFN-ω1. В других примерах содержится дальнейший сравнительный анализ, включая в себя сравнение аминокислотной последовательности консенсусного IFN-α. Infergen^®.

[00127] В некоторых этих примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа включает консенсусную последовательность, содержащую один или более сайтов гликозилирования, образующаяся из одной или более аминокислотных последовательностей родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, использующаяся для получения консенсусной последовательности. В дополнительных примерах, консенсусная последовательность далее модифицируется, чтобы она включала, по меньшей мере, один ненативный сайт гликозилирования.

[00128] В одном примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность, представляющую собой мажоритарную последовательность, изображенную на Фиг.24 (SEQ ID NO:**), далее модифицированную, чтобы она включала, по меньшей мере, один ненативный сайт гликозилирования.

[00129] В другом примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность, представляющую собой мажоритарную последовательность, изображенную на Фиг.24 (SEQ ID NO:**), далее модифицированную, чтобы она включала, по меньшей мере, один сайт гликозилирования из группы VTET сайта гликозилирования IFN-α2b, KNSS сайта гликозилирования IFN-α14, WNET сайта гликозилирования IFN-β1, и WNMT сайта гликозилирования IFN-ω1. В других примерах, мажоритарная последовательность дополнительно модифицирована, чтобы она включала один или более ненативные сайты гликозилирования.

[00130] В других примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа получен из консенсусной последовательности, которая не содержит сайт гликозилирования, происходящая из родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. В этих примерах, консенсусная последовательность в дальнейшем модифицирована, чтобы она включала, по меньшей мере, один ненативный сайт гликозилирования для получения рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. Например, в некоторых примерах, в которых консенсусная последовательность включает KDSS, KDSS последовательность модифицирована на KNSS или KNST. Согласно другому неограничивающему примеру, где консенсусная последовательность включает WDET, WDET последовательность модифицирована на WNET или WNES. Согласно другому неограничивающему примеру, где консенсусная последовательность включает VEET, VEET последовательность модифицирована на VTET, VNES или VNET.

[00131] В отдельных примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность, названную как "мажоритарная" на Фигуре 24, и далее содержит одну или более следующих модификаций: KDSS модифицировано на KNST; WDET модифицировано на WNES; VEET модифицировано на VNES или VNET.

[00132] В некоторых отдельных примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность как указано в любой из SEQ ID NOs:*-*, как показано на Фигуре 25.

[00133] В одном примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность, соответствующую мажоритарной последовательности, изображенной на Фиг.28 (SEQ ID NO:**), которая далее модифицирована, чтобы она включала, по меньшей мере, один ненативный сайт гликозилирования. В некоторых примерах, рассматриваемый полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность как указано в любой из SEQ ID NOs:*-*, как показано на Фигуре 28.

[00134] В одном примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность, соответствующую мажоритарной последовательности, указанной на Фиг.29 (SEQ ID NO:*), далее модифицированная, чтобы включала, по меньшей мере, один ненативный сайт гликозилирования. В некоторых примерах, рассматриваемый полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит аминокислотную последовательность как указано в любой из SEQ ID NOs:*-*, как показано на Фигуре 29.

Гибридные полипептидный агонисты рецептора интерферона 1 типа с ненативными сайтами гликозилирования.

[00135] В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа с одним или более сайтами гликозилирования. В других примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа с одним или более сайтами гликозилирования, не обнаруженные в любом природном полипептидном агонисте рецептора интерферона 1 типа. Использующимся здесь, "гибридным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа" является полипептид, включающий аминокислотную последовательность, содержащую дискретные суб-последовательности, соответствующие по идентичности и числу аминокислот суб-последовательностям других, природных полипептидных агонистов рецептора интерферона 1 типа, где аминокислотная последовательность рассматриваемого синтетического полипептидного агониста отличается от таковой любого природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. В некоторых примерах, дискретные суб-последовательности выбраны из IFN-α2b, IFN-α14, IFN-β1 и IFN-ω, и аминокислотная последовательность полипептидного агониста отличается от аминокислотной последовательности природного полипептидного агониста рецепторов интерферона 1 типа IFN-α2b, IFN-α14, IFN-β1, и IFN-ω.

[00136] В других примерах, дискретные суб-последовательности могут быть выбраны из IFN-α2b, IFN-α14, IFN-β1, консенсусного IFN-α Infergen^® и IFN-ω, и аминокислотная последовательность полипептидного агониста отличается от каждых аминокислотных последовательностей полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа IFN-α2b, IFN-α14, IFN-β1, консенсусного IFN-α Infergen^® и IFN-ω, соответственно.

[00137] В некоторых этих примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа является гибридным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа, аминокислотная последовательность которого содержит один или более сайты гликозилирования, происходящая из одной или более аминокислотных последовательностей родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, использующиеся для получения гибридной последовательности. В дополнительных примерах, гибридная последовательность далее модифицирована, чтобы она включала, по меньшей мере, один дополнительный ненативный сайт гликозилирования (в дополнении к любому ненативному сайту гликозилирования, происходящий из аминокислотной последовательности родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа).

[00138] Следует понимать, что синтетические полипептидные агонисты рецептора интерферона 1 типа заявленного изобретения включают гибридные полипептидные агонисты интерферона 1 типа, образованные путем замещения одного или более остатков аминокислоты в аминокислотной последовательности родительского IFN-α с аминокислотным остатком или остатками, которые образуют нативный сайт гликозилирования в гомологичном положении аминокислотной последовательности в другом родительском IFN-α.

[00139] В одном неограничивающем примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа является гибридным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа, имеющий гибридную последовательность, образованную путем замещения KNSS на нативне KDSS остатки в последовательности интерферона альфа-2а или в последовательности интерферона альфа-2b. Данные синтетические полипептидные агонисты рецептора 1 типа названы здесь как IFN-α2a (D99N) и IFN-α2b (D99N), соответственно, где нумерация аминокислотной последовательности такая, как показано на Фигуре 24.

[00140] В другом неограничивающем примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа является гибридным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа, включающий гибридную последовательность, образованную путем замещения WNET на нативные WDET остатки в последовательности интерферона альфа-2а или в последовательности интерферона альфа-2b. Данные синтетические полипептидные агонисты рецептора 1 типа здесь носят названия как IFN-α2a (D105N) и IFN-α2b (D105N), соответственно, где нумерация аминокислотной последовательности такая, как показано на Фигуре 24.

[00141] В другом неограничивающем примере, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа является гибридным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа, включающий гибридную последовательность, образованную путем замещения KNSS и WNET на нативные KDSS и WDET остатки, соответственно, в последовательности интерферона альфа-2а или в последовательности интерферона альфа-2b. Данные синтетические полипептидные агонисты рецептора 1 типа названы здесь как IFN-α2a (D99N, D105N) и IFN-α2b (D99N, D105N), соответственно, где нумерация аминокислотной последовательности такая, как показано на Фигуре 24.

[00142] В других примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа получен из гибридной последовательности, которая не содержит какие-либо сайты гликозилирования, происходящая из аминокислотной последовательности родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. В этих примерах, гибридная последовательность затем далее модифицируется путем включения, по меньшей мере, одного ненативного сайта гликозилирования для получения рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. Например, в некоторых примерах, где гибридная последовательность включает KDSS, KDSS последовательность модифицирована на KNSS. По другому неограничивающему примеру, где гибридная последовательность включает WDET, WDET последовательность модифицирована на WNET. По другому неограничивающему примеру, где гибридная последовательность включает VEET, VEET последовательность модифицирована на VTET или VNET.

[00143] В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит, в порядке от N-конца к С-концу, от около 2 до около 90, напр., от около 2 до около 5, от около 5 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, или от около 85 до около 90 соседних аминокислот первого полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, выбранного из природного человеческого IFN-α2b (SEQ ID NO:*), природного человеческого IFN-α14 (SEQ ID NO:*), природного человеческого IFN-β1 (SEQ ID NO:*), и природного человеческого IFN-ω1 (SEQ ID NO:*); и от около 2 до около 90, напр., от около 2 до около 5, от около 5 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, или от около 85 до около 90 соседних аминокислот второго полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, выбранного из природного человеческого IFN-α2b, человеческого IFN-αl4, человеческого IFN-β1 и человеческого IFN-β1), где первый и второй полипептидные агонисты рецептора интерферона 1 типа различны.

[00144] В некоторых примерах, рассматриваемый гибридный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа далее содержит от около 2 до около 90, напр., от около 2 до около 5, от около 5 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, или от около 85 до около 90 соседних аминокислот третьего полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, выбранного из природного человеческого IFN-α2b, человеческого IFN-α14, человеческого IFN-β1 и человеческого IFN-ω1, где третий полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа отличается от первого и второго полипептидных агонистов рецептора интерферона 1 типа.

[00145] Еще в других примерах, рассматриваемый гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа далее содержит от около 2 до около 90, напр., от около 2 до около 5, от около 5 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, или от около 85 до около 90 соседних аминокислот четвертого полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, выбранного из природного человеческого IFN-α2b, человеческого IFN-α14, человеческого IFN-β1, и человеческого IFN-ω1, где четвертый полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа отличается от первого, второго и третьего полипептидных агонистов рецептора интерферона 1 типа.

[00146] В отдельных примерах, любой из указанных в вышеприведенных примерах синтетический гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит от около 4 до около 90, напр., от около 4 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, или от около 85 до около 90 соседних аминокислот сегмента полипептида человеческого IFN-α14, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность KNSS природного человеческого IFN-α14.

[00147] В отдельных примерах, любой из указанных в вышеприведенных примерах синтетический гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит от около 4 до около 90, напр., от около 4 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, или от около 85 до около 90 соседних аминокислот сегмента полипептида человеческого IFN-β1, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность WNET природного человеческого IFN IFN-β1.

[00148] В отдельных примерах, любой из указанных в вышеприведенных примерах синтетический гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит от около 4 до около 90, напр., от около 4 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, or от около 85 до около 90 соседних аминокислот сегмента полипептида человеческого IFN-ω1, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность WNMT природного человеческого IFN-β1.

[00149] В отдельных примерах, любой из указанных в вышеприведенных примерах синтетический гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа содержит от около 4 до около 90, e.g., от около 4 до около 7, от около 7 до около 10, от около 10 до около 15, от около 15 до около 20, от около 20 до около 25, от около 25 до около 30, от около 30 до около 35, от около 35 до около 40, от около 40 до около 45, от около 45 до около 50, от около 50 до около 55, от около 55 до около 60, от около 60 до около 65, от около 65 до около 70, от около 75 до около 80, от около 80 до около 85, or от около 85 до около 90 соседних аминокислот сегмента полипептида человеческого IFN-α2b, который включает, по меньшей мере, аминокислотную последовательность VTET природного человеческого IFN-α2b.

Функциональные признаки

[00150] Рассматриваемый синтетический полипептид является полипептидым агонистом рецептора интерферона 1 типа, напр., рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа связывается с и вызывает сигнальную трансдукцию через рецептор интерферона 1 типа. Функционирует ли рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа как агонист рецептора интерферона 1 типа может быть быстро определено при применении известного метода. Такие методы включают методы, основанные на использовании клеток in vitro для детектирования активации генов, реагирующих на интерферон (напр., использование репортерного гена, функционально связанного с промотером, содержащий один или более иетрферон рактивных элементов); и т.п.Такие методы также включают KJRA методы для определения активационной функции рецептора интерферона 1 типа, как описано ниже в разделе "Диагностическое Применение".

[00151] В некоторых примерах, заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа проявляет одно или более следующих действий: антипролиферативное действие, противовирусное действие и антифиброзное действие. Проявляет ли заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа противовирусное действие может быть легко определено при использовании любого известного способа, включая, напр., способ in vitro на основании использования клеток для определения ингибирования вирусной репликации. См, напр., Patick et al. (1999) Antimicrobial Agents and Chemotherapy 43:2444-2450. Проявляет ли заявленный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа антипролиферативное действие может быть легко определено при использовании любого известного способа, включая, напр., способ in vitro на основании использования клеток для определения ингибирования пролиферации.

[00152] Рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа проявляет одно или более следующих свойств: увеличенное время полувыведения из сыворотки; сниженную иммуногенность in vivo; повышенное функциональное время полужизни in vivo; повышенная стабильность; сниженное расщипление условиями желудочно-кишечного тракта; и улучшенная растворимость в воде.

[00153] В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа проявляет увеличенное время полувыведения из сыворотки по сравнению с природным полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа или по сравнению с родительским полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа. Термин "время полувыведения из сыворотки" использовано здесь равнозначно с терминами "время полувыведения из плазмы" и " время полувыведения из циркуляции". В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа имеет время полувыведения из сыворотки, которое, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, по меньшей мере, на около 50%, по меньшей мере, на около 55%, по меньшей мере, на около 60%, по меньшей мере, на около 65%, по меньшей мере, на около 70%, по меньшей мере, на около 75%, по меньшей мере, на около 80%, по меньшей мере, на около 90%, по меньшей мере, на около 100% (или вдвое), по меньшей мере, в около 2,5 раза, по меньшей мере, в около втрое, по меньшей мере, в около 3,5-раза, по меньшей мере, в около вчетверо, по меньшей мере, в около 4,5-раза, или, по меньшей мере, в около пять раз больше времени полувыведения из сыворотки природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа или родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, который не содержит ненативный сайт гликозилирования. В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа имеет время полувыведения из сыворотки, которое, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, по меньшей мере, на около 50%, по меньшей мере, на около 55%, по меньшей мере, на около 60%, по меньшей мере, на около 65%, по меньшей мере, на около 70%, по меньшей мере, на около 75%, по меньшей мере, на около 80%, по меньшей мере, на около 90%, по меньшей мере, на около 100% (или вдвое), по меньшей мере, в около 2,5 раза, по меньшей мере, в около втрое, по меньшей мере, в около 3,5-раза, по меньшей мере, в около вчетверо, по меньшей мере, в около 4,5-раза, или по меньшей мере, в около пять раз больше времени полувыведения из сыворотки природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа или полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, который имеет такую же аминокислотную полседовательность, как и природный агонист рецептора интерферона 1 типа.

[00154] Время полувыведения из сыворотки рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа без труда определяется при использовании хорошо известных способов. Например, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа определенно метят, и вводят индивидууму (напр., экспериментальному животному, не принадлежащему роду человека, или человеку), и, при различных моментах времени следующего введения агониста, отбирают пробу крови и в пробе крови определяют количество определенно меченого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа.

[00155] В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа проявляет повышенную устойчивость к расщеплению условиями желудочно-кишечного тракта по сравнению с природным полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа или по сравнению с родительским полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа. В некоторых примерах, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа проявляет, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, по меньшей мере, на около 50%, по меньшей мере, на около 55%, по меньшей мере, на около 60%, по меньшей мере, на около 65%, по меньшей мере, на около 70%, по меньшей мере, на около 75%, по меньшей мере, на около 80%, или по меньшей мере, на около 90%, или более, снижение расщепления в желудочно-кишечном тракте, по сравнению с уровнем расщепления природного полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа или родительского полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, который не содержит ненативные сайты гликозилирования.

[00156] Проявляет ли рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа повышенную устойчивость к расщеплению условиями желудочно-кишечного тракта можно без труда определить при использовании известных способов. Например, рассматриваемый синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа контактирует in vitro с пищеварительными ферментами, находящимися в желудочно-кишечном тракте, и определяется действие ферментов на структурную и функциональную целостность рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. Может быть использован способ для определения устойчивости к расщеплению условиями желудочно-кишечного тракта in vivo.

[00157] Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант, пригодный здесь для использования, является протеазо-резистентным или протеазо-резистентным, гипергликозилированным вариантом родительского терапевтического протеина, где родительский терапевтический протеин является любым терапевтическим протеином, который эффективен для лечения заболевания или состояния у пациента при введении пациенту. Перечень типичных терапевтических протеинов приведен ниже. Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида является эффективным для лечения такого же заболевания или состояния у пациента, что и соответствующий родительский терапевтический протеин.

Варианты Полипептида, Устойчивого к Действию Протеазы или Гипер-гликозилированного. Устойчивого к Действию Протеазы.

[00158] Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является протеазо-резистентным или протеазо-резистентным, гипергликозилированным вариантом терапевтического протеина, и, во многих примерах, представлен в первой форме дозирования. Первая форма дозирования может содержать первое число молей известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта в фармацевтической композиции для перорального применения. Родительский терапевтический протеин во многих примерах может входить в состав немедленного высвобождения, пригодного для подкожного болюсного введения, т.е. вторая стандартная форма, где первое число молей в первой стандартной форме больше чем второе число молей терапевтического протеина во второй стандартной форме. Например, первое количество молей может быть, по меньшей мере, на около 5%, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, или, по меньшей мере, на около 50%, или, по меньшей мере, на около 75%, или, по меньшей мере, на около 100%, или, по меньшей мере, в около три раза, или, по меньшей мере, в около четыре раза, или, по меньшей мере, в около пять раз, или, по меньшей мере, в около шесть раз, или, по меньшей мере, в около семь раз, или, по меньшей мере, в около восемь раз, или, по меньшей мере, в около девять раз, или, по меньшей мере, в около десять раз, или более, чем второе количество молей.

[00159] Во многих примерах, после перорального введения первой стандартной дозы пациенту, время, необходимое для высвобождения первого количества молей известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептидного варианта не больше, чем период времени, который проходит между дозами родительского терапевтического протеина при введении во второй стандартной форме путем подкожной болюсной инъекции с выбранной частотой дозирования в терапевтическом режиме, который доказано, что является эффективным для лечения заболевания или состояния пациента. Так, напр., время, необходимое для высвобождения первого количества молей известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного варианта полипептида после перорального введения первой стандартной формы может быть, по меньшей мере, на около 5%, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, или, по меньшей мере, на около 50%, или более, меньше, чем интервал времени между дозами родительского терапевтического во второй стандартной форме, когда вводится посредством подкожной болюсной инъекции с выбранной частотой дозирования. В некоторых примерах, первая стандартная форма является составом для немедленного высвобождения, пригодной для пероральной доставки.

[00160] Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант может применяться перорально более часто, чем соответствующий родительский полипептид, вводимый посредством подкожной болюсной инъекции. Например, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант может вводится перорально, по меньшей мере, в два раза чаще, по меньшей мере в 2 1/3 раза чаще, по меньшей мере в 2,5 раза чаще, по меньшей мере в три раза чаще, по меньшей мере в 3,5 раз чаще, или по меньшей мере в четыре раза чаще, или по меньшей мере в пять раз чаще, или по меньшей мере в шесть раз чаще, или более часто, чем соответствующий родительский полипептид, вводимый путем подкожной болюснеой инъекции. Так, напр., если родительский терапевтический полипептид вводится один раз в неделю, то соответствующий вариант протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного полипептида может вводиться дважды в неделю, трижды в неделю, один раз в день, дважды в день, трижды в день, или более трех раз ежедневно.

[00161] По одному неограничивающему примеру, родительский терапевтический протеин является IFN-γ1b, и IFN-γ1b вводится в стандартной лекарственной форме, пригодной для подкожного введения в дозе 1×10⁶ Международных Единиц (МЕ)/м² (или 50 мкг/м² или 3,0×10^-9 моль/ м²) подкожно три раза в неделю, с суммарной недельной дозой 150 мкг/ м² (или 3×10⁶ ME/ м² или 9,0×10^-9 моль/ м²). Требуемый гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант IFN-γ1b находится в стандартной лекарственной форме, пригодной для пероральной доставки; известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант IFN-γ1b вводится перорально, и более часто, чем 3 раза в неделю (напр., 4 раза в неделю, 5 раз в неделю, 6 раз в неделю, один paз в день, дважды в день, или трижды в день); и суммарная недельная доза гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта IFN-γ1b, который вводится, составляет больше, чем или эквивалентна 9,0×10^-9 моль/м, напр., суммарная недельная доза составляет от около 9,0×10^-9 моль/м до около 1,0×10^-8 моль/м, от около 1,0×10^-8 моль/м² до около 2,5×10^-8 моль/м², от около 2,5×10^-8 моль/м² до около 5,0×10^-8 моль/м², или от около 5,0×10^-8 моль/м² до около 7,5×10^-8 моль/м, или от около 7,5×10^-8 моль/м до около 1,0×10^-7 моль/м, или от около 1,0×10^-7 моль/м² до около 1,0×10^-6 моль/м².

[00162] В другом аспекте, суммарная недельная доза гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта IFN-γ1b, который вводится, составляет более чем или эквивалентно 500 мкг, напр., от около 500 мкг до около 750 мкг, от около 750 мкг до около 1000 мкг, от около 1000 мкг до около 1500 мкг, или от около 1500 мкг до около 2000 мкг.

[00163] Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида проявляет повышенную устойчивость к действию протеазы по сравнению с соответствующим родительским полипептидом. В некоторых примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида проявляет устойчтвость к действию сывороточных протеаз, что, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, по меньшей мере, на около 50%, по меньшей мере, на около 55%, по меньшей мере, на около 60%, по меньшей мере, на около 65%, по меньшей мере, на около 70%, по меньшей мере, на около 75%, по меньшей мере, на около 80%, по меньшей мере, на около 90%, по меньшей мере, на около 100% (или в два раза), по меньшей мере, в около 2,5 раза, по меньшей мере, в около 3 раза, по меньшей мере, в около 3,5 раза, по меньшей мере, в около 4 раза, по меньшей мере, в около 4,5 раза, по меньшей мере, в около 5 раз (по крайней мере, впятеро), по меньшей мере, в около 6 раз, по меньшей мере, в около 7 раз, по меньшей мере, в около 8 раз, по меньшей мере, в около 9-раз, по меньшей мере, в около 10 раз, по меньшей мере, в около 20раз, по меньшей мере, в около 30 раз, по меньшей мере, в около 40 раз, по меньшей мере, в около 50 раз, по меньшей мере, в около 60 раз, по меньшей мере, в около 70 раз, по меньшей мере, в около 80 раз, по меньшей мере, в около 90 раз, по меньшей мере, в около 100 раз, по меньшей мере, в около 200 раз, по меньшей мере, в около 300 раз, по меньшей мере, в около 400 раз, по меньшей мере, в около 500 раз, по меньшей мере, в около 600 раз, по меньшей мере, в около 700 раз, по меньшей мере, в около 800 раз, по меньшей мере, в около 900 раз, или по меньшей мере, в около 1000 раз, или более, выше, чем устойчивость к действию сывороточных протеаз соответствующего родительского терапевтического протеина, в человеческой крови, человеческой сыворотке, или в смеси in vitro, содержащей одну или более протеаз.

[00164] В некоторых примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида проявляет по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, по меньшей мере, на около 50%, по меньшей мере, на около 55%, по меньшей мере, на около 60%, по меньшей мере, на около 65%, по меньшей мере, на около 70%, по меньшей мере, на около 75%, по меньшей мере, на около 80%, по меньшей мере, на около 90%, по меньшей мере, на около 100% (или в два раза), по меньшей мере, в около 2,5 раза, по меньшей мере, в около 3 раза, по меньшей мере, в около 3,5 раза, по меньшей мере, в около 4 раза, по меньшей мере, в около 4,5 раза, по меньшей мере, в около 5 раз (по крайней мере, впятеро), по меньшей мере, в около 6 раз, по меньшей мере, в около 7 раз, по меньшей мере, в около 8 раз, по меньшей мере, в около 9 раз, по меньшей мере, в около 10 раз, по меньшей мере, в около 20 раз, по меньшей мере, в около 30 раз, по меньшей мере, в около 40 раз, по меньшей мере, в около 50 раз, по меньшей мере, в около 60 раз, по меньшей мере, в около 70 раз, по меньшей мере, в около 80 раз, по меньшей мере, в около 90 раз, по меньшей мере, в около 100 раз, по меньшей мере, в около 200 раз, по меньшей мере, в около 300 раз, по меньшей мере, в около 400 раз, по меньшей мере, в около 500 раз, по меньшей мере, в около 600 раз, по меньшей мере, в около 700 раз, по меньшей мере, в около 800 раз, по меньшей мере, в около 900 раз, или по меньшей мере, в около 1000 раз, или более, повышенную устойчивость к действию одного или более α-химотрипсина, эндопротеиназы Arg-C, эндопротеиназы Asp-N, эндопротеиназы Glu-C, эндопротеиназы Lys-C, и трипсина, по сравнению с соответствующим родительским терапевтическим протеином.

[00165] В некоторых примерах, величина увеличения в протазной резистетности полипептидного варианта определяется путем сравнения времени полувыведения полипептидного варианта к времени полувыведения соотвествующего родительского терапевтического протеина в человеческой крови или человеческой сыворотки in vitro, или в композиции in vitro, содержащей одну или более сывороточных протеаз. Например, устойчивость к протеазному расщеплению может быть определена путем обнаружения уровня биологической активности варианта протеазо-резистентного полипептида, следующий за раздельным взаимодействием варианта полипептида и соответствующего родительского терапевтического протеина со смесью протеаз, с человеческой сывороткой, или с человеческой кровью; и сравнения активности вырианта полипептида с таковой соответствующего родительского терапевтического протеина. Если биологическая активность варианта полипептида выше, чем таковая соответствующего родительского терапевтического протеина, вслед за инкубацией с человеческой кровью, человеческой сывороткой, или одной или более протазами, то вариант полипептида имеет повышенную устойчивость к действию протеазы по сравнению с родительским терапевтическим протеином.

[00166] Следующим является неограничивающий пример способа для определения протеазной резистентности in vitro. В отдельных емкостях, вариант полипептида и соответствующий родительский терапевтический протеин добавляют к смеси протеаз, где содержится по 1,5 пг каждого α-химотрипсина, карбоксипептидазы, эндопротеиназы Arg-C, эндопротеи-назы Asp-N, эндопротеиназы Glu-C, эндопротеиназы Lys-C, и трипсина, формируя реакционную смесь; и сохраняют реакционную смесь при 25°С в течение 30 минут. В конце 30-минутного реакционного периода добавляют вещество, которое ингибирует активность протеаз; и определяют биологическую активность варианта полипептида и соответствующего родительского терапевтического протеина. Следующим является другой неограничивающий пример способа определения протеазной резистентности in vitro. В отдельных емкостях, вариант полипептида и соответствующий родительский терапевтический протеин добавляют к каждому лизату человеческой крови, или человеческой сыворотки, формируя реакционную смесь; и сохраняют реакционную смесь при 37°С в течение подходящего периода времени (напр., 5 минут, 10 минут, 15 минут, 30 минут, или 60 минут, и т.д.). Затем добавляют вещество, которое ингибирует активность протеаз; и определяют биологическую активность варианта полипептида и соответствующего родительского терапевтического протеина.

[00167] Соответствующий родительский терапевтический протеин может быть любым родительским терапевтическим протеином, который доказано является эффективным для лечения заболевания или состояния у пациента при введении его пациенту в составе с немедленным высвобождением путем подкожного болюсного введения второй стандартной дозы при частоте приемлемого дозирования. В этих примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида является эффективным для лечения такого же заболевания или состояния у пациента при введении пациенту перорально в первой стандартной дозе при частоте приемлимого дозирования, который является не менее частым, чем таковой режим для родительского терапевтического протеина.

[00168] Во многих примерах, известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант проявляет желаемую фармакологическую активность у млекопитающего хозяина, напр., гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант может проявлять, по меньшей мере, около 50%, по меньшей мере, около 60%, по меньшей мере, около 70%, по меньшей мере, около 80%, по меньшей мере, около 90%, или, по меньшей мере, около 95% от желаемой фармакологической активности соответствующего родительского терапевтического протеина. По неограничивающим примерам, гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант может проявлять одну или более следующих активностей: антипролиферативную активность, противовирусную активность, противофиброзную активность; гемопоэтическую активность; ангиогенную активность; ферментативную активность; активность фактора роста; хемокиновую активность; активность рецепторного агониста; активность антагониста рецептора; и анти-ангиогенную активность; где активность такая же, как желаемая соответствующего родительского терапевтического протеина.

[00169] Известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант полипептида проявляет увеличенное время полувыведения из сыворотки или увеличенное ППК по сравнению с родительским терапевтическим протеином, применяющегося при сходных условиях.

[00170] В некоторых примерах, известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант полипептида имеет увеличенное время полувыведения из сыворотки по сравнению с соответствующим родительским полипептидом. Термин "время полувыведения из сыворотки" используется здесь равнозначно с терминами "время полувыведения из плазмы" и "время полувыведения из циркуляции". В некоторых примерах, гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант имеет время полувыведения из сыворотки, которое является, по меньшей мере, на около 10%, по меньшей мере, на около 15%, по меньшей мере, на около 20%, по меньшей мере, на около 25%, по меньшей мере, на около 30%, по меньшей мере, на около 35%, по меньшей мере, на около 40%, по меньшей мере, на около 45%, по меньшей мере, на около 50%, по меньшей мере, на около 55%, по меньшей мере, на около 60%, по меньшей мере, на около 65%, по меньшей мере, на около 70%, по меньшей мере, на около 75%, по меньшей мере, на около 80%, по меньшей мере, на около 90%, по меньшей мере, на около 100% (или в два раза), по меньшей мере, в около 2,5 раза, по меньшей мере, в около 3 раза, по меньшей мере, в около 3,5 раза, по меньшей мере, в около 4 раза, по меньшей мере, в около 4,5 раза, по меньшей мере, в около 5 раз (по крайней мере, впятеро), по меньшей мере, в около 6 раз, по меньшей мере, в около 7 раз, по меньшей мере, в около 8 раз, по меньшей мере, в около 9 раз, по меньшей мере, в около 10 раз, по меньшей мере, в около 20 раз, по меньшей мере, в около 30 раз, по меньшей мере, в около 40 раз, по меньшей мере, в около 50 раз, по меньшей мере, в около 60 раз, по меньшей мере, в около 70 раз, по меньшей мере, в около 80 раз, по меньшей мере, в около 90 раз, по меньшей мере, в около 100 раз, по меньшей мере, в около 200 раз, по меньшей мере, в около 300 раз, по меньшей мере, в около 400 раз, по меньшей мере, в около 500 раз, по меньшей мере, в около 600 раз, по меньшей мере, в около 700 раз, по меньшей мере, в около 800 раз, по меньшей мере, в около 900 раз, или по меньшей мере, в около 1000 раз, или более, выше, чем время полувыведения из сыворотки соответствующего родительского терапевтического протеина. В некоторых примерах, степень увеличения во времени поувыведения известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида переделяется при сравнении времени поувыведения известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида с временем поувыведения соответствующего родительского терапевтического протеина в человеческой крови или человеческой сыворотки in vivo.

[00171] В некоторых примерах, степень увеличения во времени полувыведения известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида определяется путем сравнения времени полувыведения известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида и времени полувыведения соответствующего родительского терапевтического протеина из человеческой крови или человеческой сыворотки in vitro, или в композиции in vitro, содержащей одну или более сывороточных протеаз. Например, устойчивость к протеазному расщеплению может быть определена путем детектирования уровня биологической активности известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида, вслед за раздельным контактированием варианта полипептида и соответствующего родительского терапевтического протеина со смесью протеаз, с человеческой сывороткой, или с человеческой кровью; и сравнения активности варианта полипептида с таковой соответствующего родительского терапевтического протеина. Если биологическая активность варианта полипептида выше, чем таковая соответствующего родительского терапевтического протеина, вслед за инкубацией с человеческой кровью, человеческой сывороткой, или одной или более протазами, то вариант полипептида имеет увеличенное время полувыведения по сравнению с родительским терапевтическим протеином.

[00172] В некоторых примерах, известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант полипептида имеет ППК, которое, по меньшей мере, на 10%, по меньшей мере, на 15%, по меньшей мере, на 20%, по меньшей мере, на 25%, по меньшей мере, на 30%, по меньшей мере, на 35%, по меньшей мере, на 40%, по меньшей мере, на 45%, по меньшей мере, на 50%, по меньшей мере, на 55%, по меньшей мере, на 60%, по меньшей мере, на 65%, по меньшей мере, на 70%, по меньшей мере, на 75%, по меньшей мере, на 80%, по меньшей мере, на 90%, по меньшей мере, на 100% (или вдвое), по меньшей мере, в 2,5 раза, по меньшей мере, в 3 раза, по меньшей мере, в 3,5 раза, по меньшей мере, в 4 раза, по меньшей мере, в 4,5 раза, или по меньшей мере, в 5 раз больше, чем ППК соответствующего родительского терапевтического протеина при применении при сходных условиях.

[00173] Время полувыведения из сыворотки или ППК известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида может быть без труда определено при применении хорошо известных способов. Например, известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант полипептида детектируемо метят и вводят индивидууму (напр., экспериментальным животным, не относящимся к человеку, или человеку), и, при различных моментах времени, следующих за введением варианта гипергликозилированного, протеазо-резистентного полипептида, отбирают пробу крови и определяют количество детектируемо меченного гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида в образце крови.

Способы ЗВ-сканирования

[00174] Гликозилированный или протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического протеина может определяться при применении способа ЗП-сканирования (структурная гомология). Структурная гомология относится к гомологии между топологией и трехмерной структурой двух протеинов. Количественные способы являются хорошо известными из уровня техники для идентифицирования структурно связанных аминокислотных положений с трехмерной структурой гомологичных протеинов. Типичные способы включают, но не ограничиваются: САТН (Класс, Структура, Топология и Гомология суперсемейства), который является иерархической классификацией структур протеиновых доменов на основании четырех различных уровней (Orengo et al., Structure, 5(8): 1093-1108, 1997); СЕ (Комбинаторное Удлинение оптимального пути), который является способом для расчета парных структурных выравниваний (Shindyalov et al., Protein Engineering, 11 (9):739-747, 1998); FSSP (Классификация по укладке, основанная на выравниваниях протеинов по пространственной структуре), которая является базой данных на основании полного сравнения всех трехмерных протеиновых структур, которые в настоящее время берутся в Банке Данных Протеинов (PDB) (Holm et al., Science, 273:595-602, 1996); SCOP (Структурная Классификация Протеинов), которая представляет описательную базу данных, основанную на структурных и эволюционных отношений между всеми протеинами, чья структура является известной (Murzin et al., J. Mol. Biol, 247:536-540, 1995); и VAST (Программа Поиска Гомологии для Векторов), который сравнивает впервые установленные координаты трехмерной структуры протеина с таковой, найденной в базе данных MMDB/PDB (Gibrat et al., Current Opinion in Structural Biology, 6:377-385, 1995).

[00175] По одному не ограничивающему примеру, IFN-α2b мутанты с повышенной устойчивостью к протеолизу генерируются способом двумерного рационального сканирования; и идентифицированы соответствующие остатки членов семейства цитокинов, которые обладают структурной гомологией к IFN-α2b и идентифицированные остатки других цитокинов так же модифицированы для продуцирования цитокинов с повышенной устойчивостью к протеолизу. Смотри, напр., WO 04/022593. Протеиновая терапия

[00176] Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является вариантом полипептида, который проявляет терапевтическое действие в млекопитающем хозяине ("родительский терапевтический протеин") в лечении заболевания или состояния у млекопитающего хозяина. Известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант лечит такое же заболевание или состояние у хозяина, как и родительский терапевтический протеина.

[00177] Следует отметить, что в контексте аминокислотных замен для образования протеазо-резистентных вариантов родительского терапевтического протеина, нумерация аминоксилот, использованная для описания аминокислотных замен, которые изменяют протеазный сайт расщепления, соответствует нумерации аминокислот, как указано на Фигурах 1-23, аминокислотных замен для образования протеазо-резистентных вариантов родительского терапевтического протеина, нумерация аминоксилот, использованная для описания аминокислотных замен, которые образуют сайт гликозилирования, соответствует нумерации аминокислот, как указано на Фигурах 24-30. Соответствующие положения аминокислот IFN-α, изображенные на, напр., Фигуре 1 и Фигуре 24, являются легко определяемыми. Например, для специалистов является очевидным, что D99 IFN-α2b, изображенный на Фигуре 24, соответствует D71 IFN-α2b, изображенному на Фигуре 2, и соответствует D71 IFN-α2a, изображенному на Фигуре 1. Так, напр., аминоксилотная последовательность D99 и D105 IFN-α2b, изображенная на Фигуре 24, соответствует аминоксилотной последовательности, соответственно, D71 и D77 IFN-α2a, изображенной на Фигуре 1 аминокислотной последовательности IFN-α2b, изображенной на Фигуре 2;

аминоксилотная последовательность R50 IFN-α2b, изображенная на Фигуре 24, соответствует аминоксилотной последовательности R23 IFN-α2b, изображенной на Фигуре 2; аминоксилотная последовательность D99, D 105, и Е1 34 Infergen, изображенная на Фигуре 24, соответствует аминоксилотной последовательности D71, D77, и D106, соответственно, консенсуного IFN-α, указанных на Фигуре 9; аминоксилотные положения S99, Е134, и F136 аминоксилотной последовательности IFN-β1, указанные на Фигуре 24, соответствуют S74, Е109, и Fill, соответственно, в аминокислотной последовательности IFN-β, указанной на Фигуре 3; и положения аминокислот Е38, S40, и S99 аминокислотной последовательности IFN-γ, указанной на Фигуре 31, соответствуют Е41, S43, и S102, соответственно, аминокислотной последовательности IFN-γ, указанной на Фигуре 4.

[00178] Пригодные протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные полипептидные варианты включают протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные формы любого родительского терапевтического протеина, которые нуждаются у млекопитающего хозяина, включая, но не ограничиваясь: интерферон (напр., IFN-γ, IFN-α, IFN-β, IFN-ω; IFN-γ; как описано более детально ниже); инсулин (напр., Новолин, Хумулин, Хумалог, Лантус, Ультраленте, др.); эритропоэтин (напр., Прокрит®, Эпрекс®, или Эпоген® (эпоэтин-α); Аранесп® (дарбэпоэтин-α); НеоРекормон®, Эпогин® (эпоэтин-β); и т.п.); антитело (напр., моноклональное антитело) (напр., Ритуксан® (ритук-симаб); Ремакаде® (инфликсимаб); Herceptin® (трастузумаб); Хумира^TM (адалимумаб); Xolair® (омализумаб); Веххаг® (тозитумомаб); Раптива^TM (эфализумаб); Эрбитукс^TM (цетуксимаб); и т.п.), включая антиген-связывающий фрагмент моноклонального антитела; фактор крови (напр., тканевый активатор плазминогена Активаза® (альтеплаза); NovoSeven® (рекомбинантный человеческий фактор Vila); Фактор Vila; Фактор VIII (напр., Когенэйт®); Фактор IX; (3-глобин; гемоглобин; и т.п.); колониестимулирующий фактор (напр., Неупоген® (филграстим; G-CSF); Неуластим (пэгфилгрпстим); гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарнмоноцитарный колониестимулирующий фактор, макрофагальный колониестимулирующий фактор, мегакариоцитарный колониестимулирующий фактор; и т.п.); гормон роста (напр., соматотропин, напр., Генотропин®, Нутропин®, Нордитропин®, Сайзен®, Серостим®, Хуматроп®, др.; гормон роста человека; и т.п.); интерлейкин (напр., IL-1; IL-2, включая, напр., Пролейкин®; IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9; др.); фактор роста (напр., Регранекс® (beclapermin; PDGF); Фибласт® (trafermin; bFGF); Stemgen® (ancestim; фактор стволовых клеток); кератиноцитарный фактор роста; кислый фактор роста фибробластов, фактор стволовых клеток, основной фактор роста фибробластов, фактор роста гепатоцитов; и т.п.); растворимый рецептор (напр., ФНО-α-связывающий растворимый рецептор, такой как Энбрел® (etanercept); растворимый VEGF рецептор; растворимый интерлейкиновый рецептор; растворимый y/S Т-клеточный рецептор; и т.п.); энзим (напр., а-глюкозидаза; Cerazyme® (imiglucarase; β-глюкоцереброзидаза, Цередаза® (alglucerase); активатор ферментов (напр., тканевый активатор плазминогена); хемокин (напр., IP-10; Mig; GroaAL-S, RANTES; MIP-1a; MIP-1β; MCP-1; PF-4; и т.п.);

ангиогенное вещество (напр., васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF); анти-ангиогенное вещество (напр., растворимый VEGF рецептор); протеиновая вакцина; нейроактивный пептид, такой как брадикинин, холецистокинин, гастин, сектретин, окситоцин, гонадолиберин, бета-эндорфин, энкефалин, вещество Р, соматостатин, пролактин, галанин, фактор, высвобождающий гормон роста, бомбезин, варфарин, динорфин, нейротензин, мотилин, тиротропин, нейропептид Y, лютеинизирующий гормон, кальцитонин, инсулин, глюкагон, вазопрессин, ангиотензин II, гормон, высвобождающий тиротропин, вазоактивный пептид кишечника, пептид сна, др.; другие протеины, такие как тромболитическое вещество, атриальный натрийуретический пептид, костный мофрогенетический протеин, тромбопоэтин, релаксин, глиальный волокнисто-кислый протеин, фолликулостимулирующий гормон, человеческий альфа-1 антитрипсин, фактор, ингибирующий лейкемию, трансформирующий фактор роста, тканевой фактор, инсулиноподобнывй фактор роста, лютеинизирующий гормон, фолликулостимулирующий гормон, фактор активации макрофагов, фактор некроза опухоли, фактор, вызывающий хемотаксис нейтрофилов, фактор роста нервов, тканевый ингибитор металлопротеиназ; вазоактивный пептид кишечника, ангиогенин, ангиотропин, фибрин; гирудин; фактор, ингибирующий лейкемию; антагонист рецептора IL-1 (напр., Кинерет® (анакинра)); и т.п. Также пригодными для применения являются слитые протеины, содержащие все или части любых вышеуказанных протеинов.

[00179] Как указано выше, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный протеиновый вариант проявляет, по меньшей мере, одну требующуюся фармакологическую активность соотвтетствующего родительского протеина. Примеры пригодных способов для конкретных терапевтических протеинов включают, но не ограничиваются, GMCSF (Eaves, А. С.and Eaves С.J., Erythropoiesis in culture. In: McCullock E A (edt) Cell culture techniques- Clinics in hematology. W В Saunders, Eastbourne, p.371-91 (1984); Metcalf, D., International Journal of Cell Cloning 10: 116-25 (1992); Testa, N. G., et al., Assays for hematopoietic growth factors. In: Balkwill F R (edt) Cytokines A practical Approach, pp 229-44; IRL Press Oxford 1991) EPO (биотест: Kitamura et al., J. Cell. Physiol. 140, p.323 (1989)); Гирудин (анализ агрегационных свойств тромбоцитов: Blood Coagul Fibrinolysis 7(2):259-61 (1996)); IFNa (противовирусный тест: Rubinstein et al., J. Virol. 37(2):755-8 (1981); антипролиферативный тест: Gao Y, et al. Mol Cell Biol. 19(11):7305-13 (1999); и биотест: Czamiecki et al., J. Virol. 49 p490 (1984)); GCSF (bioassay: Shirafuji et al., Exp.Hematol. 17 pi 16 (1989); пролиферация мышиных клеток линии NFS-60 (Weinstein et al, Proc Nati Acad Sci 83:5010-4 (1986)); инсулин (тест ³H-поглощения глюкозы: Steppan et al., Nature 409(6818):307-12 (2001)); hGH (Ва/Р3-hGHR пролиферативный тест: J din Endocrinol Metab 85(11):4274-9 (2000); Международный стандарт для гормона роста: Horm Res, 51 Suppi 1:7-12 (1999)); фактор X (тест на активность фактора X: Van Wijk et al. Thromb Res 22:681-686 (1981)); фактор VII (анализ коагулирующей активности при использовании протромбинового время свертывания: Belaaouaj et al., J. Biol. Chem. 275:27123-8(2000); Diaz-Collier et al., Thromb Haemost 71:339-46 (1994)).

Интерфероны

[00180] В некоторых примерах, родительский терапевтический протеин является интерфероном, и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант содержит (1) углеводную часть, ковалентно присоединенную к, по меньшей мере, одному ненативному сайту гликозилирования, не обнаруженного в родительском интерфероне или (2), углеводную часть, ковалентно присоединенную к, по меньшей мере, одному нативному сайту гликозилирования, найденного, но не гликозилированного в родительском интерфероне; и содержит один или более мутированные сайты для расщепления протеазой, найденных в родительском терапевтическом протеине.

[00181] В некоторых примерах осуществления изобретения, родительским полипептидом является полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа. Полипептидные агонисты рецептора интерферона 1 типа включают IFN-α, IFN-β, IFN-γт, и ifn-ωcd. Так, напр., протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант может быть протеазо-резистентным или протеазо-резистентным, гипергликозилированным вариантом полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, включая гипергликозилированные варианты IFN-α, IFN-β, IFN-γ, и ifn-ω, в которых отсутствует, по меньшей мере, один сайт для расщепления протеазой, найденный в родительском протеине.

[00182] В других примерах, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является любым протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гликозилированным синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа, описанные в предварительной заявке на патент "Синтетические Полипептидные Агонисты Рецептора Интерферона 1 типа" (USSN 60/600202), опубликованной 9 августа 2004, полное изложение сущности данной заявки включено здесь путем ссылки.

[00183] В других примерах, родительский полипептид является полипептидным агонистом рецептора интерферона II типа. Полипептидные агонисты рецептора интерферона II типа включают интерферон-гамма (IFN-γ). Так, напр., протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант можут являться протеазорезистентным или протеазо-резистентным, гипергликозилированным вариантом полипептидного агониста рецептора интерферона II типа, включая гипергликозилированный IFN-γ, который не содержит, по меньшей мере, один сайт для расщепления протеазой, найденного в родительском протеине.

IFN-α

[00184] Аминокислотная последовательность любого известного IFN-α может быть изменена для образования рассматриваемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. Термин "интерферон-альфа", использующийся здесь, относится к семейству соответствующих полипептидов, которые ингибируют вирусную репликацию и клеточную пролиферацию и модулируют иммунный ответ.

[00185] Пригодные альфа интерфероны включают, но не ограничиваются, природный IFN-α (включая, но не ограничиваясь, природный IFN-α 2а, IFN-α 2b, и IFN-αl4); IFN-α, как описано в U.S. Патенте No. 6704225; рекомбинантный интерферон альфа-2b, такой как интерферон Intron-A, получаемый из Sobering Corporation, Kenilworth, N.J.; рекомбинантный интерферон альфа-2а, такой как интерферон Roferon, получаемый из Hoffmann-La Roche, Nutley, N. J.; рекомбинантный интерферон альфа-2С, такой как Berofor альфа 2 интерферон, получаемый из Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, Conn.; интерферон альфа-n1, очищенная смесь натуральных альфа интерферонов, таких как Sumiferon, получаемый из Sumitomo, Japan или как Wellferon интерферон альфа-n1 (INS), получаемый из Glaxo-Wellcome Ltd., London, Great Britain; и интерферон альфа-п3-смесь натуральных альфа интерферонов, изготовленных Interferon Sciences и получаемые из Purdue Frederick Co., Norwalk, Conn., под торговым названием Alferon; и IFN-α14.

[00186] Пригодные известные протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные полипептидные варианты включают протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные формы любого родительского полипептида альфа интерферона. В одном аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант родительского полипептида альфа интерферона содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида настолько, что вариант содержит один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде; и далее содержит, по меньшей мере, один мутантный сайт для расщепления протеазой в месте нативного сайта для расщепления протеазой, найденного в родительском протеине.

(00187] В другом аспекте, родительский полипептид является IFN-α2a и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N] IFN-α2a гликопептидом, где [D99N] IFN-α2a гликопептид является вариантом IFN-α2a, содержащим (а) аспарагиновый остаток в месте остатка нативной аспартовой кислоты в аминокислотном положении 99 в аминокислотной последовательности IFN-α2a и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе указанного аспарагинового остатка. Следует понимать, что аминокислотная последовательность IFN-α2a является такой же, что и аминокислотная последовательность IFN-α2b, изображенная на Фигуре 1, предусматривающая, что последовательность IFN-α2a содержит лизиновый остаток в месте аргининового остатка в аминокислотном положении 50 в последовательности IFN-α2b, изображенной на Фигуре 1.

[00188] В другом аспекте, родительский полипептид является IFN-α2a и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, D105N] IFN-α2a гликопептидом, где [D99N, D105N] IFN-α2a гликопептид является вариантом IFN-α2a, содержащим (а) аспарагиновый остаток в месте остатка нативной аспартовой кислоты в каждом аминокислотном положении 99 и 105 в аминокислотной последовательности IFN-α2a и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R- группе каждого указанного аспарагинового остатка. Следует понимать, что аминокислотная последовательность IFN-α2a является такой же, что и аминокислотная последовательность IFN-α2b, изображенная на Фигуре 1, предусматривающая, что последовательность IFN-α2a содержит лизиновый остаток в месте аргининового остатка в аминокислотном положении 50 в последовательности IFN-α2b, изображенной на Фигуре 1.

[00189] В другом аспекте, родительский полипептид является IFN-α2b и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N] IFN-α2b гликопептидом, где [D99N] IFN-α2b гликопептид является вариантом IFN-α2b, содержащий (а) аспарагиновый остаток в месте остатка нативной аспартовой кислоты в аминокислотном положении 99 в аминокислотной последовательности IFN-α2b, изображенной на Фигуре 1, и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе указанного аспарагинового остатка.

[00190] В другом аспекте, родительский полипептид является IFN-α2b и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, D105N] IFN-α2b гликопептидом, где [D99N, D105N] IFN-α2b гликопептид является вариантом IFN-α2b, содержащий (а) аспарагиновый остаток в месте остатка нативной аспартовой кислоты в каждом аминокислотном положении 99 и 105 в аминокислотной последовательности IFN-α2b, изображенной на Фигуре 1 и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе каждого указанного аспарагинового остатка.

[00191] Пригодные альфа интерфероны далее включают консенсусный IFN-α. Консенсусный IFN-α (также обозначающийся как "KIFN" и "IFN-соn" и "консенсусный интерферон") включает, но не ограничиваясь, аминокислотные последовательности, обозначенные IFN-con₁, IFN-соn₂ и IFN-con₃, которые описаны в Патентах U.S. №4695623 и №4897471; и консенсусный интерферон как определен определением консенсусной последовательностью природных интерферонов альфа (напр., Infergen®, InterMune, Inc., Brisbane, Calif). IFN-con₁ является веществом консенсусного интерферона в продукте Infergen® alfacon-1. Продукт консенсусный интерферон Infergen® относится здесь к торговому названию (Infergen®) или к его родовому обозначению (интерферон alfacon-1).

[00192] Пригодные известные протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные полипептидные варианты включают гипергликозилированные формы любого родительского полипептида консенсусного IFN-α; где вариант не содержит, по крайней мере, сайт для расщепления протеазой, найденный в родительском протеине. В другом аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант родительского полипептида консенсусного IFN-α имеет аминокислотную поледовательность, которая отличается от аминокислотной поледовательности родительского полипептида настолько, что вариант содержит один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде; и где вариант содержит, по меньшей мере, один мутантный сайт для расщепления протеазой в месте нативного сайта для расщепления протеазой, найденного в родительском протеине.

[00193] В другом аспекте, родительский полипептид является полипептидом интерферон alfacon-1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N] интерферон alfacon-1 гликопептидом, где [D99N] интерферон alfacon-1 гликопептид является вариантом интерферонового полипептида alfacon-1, имеющий (а) аспарагиновый остаток, замещенный на остаток нативной аспартовой кислоты в аминокислотном положении 99 в аминокислотной последовательности Infergen (интерферон alfacon-1), изображенной на Фигуре 1, и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе указанного аспарагинового остатка.

[00194] В другом аспекте, где родительский полипептид является полипептидом интерферон alfacon-1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, D105N] интерферон alfacon-1 гликопептидом, где [D99N, 0105М]интерферон alfacon-1 гликопептид является вариантом полипептида интерферон alfacon-1, содержащий (а) аспарагиновый остаток, замещенный на остаток нативной аспартовой кислоты в аминокислотном положении 99 и 105 в аминокислотной последовательности Infergen, изображенной на Фигуре 1, и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-групппе каждого указанного аспарагинового остатка.

[00195] В другом аспекте, родительский полипептид является полипептидом интерферон alfacon-1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, D105N, E134N] интерферон alfacon-1 гликопептидом, где [D99N, D105N, Е134N]интерферон alfacon-1 гликопептид является вариантом полипептида интерферон alfacon-1, содержащий (а) аспарагиновый остаток, замещенный на каждые остатки нативной аспартовой кислоты, аспартовой кислоты, и глютаминовой кислоты в аминокислотных положениях 99, 105 и 134, соответственно, в аминокислотной последовательности Infergen, изображенной на Фигуре 1, и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе каждого указанного аспарагинового остатка.

[00196] В другом аспекте, родительский полипептид является полипептидом интерферон alfacon-1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, Е134N]интерферон alfacon-1 гликопептидом, где [D99N, Е 134N] интерферон alfacon-1 гликопептид является вариантом полипептида интерферон alfacon-1, содержащий (а) аспарагиновый остаток, замещенный на каждые остатки нативной аспартовой кислоты и глютаминовой кислоты в аминокислотных положениях 99 и 134, соответственно, в аминокислотной последовательности Infergen, изображенной на Фигуре 1, и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе каждого указанного аспарагинового остатка.

[00197] В другом аспекте, родительский полипептид является полипептидом интерферон alfacon-1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D105N, Е134N]интерферон alfacon-1 гликопептидом, где [D105N, E134N] интерферон alfacon-1 гликопептид является вариантом полипептида интерферон alfacon-1, содержащий (а) аспарагиновый остаток, замещенный на каждые остатки нативной аспартовой кислоты и глютаминовой кислоты в аминокислотных положениях 105 и 134, соответственно, в аминокислотной последовательности Infergen, изображенной на Фигуре 1, и (б) углеводную часть, ковалентно присоединенную к R-группе каждого указанного аспарагинового остатка.

[00198] В другом аспекте, родительский полипептид является интерферон-алфакон-1 полипептидом и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, D105N, Е134Т] интерферон-алфакон-1 гликопетидом, где [D99N, D105N, Е134Т] интерферон алфакон-1 гликопептид является вариантом интерферон алфакон-1 полипептида, имеющим (а) аспарагиновый остаток, замещающий каждый из нативных остатков аспарагиновой кислоты в положениях аминокислот 99 и 105 в аминокислотной последовательности Инфергена, изображенного на фигуре 1, (b) треониновый остаток, замещающий нативный остаток глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, изображенного на фигуре 1, и (с) углеводородную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе каждого из указанных аспарагиновых и треониновых остатков.

[00199] В другом аспекте родительский полипептид является интерферон-алфакон-1 полипептидом и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D99N, Е134Т] интерферон-алфакон-1 гликопептидом, где [D99N, El 34T] интерферон-алфакон-1 гликопептид является вариантом интерферон-алфакон-1 полипептида, имеющего (а) аспарагиновый остаток, замещающий нативный остаток аспарагиновой кислоты в положении 99 аминокислотной последовательности Инфергена, изображенного на фиг.1, (b) треониновый остаток, замещающий нативный глутаминовый остаток в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, изображенного на фигуре 1, и (с) углеводородную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе каждого из указанных аспарагиновых и треониновых остатков.

[00200] В другом аспекте, родительский полипептид является интерферон-алфакон-1 полипептидом и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [D105N, Е134Т] интерферон-алфакон-1 гликопептидом, где [D105N, Е134Т] интерферон-алфакон -1 гликопептид является вариантом интерферон-алфакон-1 полипептида, имеющего (а) аспарагиновый остаток, замещающий нативный остаток аспарагиновой кислоты в аминокислотном положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена, изображенного на фиг.1, (b) треониновый остаток, замещающий нативный остаток глутаминовой кислоты в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, изображенного на фигуре 1, и (с) углеводородную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе каждого из указанных аспарагиновых и треониновых остатков.

[00201] Количество аминокислот, обсуждаемых в контексте аминокислотных замещений для получения гипергликозилированных вариантов родительского терапевтического протеина, совпадает с количеством аминокислот, используемых для отображения аминокислотной последовательности интерферона типа 1 на фигуре 24. В контексте аминокислотных замещений, для получения протеазо-резистентных вариантов родительского терапевтического протеина, число аминокислот используемых для описания IFN-α вариантов, совпадает с количеством аминокислот, отображенных на фигуре 1.

[00202] В другом аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического интерферон-альфа протеина отличается от родительского терапевтического интерферона-альфа в такой степени, что известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант включает (1) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к не-нативному сайту гликозилирования, не найденному в родительском терапевтическом интерфероне-альфа и/или (2) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к нативному сайту гликозилирования, но найденного в родительском терапевтическом интерфероне-альфа негликозилированным; и включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском терапевтическом протеине IFN-α.

IFN-β

[00203] Аминокислотная последовательность любого известного IFN-β может быть модифицирована до получения заявляемого полипептидного синтетического агониста рецептора интерферона типа 1. Термин интерферон-бета ("IFN-β") включает IFN-β полипептиды, которые встречаются в природе, но не ограничены только ими, природно-встречающимися IFN-β полипептидами являются; IFN-β1 а, например Авонекс® (Biogen, Inc.), и Ребиф® (Serono, SA); IFN-β1b (Ветасерон®; BERLEX); и так далее. Аминокислотная последовательность IFN-β публично доступна; например, аминокислотная последовательность человеческого IFN-β1 найдена в GenBank Accession No. NP_002167 и отображена на Фигуре 24 (SEQ ID NO:**). Последовательность IFN-β человека также представлена на фигуре 3.

[00204] Пригодный известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант включает гипергликолированные формы любого родительского IFN-β полипептида. В одном аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант родительского IFN-β полипептида имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида в такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, не найденных в родительском полипептиде; и включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде IFN-β.

[00205] Число аминокислот, обсуждаемых в контексте аминокислотных замещений для получения гипергликозилированных вариантов родительского терапевтического протеина, совпадает с числом аминокислот используемых для отображения аминокислотных последовательностей интерферона типа 1 на фигуре 24. В контексте аминокислотных замещений для получения протеазо-резистентных вариантов родительского терапевтического протеина, число аминокислот, используемых для описания IFN-β вариантов, совпадает с числом аминокислот, отображенных на фигуре 3.

[00206] В другом аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского интерферона-бета отличается от родительского терапевтического интерферона-бета в такой степени, что протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант включает (1) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к ненативному сайту гликозилирования, не найденному в родительском терапевтическом интерфероне-бета, и/или (2) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к нативному сайту гликозилирования, но найденному негликозилированным в родительском терапевтическом интерфероне-бета; и включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском

полипептиде IFN-β.

IFN-tau

[00207] Аминокислотная последовательность любого известного IFN-tau может быть модифицирована до получения заявляемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона типа 1. Термин интерферон-tau включает IFN-tau полипептиды, которые встречаются в природе; но не ограничиваются природно встречающимися IFN-tau; Пригодные tau интерфероны включают, но не ограничиваются только природно встречающимися IFN-tau; Тауферон(®) (Pepgen Corp.); и так далее. IFN-tau может включать аминокислотную последовательность как указано в одном любом GenBank Accession Nos. PI 5696; P56828; P56832; P56829; P56831; Q29429; Q28595; Q28594; S08072; Q08071; Q08070; Q08053; P56830; P28169; P28172; and P28171. Любой протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный IFN-tau полипептидный вариант, который сохраняет желательную фармакологическую активность, может быть использован в методах и композициях по изобретению.

(00208] Пригодный известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидные варианты включают протеазо-резистентную или протеазо-резистентную, гипергликозилированную формы любого родительского IFN-tau полипептида. В одном аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант родительского IFN-tau полипептида имеет аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида в такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, не найденных в родительском полипептиде; и включает по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском INF-tau полипептиде.

IFN-ω

[00209] Аминокислотная последовательность любого известного IFN-омега может быть модифицирована до получения заявляемого синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона типа 1. Термин интерферон-омега ("IFN-ω") включает IFN-ω полипептиды, которые встречаются в природе; и которые не встречаются в природе IFN-ω полипептиды. Пригодные IFN-ω включают, но не ограничиваются ими, природного происхождения IFN-ω; рекомбинантный IFN-ω; например, Биомед 510(Bio-Medicines); и тому подобные. IFN-ω может включать аминокислотную последовательность, как указано в GenBank Accession No. NP_002168; or AAA70091.

[00210] Пригодный известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный варианты включают протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилирован-ные формы любого родительского INF-coполипептида. В одном аспекте известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликолизированный вариант родительского полипептида INF-ω имеют аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида в такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, не найденных в родительском полипептиде; и включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде.

[00211] В другом аспекте, родительский полипептид является полипептидом INF-ω1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликолизированный полипептидный вариант является [R99N] INF-ω1 гликопептидом, где [R99N]] INF-ω1 гликопептид является вариантом INF-ω1, имеющим (а) аспарагиновый остаток, замещающий нативный аргининовый остаток в аминокислотном положении 99 в аминокислотной последовательности INF-ω1 и (b), углеводную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе указанного аспаргинового остатка; где вариант включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде.

[00212] В другом аспекте родительский полипептид является полипептидом INF-ω1 и известный протеазо-резистентный или протеазорезистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [G134N] INF-ω1 гликопептидом, где [G134N] INF-ω1 гликопептид является вариантом INF-ω1, имеющим (а) аспарагиновый остаток, замещающий нативный глициновый остаток в аминокислотном положении 134 в аминокислотной последовательности INF-ω1, и (b), углеводную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе указанного аспарагинового остатка; где вариант включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде.

[00213] В другом аспекте родителький полипетид является полипептидом INF-ω1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является [G134T] INF-ω1 гликопептидом, где [G134T] INF-ω1 гликопептид является вариантом INF-ω1, имеющим а) треониновый остаток, замещающий нативный глициновый остаток в аминокислотном положении 134 в аминокислотной последовательности INF-ω1, и (b), углеводную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе указанного треонинового остатка; где вариант включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде.

[00214] В другом аспекте родительский полипептид является полипептидом INF-ω1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является an [S99N, G134N] INF-ω1 гликопептидом, где [S99N, G134N] INF-ω1 гликопептид является вариантом INF-ω1, имеющим (а) аргининовые остатки, замещающие нативный сериновый и глициновый остатки в аминокислотных положениях 99 и 134 соответственно в аминокислотной последовательности INF-ω1, и (b) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе каждого из указанных аспарагиновых остатков; где вариант включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде.

[00215] В другом аспекте родительский полипетид является полипептидом INF-ω1 и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант является an [S99N, G134T] INF-ω1 гликопептидом, где [S99N, G134T] INF-ω1 гликопептид является вариантом INF-ω1, имеющим (а) аспарагиновый и треониновый остатки, замещающие нативный сериновый и глициновый остатки в аминокислотных положениях 99 и 134 соответственно в аминокислотной последовательности INF-ω1 (как указано на фигуре 24), и (b), углеводную часть, ковалентно прикрепленную к R-группе каждого из указанных аспарагиновых и треониновых остатков; где вариант включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском полипептиде.

[00216] Число аминокислот, обсуждаемых в контексте аминокислотных замещений для получения гипергликозилированных вариантов родительского терапевтического протеина, совпадает с числом аминокислот, используемых для отображения аминокислотной последовательности интерферона типа 1, представленного на фигуре 24. В контексте аминокислотных замещений для получения протеазо-резистентных вариантов родительского терапевтического протеина, число аминокислот, используемых для описания IFN-омега вариантов, совпадает с числом аминокислот, отображенных на фигуре 1.

[00217] В другом аспекте известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического интерферона-омега отличается от родительского терапевтического интерферона-омега в такой степени, что известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный гипергликозилированный полипептидный вариант включает (1) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к ненативному сайту гликозилирования, не найденному в родительском терапевтическом интерфероне-омега, и/или (2) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к нативному сайту гликозилирования, найденному, но негликозилированному в родительском терапевтическом интерфероне-омега; и включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного протеазного сайта расщепления, найденного в родительском полипептиде.

Интерферон-гамма

[00218] Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих IFN-γ полипептиды, могут быть взяты из опубликованных баз данных, например, GenBank, журнальных публикаций и подобное. В то время как различные IFN-гамма полипептиды млекопитающих представляют интерес, для лечения заболеваний человека должен быть использован человеческий протеин. Последовательности, кодирующие человеческий IFN-гамма, могут быть найдены в коллекциях Genbank, accession numbers XI 3274; V00543; и NM_000619. Соответствующие геномные последовательности могут быть найдены в Genbank, accession numbers J00219; М37265; and V00536. Смотри, например, Gray et al. (1982), Nature 295:501, (Genbank XI 3274); и Rinderknecht et al. (1984) J. B.C. 259:6790. В некоторых воплощениях IFN-γ является гликозилированным.

[00219] IFN-γ1b (Актиммун®; человеческий интерферон) является одноцепочечным полипептидом, включающим 140 аминокислот.Он может быть приготовлен рекомбинантным методом в Е.соli и является негликозилированным. (Rinderknecht et al. 1984, J Biol. Chem. 259:6790-6797). Рекомбинантный IFN-гамма обсуждается в U.S. Патент No. 6,497,871 и является также пригодным для применения здесь.

[00220] Термин "IFN-гамма" включает любые природные IFN-гамма, рекомбинантные IFN-гамма и их производные, обладающие IFN-γ активностью, особенностью человеческого IFN-γ. Человеческий IFN-гамма обладает антивирусными и антипролиферативными свойствами, характеризующими интерфероны, также как и рядом иммуномодулирующих активностей, известных из предшествующего уровня техники. Хотя IFN-гамма основан на последовательности, как указано выше, производство протеина и протеолитический процессинг могут в результате привести к образованию вариантов. Непроцессированная последовательность, как показано Gray et а1., как указано выше, включает 166 аминокислот (аа). Хотя первоначально считали, что рекомбинантный IFN-гамма, произведенный в Е. Соli, состоит из 146 аминокислот (начиная с 20 аминокислоты) впоследствии обнаружили, что нативный человеческий INF-гамма расщепляется после остатка 23, для производства 143 аа протеина, или 144 аа, если терминальный метионин присутствует, как требуется для экспрессии в бактериях. Во время очистки зрелый протеин может дополнительно расщепляться на С-конце после остатка в положении 162 (ссылка на последовательность Gray et al.), приводя в результате к образованию протеина из 139 или 140 аминокислот, если начальный метионин присутствует, что требуется для экспрессии в бактериях. N-терминальный метионин является артефактом, кодируемым тРНК трансляционным "стартовым" сигнальным AUG, который в особом случае экспрессии в Е. coli не процессируется вообще. В других микробиологических системах или эукариотических экспрессионных системах метионин может удаляться.

[00221] Любые нативные INF-гамма пептиды, их модификации и варианты, или комбинации одного или более пептидов могут быть использованы в качестве родительскиого референс-полипептида в соответствии с представленными методами и/или композициями. INF-гамма пептиды, представляющие интерес, включают фрагменты и могут быть различным образом усечены на карбоксильном конце соответствующей полноразмерной последовательности. Такие фрагменты продолжают представлять свойства, характерные для человеческого гамма-интерферона, длина их составляет от 24 до 149 аминокислот (число аминокислотных остатков непроцессированного полипептида). Маргинальные последовательности могут быть замещены на следующие за аминокислотой 155 без потери активности. Смотри, например, U.S. Патент No. 5,690,925. Нативные IFN-гамма части включают молекулы, состоящие из различных аминокислотных остатков размером 24-150; 24-151, 24-152; 24- 153, 24-155; и 24-157.

[00222] Любой известный протеазо-резистентный или протеазо-резистент-ный, гипергликозилированный IFN-гамма полипептидный вариант, который сохраняет желательную фармакологическую активность родительского IFN-гамма полипептида, может быть использован в методах и/или композициях по изобретению.

[00223] В другом аспекте, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант, родительского терапевтического интерферона-гамма отличается от родительского терапевтического интерферона-гамма отличается в такой степени, что известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный полипептидный вариант включает (1), углеводную часть, ковалентно прикрепленную к не-нативному сайту гликозилирования, не найденномуу в родительском терапевтическом интерфероне-гамма, и/или (2) углеводную часть, ковалентно прикрепленную к нативному сайту гликозилирования, найденному негликозилированным в родительском терапевтическом интерфероне-гамма; и включает, по крайней мере, один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском IFN-γ полипептиде.

[00224] В другом аспекте, родительский терапевтический протеин является интерфероном-гамма 1b и известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипегликозилированный полипептидный вариант родительского терапевтического интерферона-гамма 1b является протеазо-резистентным вариантом гликозилированного нативного (дикого типа) человеческого IFN-γ. Гликозилированный нативный (дикого типа) человеческий IFN-γ описан в WO 02/081507.

Эритропоэтин

[00225] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный гипергликозилированный вариант полипептида содержит аминокислотную последовательность эритропоэтина, содержащую, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования в сравнении с родительским полипептидом эритропоэтином; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы, найденный в родительском ЕРО полипептиде. Применяющиеся полипептиды эритропоэтина включают такие протеины, которые обладают биологической активностью человеческого эритропоэтина, такие как аналоги эритропоэтина, изоформы эритропоэтина, фрагменты эритропоэтина, гибриды белка эритропоэтина, комбинированные протеины, а также олигимеры и мультимеры всех вышеперечисленных форм эритропоэтина.

[00226] Специфические примеры эритропоэтина включают, но не ограничиваются, человеческий Эритропоэтин (см. также Jacobs et al. (1985) Nature 313:806-810; и Lin et al. (1985) Proc Nati Acad Sci USA 82:7580-7584); полипептиды эритропоэтина, представленные в U.S. Patent Nos. 6,696,056 и 6,585,398; аминокислотные последовательности, представленные в Gen-Bank под номерами NP_00790 и САА26095; эпоэтин альфа (EPREX(R); ERYPO(R)); новый белок стимуляции эритропоэза (гипергликозилированный аналог человеческого рекомбинантного белка стимуляции эритропоэза, описанного в Европейской патентной заявке ЕР640619); аналог человеческого эритропоэтина - комбинированные протеины с человеческим сывороточным альбумина, описанные в Международной патентной заявке W09966054; мутантные формы эритропоэтина, описанные в Международной патентной заявке W09938890; эритропоэтин омега, продукт реестрикционного фрагмента Ара I гена эритропоэтина человека, описанный в патенте США No. 5,688,679; измененный гликозилированный эритропоэтин человека, описанный в Международной патентной заявке W09911781;

конъюгированные с ПЭГ аналоги эритропоэтина, описанные в патенте WO 9805363 или в патенте США No. 5,643,575. Специальные клеточные линии, подобранные для экспрессии эндогенного человеческого эритропоэтина, описаны в Международных патентных заявках WO 9905268 и WO 9412650.

[00227] С одной стороны, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный гипергликозилированный вариант родительского эритропоэтина сохраняет гематопоэтическую активность природного эритропоэтина, что показано путем мониторинга и измерения гематокрита пациентов.

[00228] С другой стороны, родительский полипептид является EPOGEN® эпоэтином альфа, а известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный гипергликозилированный вариант полипептида является резистентным к действию протеаз вариантом ARANESP® дарбепоэтина альфа. Инсулин.

[00229] По некоторым данным, известный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант полипептида содержит аминокислотную последовательность инсулина, содержащую, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с родительским полипептидом инсулина; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта протеазного расщепления, найденного в родительском инсулиновом полипептиде. Пригодные инсулиновые полипептиды включают, но не ограничиваются, проинсулин, препроинсулин и формы инсулина, описанные в патентах США 4992417; 4992418; 5474978; 5514646; 5504188; 5547929; 5650486; 5693609; 5700662; 5747642; 5922675; 5952297; 6034054; и 6211144; и опубликованные в заявках РСТ WO 00/121197; WO 09/010645; и WO 90/12814. Аналоги инсулина включают, но не ограничиваются, суперактивные аналоги инсулина, мономерные инсулины и печеночно-специфичные аналоги инсулина. Различные формы инсулина включают Humalog®; Humalog® Mix 50/50^TM; Humalog® Mix 75/25^TM; Humulin® 50/50; Humulin® 70/30; Humulin® L; Humulin® N; Humulin® R; Humulin® Ultralente; Laiirus®; Lente® Iletin® II; Lente® Insulin; Lente® L; Novolin® 70/30; Novolin® L; Novolin® N; Novolin® R; NovoLog^TM; NPH Iletin® I; NPH-N; Pork NPH Iletin® II; Pork Regular Iletin® II; Regular (концентрированный) Iletin® II U-500; Regular Iletin® I; и Velosulin® BR человеческий (буферизованный).

[00230] Полипептиды инсулина, пригодные для модификаций и применения, согласно настоящему изобретению включают аналоги человеческого инсулина, где в положения В28 являются Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положения В29 является Lys или Pro; des (B28-B30) человеческий инсулин; des(B27) человеческий инсулин; des(B30) человеческий инсулин; аналог человеческого инсулина, у которого положение В28 включает Asp и положение В29 включает Lys или Pro; аналог человеческого инсулина, в котором положение В28 соответствует Lys, положение В29 соответствует Lys или Pro; Asp^B28 человеческий инсулин; Lys^B2S Pro^B29 человеческий инсулин; В29-N-миристоил-des (B30) человеческий инсулин; B29-N⁸-пaльмитoил-des (B30) человеческий инсулин; B29-N⁸-миристоил человеческий инсулин; B29-N⁶- пальмитоил человеческий инсулин; B28-N⁸- миристоил Lys⁸²⁸ Pro⁸²⁹ человеческий инсулин; B28-N⁸- пальмитоил Lys⁸²⁸ Pro⁸²⁹ человеческий инсулин; B30-N⁶- миристоил -Thr⁸²⁹ Lys⁸³⁰ человеческий инсулин; В30-N⁸-пальмитоил-Tlir⁸²⁹ Lys⁸³⁰ человеческий инсулин; B29-N⁸-(N-пальми-[гамма]-глутамин)-des(B30) человеческий инсулин; B29-N⁸-(N-лито-холил-[гамма])-des(B30) человеческий инсулин; B29-N^e-([oмeгa]-кapбoкcигeптaдeкaнoил)-des(B30) человеческий инсулин; и B29-N⁸-([oмeгa]-карбоксигептадеканоил) человеческий инсулин.

[00231] Аминокислотные последовательности различных полипептидов инсулина доступны в таких базах данных, как GenBank, в статьях журналов, в патентах и бюллетенях патентов и т.д. Например, аминокислотные последовательности человеческого инсулина можно найти в GenBank под следующими номерами: САА00714; САА00713; САА00712; САА01254; IHISA и IHISB; 1 HIQA и 1 fflQB; IHITA и IHITB; 1 HLSA и IHLSB; IVKTA и IVKTB.

[00232] В дополнение, производные инсулина и резистентные к действию протеаз или резистентные к действию протеаз, гипергликозилированные формы могут использоваться как родительские полипептиды и как протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные полипептидные варианты, соответственно, в методах и/или комположениях данного изобретения. Производные инсулина включают ацилированный инсулин, гликозилированный инсулин и т.п. Примерами ацилированного инсулина являются таковые, описанные в U.S. Patent No. 5922675, например, инсулин производное с Сб-С21 жирных кислот (миристиновой, пентадециловой, пальмитиловой, гептадициловой, стеариловой) в а- или е-аминокислот глицина, фенилаланинаили лизина.

Антитела

[00233] В некоторых примерах осуществления изобретения известный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант полипептида включает аминокислотную последовательность полипептида антитела; далее содержит, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с родительским полипептидом антитела; затем включает в себя, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у родительского белка антитела. Пригодные антитела включают, но не ограничиваются, антитела различных изотипов (IgGI, IgG3 и IgG4); моноклональные антитела, производящиеся любыми способами; хюманизированные антитела; химерные антитела; одноцепочечные антитела; фрагменты антител, такие как Fv, F(ab')₂, Fab¹, Fab, Facb, и подобные, обеспечивающие, что антитело способно к связыванию с антигеном. Пригодные моноклональные антитела включают в себя антитела, специфичные к рецепторам на поверхности клеток и функционирующие как антагонисты к рецепторам, включая, но не ограничиваясь, антитело к рецептору TGF-P, антитело к рецептору TNF-a, антитело к рецептору VEGF (см., например, U.S. Patent Nos. 6617160, 6448077, и 6365157), антитело к рецептору эпидермального фактора роста и подобные; антитела, специфичные к лигандам рецепторов, включают следующие, и не только: антитело к TGF-β, антитело к TNF-a, антитело к VEGF и подобные; антитело к специфическому антигену, ассоциированому с опухолью; антитело, специфичное к CD20; антитело, специфичное к рецептору эпидермального фактора роста -2; антитело, специфичное к рецептор-связывающему домену IgE; антитело, специфичное к адгезивным молекулам (например, антитело специфичное к а субъединице (CD 11 а) LFA-1; антитело, специфичное к а4р7; и др.); и прочие подобные.

Факторы крови

[00234] В некоторых примерах осуществления изобретения известный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант полипептида содержит аминокислотную последовательность полипетида фактора крови; и далее включает в себя, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с родительским полипептидом фактора крови; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у родительского полипептида. Пригодные полипептиды факторов роста включают, но не ограничиваясь, активатор тканевого плазминогена (ТРА); фактор Вила; фактор VIII; фактор IX; β-глобин; гемоглобин; и подобные. Аминокислотные последовательности различных факторов крови общедоступны, например, в базе данных Gen-Bank; в статьях журналов, в патентах и бюллетенях патентов и т.д.

Например, аминокислотная последовательность человеческого ТРА найдена в GenBank под номерами Р0070, NP_127509, и NP-000921; аминокислотная последовательность человеческого фактора Вила найдена в GenBank под номером KFHU7; аминокислотная последовательность человеческого фактора ВС найдена в GenBank под номерами Р00740 и NP_000124; аминокислотная последовательность человеческого фактора VIII найдена в Gen-Bank под номерами ААН64380, ААН22513 и Р00451.

[00235] В одном аспекте, родительский полипептид является ACTIVASE® альтеплазой и протеазо-резистентный, вариант полипептида является устойчивым к действию протеаз вариантом TNKase(TM) тенектеплазы.

Колониестимулирующие факторы.

[00236] В некоторых примерах осуществления изобретения известный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант полипептида содержит аминокислотную последовательность полипептида колониестимулирующего фактора, затем содержит, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с родительским полипептидом колониестимулирующего фактора; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у исходного полипептида колониестимулирующего фактора. Использующиеся полипептиды колониестимулирующих факторов включают, но не ограничиваясь, гранулоцитколониестимулирующий фактор(С-СЗР), такие как NEUPOGEN® филграстим и NEULASTA пегфилграстим, гранулоцитмоноцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), такой как LEUKINE® сарграмостим, макрофагальный колониестимулирующий фактор, мегакариоцитколониестимулирующий фактор, IL-3, фактор стволовых клеток (SCF); и прочие подобные.

[00237] Аминокислотные последовательности различных факторов крови общедоступны, в том числе в публичных базах данных, таких как GenBank; статьи в журналах, патенты и приложения к патентам и т.п. Например, аминокислотная последовательность IL-3 имеется в патентах США под номерами 4877729 и 4959455, и международной патентной заявке под номером WO 88/00598; аминокислотная последовательность человеческого G-CSF имеется в патентах США под номером 4810643; под номерами WO 91/02754 и WO 92/04455 имеются аминокислотные последовательности составных белков, содержащие IL-3; WO 95/21197, WO 95/21254, и патент США 6730303 описывают слитые протеины, обладающие широким спектром гематопоэтических свойств; аминокислотные последовательности человеческого G-CSF найдены в GenBank под номерами NP_757374, Р09919, FQHUGL, и NP_000750; аминокислотные последовательности человеческого GM-CSF найдены в GenBank под номерами NP_000749 и Р04141; аминокислотные последовательности IL-3 найдены в GenBank под номерами ААН66272, ААН66273, и ААН66276; и т.д.

Гормоны роста

[00238] В некоторых примерах осуществления изобретения известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность полипептида гормона роста, и, более того, содержит, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом гормона роста; и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Применяющиеся полипептиды гормонов роста включают, но не ограничиваются, соматотропином; гормоном роста человека; любой из вариантов гормонов роста имеется в патенте США под номерами 6143523, 6136563, 6022711, и 5688666; синтетические протеины, содержащие гормон роста, например, имеются в патенте США No. 5889144; фрагменты гормонов роста, обладающие активностью гормонов роста; полипептид-агонист рецептора гормона роста описан в патенте США под номером 6387879; и т.д. Гормоны роста включают также альтернативные формы известных гормонов роста, например, альтернативные формы гормона роста человека (hGH), включающие в себя полученные естественным путем производные, варианты и метаболические продукты, продукты деградации главным образом биосинтетического hGH и разработанные с помощью рекомбинантных методов варианты hGH. (см. например, патент США 6348444).

Факторы роста

[00239] В некоторых примерах осуществления изобретения протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность фактора роста, и, более того, содержит по крайней мере один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом фактора роста;

и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Применяющиеся полипептиды факторов роста включают, но не ограничиваются, фактором роста кератиноцитов; кислым фактором роста фибробластов, фактором стволовых клеток, основным фактором роста фибробластов, фактором роста гепатоцитов, инсулиноподобным фактором роста, и др; активными фрагментами факторов роста; синтетическими белками, содержащими факторы роста, и т.п. Аминокислотные последовательности различных факторов роста общедоступны, в том числе в публичных базах данных, таких как GenBank; статьи в журналах, патенты и приложения к патентам и т.п. Например, аминокислотная последовательность bFGF имеется в GenBank под номерами ААВ20640, ААА57275, А43498, и ААВ20639; аминокислотная последовательность aFGF имеется в GenBank под номерами ААВ29059, САА46661, и 1605206А; аминокислотная последовательность фактора стволовых клеток имеется в GenBank под номерами ААН69733, ААН69783, и ААН69797; аминокислотная последовательность фактора роста кератиноцитов имеется в GenBank под номерами 035565, AAL05875, и Р21781; аминокислотная последовательность фактора роста гепатоцитов имеется в GenBank под номерами ААА64239, ААВ20169 и САА40802.

Растворимые рецепторы

[00240] В некоторых примерах осуществления изобретения, протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность варианта полипептида растворимого рецептора, и, более того, содержит по крайней мере один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом фактора роста; и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Применяющиеся полипептиды факторов роста включают, но не ограничиваются, растворимым рецептором связывания TNF-α; растворимым рецептором VEGF; растворимым рецептором интерлейкина; растворимым рецептором IL-1; растворимым рецептором IL-1 II типа; растворимым γ/δ Т-клеточнымй рецептором; лиганд-связывающими фрагментами растворимого рецептора; и т.п. Применяющиеся растворимые рецепторы связывают лиганд, который в нормальных физиологических условиях связывается с ними, и активирует соответствующий мембраносвязанный рецептор или рецептор на поверхности клетки. Таким образом, применяющиеся растворимые рецепторы функционируют как рецепторные антагонисты за счет того, что связывают лиганд, который должен был связаться с рецептором в его нативной (то есть мембраносвязанной) форме.

[00241] Аминокислотные последовательности различных растворимых рецепторов общедоступны, в том числе в публичных базах данных, таких как GenBank; статьях в журналах, патентах и приложениях к патентам и т.п. Например, аминокислотные последовательности растворимого VEGF-рецептора найдены в GenBank под номерами ААС50060 и NP_002010;

растворимые VEGF-рецепторы описаны в патентах США под номерами Nos. 6383486, 6375929, и 6100071; растворимый рецептор IL-4 описан в патенте США под номером 5599905; растворимые рецепторы IL-I описаны в Публикации Патентов США 20040023869; и т.д.

Хемокины

[00242] В некоторых примерах осуществления изобретения известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность варианта полипептида хемокина, и, более того, содержит по крайней мере один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом хемокина; и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Применяющиеся полипептиды хемокинов включают, помимо многих других, IP-10; Mig; Groα/IL-8, RANTES; MIP-1a; MIP-1β; MCP-1; PF-4; и т.п; и также слитыми протеинами, содержащими хемокины. Аминокислотные последовательности различных растворимых рецепторов общедоступны, в том числе в публичных базах данных, таких как GenBank; статьях в журналах, патентах и приложениях к патентам и т.п. Например, аминокислотные последовательности IP-10 описаны в патентах США под номерами 6491906, 5935567, 6153600, 5728377, и 5994292; аминокислотные последовательности Mig описаны в патенте США под номером 6491906, и в статье Farber (1993) Biochemical и Biophysical Research Communications 192(1):223-230; аминокислотные последовательности RANTES описаны в патентах США под номерами 6709649, 6168784, и 5965697; и т.д.

Ангиогенные факторы

[00243] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность варианта полипептида ангиогенного полипептида, и, более того, содержит по крайней мере один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом ангиогенного фактора; и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Применяющиеся ангиогенные полипептиды включают помимо многих других, полипептиды фактора роста эндотелия сосудов VEGF, среди них VEGF 121, VEGF 165, VEGF-C, VEGF-2, и др.; трансформирующий фактор роста - бета; основный фактор роста фибробластов; фактор роста, секретируемый клетками глиомы; ангиогенин; ангиогенин -2; и т.п. Аминокислотные последовательности различных растворимых рецепторов общедоступны, в том числе в публичных базах данных, таких как GenBank; статьи в журналах, патенты и приложения к патентам и т.п. Например, аминокислотные последовательности полипептидов VEGF описаны в патентах США под номерами 5194596, 5332671, 5240848, 6475796, 6485942, и 6057428; аминокислотные последовательности полипептидов VEGF-2 polypeptides описаны в патентах США под номерами 5726152 и 6608182; аминокислотные последовательности полипептидов факторов роста, секретируемых клетками глиомы, обладающих ангиогенной активностью, описаны в патентах США под номерами 5338840 и 5532343; аминокислотные последовательности ангиогенина найдены в GenBank под номерами ААА72611, ААА51678, ААА02369, AAL67710, AAL67711, AAL67712, AAL67713, и AAL67714; и т.д.

Нейроактивные пептиды

[00244] В некоторых примерах осуществления изобретения известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность варианта нейроактивного пептида, и, более того, содержит по крайней мере один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным нейроактивным пептидом; и, более того, содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Применяющиеся ангиогенные полипептиды включают помимо многих других, фактор роста нервов, брадикинин, хлецитокинин, гастин, секретин, окситоцин, гонадолиберин, бета-эндорфин, энкефалин, субстанцию Р, соматостатин, пролактин, галанин, гормон, освобождающий гормон роста, бомбесин, динорфин, нейротенсин, мотилин, тиротропин, нейропептид Y, лютеинизирующий гормон, кальцитонин, инсулин, глюкагон, вазопрессин, ангиотензин II, гормон, высвобождающий триптофан, вызоактивный интестинальный пептид, пептид сна и т.д.

Другие пептиды.

[00245] В широком смысле, комположении и способы изобретения подразумевают использование любого известного протеазо-резистентного или протеазо-резистентного, гипергликозилированного варианта полипептида, который содержит, по крайней мере, один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным полипептидом; и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Другие протеины, представляющие интерес для фармакологии, включают, помимо многих прочих, тромболитический фактор, предсердный натрий-уретический пептид, белок морфогенеза костей, тромбопоэтин, кислый фибриллярный белок глии, фолликулостимулирующий гормон, человеческий альфа-1 антитрипсин, фактор ингибиции лейкемии, трансформирующий фактор роста, инсулиноподобный фактор роста, лютеинизирующий гормон, фактор активации макрофагов, фактор некроза опухоли, фактор хемотаксиса нейтрофилов, фактор роста нервов, тканевой ингибитор металопротеиназ; вазоактивный интестинальный пептид, ангиотропин, фибрин; гирудин; фактор ингибиции лейкемии и т.п. Аминокислотные последовательности различных терапевтических белков общедоступны, в том числе в публичных базах данных, таких как GenBank; статьи в журналах, патенты и приложения к патентам и т.п. Например, аминокислотная последовательность тканевого активатора плазминогена найдена в базе GenBank под номерами Р00750, ААА01895, ААА01378, ААВ06956, и САА00642.

[00246] В некоторых примерах осуществления изобретения известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой аминокислотную последовательность варианта релаксина, и, более того, содержит по крайней мере один ненативный сайт гликозилирования по сравнению с нативным релаксином; и, более того, содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеаз вместо нативного сайта расщепления протеаз, имеющегося у родительского полипептида. Пептид релаксин может быть природным и синтетическим. Природный биологически активный релаксин может быть человеческим, мышиным или крысиным, свиным и полученным от других млекопитающих. Термин "релаксин" включает человеческий H1 препрорелаксин, прорелаксин, и релаксин; Н2 препрорелаксин, прорелаксин, и релаксин; рекомбинантный человеческий релаксин (rhRLX); и Н3 препрорелаксин, прорелаксин, и релаксин. Н3 релаксин описан в статье. См. также Sudo et al. (2003) J Biol Chem. 7:278(10):7855-62. Аминокислотные последовательности человеческого релаксина описаны в статьях. Например, Аминокислотные последовательности человеческого релаксина находятся в GenBank под следующими номерами: Q3WXF3, человеческий Н3 прорелаксин; Р04808, человеческий H1 прорелаксин; NP_604390 и NP_005050, человеческий Н2 прорелаксин; ААН05956, человеческий релаксин 1 препротеин; NP_008842, человеческий H1 препрорелаксин; и т.д. Релаксин может содержать А и В цепи, усеченные с N- и/или С-концов. Например, в Н2 релаксине А-цепь может варьировать в пределах от А(1 -24) до А(10-24) и В-цепь - от В(1-33) до В(10-22); в H1 релаксине А-цепь может варьировать в пределах от А(1 -24) до А(10-24) и В-цепь - от В(1-32) до В(10-22). Также удобными для различных модификаций представляются аналоги релаксина с отличной от дикого типа (нативного) аминокислотной последовательностью, к которым относятся аналоги релаксина, описанные в патентах США под номерами 5811395, и 6200953. Другие применяющиеся релаксины и аналоги описаны в патенте США 5945402. Другие возможные полипептиды релаксина включают релаксин, имеющий замены одной или более аминокислот в А и/или В цепях на другие аминокислоты (включая D-форму натуральных аминокислот), включая, помимо многих других, замену Метионина в положении В24 на норлейцин (Nie), Валин (Val), аланин (А1а), глицин (Gly), серин (Ser) или гомосерин (HomoSer). Другие возможные полипептиды релаксина включают релаксин, имеющий замены аминокислот в В/С и С/А соединениях прорелаксина, модификации которых облегчают отщепление С-цепи от прорелаксина; и вариант релаксина, имеющий ненативный С-пептид, как описано в патенте США под номером 5759807.

Протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные варианты полипептида родительских цитокиновых полипептидов.

[00247] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой вариант природного терапевтического белка, являющегося цитокином. В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида содержит одну или более аминокислотных замен по сравнению с немодифицированным природным цитокином, находящиеся в положениех: 2-181 (IFN-α2b варианты), 233-289 (IFN-β варианты), 290-311 (IFN-γ варианты), 362-400 (GM-CSF варианты), 631-662 (G-CSF variants), 850-895 (hGH variants), 940-977 (EPO варианты), 978-988 (IFN-α варианты) и 989-1302 (IFN-β варианты); и, более того, представляют собой аминокислотные последовательности, отличающиеся от нативных тем, что имеют один или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде. Типичные аминокислотные замены, приводящие к формированию сайта гликозилирования, проиллюстрированы на Фиг.23-30. В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипер-гликозилированный вариант полипептида является структурным гомологом белка, имеющего аминокислотную последовательность как у следующих SEQ ID NOs: 2-181 (IFN-α2b варианты), 233-289 (IFN-β варианты), 290-311 (IFN-γ варианты), 362-400 (GM-CSF варианты), 631-662 (G-CSF variants), 850-895 (hGH variants), 940-977 (EPO варианты), 978-988 (IFN-α варианты), и 989-1302 (IFN-β варианты); и, более того, представляет собой аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной тем, что имеет один или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00248] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида содержит один или более аминокислотных замен по сравнению с немодифицированным природным цитокином, как показано в аминокислотных последовательностях любой из этих SEQ ID номеров: 87, 89, 90, 93, 96, 101, 103, 107, 124, 979, 980, 983, 984, 986, и 987; и, более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной тем, что имеет один или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00249] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида является цитокином, модифицированным на основании 3-мерной структурной гомологии с любым из SEQ ID NOs: 87, 89, 90, 93. 96, 101, 103, 107, 124, 979, 980, 983, 984, 986, и 987; где этот вариант представляет собой аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной тем, что имеет один или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00250] В некоторых примерах осуществления изобретения известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида выбран из следующих протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов полипептида: интерлейкина-10 (IL-10), интерферона бета (IFNR), интерферона альфа-2а (IFN-α2a), интерферона альфа -2b (IFN-α2b), интерферона гамма (IFN-γ), гранулоцит колониестимулирующего фактора (G-CSF), фактора ингибиции лейкемии (LIF), человеческого гормона роста (hGH), цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), лептина, онкостатина М, интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-12 (IL-12), эритропоэтина (ЕРО), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего (GM-CSF), интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-3 (IL-3), интерлейкина -4 (IL-4), интерлейкина -5 (IL-5), интерлейкина-13 (IL-13), Flt3 лиганда и фактора стволовых клеток (SCF). В конкретных примерах осуществления изобретения, известный протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант полипептида выбран из протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFNβ, IFN-α2a, IFN-α2b, IFN-γ, G-CSF, hGH, ЕРО, и GM-CSF. В конкретных примерах осуществления изобретения известным резистентным к действию протеаз вариантом цитокина является интерферон.

[00251] Известный гипергликозилированный вариант природного цитокина, устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз, обладает повышенной устойчивостью к протеолизу по сравнению с немодифицированным нативным цитокином. В некоторых примерах осуществления изобретения известным резистентным к действию протеаз вариантом цитокина является интерферон. В некоторых примерах осуществления изобретения известным гипергликозилированным резистентным к действию протеаз или резистентным к действию протеаз вариантом интерферона является интерферона альфа-2а (IFN-α2a). В некоторых примерах осуществления изобретения известным гипергликозилированным резистентным к действию протеаз или резистентным к действию протеаз вариантом интерферона является интерферона альфа-2b (IFN-α2 b). В некоторых примерах осуществления изобретения известным гипергликозилированным резистентным к действию протеаз или резистентным к действию протеаз вариантом интерферона является IFNβ. В некоторых примерах осуществления изобретения известным гипергликозилированным резистентным к действию протеаз или резистентным к действию протеаз вариантом интерферона является IFNγ. В некоторых примерах осуществления изобретения известным гипергликозилированным резистентным к действию протеаз или резистентным к действию протеаз вариантом цитокина является вариант интерферона, и представляет собой аминокислотную последовательность определяемую как SEQ ID NO: 232, или как показано на Фиг.9, или как изображено на Фиг.24.

Варианты полипептида IFN-α.

[00252] В некоторых примерах осуществления изобретения известный гипергликозилированный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант полипептида содержит одну или более мутаций, показанных в таблице 1, и ниже, где нумерация аминокислот соответствует нумерации аминокислот на Фиг.1; и, более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайтов гликозилирования.

Таблица 1 IFN-α пример SEQ ID NO Мутация(и) 1 983 K121Q/P109A 2 987 E159H/Y89H 3 124 E159Q 4 90 Е58Н 5 89 E58Q 6 979 E41H/Y89H/N45D 7 103 L117I 8 986 R125H/M111V 9 96 Е107Н 10 101 Е113Н 11 87 E41Q 12 107 R125Q 13 985 L117V/A139G 14 980 E41Q/D94G 15 93 Е78Н 16 984 K133Q/K121Q/P109A/G102R

[00253] С одной стороны, родительский полипептид является IFN-α2a или IFN-α2b и известный гипергликозилированный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант полипептида имеет одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности IFN-α 2а, проиллюстрированной на Фиг.1, или последовательности IFN-α 2b, проиллюстрированной на Фиг.2, соответствующих заменам: L на V в положении 3; L на I в положении 3; Р на S в положении 4; Р на А в положении 4; R на Н в положении 12; R на Q в положении 12; R на Н в положении 13; R на Q в положении 13; М на V в положении 16; М на I в положении 16; R на Н в положении 22; R на Q в положении 22; R или К на Н в положении 23; R или К на Q в положении 23; F на I в положении 27; F на V в положении 27; L на V в положении 30; L на I в положении 30; К на Q в положении 31; К на Т в положении 31; R на Н в положении 33; R на Q в положении 33; Е на Q в положении 41; Е на Н в положении 41; К на Q в положении 49; К на Т в положении 49; Е на Q в положении 58; Е на Н в положении 58; К на Q в положении 70; К на Т в положении 70; Е на Q в положении 78; Е на Н в положении 78; К на Q' в положении 83; К на Т в положении 83; Y на Н в положении 89; Y на I в положении 89; Е на Q - в положении 96; Е на Н в положении 96; Е на Q в положении 107; Е на Н в положении 107; Р на S в положении 109; Р на А в положении 109; L на V в положении 110; L на I в положении 110; М на V в положении 111; М на I в положении 111; Е на Q в положении 113; Е на Н в положении 113; L на V в положении 117; L на I в положении 117; R на Н в положении 120; R на Q в положении 120; К на Q в положении 121; К на Т в положении 121; R на Н в положении 125; R на Q в положении 125; L на V в положении 128; L на I в положении 128; К на Q в положении 131; К на Т в положении 131; Е на Q в положении 132; Е на Н в положении 132; К на Q в положении 133; К на Т в положении 133; К на Q в положении 134; К на Т в положении 134; Y на Н в положении 135; Y на I в положении 135; Р на S в положении 137; Р на А в положении 137; М на V в положении 148; М на I в положении 148; R на Н в положении 149; R на Q в положении 149; Е на Q в положении 159; Е на Н в положении 159; L на V в положении 161; L на I в положении 161; R на Н в положении 162; R на Q в положении 162; К на Q в положении 164; К на Т в положении 164; Е на Q в положении 165; и Е на Н в положении 165, где остаток 1 соответствует остатку 1 в готовом белке IFN-α2a, как показано на Фиг.1 или где остаток 1 соответствует остатку 1 в зрелой форме белка IFN-α2b, как показано на Фиг.2; и, более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайтов гликозилирования.

[00254] С другой стороны, родительский пептид является IFN- а2а или IFN-α2b, и известный гипергликозилированный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант полипептида имеет одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности IFN- а2а, как показано на Фиг.1, или IFN-α2b, как показано на Фиг.2, соответствующих заменам: F на V в положении 27; R на Н в положении 33;

Е на Q в положении 41; Е на Н в положении 41; Е на Q в положении 58; Е на Н в положении 58; Е на Q в положении 78; Е на Н в положении 78; Y на Н в положении 89; Е на Q в положении 107; Е на Н в положении 107; Р на А в положении 109; L на V в положении 110; М на V в положении 111; Е на Q в положении 113; Е на Н в положении 113; L на V в положении 117; L на I в положении 117; К на Q в положении 121; К на Т в положении 121; R на Н в положении 125; R на Q в положении 125; К на Q в положении 133; К на Т в положении 133; Е на Q в положении 159 и Е на Н в положении 159, где остаток 1 соответствует остатку 1 в готовом белке IFN-α2a, как показано на Фиг.1, или где остаток 1 соответствует остатку 1 в зрелой форме белка IFN-α2b, как показано на Фиг.2; и, более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде.

[00255] С другой стороны, родительский полипептид является IFN-α2a или IFN-α2b, и известный гипергликозилированный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант полипептида имеет одну или более двойных аминокислотных замен в аминокислотной последовательности IFN-α2a, как показано на Фиг.1, или IFN-α2b, как показано на Фиг.2, соответствующих заменам:

[00256] D на N в положении 2 и Р на S в положении 4;

[00257] D на N в положении 2 и Р на Т в положении 4;

[00258] L на N в положении 3 и Q на S в положении 5;

[00259] L на N в положении 3 и Q на Т в положении 5;

[00260] Р на N в положении 4 и Т на S в положении 6;

[00261] Р на N в положении 4 и Т на Т в положении 6;

[00262] Q на N в положении 5 и Н на S в положении 7;

[00263] Q на N в положении 5 и Н на Т в положении 7;

[00264] Т на N в положении 6 и S на S в положении 8;

[00265] Т на N в положении 6 и S на Т в положении 8;

[00266] Н на N в положении 7 и L на S в положении 9;

[00267] Н на N в положении 7 и L на Т в положении 9;

[00268] S на N в положении 8 и G на S в положении 10;

[00269] S на N в положении 8 и G на Т в положении 10;

[00270] L на N в положении 9 и S на S в положении 11;

[00271] L на N в положении 9 и S на Т в положении 11;

[00272] М на N в положении 21 и К на S в положении 23;

[00273] М на N в положении 21 и К на Т в положении 23;

[00274] R на N в положении 22 и I на S в положении 24;

[00275] R на N в положении 22 и I на Т в положении 24;

[00276] R или К на N в положении 23 и S на S в положении 25;

[00277] R или К на N в положении 23 и S на Т в положении 25;

[00278] I на N в положении 24 и L на S в положении 26;

[00279] I на N в положении 24 и L на Т в положении 26;

[00280] S на N в положении 25 и F на S в положении 27;

[00281] S на N в положении 25 и F на Т в положении 27;

[00282] L на N в положении 26 и S на S в положении 28;

[00283] L на N в положении 26 и S на Т в положении 28;

[00284] S на N в положении 28 и L на S в положении 30;

00285] S на N в положении 28 и L на Т в положении 30;

[00286] L на N в положении 30 и D на S в положении 32;

[00287] L на N в положении 30 и D на Т в положении 32;

[00288] К на N в положении 31 и R на S в положении 33;

[00289] К на N в положении 31 и R на Т в положении 33;

[00290] D на N в положении 32 и Н на S в положении 34;

[00291] D на N в положении 32 и Н на Т в положении 34;

00292] R на N в положении 33 и D на S в положении 35;

[00293] R на N в положении 33 и D на Т в положении 35;

[00294] Н на N в положении 34 и F на S в положении 36;

[00295] Н на N в положении 34 и F на Т в положении 36;

[00296] D на N в положении 35 и G на S в положении 37;

[00297] D на N в положении 35 и G на Т в положении 37;

[00298] F на N в положении 36 и F на S в положении 38;

[00299] F на N в положении 36 и F на Т в положении 38;

[00300] G на N в положении 37 и Р на S в положении 39;

[00301] G на N в положении 37 и Р на Т в положении 39;

[00302] F на N в положении 38 и Q на S в положении 40;

[00303] F на N в положении 38 и Q на Т в положении 40;

[00304] Р на N в положении 39 и Е на S в положении 41;

[00305] Р на N в положении 39 и Е на Т в положении 41;

[00306] Q на N в положении 40 и Е на S в положении 42;

[00307] Q на N в положении 40 и Е на Т в положении 42;

[00308] Е на N в положении 41 и F на S в положении 43;

[00309] Е на N в положении 41 и F на Т в положении 43;

[00310] Е на N в положении 42 и G на S в положении 44;

[00311] Е на N в положении 42 и G на Т в положении 44;

[00312] F на N в положении 43 и N на S в положении 45;

[00313] F на N в положении 43 и N на Т в положении 45;

[00314] G на N в положении 44 и Q на S в положении 46;

[00315] G на N в положении 44 и Q на Т в положении 46;

[00316] N на N в положении 45 и F на S в положении 47;

[00317] N на N в положении 45 и F на Т в положении 47;

[00318] Q на N в положении 46 и Q на S в положении 48;

[00319] Q на N в положении 46 и Q на Т в положении 48;

[00320] F на N в положении 47 и К на S в положении 49;

[00321] F на N в положении 47 и К на Т в положении 49;

[00322] Q на N в положении 48 и А на S в положении 50;

[00323] Q на N в положении 48 и А на Т в положении 50;

[00324] К на N в положении 49 и Е на S в положении 51;

[00325] К на N в положении 49 и Е на Т в положении 51;

[00326] А на N в положении 50 и Т на S в положении 52;

[00327] А на N в положении 50 и Т на Т в положении 52;

[00328] S на N в положении 68 и К на S в положении 70;

[00329] S на N в положении 68 и К на Т в положении 70;

[00330] К на N в положенииеd и S на S в положении 72;

[00331] К на N в положении 70 и S на Т в положении 72;

[00332] А на N в положении 75 и D на S в положении 77;

[00333] А на N в положении 75 и D на Т в положении 77;

[00334] D на N в положении 77 и Т на S в положении 79;

[00335] D на N в положении 77 и Т на Т в положении 79;

[00336] I на N в положении 100 и G на S в положении 102;

[00337] I на N в положении 100 и G на Т в положении 102;

[00338] Q на N в положении 101 и V на S в положении 103;

[00339] Q на N в положении 101 и V на Т в положении 103;

[00340] G на N в положении 102 и G на S в положении 104;

[00341] G на N в положении 102 и G на Т в положении 104;

[00342] V на N в положении 103 и V на S в положении 105;

[00343] V на N в положении 103 и V на Т в положении 105;

[00344] G на N в положении 104 и Т на S в положении 106;

[00345] G на N в положении 104 и Т на Т в положении 106;

[00346] V на N в положении 105 и Е на S в положении 107;

[00347] V на N в положении 105 и Е на Т в положении 107;

[00348] Т на N в положении 106 и Т на S в положении 108;

[00349] Т на N в положении 106 и Т на Т в положении 108;

[00350] Е на N в положении 107 и Р на S в положении 109;

[00351] Е на N в положении 107 и Р на Т в положении 109;

[00352] Т на N в положении 108 и I на S в положении 110;

[00353] Т на N в положении 108 и I на Т в положении 110;

[00354] К на N в положении 134 и S на S в положении 136;

[00355] К на N в положении 134 и S на Т в положении 136;

[00356] S на N в положении 154 и N на S в положении 156;

[00357] S на N в положении 154 и N на Т в положении 156;

[00358] Т на N в положении 155 и L на S в положении 157;

[00359] Т на N в положении 155 и L на Т в положении 157;

[00360] N на N в положении 156 и Q на S в положении 158;

[00361] N на N в положении 156 и Q на Т в положении 158;

[00362] L на N в положении 157 и Е на S в положении 159;

[00363] L на N в положении 157 и Е на Т в положении 159;

[00364] Q на N в положении 158 и S на S в положении 160;

[00365] Q на N в положении 158 и S на Т в положении 160;

[00366] Е на N в положении 159 и L на S в положении 161;

[00367] Е на N в положении 159 и L на Т в положении 161;

[00368] S на N в положении 160 и R на S в положении 162;

[00369] S на N в положении 160 и R на Т в положении 162;

[00370] L на N в положении 161 и S на S в положении 163;

[00371] L на N в положении 161 и S на Т в положении 163;

[00372] R на N в положении 162 и К на S в положении 164;

[00373] R на N в положении 162 и К на Т в положении 164;

[00374] S на N в положении 163 и Е на S в положении 165;

[00375] S на N в положении 163 и Е на Т в положении 165, где остаток 1 соответствует остатку 1 в готовом белке IFN-α2a, как показано на Фиг.1, или где остаток 1 соответствует остатку 1 в зрелой форме белка IFN-α2b, как показано на Фиг.2; и, более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайтов гликозилирования, не найденного в родительском полипептиде.

[00376] С другой стороны, родительский полипептид является IFN-α2a или IFN-α2b, и известный гипергликозилированный резистентный к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант полипептида имеет одну или более двойных аминокислотных замен в аминокислотной последовательности IFN-α2a, как показано на Фиг.1, или IFN-α2b, как показано на Фиг.2, соответствующих заменам:

[00377] Q на N в положении 5 и Н на S в положении 7;

[00378] Р на N в положении 39 и Е на S в положении 41;

[00379] Р на N в положении 39 и Е на Т в положении 41;

[00380] Q на N в положении 40 и Е на S в положении 42;

[00381] Q на N в положении 40 и Е на Т в положении 42;

[00382] Е на N в положении 41 и F на S в положении 43;

[00383] Е на N в положении 41 и F на Т в положении 43;

[00384] F на N в положении 43 и N на S в положении 45;

[00385] G на N в положении 44 и Q на Т в положении 46;

[00386] N на N в положении 45 и F на S в положении 47;

[00387] N на N в положении 45 и F на Т в положении 47;

[00388] Q на N в положении 46 и Q на S в положении 48;

[00389] F на N в положении 47 и К на S в положении 49;

[00390] F на N в положении 47 и К на Т в положении 49;

[00391] I на N в положении 00 и G на S в положении 102;

[00392] I на N в положении 100 и G на Т в положении 102;

[00393] V на N в положении 105 и Е на S в положении 107;

[00394] V на N в положении 105 и Е на Т в положении 107;

[00395] Т на N в положении 106 и Т на S в положении 108;

[00396] Т на N в положении 106 и Т на Т в положении 108;

[00397] Е на N в положении 107 и Р на S в положении 109;

[00398] Е на N в положении 107 и Р на Т в положении 109;

[00399] L на N в положении 157 и Е на 8 в положении 159;

[00400] L на N в положении 157 и Е на Т в положении 159;

[00401] Е на N в положении 159 и L на S в положении 161; и

[00402] Е на N в положении 159 и L на Т в положении 161, где остаток 1 соответствует остатку 1 в готовом белке IFN-α2a, как показано на Фиг.1, или где остаток 1 соответствует остатку 1 в зрелой форме белка IFN-α2b, как показано на Фиг.2; и, более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде.

[00403] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант цитокина является IFN-α2b, IFN-α2a, или IFN-2с вариантом, содержащим одну или более одиночных аминокислотных замен, соответствующим заменам: N на D в положении 45; D на G в положении 94; G на R в положении 102; А на G в положении 139; или любой комбинации из них, где нумерация аминокислот такая, как показано на Фиг.1.

[00404] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант цитокина является IFN-α2b, IFN-α2a, или IFN-2с, содержащим одну или более одиночных аминокислотных замен, в любой из SEQ ID Nos. I, 182, 185 или 232 (то есть в любой из последовательностей, представленных на Фиг.2, 1, 11 и 9 соответственно), соответствующих следующим заменам: L на V в положении 3; L на I в положении 3; Р на S в положении 4; Р на S в положении 4; Р на А в положении 4; R на Н в положении 12; R на Q в положении 12; R на Н в положении 13; R на Q в положении 13; М на V в положении 16; М на I в положении 16; R на Н в положении 22; R на Q в положении 22; R or К на Н в положении 23; R or К на Q в положении 23; F на I в положении 27; F на V в положении 27; L на V в положении 30; L на I в положении 30; К на Q в положении 31; К на Т в положении 31; R на Н в положении 33; R на Q в положении 33; Е на Q в положении 41; Е на Н в положении 41; К на Q в положении 49; К на Т в положении 49; Е на Q в положении 58; Е на Н в положении 58; К на Q в положении 70; К на Т в положении 70; Е на Q в положении 78; Е на Н в положении 78; К на Q в положении 83; К на Т в положении 83; Y на Н в положении 89; Y на I в положении 89; Е на Q в положении 96; Е на Н в положении 96; Е на Q в положении 107; Е на Н в положении 107; Р на S в положении 109; Р на А в положении 109; L на V в положении 110; L на I в положении 110; М на V в положении 111; М на I в положении 111; Е на Q в положении 113; Е на Н в положении 113; L на V в положении 117; L на I в положении 117; R на Н в положении 120; R на Q в положении 120; К на Q в положении 121; К на Т в положении 121; R на Н в положении 125; R на Q в положении 125; L на V в положении 128; L на I в положении 128; К на Q в положении 131; К на Т в положении 131; Е на Q в положении 132; Е на Н в положении 132; К на Q в положении 133; К на Т в положении 133; К на Q в положении 134; К на Т в положении 134; Y на Н в положении 135; Y на I в положении 135; Р на S в положении 137; Р на А в положении 137; М на V в положении 148; М на I в положении 148; R на Н в положении 149; R на Q в положении 149; Е на Q в положении 159; Е на Н в положении 159; L на V в положении 161; L на I в положении 161; R на Н в положении 162; R на Q в положении 162; К на Q в положении 164; К на Т в положении 164; Е на Q в положении 165; или Е на Н в положении 165; или любой комбинации из них, где остаток 1 соответствует остатку 1 в зрелой форме белка IFN-α2b или белка IFN-α2a, представленных в SEQ ID NOS:1 или 182 (или как дано на Фиг.2 и 1, соответственно); и более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде.

[00405] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант цитокина, является IFN-α2b, IFN-α2a, или IFN-2с, содержащий одну или более одиночных аминокислотных замен, в любой из SEQ ID Nos. 1, 182, 185 или 232 (то есть в любой из последовательностей, представленных на Фиг.2,1, 11 и 9 соответственно), соответствующих следующим заменам: L на V в положении 3; L на I в положении 3; Р на S в положении 4; Р на А в положении 4; R на Н в положении 12; R на Q в положении 12; R на Н в положении 13; R на Q в положении 13; М на V в положении 16; М на I в положении 16; R на Н в положении 22; R на Q в положении 22; R or К на Н в положении 23; R or К на Q в положении 23; F на I в положении 27; F на V в положении 27; L на V в положении 30; L на I в положении 30; К на Q в положении 31; К на Т в положении 31; R на Н в положении 33; R на Q в положении 33; Е на Q в положении 41; Е на Н в положении 41; К на Q в положении 49; К на Т в положении 49; Е на Q в положении 58; Е на И в положении 58; К на Q в положении 70; К на Т в положении 70; Е на Q в положении 78; Е на Н в положении 78; К на Q в положении 83; К на Т в положении 83; Y на Н в положении 89; Y на I в положении 89; Е на Q в положении 96; Е на Н в положении 96; Е на Q в положении 107; Е на Н в положении 107; Р на S в положении 109: Р на А в положении 109: L на V в положении 110: L на I в положении 110: М на V в положении 121; К на Т в положении 121; R на Н в положении 125; R на Q в положении 125; L на V в положении 128; L на I в положении 128; К на Q в положении 131; К на Т в положении 131; Е на Q в положении 132; Е на Н в положении 132; К на Q в положении 133; К на Т в положении 133; К на Q в положении 134; К на Т в положении 134; Y на Н в положении 135; Y на I в положении 135; Р на S в положении 137; Р на А в положении 137; М на V в положении 148; М на I в положении 148; R на Н в положении 149; R на Q в положении 149; Е на Q в положении 159; Е на Н в положении 159; L на V в положении 161; L на I в положении 161; R на Н в положении 162; R на Q в положении 162; К на Q в положении 164; К на Т в положении 164; Е на Q в положении 165; Е на Н в положении 165; N на D в положении 45; D на G в положении 94; G на R в положении 102; или А на G в положении 139; или любой комбинации из них, где остаток 1 соответствует остатку 1 в зрелой форме белка IFN-α2b или белка IFN-α2a, представленных в SEQ ID NOS: 1 или 182; и более того, содержит аминокислотную последовательность, отличающуюся от аминокислотной последовательности родительского полипептида тем, что имеет один или более сайты гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде.

[00406] В некоторых примерах осуществления изобретения, любым из вышеописанных вариантов устойчивого к действию протеаз или гипергли-козилированного устойчивого к действию протеаз IFN-α2a является глико-пептид [D99N] IFN-α2a, где гликопептид [D99N] IFN-α2a является вариантом IFN-α2a, имеющим (а) остаток аспарагина вместо аспартата в положении 99 аминокислотной последовательности IFN-α2a (где эта аминокислотная в положении такая, как показано на Фиг.24; и соответствует D71 в последовательности, данной на Фиг.1); и (б) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутого аспарагинового остатка. В некоторых примерах осуществления изобретения, в последовательности IFN-α2a имеется лизин вместо аргинина в положении 50 аминокислотной последовательности IFN-α2b, показанной на Фиг.24 (соответствующей положении 23 в последовательности IFN-α2b, данной на Фиг.2).

[00407] В некоторых примерах осуществления изобретения, любым из вышеописанных вариантов устойчивого к действию протеаз или гипергли-козилированного устойчивого к действию протеаз IFN-α2a является глико-пептид [D99N, D105N] IFN-α2a, где гликопептид [D99N, D105N] IFN-α2a является вариантом IFN-α2a, имеющим (а) остаток аспарагина вместо аспартата в положениях 99 и 105 аминокислотной последовательности IFN-α2a (где эти аминокислотные положения такие, как показано на Фиг.24; и где D99 и D 105 на Фиг.24 соответствуют D71 и D77 соответственно в последовательности, данной на Фиг.1 и 2); и (б) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых остатков. В некоторых примерах осуществления изобретения, в последовательности IFN-α2a имеется лизин вместо аргинина в положении 50 аминокислотной последовательности IFN-α2b, показанной на Фиг.24 (соответствующей аргинину 23 в последовательности IFN-α2a, данной на Фиг.2).

[00408] В некоторых примерах осуществления изобретения, любым из вышеописанных вариантов гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз или устойчивого к действию протеаз IFN-α2b, является гликопептид [D99N] IFN-α2b, где гликопептид [D99N] IFN-α2b является вариантом IFN-α2b, имеющим (а) остаток аспарагина вместо аспартата в положении 99 аминокислотной последовательности IFN-α2b (где это аминокислотное положение такое, как показано на Фиг.24; и соответствует D71 в последовательности, данной на Фиг.1); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутого аспарагинового остатка.

[00409] В некоторых примерах осуществления изобретения, любым из вышеописанных вариантов гипергликозилированного IFN-α2b, устойчивого к действию протеаз или устойчивого к действию протеаз, является гликопептид [D99N, D105N] IFN-α2b, где гликопептид [D99N, D105N] IFN-α2b является вариантом IFN-α2b, имеющим (а) остаток аспарагина вместо аспартата в положениях 99 и 105 аминокислотной последовательности IFN-α2b, изображенной на Фиг.24 (где эти аминокислотные положения такие, как показано на Фиг.24; и где D99 и D 105 на Фиг.24 соответствуют D71 и D77 соответственно в последовательности, данной на Фиг.1 и 2); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых остатков.

[00410] С другой стороны, любой из вышеупомянутых вариантов гипер-гликозилированного, устойчивого к действию протеаз или устойчивого к действию протеаз IFN-α2a или IFN-α2b, содержит одну или более псевдодиких типов мутации. В конкретных примерах осуществления изобретения, любой из вышеупомянутых вариантов гипергликозилированного полипептида IFN-α2a, устойчивого к действию протеаз или устойчивого к действию протеаз, содержит одну или более мутаций псевдодикого типа в одном или более аминокислотных остатках 9, 10, 17, 20, 24, 25, 35, 37, 41, 52, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 64, 65, 76, 89, и 90 как показано на Фиг.1, где мутация(и) представляют собой инсерции, делеции и замены нативных аминокислот. В других примерах осуществления изобретения, любой из вышеупомянутых вариантов гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз или устойчивого к действию протеаз IFN-α2b содержит одну или более псевдодикие типы мутации в одном или более аминокислотных остатках 9, 10, 17, 20, 24, 25, 35, 37, 41, 52, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 64, 65, 76, 89, и 90 как показано на Фиг.1, где мутация(и) представляют собой инсерции, делеции и замены нативных аминокислот.

[00411] Типичные замены псевдодикого типа являются одна или более мутаций в аминокислотной последовательности IFN-α2a, описанной в Фиг.1, или в аминокислотной последовательности IFN-α2b, описанной в Фиг.2, соответствующие следующим заменам: Р на А в положении 4; Q на А в положении 5, Т на А в положении 6; L на А в положении 9, LG на А в положении 10; L на А в положении 17, Q на А в положении 20; I на А в положении 24, S на А в положении 25; D на А в положении 35, G на А в положении 37; G на А в положении 39; Е на А в положении 41; Е на А в положении 42 Е на А в положении 51; Т на А в положении 52, Р на А в положении 54; V на А в положении 55 L на А в положении 56; Н на А в положении 57, Е на А в положении 58; I на А в положении 60, 1 на А в положении 63; F на А в положении 64, N на А в положении 65; W на А в положении 76, D на А в положении 77; Е на А в положении 78 L на А в положении 81; Y на А в положении 85 Y на А в положении 89; Q на А в положении 90 G на А в положении 104; L на А в положении 110 и S на А в положении 115 и Е на А в положении 146.

[00412] С другой стороны, любой из вышеупомянутых гипергликозилированных устойчивых к действию протеаз или устойчивых к действию протеаз вариантов полипептида IFN-α2a или IFN-α2b содержит одну или более псевдодиких типов мутации, в конкретных примерах осуществления изобретения, любой из вышеупомянутых протеазо-резистентных или протеазо-резистентных вариантов полипептида IFN-α2a содержат одну или более мутаций псевдодикого типа в одном или более аминокислотных остатках 4, 5, 6, 9, 10, 17, 20, 24, 25, 35, 37, 39, 41, 42, 51, 52, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 64, 65, 76, 77, 78, 81, 85, 89, 90, 104, 110, 115 и 146 как показано на Фиг.1, где мутация(и) представляют собой инсерции, делеции и замены нативных аминокислот. В других конкретных примерах осуществления изобретения, протеазо-резистентных или протеазо-резистентных вариантов полипептида IFN-α2b содержит одну или более мутаций псевдодикого типа в одном или более аминокислотных остатках 4, 5, 6, 9, 10, 17, 20, 24, 25, 35, 37, 39, 41, 42, 51, 52, 54, 56, 57, 58, 60, 63, 64, 65, 76, 77, 78, 81, 85, 89, 90, 104, 110, 115 и 146, как показано на Фиг.1, где мутация(и) представляют собой инсерции, делеции и замены нативных аминокислот.

[00413] Типичными заменами псевдодикого типа являются одна или более мутаций в аминокислотной последовательности IFN-α2a, описанной в Фиг.1, или в аминокислотной последовательности IFN-α2b, описанной в Фиг.2, соответствующие следующим заменам: Р на А в положении 4; Q на А в положении 5; Т на А в положении 6; L на А в положении 9; LG на А в положении 10; L на А в положении 17; Q на А в положении 20; I на А в положении 24; S на А в положении 25; D на А в положении 35; G на А в положении 37; G на А в положении 39; Е на А в положении 41; Б на А в положении 42; Е на А в положении 51; Т на А в положении 52; Р на А в положении 54; V на А в положении 55; L на А в положении 56; Н на А в положении 57; Е на А в положении 58; I на А в положении 60; I на А в положении 63; F на А в положении 64; N на А в положении 65; W на А в положении 76; D на А в положении 77; Е на А в положении 78; L на А в положении 81; Y на А в положении 85; Y на А в положении 89, Q на А в положении 90; G на А в положении 104; L на А в положении 110; S на А в положении 115 и Е на А в положении 146.

[00414] В некоторых примерах осуществления изобретения, известным гипергликозилированным устойчивым к действию протеаз или устойчивым к действию протеаз вариантом полипептида является вариант нативного цитокина, обладающего противовирусной активностью. В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз противовирусный цитокин (то есть устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида IFN-α2a, IFN-α2b, IFN-γ) обладает по крайней мере 10%, по крайней мере 20%, по крайней мере около 30%, по крайней мере около 40%, по крайней мере около 50%, по крайней мере около 60%, по крайней мере около 70%, по крайней мере около 80%, по крайней мере около 90%, или до 100% противовирусной активности соответствующего немодифицированного (нативного) цитокина (то есть по сравнению с нативными цитокинами IFN-α2a, IFN-α2b, или IFN-γ).

[00415] Противовирусная активность легко определяется различными известными методами. Например, противовирусная активность IFN-α2a протестирована in vitro следующим образом. Чувствительная к интерферону культура клеток HeLa (ее АТСС номер - CCL-2) инкубировали in vitro с IFN-α2a; в последующем, клетки проинкубировали с вирусом энцефаломиокардита (EMCV). Противовирусная активность обнаружена по наличию цитопатического эффекта (СРВ); или путем измерения количества мРНК EMCV в экстрактах инфицированных клетках методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

[00416] Определение может быть количественным. Например, в некоторых примерах осуществления изобретения, противовирусная активность определялась с помощью обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (ОТ-кПЦР). Например, конфлуентные клетки (клетки под АТСС номером CCL-2) высевали с плотностью are 2×10⁴ клеток на лунку в культуральной среде (например, DMEM с 5% сывороткой телячьей). Клетки затем инкубировали с IFN-α2b в концентрации 500 ед/мл в течение 24 часов при 37°C. После 24-часовой инкубации с IFN-α2b клетки были обработаны EMCV (MOI=100). После инкубации с вирусом в течение 16 часов или тогда, когда вирус-индуцированная СРЕ находится около своего максимума в контрольных клетках, не инкубировавшихся с IFN-α2b, число гранул EMCV в каждой лунке определялось методом ОТ-ПЦР, путем определения количества мРНК EMCV в клеточных лизатах. РНК очищали из клеточных лизатов. См., например, публикацию патента США №2004/0132977.

[00417] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант полипептида эффективно снижает тяжесть течения вирусных заболеваний. Тяжесть течения вирусных заболеваний может быть оценена путем измерения уровня или титра вируса в крови. Методы определения помимо многих других включают количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и тест с разветвленной ДНК (bDNA test). Разработан количественный метод определения титра вируса HCV. Многие такие методы коммерчески доступны, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР) (Amplicor HCV Monitor(TM), Roche Molecular Systems, New Jersey); и тест с разветвлением ДНК (bDNA test) сигнал амплификации (Quantiplex(TM) HCV RNA Assay (bDNA), Chiron Corp., EmeryvIUIle, California). См. также, например, Gretch et all (1995) Ann. Intern. Med. 123:321-329. Также интерес представляет тест с нуклеиновыми кислотами (NAT), разработанный Gen-Probe Inc. (San Diego) и Chiron Corporation, продаваемый Chiron Corporation под торговой маркой Procleix®, тесты определяют одновременно наличие HIV-1 и HCV. См., например, Vargo и др. (2002) Transfusion 42:876-885.

[00418] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант противовирусного цитокина (то есть IFN-α2a паолипептид, IFN-α2b полипептид и IFN-γ полипептид) обладает антипролиферативной активностью по сравнению с немодифицированным (родительским) терапевтическим цитокином.

[00419] Антипролиферативная активность может быть измерена любым известным способом. Например, антипролиферативная активность измеряется путем определения пролиферации клеток в присутствии варианта противовирусного цитокина, резистентного к действию протеаз, и пролиферацию клеток можно измерить любым удобным способом. Клеточная пролиферация может быть измерена тестом с включением Н-3-тимидина; включением аналога тимидина - BrdU; расщепление тетразолиевых солей; формирование окрашенных комплексов с ДНК; и т.п. Одним из примеров удобного определения клеточной пролиферации является CellTiter 96®AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega). CellTiter 96®Aqueous assay метод является колориметрическим методом определения числа жизнеспособных клеток в тестах на пролиферацию или хемочувствительность. CellTiter 96®AQueous Assay состоит из растворов тетразолия (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолиум, внутренняя соль; MTS) и сопряженный с электороном реагент (феназин метосульфат; PMS). MTS восстанавливается клетками формазановый продукт, растворимый в культуральной среде. Длина волны поглощения формазана - 490 нм, что может быть измерено сразу в 96 лунках без дополнительных затрат. Процесс восстановления MTS клетками в формазановый водорастворимый продукт осуществляется дегидрогеназами жизнеспособных клеток. Количество образовавшегося формазана измеряется по поглощению при 490 нм и прямо пропорционально количеству живых клеток в культуре.

[00420] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гиперликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант противовирусного цитокина (то есть гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант полипептида IFN-α2a, полипептида IFN-α2b и полипептида IFN-γ) связывается с интерфероновым рецептором, но обладает меньшей противовирусной активностью по сравнению с нативным немодифицированным терапевтическим цитокином или обладает меньшей антипролиферативной активностью по сравнению с родительским терапевтическим цитокином.

[00421] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант противовирусного цитокина (то есть устойчивый к действию протеаз вариант полипептида IFN-α2a, полипептида IFN-α2b и полипептида IFN-γ) содержит две или более мутаций, то есть резистентные к действию протеаз противовирусные цитокины содержат 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 одиночных аминокислотных замен по сравнению с соответствующими нативными цитокинами. В некоторых примерах осуществления изобретения, известным гипергликозилированным вариантом противовирусного цитокина является полипептид IFN-α2а. В других примерах осуществления изобретения, известным гипер-гликозилированным вариантом противовирусного цитокина является полипептид IFN-α2a. В других примерах осуществления изобретения, известным гипергликозилированным вариантом противовирусного цитокина является полипептид IFN-γ.

[00422] В некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант цитокина имеет аминокислотную последовательность такую же, как дано в любой из SEQ ID NOs: 2-181, где аргинин в положении 23 заменен на лизин; и помимо прочего содержит по крайней мере один или более сайтов гликозилирования по сравнению с родительским полипептидом, который не содержит сайтов гликозилирования. В других примерах осуществления изобретения известный гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз вариант цитокина обладает большей устойчивость к расщеплению протеазами, чем немодифицированный (родительский) цитокин, и устойчивый к действию протеаз или гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз вариант цитокина содержит одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях цитокина, соответствующих структурно-соотносящимся измененным положением аминокислот в 3-мерных структурах IFN-α2a, IFN-α2b, IFN-α2c, или консенсусного IFN-α, как показано на Фиг.9. В некоторых примерах осуществления изобретения, резистентность к протеолизу измеряется путем инкубации варианта полипептида in vitro, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, резистентность к протеолизу измеряется путем инкубации варианта полипептида in vitro или in vivo с кровью (имеется в виду с человеческой кровью). В других примерах осуществления изобретения, резистентность к протеолизу измеряется путем инкубации варианта полипептида in vitro с сывороткой крови (имеется в виду с человеческой сывороткой крови), как описано выше.

[00423] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше устойчивых к действию протеаз или устойчивых к действию протеаз гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2b обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным (нативным) цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка подавлять репликацию вируса или ингибировать клеточную пролиферацию в определенных клетках после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00424] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше устойчивых к действию протеаз или устойчивых к действию протеаз гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2а обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где биологическая активность оценивается как способность белка подавлять репликацию вируса или ингибировать клеточную пролиферацию в определенных клетках после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00425] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2a обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка подавлять репликацию вируса или ингибировать клеточную пролиферацию в определенных клетках после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00426] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2a обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным (нативным) цитокином, где биологическая активность оценивается как способность белка подавлять репликацию вируса или ингибировать клеточную пролиферацию в определенных клетках после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00427] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2c обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным (нативным) цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка подавлять репликацию вируса или ингибировать клеточную пролиферацию в определенных клетках после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00428] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2c имеет более высокую биологическую активность по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином после инкубации либо самостоятельными протеазами, либо смесями протеаз, лизатом крови или сыворотки, как описано выше.

3-мерные структурные гомологи

[00429] В некоторых примерах осуществления изобретения, гипергли-козилированный, протеазо-резистентный вариант полипептида является вариантом модифицированного цитокина. В некоторых примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз вариант цитокина является модифицированным интерфероном. В некоторых примерах осуществления изобретения, любые из описанных выше гипергликозилированные, протеазо-резистентные варианты цитокинов, являющихся структурными гомологами IFN-α2b, содержат одну или более аминокислотных замен в положениях, соответствующих 3-мерным структурно похожим модифицированным положениям в 3-мерной структуре модифицированных IFN-α2b, IFN-α2a, IFN-α2c, или консенсус-ному IFN-α, как показано на Фиг.9. В некоторых примерах осуществления изобретения структурный гомолог имеет повышенную устойчивость к протеолизу по сравнению с немодифицированным (природным) аналогом, при этом устойчивость к протеолизу оценивалась после инкубации с протеазой in vitro, либо с кровью или сывороткой крови, как описано выше.

[00430] В некоторых примерах, гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз вариант цитокина является структурным гомологом IFN-α цитокина. В некоторых примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз вариант IFN-α является структурным гомологом IFN-α2b. В некоторых данных примерах, цитокин IFN-α выбран из вариантов IFN-α2a, IFN-α2c, IFN-αc, IFN-αd, IFN-α 5, IFN-α 6, IFN-α 4, IFN-α b, IFN-α 1, IFN-α J, IFN-α H, IFN-α F, IFN-α 8 и консенсусного IFN-α. Таким образом, в некоторых примерах осуществления изобретения, известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант IFN-α содержит одну или более аминокислотных замен в 1 или более целевых положениях в аминокислотной последовательности IFN-α2a, IFN-α2c, IFN-αc, IFN-αd, IFN-α 5, IFN-α 6, IFN-α 4, IFN-α b, IFN-α 1, IFN-α J, IFN-α H, IFN-α F, IFN-α 8, или консенсусном IFN-α, соответствующие структурно-соотносящимся модифицированным аминокислотным положением в 3-мерной структуре модифицированных IFN-α 2b-белков, как описано выше. Замены аминокислот приводят к большей устойчивости к протеазам, что показано при инкубации с протеазами или лизатами крови, сыворотки, по сравнению с немодифицированным (нативным) IFN-α, т.е. по сравнению с нативным полипептидом IFN-α2a или IFN-α2b.

[00431] В некоторых примерах осуществления изобретения, гиперглико-зилированный, устойчивый к действию протеаз вариант IFN-α, содержит 1 или более аминокислотных замен в одной или более аминокислотных целевых положениях в аминокислотной последовательности, данной на Фиг.1 (или SEQ ID NO: 182), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α2a.

[00432] В некоторых примерах осуществления изобретения, гиперглико-зилированный устойчивый к действию протеаз вариант IFN-α содержит 1 или более одиночных аминокислотных замен в одной или более целевых положениях в SEQ ID NO: 182 (или аминоксилотной последовательности, данной на Фиг.1), соответствующих следующим аминокислотным положением: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159; и кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, не найденные в родительском полипептиде.

[00433] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α с, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более аминокислотных целевых положениех в аминокислотной последовательности, данной на Фиг.10 (или SEQ ID NO:183), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положениям в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным натив-ным IFN-α 2с. В некоторых примерах осуществления этих изобретений, модифицированный IFN-α с выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO: 183 (как показано на Фиг.10), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00434] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α2c, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более аминокислотных целевых положениех в аминокислотной последовательности, данной на Фиг.11 (или SEQ ID NO:185), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α2c. В некоторых примерах осуществления этих изобретений, модифицированный IFN-α2c выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:185 (как показано на Фиг.11), соответствующих любой из этих: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122,126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00435] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α2c, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка подавлять репликацию вируса или ингибировать клеточную пролиферацию в определенных клетках после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α2c, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00436] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-αd, содержащим одну или более аминокислотных замен в 1 или более целевых положениех в аминокислотной последовательности, данной на Фиг.12 (или SEQ ID NO:186), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным IFN-αd. В некоторых примерах осуществления этих изобретений, модифицированный IFN-αd выбран из белков, содержащих одну или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:186 (как показано на Фиг.12), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33,41,59,79,90, 108,110,111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием одного или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00437] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-αd, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-αd, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00438] В других примерах, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α 5, содержащий одну или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениях в SEQ ID NO:187 (как дано на Фиг.13) соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α5. В некоторых данных примерах, модифицированный IFN-α5 выбран из белков, содержащих одну или более аминокислотных замен в SEQ ID NO: 187 (как показано на Фиг.13), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием одного или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00439] В некоторых примерах, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α5, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным (нативным) цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α 5, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00440] В других примерах, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α 6, содержащим одну или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениях в SEQ ID NO:188 (как дано на Фиг.14) соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α6. В некоторых этих примерах, модифицированный IFN-α 5 выбран из белков, содержащих одну или более аминокислотных замен в SEQ ID NO: 188 (как показано на Фиг.14), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00441] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α 6, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным родительским цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α6, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным (нативным) цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00442] В других примерах, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α4, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO:189 (как дано на Фиг.15) соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α 4. В некоторых этих примерах, модифицированный IFN-α 4 выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:188 (как показано на Фиг.14), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00443] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α 4, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α 4, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00444] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α4b, содержащий 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO: 190 (как дано на Фиг.16), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α4b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α4b. В некоторых этих примерах осуществления изобретения, модифицированный IFN-α4b выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:190 (как показано на Фиг.16), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00445] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α4b, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α4b, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00446] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α 1, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO: 191 (как дано на Фиг.17), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α 2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α 1. В некоторых этих примерах осуществления изобретения, модифицированный IFN-α 1 выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:191 (как показано на Фиг.17), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00447] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α 1, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α1, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00448] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-αJ, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO: 192 (как дано на Фиг.18), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α 2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с неизмененным нативным IFN-αJ. В некоторых этих примерах осуществления изобретения, модифицированный IFN-α 1 выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:192 (как показано на Фиг.18), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00449] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-αJ, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-αJ, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00450] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-αH, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO: 193 (как дано на Фиг.19), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-αH. В некоторых этих примерах осуществления изобретения, модифицированный IFN-αH выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:193 (как показано на Фиг.19), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00451] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-αH, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-αH, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00452] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-αF, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO: 194 (как дано на Фиг.20) соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-αF. В некоторых этих примерах, модифицированный IFN-αF выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:194 (как показано на Фиг.20), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00453] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-αF, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-αF, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

[00454] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным цитокином IFN-α8, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениех в SEQ ID NO:195 (как дано на Фиг.21) соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α8. В некоторых этих примерах, модифицированный IFN-αF выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:195 (как показано на Фиг.21), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00455] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных вариантов IFN-α8, резистентных к действию протеаз, обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, где стабильность измеряется путем оценки оставшейся биологической активности белка после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из описанных выше гипергликозилированных вариантов полипептида IFN-α8, устойчивых к действию протеаз, обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным нативным цитокином, после инкубации со смесью протеаз, с отдельными протеазами, с лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

Варианты консенсусного полипептида IFN-α.

[00456] В других примерах осуществления изобретения, гипергликозилированный вариант IFN-α, устойчивый к действию протеаз, является модифицированным консенсусным цитокином IFN-α, содержащим 1 или более аминокислотных замен в одной или более целевых положениях в SEQ ID NO:232 (как дано на Фиг.9), соответствующих структурно-соотносящимся измененным аминокислотным положением в 3-мерной структуре вышеупомянутого варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводят к большей устойчивости к действию протеаз, как показано после инкубации с протеазами или сывороткой крови (как описано выше) по сравнению с неизмененным нативным IFN-α. В некоторых этих примерах, модифицированный IFN-α выбран из белков, содержащих 1 или более аминокислотных замен в SEQ ID NO:232 (как показано на Фиг.9), соответствующих любой из этих: 41, 59, 79, 108, 118, 126, 134 и 160, или любой из этих: 27, 33, 41, 59, 79, 90, 108, 110, 111, 112, 114, 118, 122, 126, 134, и 160; и, кроме того, отличается от родительского полипептида наличием 1 или более сайтов гликозилирования, которых нет в нативном полипептиде.

[00457] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D99N] интерферона alfacon-1, где гликопептид [D99N] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферона альфакон-1, имеющего (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D99 на Фиг.24 соответствует D71 на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутого аспарагинового остатка.

[00458] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D99N, D105N] интерферона альфакон-1, где гликопептид [D99N, D105N] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющего (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 и положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D99 и D105 на Фиг.24 соответствуют D71 и D77, соответственно, на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков.

[00459] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D99N, D105N, E134N] интерферона альфакон-1 ([D99N, D105N, E134N] interferon alfacon-1 glycopeptide), где гликопептид [D99N, D105N, E134N] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющим (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 и положении 105, и вместо глутамата (нативного) в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D99, D105 и Е134 на Фиг.24 соответствуют D71, D77 и Е106, соответственно, на Фиг.9); и (b) углеводородная часть ковалентно связана с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков.

[00460] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D99N, E134N] интерферона альфакон-1, где гликопептид [D99N, E134N] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99, и аспрагин вместо глутамата (нативного) в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D99 и Е134 на Фиг.24 соответствуют D71 и Е106, соответственно, на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков.

[00461] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D105N, E134N] интерферона альфакон-1, где гликопептид [D105N, E134N] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 105, и аспрагин вместо глутамата (нативного) в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D105 и Е134 на Фиг.24 соответствуют D77 и Е106, соответственно, на Фиг.9); и (b) углеводородная часть ковалентно связана с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков.

[00462] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D99N, D105N, Е134Т] интерферона альфакон-1, где гликопептид [D99N, D105N, Е134Т] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 и положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24, (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; (b) треонин вместо исходного (нативного) глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24, (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D99, D105 и Е134 на Фиг.24 соответствуют D71, D77 и Е106, соответственно, на Фиг.9); и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков.

[00463] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D99N, Е134Т] интерферона альфакон-1, где гликопептид [D99N, Е134Т] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; (b) треонин вместо исходного (нативного) глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D99 и Е134 на Фиг.24 соответствуют D71 и Е106, соответственно, на Фиг.9); и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков.

[00464] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных вариантов консенсусного IFN-α является гликопептидом [D105N, Е134Т] интерферона альфакон-1, где гликопептид [D105N, Е134Т] интерферон альфакон-1 является вариантом интерферон альфакон-1, имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24); (b) треонин вместо исходного (нативного) глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена (интерферона альфакон-1), проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг.24; и где D105 и Е134 на Фиг.24 соответствуют D77 и Е106, соответственно, на Фиг.9); и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков.

Полипептидные агонисты интерфероновых рецепторов гибридного типа 1

[00465] В данном контексте, "полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа 1" является полипептидом, имеющим аминокислотную последовательность, содержащую отдельные субпоследовательности, соответствующие по аминокислотному составу и числу субпоследовательностям разных натуральных (нативных) полипептидов агонистов рецепторов интерферона 1 типа, при этом аминокислотная последовательность данного полипетидного агониста отличается от таковой любого из нативных полипептидных агонистов рецепторов интерферона 1 типа. В некоторых примерах осуществления изобретения, вариант полипептида состоит из отдельных субпоследовательностей, выделенных из IFN-α2b, IFN-α14, IFN-β1, и IFN-ω, аминокислотная последовательность данного варианта полипетидного агониста отличается от аминокислотных последовательностей IFN-α2b, IFN-α14, IFN-βl, и IFN-ω). В других примерах осуществления изобретения, вариант полипептида состоит из отдельных субпоследовательностей, выделенных из IFN-α2b, IFN-αl4, IFN-β1, консенсусного IFN-α - инфергена® и IFN-ω, и аминокислотная последовательность данного варианта полипетидного агониста отличается от аминокислотных последовательностей IFN-α2b, IFN-α14, IFN-β1, консенсусного IFN-α - инфергена® и IFN-ω).

[00466] Пригодные протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные варианты полипептида включают протеазо-резистентные или протеазо-резистентные, гипергликозилированные формы любых родительских полипептидных агонистов интерфероновых рецепторов гибридного типа 1. С одной стороны, протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант родительского полипептидного агониста интерфероновых рецепторов гибридного типа 1 имеет аминокислотную последовательность, отличающуюся от амиинокислотной последовательности родительского полипептида тем, что содержит 1 или более сайтов гликозилирования, не содержащихся в нативном полипептиде; и содержит по крайней мере один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющимся у родительского полипептида.

[00467] В одном аспекте, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является гликопептидом [D99N]IFN-α2a, где гликопептид [D99N]IFN-α2a является вариантом IFN-α2а, имеющим аспарагиновый остаток вместо нативного аспартата в положении 99 аминокислотной последовательности IFN-α2a; и гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант родительского полипептида является гликопептидом [D99N, D105N] IFN-α2a, устойчивым к действию протеаз, где резистентный к протеазам гликопептид [D99N, D105N] IFN-α2a является вариантом IFN-α2a, имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 и положении 105 аминокислотной последовательности IFN-α2a, проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как дано на Фиг 24; и где D99 и D105 на Фиг.24 соответствуют D71 и D77, соответственно, на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспараги-новых остатков. Следует понимать, что аминокислотная последовательность IFN-α2a является такой, как аминокислотная последовательность IFN-α2b, изображенная на Фигуре 24, представляющая что последовательность IFN-α2a имеет лизиновый остаток в месте аргининового остатка в аминокислотном положении 50 в последовательности IFN-α2b, изображенная на Фигуре 24 (соответствующая R50 последовательности IFN-α2b, указанной на Фигуре 2).

[00468] В другом аспекте, родительский гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа является гликопептидом [D99N] IFN-α2b, где гликопептид [D99N] IFN-α2b является вариантом IFN-α2b, имеющий аспарагиновый остаток вместо нативного аспартата в положении 99 аминокислотной последовательности IFN-α2b; и протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D99N, D105N] IFN-α2b, устойчивым к действию протеаз, где резистентный к протеазам гликопептид [D99N, D105N] IFN-α2b является вариантом IFN-α2b, имеющим (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в аминокислотном положении 99 и положении 105 аминокислотной последовательности IFN-α2b, проиллюстрированной на Фиг.24 (где аминокислотное положение такое, как указано на Фиг.24; и где D99 и D105 на Фиг.24 соответствуют D71 и D77, соответственно, на Фиг.2); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков; и содержащим, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00469] С другой стороны, родительский гибридный полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа является полипептидом интерферона альфакона-1; и протеазо-резистентный или протеазо-резистентный гипергликозилированный вариант полипептида родительского полипептида является гликопептидом [D99N] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D99N] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D99 соответствует D71 консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00470] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является полипептидом интерферона альфакона-1; и гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз полипептидный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D99N, D105N] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D99N, D105N] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 и положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D99 и D105 соответствуют D71 и D77 консенсусного IFN-[alpha], показанного на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00471] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является полипептидом интерферона альфакона-1; и гипергликозилированный устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз вариант полипептида родительского полипептида является гликопептидом [D99N, D105N, -E134N] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D99N, D105N, E134N] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 и положении 105 и аспарагин вместо глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D99 и D105 и Е134 соответствуют D71, D77 и Е106, соответственно, консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00472] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является полипептидом интерферона альфакона-1; и гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз полипептидный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D99N, E134N] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D99N, E134N] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 и положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D99 и Е134 соответствуют D71 и Е106, соответственно, консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00473] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является полипептидом интерферона альфакона-1; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D105N, E134N] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D105N, E134N] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 105 и положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D105 и Е134 соответствуют D77 и Е106, соответственно, консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспара-гиновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00474] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа является полипептидом интерферона альфакона-1; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D99N, D105N, Е134Т] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D99N, D105N, Е134Т] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 и положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24; (b) треонин вместо нативного глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D99, D105 и Е134 соответствуют D71, D77 и Е106, соответственно, консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00475] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является полипептидом интерферона альфакона-1; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D99N, Е134Т] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D99N, Е134Т] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24; (b) треонин вместо нативного глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D99 и Е134 последовательности Инфергена, проиллюстрированные на Фиг.24, соответствуют D71 и Е106, соответственно, консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00476] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I является полипептидом интерферона альфакона-1; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является гликопептидом [D105N, Е134Т] интерферона альфакона-1, где гликопептид [D105N, Е134Т] интерферона альфакона-1 является вариантом полипептида интерферона альфакона-1, в котором (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 105 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24; (b) треонин вместо нативного глутамата в положении 134 аминокислотной последовательности Инфергена, проиллюстрированной на Фиг.24 (где D105 и Е134 последовательности Инфергена, проиллюстрированные на Фиг.24, соответствуют D77 и Е106, соответственно, консенсусного IFN-α, показанного на Фиг.9); и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков; и который содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00477] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является [D99N] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона 1 типа, где [D99N] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенного на Фиг.24, и имеет (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 «мажоритарной» аминокислотной последовательности и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой упомянутого аспарагинового остатка; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющимся у родительского полипептида.

[00478] В другом аспекте, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I имеет «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является [D99N, D105N] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона типа I, где [D99N, D105N] «мА-жоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24, и содержит (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положениях 99 и 105 «мажоритарной» аминокислотной последовательности и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющимся у родительского полипептида.

[00479] В другом аспекте, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I имеет «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является [D99N, D105N, E134N] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона 1 типа, где [D99N, D105N, E134N] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24 и имеет (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положениях 99 и 105 «мажоритарной» аминокислотной последовательности и аспарагин вместо глутамата в положении 134 в «мажоритарной» аминокислотной последовательности и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющимся у родительского полипептида.

[00480] В другом аспекте, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа имеет «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида является [D99N, E134N] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона 1 типа, где [D99N, E134N] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа включает «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенную на Фиг.24 и имеющий (а) аспарагин вместо аспартата (нативного) в положении 99 «мажоритарной» аминокислотной последовательности и аспарагин вместо глутамата в положении 134 в «мажоритарной» аминокислотной последовательности и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт для расщепления протеазы вместо нативного сайта для расщепления протеазы, имеющегося у родительского полипептида.

[00481] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенного на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант родительского полипептида является [D105N, E134N] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона типа I, где [D105N, E134N] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа содержит «мА-жоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона типа I, изображенного на Фиг.24, и имеющей (а) остаток аспарагина вместо нативной аспартатовой кислоты в положениях 105 и 134, соответственно, в «мажоритарной» аминокислотной последовательности (где аминокислотный положения указаны на Фигуре 24), и (b) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у родительского полипептида.

[00482] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа имеет «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенного на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант родительского полипептида является [D99N, D105N, Е134Т] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона типа I, где [D99N, D105N, Е134Т] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона типа I, изображенного на Фиг.24, и имеющей (а) остаток аспарагина вместо нативной аспартатовой кислоты в положениях 99 и 105 «мажоритарной» аминокислотной последовательности (b) остаток треонина вместо исходного (нативного) глутамата в положении 134 «мажоритарной» аминокислотной последовательности и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у родительского полипептида.

[00483] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I имеет «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона типа I, изображенного на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант родительского полипептида является [D99N, Е134Т] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона типа I, где [D99N, Е134Т] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона типа I содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона типа I, изображенного на Фиг.24, и имеющей (а) остаток аспарагин вместо нативной аспартатовой кислоты в положении 99 «мажоритарной» аминокислотной последовательности, (b) остаток треонина вместо нативного глутамата в положении 134 «мажоритарной» аминокислотной последовательности, и (с) углеводороднйю часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у родительского полипептида.

[00484] С другой стороны, родительский полипептидный агонист интерфероновых рецепторов гибридного типа I имеет «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона типа I, изображенной на Фиг.24; и устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант родительского попептида является [D105N, Е134Т] «мажоритарным» гликопептидом консенсусного интерферона 1 типа, где [D99N, Е134Т] «мажоритарный» гликопептид консенсусного интерферона 1 типа содержит «мажоритарную» аминокислотную последовательность консенсусного интерферона 1 типа, изображенная на Фиг.24, и имеющей (а) остаток аспарагина вместо нативного аспартата в положении 105 «мажоритарной» аминокислотной последовательности, (b) остаток треонина вместо нативного глутамата в положении 134 «мажоритарной» аминокислотной последовательности, и (с) углеводородную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из упомянутых аспарагиновых и треониновых остатков; и содержит, по крайней мере, один мутантный сайт расщепления протеазами вместо нативного сайта расщепления протеазами, имеющегося у родительского полипептида.

[00485] Нумерация аминокислотных замен (обсуждаемых в контексте создания гипергликозилированных вариантов родительского терапевтического белка), использованная для описания гипергликозилированных вариантов родительских полипептидных агонистов интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа здесь совпадает с нумерацией аминокислот, использованной на Фиг.24 для отображения аминокислотной последовательности интерферона 1 типа.

[00486] С другой стороны, устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант родительского полипептида отличается от родительского полипептидного агониста интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа тем, что устойчивый к действию протеаз или резистентный к действию протеаз, гипергликозилированный вариант родительского полипептида содержит 1.) углеводородную часть, ковалентно связанную с ненативным сайтом гликозилирования, которого нет в родительком терапевтическом полипептидном агонисте интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа, и 2.) углеводородную часть, ковалентно связанную с нативным сайтом гликозилирования, который имеется в родительском терапевтическом полипептидном агонисте интерфероновых рецепторов гибридного 1 типа, но не гликозилирован.

[00487] В некоторых примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных, устойчивых к действию протеаз вариантов консенсусного IFN-α обладает повышенной стабильностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, где стабильность оценивается по величине оставшейся биологической активности после инкубации со смесью протеаз, отдельными протазами, лизатом крови или сывороткой, как описано выше. В других примерах осуществления изобретения, любой из вышеописанных гипергликозилированных, устойчивых к действию протеаз вариантов консенсусного IFN-α обладает повышенной биологической активностью по сравнению с немодифицированным (родительским) цитокином, после инкубации со смесью протеаз, отдельными протазами, лизатом крови или сывороткой, как описано выше.

Полипептидные варианты IFN-β

В некоторых воплощениях изобретения протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный цитокиновый вариант представляет собой вариант IFN-β. В некоторых воплощениях изобретения протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипергликозилированный IFN-β вариант включает одну или более единичных аминокислотных замен в SEQ ID NO:196 (или аминокислотной последовательности, представленной далее на фиг.3), соответствующих замене одного или более: М на V в положении 1, М на I в положении 1, М на Т в положении 1, М на Q в положении 1, М на А в положении 1, L на V в положении 5, L на I в положении 5, L на Т в положении 5, L на Q в положении 5, L на Н в положении 5, L на А в положении 5, F на I в положении 8, F на V в положении 8, L на V в положении 9, L на I в положении 9, L на Т в положении 9, L на Q в положении 9, L на Н в положении 9, L на А в положении 9, R на Н в положении 11, R на Q в положении 11, F на I в положении 15, F на V в положении 15, К на Q в положении 19, К на Т в положении 19, К на S в положении 19, К на Н в положении 19, W на S в положении 22, W на Н в положении 22, N на Н в положении 25, N на S в положении 25, N на Q в положении 25, R на Н в положении 27, R на Q в положении 27, L на V в положении 28, L на I в положении 28, L на Т в положении 28, L на Q в положении 28, L на Н в положении 28, L на А в положении 28, Е на Q в положении 29, Е на Н в положении 29, Y на Н в положении 30, Y на I в положении 30, L на V в положении 32, L на I в положении 32, L на Т в положении 32, L на Q в положении 32, L на Н в положении 32, L на А в положении 32, К на Q в положении 33, К на Т в положении 33, К на S в положении 33, К на Н в положении 33, R на Н в положении 35, R на Q в положении 35, М на V в положении 36, М на I в положении 36, М на Т в положении 36, М на Q в положении 36, М на А в положении 36, D на Q в положении 39, D на Н в положении 39, D на G в положении 39, Е на Q в положении 42, Е на Н в положении 42, К на Q в положении 45, К на Т в положении 45, К на S в положении 45, К на Н в положении 45, L на V в положении 47, L на I в положении 47, L на Т в положении 47, L by, Q в положении 47, L на Н в положении 47, L на А в положении 47, К на Q в положении 52, К на Т в положении 52, К на S в положении 52, К на Н в положении 52, F на I в положении 67, F на V в положении 67, R на Н в положении 71, R на Q в положении 71, D на Q в положении 73, D на Н в положении 73, D на G в положении 73, Е на Q в положении 81, Е на Н в положении 81, Е на Q в положении 85, Е на Н в положении 85, Y на Н в положении 92, Y на I в положении 92, К на Q в положении 99, К на Т в положении 99, К на S в положении 99, К на Н в положении 99, Е на Q в положении 103, Е на Н в положении 103, Е на Q в положении 104, Е на Н в положении 104, К на Q в положении 105, К на Т в положении 105, К на S в положении 105, К на Н в положении 105, Е на Q на, position 107, Е на Н в положении 107, К на Q в положении 108, К на Т в положении 108, К на S в положении 108, К на Н в положении 108, Е на Q в положении 109, Е на Н в положении 109, D на Q в положении 110, D на Н в положении 110, D на G в положении 110, F на I в положении 111, F на V в положении 111, R на Н в положении 113, R на Q в положении 113, L на V в положении 116, L на I в положении 116, L на Т в положении 116, L на Q в положении 116, L на Н в положении 116, L на А в положении 116, L на V в положении 120, L на I в положении 120, L на Т в положении 120, L на Q в положении 120, L на Н в положении 120, L на А в положении 120, К на Q в положении 123, К на Т в положении 123, К на S в положении 123, К на Н в положении 123, R на Н в положении 124, R на Q в положении 124, R на Н в положении 128, R на Q в положении 128, L на V в положении 130, L на I в положении 130, L на Т в положении 130, L на Q в положении 130, L на Н в положении 130, L на А в положении 130, К на Q в положении 134, К на Т в положении 134, К на S в положении 134, К на Н в положении 134, К на Q в положении 136, К на Т в положении 136, К на S в положении 136, К на Н в положении 136, Е на Q в положении 137, Е на Н в положении 137, Y на Н в положении 138, Y на I в положении 138, R на Н в положении 152, R на Q в положении 152, Y на Н в положении 155, Y на I в положении 155, R на И в положении 159, R на Q в положении 159, Y на Н в положении 163, Y на I в положении 163, R на Н в положении 165, R на Q в положении 165, М на D в положении 1, М на Е в положении 1, М на К в положении 1, М на N в положении 1, М на R в положении 1, М на S в положении 1, L на D в положении 5, L на Е в положении 5, L на К в положении 5, L на N в положении 5, L на R в положении 5, L на S в положении 5, L на D в положении 6, L на Е в положении 6, L на К в положении 6, L на N в положении 6, L на R в положении 6, L на S в положении 6, L на Q в положении 6, L на Т в положении 6, F на Е в положении 8, F на К в положении 8, F на R в положении 8, F на D в положении 8, L на D в положении 9, L на Е в положении 9, L на К в положении 9, L на N в положении 9, L на R в положении 9, L на S в положении 9, Q на D в положении 10, Q на Е в положении 10, Q на К в положении 10, Q на N в положении 10, Q на R в положении 10, Q на S в положении 10, Q на Т в положении 10, S на D в положении 12, S на Е в положении 12, S на К в положении 12, S на R в положении 12, S на D в положении 13, S на Б в положении 13, S на К в положении 13, S на R в положении 13, S на N в положении 13, S на Q в положении 13, S на Т в положении 13, N на D в положении 14, N на Е в положении 14, N на К в положении 14, N на Q в положении 14, N на R в положении 14, N на S в положении 14, N на Т в положении 14, F на D в положении 15, F на Е в положении 15, F на К в положении 15, F на R в положении 15, Q на D в положении 16, Q на Е в положении 16, Q на К в положении 16, Q на N в положении 16, Q на R в положении 16, Q на S в положении 16, Q на Т в положении 16, С на D в положении 17, С на Е в положении 17, С на К в положении 17, С на N в положении 17, С на Q в положении 17, С на R в положении 17, С на S в положении 17, С на Т в положении 17, L на N в положении 20, L на Q в положении 20, L на R в положении 20, L на S в положении 20, L на Т в положении 20, L на D в положении 20, L на Е в положении 20, L на К в положении 20, W на D в положении 22, W на Е в положении 22, W на К в положении 22, W на R в положении 22, Q на D в положении 23, Q на Е в положении 23, Q на К в положении 23, Q на R в положении 23, L на D в положении 24, L на Е в положении 24, L на К в положении 24, L на R в положении 24, W на D в положении 79, W на Е в положении 79, W на К в положении 79, W на R в положении 79, N на D в положении 80, N на Е в положении 80, N на К в положении 80, N на R в положении 80, Т на D в положении 82, Т на Е в положении 82, Т на К в положении 82, Т на R в положении 82, I на D в положении 83, I на Е в положении 83, I на К в положении 83, I на R в положении 83, I на N в положении 83, I на Q в положении 83, I на S в положении 83, I на Т в положении 83, N на D в положении 86, N на Е в положении 86, N на К в положении 86, N на R в положении 86, N на Q в положении 86, N на S в положении 86, N на Т в положении 86, L на D в положении 87, L на Е в положении 87, L на К в положении 87, L на R в положении 87, L на N в положении 87, L на Q в положении 87, L на S в положении 87, L на Т в положении 87, А на D в положении 89, А на Е в положении 89, А на К в положении 89, А на R в положении 89, N на D в положении 90, N на Е в положении 90, N на К в положении 90, N на Q в положении 90, N на R в положении 90, N на S в положении 90, N на Т в положении 90, V на D в положении 91, V на Е в положении 91, V на К в положении 91, V на N в положении 91, V на Q в положении 91, V на R в положении 91, V на S в положении 91, V на Т в положении 91, Q на D в положении 94, Q на Е в положении 94, Q на Q в положении 94, Q на N в положении 94, Q на R в положении 94, Q на S в положении 94, Q на Т в положении 94, I на D в положении 95, I на Е в положении 95, I на К в положении 95, I на N в положении 95, I на Q в положении 95, I на R в положении 95, I на S в положении 95, I на Т в положении 95, Н на D в положении 97, Н на Е в положении 97, Н на К в положении 97, Н на N в положении 97, Н на Q в положении 97, Н на R в положении 97, Н на S в положении 97, Н на Т в положении 97, L на D в положении 98, L на Е в положении 98, L на К в положении 98, L на N в положении 98, L на Q в положении 98, L на R в положении 98, L на S в положении 98, L на Т в положении 98, V на D в положении 101, V на Е в положении 101, V на К в положении 101, V на N в положении 101, V на Q в положении 101, V на R в положении 101, V на S в положении 101, V на Т в положении 101, М на С в положении 1, L на С в положении 6, Q на С в положении 10, S на С в положении 13, Q на С в положении 16, L на С в положении 17, V на С в положении 101, L на С в положении 98, Н на С в положении 97, Q на С в положении 94, V на С в положении 91, or N на С в положении 90, где остаток 1 соответствует остатку 1 зрелого цитокина IFN-β, представленного далее в SEQ ID NO:196; и дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

3-D структурные гомологи

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистетный вариант интерферона представляет собой модифицированный цитокин IFN-β, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:196 (как представлено далее на фиг.3), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным IFN-β. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный IFN-βвыбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:196 (как представлено далее на фиг.3), соответствующих любым аминокислотным положениям: 39, 42, 45, 47, 52, 67, 71, 73, 81, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 116, 120, 123, 124, 128,130, 134, 136, 137, 163 и 165, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов); где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения гипергликолизированный, протеазо-резистентный вариант интерферона представляет собой модифицированный цитокин IFN-β, включающий одну или более аминокислотных замен, где замены выбраны из аминокислотных замещений в SEQ ID NO:196 (как представлено далее на фиг.3), соответствующих: D на Q в положении 39, D на Н в положении 39, D на G в положении 39, Е на Q в положении 42, Е на Н в положении 42, К на Q в положении 45, К на Т в положении 45, К на S в положении 45, К на Н в положении 45, L на V в положении 47, L на I в положении 47, L на Т в положении 47, L на Q в положении 47, L на Н в положении 47, L на А в положении 47, К на Q в положении 52, К на Т в положении 52, К на S в положении 52, К на Н в положении 52, F на I в положении 67, F на V в положении 67, R на Н в положении 71, R на Q в положении 71, D на Н в положении 73, D на G в положении 73, D на Q в положении 73, Е на Q в положении 81, Е на Н в положении 81, Е на Q в положении 107, Е на Н в положении 107, К на Q в положении 108, К на Т в положении 108, К на S в положении 108, К на Н в положении 108, Е на Q в положении 109, Е на Н в положении 109, D на Q в положении 110, D на Н в положении 110, D на G в положении 110, F на I в положении 111, F на V в положении 111, R на Н в положении 113, R на Q в положении 113, L на V в положении 116, L на I в положении 116, L на Т в положении 116, L на Q в положении 116, L на Н в положении 116, L на А в положении 116, L на V в положении 120, L на I в положении 120, L на Т в положении 120, L на Q в положении 120, L на Н в положении 120, L на А в положении 120, К на Q в положении 123, К на Т в положении 123, К на S в положении 123, К на Н в положении 123, R на Н в положении 124„ R на Q в положении 124, R на Н в положении 128, R на Q в положении 128, L на V в положении 130, L на I в положении 130, L на Т в положении 130, L на Q в положении 130, L на Н в положении 130, L на А в положении 130, К на Q в положении 134, К на Т в положении 134, К на S в положении 134, К на Н в положении 134, К на Q в положении 136, К на Т в положении 136, К на S в положении 136, К на Н в положении 136, Е на Q в положении 137, Е на Н в положении 137, Y на И в положении 163, Y на I в положении 163, R на Н в положении 165, или R на Q в положении 165, где первая из списка аминокислота замещена второй в указанной позиции; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В некоторых воплощениях изобретения любые гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-R обладают повышенной стабильностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, где стабильность оценена путем измерения остаточной биологической активности после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или сывороткой крови как описано выше. В других воплощениях изобретения любые гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β обладают повышенной биологической активностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови как описано выше.

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант интерферона представляет собой модифицированный цитокин IFN-β1, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:197 (как представлено на фиг.22), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным IFN-β1. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный IFN-β1 выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:197 (как представлено на фиг.22), соответствующих любым аминокислотным позициям: 39, 42, 45, 47, 52, 67, 71, 73, 81, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 116, 120, 123, 124, 128, 130, 134, 136, 137, 163 и 165, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов); где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В некоторых воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β1 обладают повышенной стабильностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, где стабильность оценена путем измерения остаточной биологической активности после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови или сывороткой крови как описано выше. В других воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β1 обладают повышенной биологический активностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови или с сывороткой крови как описано выше.

В других воплощениях изобретения протеазо-резистентный вариант интерферона представляет собой модифицированный цитокин IFN-β2a, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:198 (как представлено на фиг.23), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным IFN-β2a. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный IFN-β2a выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:198 (как представлено на фиг.23), соответствующих любым аминокислотным положениям: 39, 42, 45, 47, 52, 67, 71, 73, 81, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 116, 120, 123, 124, 128, 130, 134, 136, 137, 163 и 165, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов); где варианты дополнительно включают аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В некоторых воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β2a обладают повышенной стабильностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, где стабильность оценена путем измерения остаточной биологической активности после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови как описано выше. В других воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β2a обладают повышенной биологический активностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови как описано выше.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к цитокиновому структурному гомологу любого из описанных выше протеазо-резистентных IFN-β вариантов, где гомолог включает одну или более аминокислотных замен в положениях, соответствующих трехмерным структурно-подобным модифицированным положениям в трехмерной структуре модифицированного IFN-β. Во многих воплощениях изобретения гомолог обладает повышенной устойчивостью к протеолизу по сравнению с его не модифицированной цитокиновой копией, где устойчивость к протеолизу определяют смешиваем in vitro с протеазой, инкубацией с кровью или инкубацией с сывороткой крови. Во многих воплощениях изобретения цитокин представляет собой IFN-β цитокин.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к модифицированному IFN-β цитокину (например, гипергликозилированному протеазо-резистентному IFN-p варианту), включающему одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:196 (аминокислотная последовательность представлена далее на фиг.23), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре любых описанных выше модифицированных цитокинов IFN-β, где замены приводят к большей устойчивости к протеазам, что оценено инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови, по сравнению с не модифицированным IFN-β.

В некоторых воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β обладают повышенной стабильностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, где стабильность оценена путем измерения остаточной биологической активности в отношении ингибирования репликации вируса или стимулирования клеточной пролиферации в соответствующих клетках после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови как описано выше.

В некоторых воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-резистентные варианты IFN-β обладают повышенной биологический активностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, где активность оценивают способностью ингибировать репликацию вируса в соответствующих клетках или ингибировать клеточную пролиферацию в соответствующих клетках после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови, как описано выше.

В некоторых воплощениях изобретения гипергликолизированный, протеазо-резистентный вариант IFN-β («модифицированный цитокин IFN-β») выбирают из группы протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в SEQ ID NO:196, как представлено далее на фиг.3, соответствующих замене: М на V в положении 1, М на I в положении 1, М на Т в положении 1, М на Q в положении 1, М на А в положении 1, L на V в положении 5, L на I в положении 5, L на Т в положении 5, L на Q в положении 5, L на Н в положении 5, L на А в положении 5, F на I в положении 8, F на V в положении 8, L на V в положении 9, L на I в положении 9, L на Т в положении 9, L на Q в положении 9, L на Н в положении 9, L на А в положении 9, R на Н в положении 11, R на Q в положении 11, F на I в положении 15, F на V в положении 15, К на Q в положении 19, К на Т в положении 19, К на S в положении 19, К на Н в положении 19, W на S в положении 22, W на Н в положении 22, N на Н в положении 25, N на S в положении 25, N на Q в положении 25, R на Н position 27, R на Q position 27, L на V в положении 28, L на I в положении 28, L на Т в положении 28, L на Q в положении 28, L на Н в положении 28, L на А в положении 28, Е на Q в положении 29, Е на Н в положении 29, Y на Н в положении 30, Y на I в положении 30, L на V в положении 32, L на I в положении 32, L на Т в положении 32, L на Q в положении 32, L на Н в положении 32, L на А в положении 32, К на Q в положении 33, К на Т в положении 33, К на S в положении 33, К на Н в положении 33, R на Н в положении 35, R на Q в положении 35, М на V в положении 36, М на I в положении 36, М на Т в положении 36, М на Q в положении 36, М на А в положении 36, D на Q в положении 39, D на Н в положении 39, D на G в положении 39, Е на Q в положении 42, Е на Н в положении 42, К на Q в положении 45, К на Т в положении 45, К на S в положении 45, К на Н в положении 45, L на V в положении 47, L на I в положении 47, L на Т в положении 47, L на Q в положении 47, L на Н в положении 47, L на А в положении 47, К на Q в положении 52, К на Т в положении 52, К на S в положении 52, К на Н в положении 52, F на I в положении 67, F на V в положении 67, R на Н в положении 71, R на Q в положении 71, D на Q в положении 73, D на Н в положении 73, D на G в положении 73, E на Q в положении 81, Е на Н в положении 81, Е на Q в положении 85, Е на Н в положении 85, Y на Н в положении 92, Y на I в положении 92, К на Q в положении 99, К на Т в положении 99, К на S в положении 99, К на Н в положении 99, Е на Q в положении 103, Е на Н в положении 103, Е на Q в положении 104, Е на Н в положении 104, К на Q в положении 105, К на Т в положении 105, К на S в положении 105, К на Н в положении 105, Е на Q в положении 107, Е на Н в положении 107, К на Q в положении 108, К на Т в положении 108, К на S в положении 108, К на Н в положении 108, Е на Q в положении 109, Е на Н в положении 109, D на Q в положении 110, D на Н в положении 110, D на G в положении 110, F на I в положении 111, F на V в положении 111, R на Н в положении 113, R на Q в положении 113, L на V в положении 116, L на I в положении 116, L на Т в положении 116, L на Q в положении 116, L на Н в положении 116, L на А в положении 116, L на V в положении 120, L на I в положении 120, L на Т в положении 120, L на Q в положении 120, L на Н в положении 120, L на А в положении 120, К на Q в положении 123, К на Т в положении 123, К на S в положении 123, К на Н в положении 123, R на Н в положении 124, R на Q в положении 124, R на Н в положении 128, R на Q в положении 128, L на V в положении 130, L на I в положении 130, L на Т в положении 130, L на Q в положении 130, L на Н в положении 130, L на А в положении 130, К на Q в положении 134, К на Т в положении 134, К на S в положении 134, К на Н в положении 134, К на Q в положении 136, К на Т в положении 136, К на S в положении 136, К на Н в положении 136, Е на Q в положении 137, Е на Н в положении 137, Y на Н в положении 138, Y на I в положении 138, R на Н в положении 152, R на Q в положении 152, Y на Н в положении 155, Y на I в положении 155, R на Н в положении 159, R на Q в положении 159, Y на Н в положении 163, Y на I в положении 163, R на Н в положении 165, R на Q в положении 165, М на D в положении 1, М на Е в положении 1, М на К в положении 1, М на N в положении 1, М на R в положении 1, М на S в положении 1, L на D в положении 5, L на Е в положении 5, L на К в положении 5, L на N в положении 5, L на R в положении 5, L на S в положении 5, L на D в положении 6, L на Е в положении 6, L на К в положении 6, L на N в положении 6, L на R в положении 6, L на S в положении 6, L на Q в положении 6, L на Т в положении 6, F на Е в положении 8, F на К в положении 8, F на R в положении 8, F на D в положении 8, L на D в положении 9, L на Е в положении 9, L на К в положении 9, L на N в положении 9, L на R в положении 9, L на S в положении 9, Q на D в положении 10, Q на Е в положении 10, Q на К в положении 10, Q на N в положении 10, Q на R в положении 10, Q на S в положении 10, Q на Т в положении 10, S на D в положении 12, S на Е в положении 12, S на К в положении 12, S на R в положении 12, S на D в положении 13, S на Е в положении 13, S на К в положении 13, S на R в положении 13, S на N в положении 13, S на Q в положении 13, S на Т в положении 13, N на D в положении 14, N на Е в положении 14, N на К в положении 14, N на Q в положении 14, N на R в положении 14, N на S в положении 14, N на Т в положении 14, F на D в положении 15, F на Е в положении 15, F на К в положении 15, F на R в положении 15, Q на D в положении 16, Q на Е в положении 16, Q на К в положении 16, Q на N в положении 16, Q на R в положении 16, Q на S в положении 16, Q на Т в положении 16, С на D в положении 17, С на Е в положении 17, С на К в положении 17, С на N в положении 17, С на Q в положении 17, С на R at position 17, С на S в положении 17, С на Т в положении 17, L на N в положении 20, L на Q в положении 20, L на R в положении 20, L на S в положении 20, L на Т в положении 20, L на D в положении 20, L на Е в положении 20, L на К в положении 20, W на D в положении 22, W на Е в положении 22, W на К в положении 22, W на R в положении 22, Q на D в положении 23, Q на Е в положении 23, Q на К в положении 23, Q на R в положении 23, L на D в положении 24, L на Е в положении 24, L на К в положении 24, L на R в положении 24, W на D в положении 79, W на Е в положении 79, W на К в положении 79, W на R в положении 79, N на D в положении 80, N на Е в положении 80, N на К в положении 80, N на R в положении 80, Т на D в положении 82, Т на Е в положении 82, Т на К в положении 82, Т на R в положении 82,1 на D в положении 83,1 на Е в положении 83,1 на К в положении 83,1 на R в положении 83,1 на N в положении 83,1 на Q в положении 83,1 на S в положении 83,1 на Т в положении 83, N на D в положении 86, N на Е в положении 86, N на К в положении 86, N на R в положении 86, N на Q в положении 86, N на S в положении 86, N на Т в положении 86, L на D в положении 87, L на Е в положении 87, L на К в положении 87, L на R в положении 87, L на N в положении 87, L на Q в положении 87, L на S в положении 87, L на Т в положении 87, А на D в положении 89, А на Е в положении 89, А на К в положении 89, А на R в положении 89, N на D в положении 90, N на Е в положении 90, N на К в положении 90, N на Q в положении 90, N на R в положении 90, N на S в положении 90, N на Т в положении 90, V на D в положении 91, V на Е в положении 91, V на К в положении 91, V на N в положении 91, V на Q в положении 91, V на R в положении 91, V на S в положении 91, V на Т в положении 91, Q на D в положении 94, Q на Е в положении 94, Q на Q в положении 94, Q на N в положении 94, Q на R в положении 94, Q на S в положении 94, Q на Т в положении 94,1 на D в положении 95,1 на Е в положении 95,1 на К в положении 95,1 на N в положении 95,1 на Q в положении 95,1 на R в положении 95,1 на S в положении 95,1 на Т в положении 95, Н на D в положении 97, Н на Е в положении 97, Н на К в положении 97, Н на N в положении 97, Н на Q в положении 97, Н на R в положении 97, Н на S в положении 97, Н на Т в положении 97, L на D в положении 98, L на Е в положении 98, L на К в положении 98, L на N в положении 98, L на Q в положении 98, L на R в положении 98, L на S в положении 98, L на Т в положении 98, V на D в положении 101, V на Е в положении 101, V на К в положении 101, V на N в положении 101, V на Q в положении 101, V на R в положении 101, V на S в положении 101, V на Т в положении 101, М на С в положении 1, L на С в положении 6, Q на С в положении 10, S на С в положении 13, Q на С в положении 16, L на С в положении 17, V на С в положении 101, L на С в положении 98, Н на С в положении 97, Q на С в положении 94, V на С в положении 91, or N на С в положении 90, или комбинацию таких замен, где остаток 1 соответствует остатку 1 зрелого цитокина IFN-β, представленного далее в SEQ ID NO:196 (как представлено далее на фиг.3); где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант IFN-J3 («модифицированный цитокин IFN-β») выбирают из группы протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в SEQ ID NO:196, как представлено на фиг.3, соответствующих замене: D на Q в положении 39, D на Н в положении 39, D на G в положении 39, Е на Q в положении 42, Е на Н в положении 42, К на Q в положении 45, К на Т в положении 45, К на S в положении 45, К на Н в положении 45, L на V в положении 47, L на I в положении 47, L на Т в положении 47, L на Q в положении 47, L на Н в положении 47, L на А в положении 47, К на Q в положении 52, К на Т в положении 52, К на S в положении 52, К на Н в положении 52, F на I в положении 67, F на V в положении 67, R на Н в положении 71, R на Q в положении 71, D на Н в положении 73, D на G в положении 73, D на Q в положении 73, Е на Q в положении 81, Е на Н в положении 81, Е на Q в положении 107, Е на И в положении 107, К на Q в положении 108, К на Т в положении 108, К на S в положении 108, К на Н в положении 108, Е на Q в положении 109, Е на Н в положении 109, D на Q в положении 110, D на Н в положении 110, D на G в положении 110, F на I в положении 111, F на V в положении 111, R на Н в положении 113, R на Q в положении 113, L на V в положении 116, L на I в положении 116, L на Т в положении 116, L на Q в положении 116, L на Н в положении 116, L на А в положении 116, L на V в положении 120, L на I в положении 120, L на Т в положении 120, L на Q в положении 120, L на Н в положении 120, L на А в положении 120, К на Q в положении 123, К на Т в положении 123, К на S в положении 123, К на Н в положении 123, R на Н в положении 124, R на Q в положении 124, R на Н в положении 128, R на Q в положении 128, L на V в положении 130, L на I в положении 130, L на Т в положении 130, L на Q в положении 130, L на Н в положении 130, L на А в положении 130, К на Q в положении 134, К на Т в положении 134, К на S в положении 134, К на Н в положении 134, К на Q в положении 136, К на Т в положении 136, К на S в положении 136, К на Н в положении 136, Е на Q в положении 137, Е на Н в положении 137, Y на Н в положении 163, Y на I в положении 1631, R на Н в положении 165, or R на Q в положении 165, или любую комбинацию таких замен, где первая из списка аминокислота замещена второй в указанной позиции; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В некоторых воплощениях изобретения гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант IFN-β («модифицированный цитокин IFN-β») выбирают из группы протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в SEQ ID NO:196, как представлено далее на фиг.3, соответствующих замене: М на V в положении 1, М на I в положении 1, М на Т в положении 1, М на Q в положении 1, М на А в положении 1, L на V в положении 5, L на I в положении 5, L на Т в положении 5, L на Q в положении 5, L на Н в положении 5, L на А в положении 5, F на I в положении 8, F на V в положении 8, L на V в положении 9, L на I в положении 9, L на Т в положении 9, L на Q в положении 9, L на И в положении 9, L на А в положении 9, R на Н в положении 11, R на Q в положении 11, F на I в положении 15, F на V в положении 15, К на Q в положении 19, К на Т в положении 19, К на S в положении 19, К на Н в положении 19, W на S в положении 22, W на Н в положении 22, N на Н в положении 25, N на S в положении 25, N на Q в положении 25, R на Н position 27, R на Q position 27, L на V в положении 28, L на I в положении 28, L на Т в положении 28, L на Q в положении 28, L на Н в положении 28, L на А в положении 28, Е на Q в положении 29, Е на Н в положении 29, Y на Н в положении 30, Y на I в положении 30, L на V в положении 32, L на I в положении 32, L на Т в положении 32, L на Q в положении 32, L на Н в положении 32, L на А в положении 32, К на Q в положении 33, К на Т в положении 33, К на S в положении 33, К на Н в положении 33, R на Н в положении 35, R на Q в положении 35, М на V в положении 36, М на I в положении 36, М на Т в положении 36, М на Q в положении 36, М на А в положении 36, D на Q в положении 39, D на Н в положении 39, D на G в положении 39, Е на Q в положении 42, Е на Н в положении 42, К на Q в положении 45, К на Т в положении 45, К на S в положении 45, К на Н в положении 45, L на V в положении 47, L на I в положении 47, L на Т в положении 47, L by, Q в положении 47, L на Н в положении 47, L на А в положении 47, К на Q в положении 52, К на Т в положении 52, К на S в положении 52, К на Н в положении 52, F на I в положении 67, F на V в положении 67, R на Н в положении 71, R на Q в положении 71, D на Q в положении 73, D на Н в положении 73, D на G в положении 73, Е на Q в положении 81, Е на Н в положении 81, Е на Q в положении 85, Е на Н в положении 85, Y на Н в положении 92, Y на I в положении 92, К на O в положении 99, К на Т в положении 99, К на S в положении 99, К на Н в положении 99, Е на Q в положении 103, Е на Н в положении 103, Е на Q в положении 104, Е на Н в положении 104, К на Q в положении 105, К на Т в положении 105, К на S в положении 105, К на Н в положении 105, Е на Q в положении 107, Е на Н в положении 107, К на Q в положении 108, К на Т в положении 108, К на S в положении 108, К на Н в положении 108, Е на Q в положении 109, Е на Н в положении 109, D на Q в положении 110, D на Н в положении 110, D на G в положении 110, F на I в положении 111, F на V в положении 111, R на Н в положении 113, R на Q в положении 113, L на Vat position 116, L на I в положении 116, L на Т в положении 116, L на Q в положении 116, L на Н в положении 116, L на А в положении 116, L на V в положении 120, L на I в положении 120, L на Т в положении 120, L на Q в положении 120, L на Н в положении 120, L на А в положении 120, К на Q в положении 123, К на Т в положении 123, К на S в положении 123, К на Н в положении 123, R на Н в положении 124, R на Q в положении 124, R на Н в положении 128, R на Q в положении 128, L на V в положении 130, L на I в положении 130, L на Т в положении 130, L на Q в положении 130, L на Н в положении 130, L на А в положении 130, К на Q в положении 134, К на Т в положении 134, К на S в положении 134, К на Н в положении 134, К на Q в положении 136, К на Т в положении 136, К на S в положении 136, К на Н в положении 136, Е на Q в положении 137, Е на Н в положении 137, Y на Н в положении 138, Y на I в положении 138, R на Н в положении 152, R на Q в положении 152, Y на Н в положении 155, Y на I в положении 155, R на Н в положении 159, R на Q в положении 159, Y на Н в положении 163, Y на I в положении 163, R на Н в положении 165, R на Q в положении 165, М на D в положении 1, М на Е в положении 1, М на К в положении 1, М на N в положении 1, М на R в положении 1, М на S в положении 1, L на D в положении 5, L на Е в положении 5, L на К в положении 5, L на N в положении 5, L на R в положении 5, L на S в положении 5, L на D в положении 6, L на Е в положении 6, L на К в положении 6, L на N в положении 6, L на R в положении 6, L на S в положении 6, L на Q в положении 6, L на Т в положении 6, F на Е в положении 8, F на К в положении 8, F на R в положении 8, F на D в положении 8, L на D в положении 9, L на Е в положении 9, L на К в положении 9, L на N в положении 9, L на R в положении 9, L на S в положении 9, Q на D в положении 10, Q на Е в положении 10, Q на К в положении 10, Q на N в положении 10, Q на R в положении 10, Q на S в положении 10, Q на Т в положении 10, S на D в положении 12, S на Е в положении 12, S на К в положении 12, S на R в положении 12, S на D в положении 13, S на Е в положении 13, S на К в положении 13, S на R в положении 13, S на N в положении 13, S на Q в положении 13, S на Т в положении 13, N на D в положении 14, N на Е в положении 14, N на К в положении 14, N на Q в положении 14, N на R в положении 14, N на S в положении 14, N на Т в положении 14, F на D в положении 15, F на Е в положении 15, F на К в положении 15, F на R в положении 15, Q на D в положении 16, Q на Е в положении 16, Q на К в положении 16, Q на N в положении 16, Q на R в положении 16, Q на S в положении 16, Q на Т в положении 16, С на D в положении 17, С на Е в положении 17, С на К в положении 17, С на N в положении 17, С на Q в положении 17, С на R в положении 17, С на S в положении 17, С на Т в положении 17, L на N в положении 20, L на Q в положении 20, L на R в положении 20, L на S в положении 20, L на Т в положении 20, L на D в положении 20, L на Е в положении 20, L на К в положении 20, W на D в положении 22, W на Е в положении 22, W на К в положении 22, W на R в положении 22, Q на D в положении 23, Q на Е в положении 23, Q на К в положении 23, Q на R в положении 23, L на D в положении 24, L на Е в положении 24, L на К в положении 24, L на R в положении 24, W на D в положении 79, W на Е в положении 79, W на К в положении 79, W на R в положении 79, N на D в положении 80, N на Е в положении 80, N на К в положении 80, N на R в положении 80, Т на D в положении 82, Т на Е в положении 82, Т на К в положении 82, Т на R в положении 82,1 на D в положении 83,1 на Е в положении 83,1 на К в положении 83,1 на R в положении 83,1 на N в положении 83,1 на Q в положении 83,1 на S в положении 83,1 на Т в положении 83, N на D в положении 86, N на Е в положении 86, N на К в положении 86, N на R в положении 86, N на Q в положении 86, N на S в положении 86, N на Т в положении 86, L на D в положении 87, L на Е в положении 87, L на К в положении 87, L на R в положении 87, L на N в положении 87, L на Q в положении 87, L на S в положении 87, L на Т в положении 87, А на D в положении 89, А на Е в положении 89, А на К в положении 89, А на R в положении 89, N на D в положении 90, N на Е в положении 90, N на К в положении 90, N на Q в положении 90, N на R в положении 90, N на S в положении 90, N на Т в положении 90, V на D в положении 91, V на Е в положении 91, V на К в положении 91, V на N в положении 91, V на Q в положении 91, V на R в положении 91, V на S в положении 91, V на Т в положении 91, Q на D в положении 94, Q на Е в положении 94, Q на Q в положении 94, Q на N в положении 94, Q на R в положении 94, Q на S в положении 94, Q на Т в положении 94,1 на D в положении 95,1 на Е в положении 95,1 на К в положении 95,1 by N в положении 95,1 на Q в положении 95,1 на R в положении 95,1 на S в положении 95,1 на Т в положении 95, И на D в положении 97, Н на Е в положении 97, Н на К в положении 97, Н на N в положении 97, Н на Q в положении 97, Н на R в положении 97, Н на S в положении 97, Н на Т в положении 97, L на D в положении 98, L на Е в положении 98, L на К в положении 98, L на N в положении 98, L на Q в положении 98, L на R в положении 98, L на S в положении 98, L на Т в положении 98, V на D в положении 101, V на Е в положении 101, V на К в положении 101, V на N в положении 101, V на Q в положении 101, V на R в положении 101, V на S в положении 101, V на Т в положении 101, М на С в положении 1, L на С в положении 6, Q на С в положении 10, S на С в положении 13, Q на С в положении 16, L на С в положении 17, V на С в положении 101, L на С в положении 98, Н на С в положении 97, Q на С в положении 94, V на С в положении 91, N на С в положении 90, D на Q в положении 39, D на Н в положении 39, D на G в положении 39, Е на Q в положении 42, Е на Н в положении 42, К на Q в положении 45, К на Т в положении 45, К на S в положении 45, К на Н в положении 45, L на V в положении 47, L на I в положении 47, L на Т в положении 47, L на Q в положении 47, L на И в положении 47, L на А в положении 47, К на Q в положении 52, К на Т в положении 52, К на S в положении 52, К на Н в положении 52, F на I в положении 67, F на V в положении 67, R на Н в положении 71, R на Q в положении 71, D на Н в положении 73, D на G в положении 73, D на Q в положении 73, Е на Q в положении 81, Е на Н в положении 81, Е на Q в положении 107, Е на Н в положении 107, К на Q в положении 108, К на Т в положении 108, К на S в положении 108, К на Н в положении 108, Е на Q в положении 109, Е на Н в положении 109, D на Q в положении 110, D на Н в положении 110, D на G в положении 110, F на I в положении 111, F на V в положении 111, R на Н в положении 113, R на Q в положении 113, L на V в положении 116, L на I в положении 116, L на Т в положении 116, L на Q в положении 116, L на Н в положении 116, L на А в положении 116, L на V в положении 120, L на I в положении 120, L на Т в положении 120, L на Q в положении 120, L на Н в положении 120, L на А в положении 120, К на Q в положении 123, К на Т в положении 123, К на S в положении 123, К на Н в положении 123, R на Н в положении 124, R на Q в положении 124, R на Н в положении 128, R на Q в положении 128, L на V в положении 130, L на I в положении 130, L на Т в положении 130, L на Q в положении 130, L на Н в положении 130, L на А в положении 130, К на Q в положении 134, К на Т в положении 134, К на S в положении 134, К на Н в положении 134, К на Q в положении 136, К на Т в положении 136, К на S в положении 136, К на Н в положении 136, Е на Q в положении 137, Е на Н в положении 137, Y на Н в положении 163, Y на I в положении 163, R на Н в положении 165, or R на Q в положении 165, или любую комбинацию таких замен, где первая из списка аминокислота замещена второй в указанной позиции; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В предпочтительном воплощении изобретения гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант IFN-β («модифицированный цитокин IFN-β») выбирают из группы, состоящей из модифицированного IFN-β, включающего аминокислотную последовательность, как указано в любой SEQ ID Nos.234-289, и 989-1302; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В предпочтительном воплощении изобретения гипергликозилированный, протеазо-резистентный вариант IFN-β («модифицированный цитокин IFN-β») включает одну или более аминокислотных замен, как представлено далее в Таблице 2 (IFN-β); где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1а и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N] IFN-β1a, где гликопептид [S99N] IFN-β1а представляет собой вариант IFN-β1а, имеющий (а) аспарагиновый остаток, замещенный на остаток нативного серина в 99 аминокислотном положении в аминокислотной последовательности IFN-β1a (где аминокислотное положение S99 представлено далее на фиг.24; и соответствует S74 в аминокислотной последовательности IFN-β, представленной далее на фиг.3); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1a и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N, E134N]IFN-β1a, где гликопептид [S99N, E134N]IFN-β1a представляет собой вариант IFN-β1a, имеющий (а) остаток аспарагина, замещенный на каждый из остатков нативного серина и глутаминовой кислоты в 99 и 134 аминокислотных положениях соответственно, в аминокислотной последовательности IFN-β1a (где аминокислотные положения S99 и Е134 представлены далее на фиг.24; и соответствуют S74 и Е109 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β, представленной далее на фиг.3); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1a и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N, E134N, F136T]IFN-β1a, где гликопептид [S99N, E134N, F136T]IFN-β1a представляет собой вариант IFN-β1a, имеющий (а) остатки аспарагина, аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативного серина, глутаминовой кислоты и фенилаланина в аминокислотных положениях 99, 134 и 136 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1a (где аминокислотные положения S99, Е134 и F136 представлены далее на фиг.24; и соответствуют S74, Е109 и Fill соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β, представленной далее на фиг.3); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1а и этот вариант представляет собой гликопептид [E134N]IFN-β1a, где гликопептид [E134N] IFN-β1а представляет собой вариант IFN-β1а, имеющий (а) остаток аспарагина, замещенный на остаток нативной глутаминовой кислоты в 134 аминокислотном положении в аминокислотной последовательности IFN-β1а (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1а и этот вариант представляет собой гликопептид [E134N, F136T]IFN-β1a, где гликопептид [E134N, F136T]IFN-β1a представляет собой вариант IFN-β1а, имеющий (а) остатки аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативной глутаминовой кислоты и фенилаланина в 134 и 136 аминокислотных положения соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1а (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1а и этот вариант представляет собой гликопептид [E134T]IFN-β1a, где гликопептид [Е134Т] IFN-β1а представляет собой вариант IFN-β1a, имеющий (а) остаток треонина, замещенный на остаток нативной глутаминовой кислоты в 134 положении в аминокислотной последовательности IFN-β1а (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка треонина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1a, и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N, E134T]IFN-β1a, где гликопептид [S99N, E134T]IFN-β1a представляет собой вариант IFN-β1a, имеющий (а) остатки аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативного серина и глутаминовой кислоты в аминокислотных положениях 99 и 134 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1a (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N]IFN-β1b, где гликопептид [S99N]

IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остаток аспарагина, замещенный на остаток нативного серина в 99 аминокислотном положении в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где положения аминокислоты представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N, E134N]IFN-β1b, где гликопептид [S99N, E134N]IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остаток аспарагина, замещенный на остаток нативного серина и остаток глутаминовой кислоты в положениях 99 и 134 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N, E134N, F136T] IFN-β1b, где гликопептид [S99N, E134N, F136T]IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остатки аспарагина, аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативного серина, глутаминовой кислоты и фенилаланина в положениях 99, 134 и 136 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [E134N]IFN-β1b, где гликопептид [E134N] IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остаток аспарагина, замещенный на остаток нативной глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 134 в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [E134N, F136T]IFN-β1b, где гликопептид [E134N, F136T]IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остатки аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативной глутаминовой кислоты и фенилаланина в аминокислотных положениях 134 и 136 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [Е134Т] IFN-β1b, где гликопептид [Е134Т] IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остаток треонина, замещенный на остаток нативной глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 134 в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где аминокислотные положения представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой указанного остатка аспарагина.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-β представляет собой вариант IFN-β1b, и этот вариант представляет собой гликопептид [S99N, E134T]IFN-β1b, где гликопептид [S99N, E134T]IFN-β1b представляет собой вариант IFN-β1b, имеющий (а) остатки аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативного серина и глутаминовой кислоты в положениях 99 и 134 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-β1b (где аминокислотные позиции представлены далее на фиг.24); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой каждого из указанных остатков аспарагина и треонина.

Полипептидные варианты IFN-γ

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант интерферона представляет собой модифицированный цитокин IFN-γ, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:199 (как представлено на фиг.4), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным IFN-γ. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный IFN-γ выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:199 (как представлено на фиг.4), соответствующих любым аминокислотным положениям: 33, 37, 40, 41, 42, 58, 66, 64, 65 и 66, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов). В предпочтительных воплощениях изобретения замены выбирают из аминокислотных замещений в SEQ ID NO:199, представленной далее в Таблице 3, где первая из списка аминокислота замещена второй аминокислотой в указанном положении; и где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозлирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения модифицированный IFN-γ включает аминокислотную последовательность, соответствующую любой SEQ ID NOS:290-311, и дополнительно включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-γ представляет собой гликопептид [S99T]IFN-гамма, где гликопептид [S99T]IFN-гамма представляет собой вариант зрелого, нативного IFN-гамма, имеющего (а) остаток треонина, замещенный на остаток нативного серина в аминокислотном положении 99 в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленной на фиг.31 (соответствующей S102 в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.4); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка в 97 аминокислотном положении в аминокислотной последовательности (а); и включающий по крайней мере один мутированный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, присутствующего в родительском полипептиде IFN-γ.

Так как сайт гликозилирования, образованный N97, Y98, Т99 в варианте [S99T]IFN-гамма, отличается от сайта гликозилирования, образованного N97, Y98, S99 в нативном IFN-гамма, сайт гликозилирования N97, Y98, Т99 квалифицируется как не нативный сайт гликозилирования, который не присутствует в родительском полипептиде. Кроме того, как описано в WO 02/081507, замещение S99T в аминокислотной последовательности нативного IFN-гамма обеспечивает большую эффективность гликозилирования в сайте гликозилирования N97, Y98, Т99 в варианте [S99T]IFN-гамма по сравнению с эффективностью гликозилирования в сайте гликозилирования N97, Y98, S99 в варианте [S99T]IFN-гамма. Таким образом [S99T]IFN-гамма квалифицируется, как гипергликозилированный полипептидный вариант родительского полипептида IFN-гамма (где аминокислотные позиции N97, Y98, S99 в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленные на фиг.31, соответствуют N100, Y102 и S102 в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленной на фиг.4).

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-γ представляет собой гликопептид [E38N]IFN-гамма, где гликопептид [E38N]IFN-гамма представляет собой вариант зрелого, нативного IFN-гамма, имеющего (а) остаток аспарагина, замещенный на остаток нативной глутаминовой кислоты в аминокислотном положении 38 в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленной на фиг.31 (где аминокислота Е38 в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.31, соответствует Е41 в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.4); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка в 38 аминокислотном положении в аминокислотной последовательности (а); и включающий по крайней мере один мутированный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, присутствующего в родительском полипептиде IFN-γ.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-γ представляет собой гликопептид [E38N, S99T]IFN-гамма, где гликопептид [E38N, S99Т]IFN-гамма представляет собой вариант зрелого, нативного IFN-гамма, имеющего (а) остатки аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативной глутаминовой кислоты и серина в аминокислотных положениях 38 и 99 в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленной на фиг.31 (где аминокислоты Е38 и S99 в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.31, соответствуют Е41 и S102 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.4); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка в каждом аминокислотном положении 38 и 97 в аминокислотной последовательности (а); и включающий по крайней мере один мутированный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, присутствующего в родительском полипептиде IFN-γ.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-γ представляет собой гликопептид [E38N, S40T]IFN-гамма, где гликопептид [E38N, S40T]IFN-гамма представляет собой вариант зрелого, нативного IFN-гамма, имеющего (а) остатки аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативной глутаминовой кислоты и серина в аминокислотных положениях 38 и 40 в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленной на фиг.31 (где аминокислоты Е38 и S99 в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.31, соответствуют Е41 и S42 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.4); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка в аминокислотной позиции 38 в аминокислотной последовательности (а); и включающий по крайней мере один мутированный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, присутствующего в родительском полипептиде IFN-γ.

В некоторых воплощениях изобретения любой из описанных выше протеазо-резистентных или протеазо-резистентных, гипергликозилированных вариантов IFN-γ представляет собой гликопептид [E38N, S40T, S99T]

IFN-гамма, где гликопептид [E38N, S40T, S99T]IFN-гамма представляет собой вариант зрелого, нативного IFN-гамма, имеющего (а) остатки аспарагина, аспарагина и треонина, замещенные на остатки нативной глутаминовой кислоты, серина и серина в аминокислотных положениях 38, 40 и 99 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-гамма, представленной на фиг.31 (где аминокислоты Е38, S40 и S99 в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.31, соответствуют Е41, S43 и S102 соответственно в аминокислотной последовательности IFN-γ, представленной далее на фиг.4); и (b) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка в аминокислотной позиции 38 в аминокислотной последовательности (а), и необязательно дополнительно имеющий (с) углеводную часть, ковалентно связанную с R-группой аспарагинового остатка в аминокислотной позиции 97 в аминокислотной последовательности (а); и включающий по крайней мере один мутированный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, присутствующего в родительском полипептиде IFN-γ.

В некоторых воплощениях изобретения любые описанные выше гипергликозилированные протеазо-устойчивые варианты IFN-γ обладают повышенной стабильностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, где стабильность оценена путем измерения остаточной биологической активности после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови как описано выше. В других воплощениях изобретения любые описанные выше протеазо-устойчивые варианты IFN-γ обладают повышенной биологической активностью по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином, после инкубации или со смесью протеаз, или с индивидуальными протеазами, или с лизатом крови, или с сывороткой крови как описано выше.

Полипептидные варианты эритропоэтина

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант цитокина представляет собой модифицированный цитокин эритропоэтин, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:201 (как представлено далее на фиг.7), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным эритропоэтином. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный эритропоэтин выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:201 (как представлено далее на фиг.7), соответствующих любому аминокислотному положению: 34, 45, 48, 49, 52, 53, 55, 72, 75, 76, 123, 129, 130, 131, 162 и 165, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка (ов). В предпочтительных воплощениях изобретения замены выбирают из аминокислотных замещений в SEQ ID NO:201, представленной далее в таблице 4, где первая из списка аминокислота замещена второй аминокислотой в указанном положении; и где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения модифицированный эритропоэтин включает аминокислотную последовательность, соответствующую любой SEQ ID NO8:940-977, и дополнительно включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

Полипептидные варианты GM-CSF

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант цитокина представляет собой модифицированный цитокин GM-CSF, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:202 (как представлено далее на фиг.8), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта эритропоэтина, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным GM-CSF. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный GM-CSF выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:202 (как представлено далее на фиг.8), соответствующих любым аминокислотным положениям: 38, 41, 45, 46, 48, 49, 51, 60, 63, 67, 92, 93, 119, 120 и 124, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов). В предпочтительных воплощениях изобретения замены выбирают из аминокислотных замещений в SEQ ID NO:202, представленной далее в таблице 5, где первая из списка аминокислота замещена второй аминокислотой в указанной позиции; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения модифицированный GM-CSF включает аминокислотную последовательность, соответствующую любой SEQ ID N0s:362-400, и дополнительно включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

Полипептидные варианты G-CSF

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант цитокина представляет собой модифицированный цитокин G-CSF, включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:210 (как представлено далее на фиг.5), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-α2b, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным G-CSF. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный G-CSF выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:210 (как представлено далее на фиг.5), соответствующих любым аминокислотным положениям: 61, 63, 68, 72, 86, 96, 100, 101, 131, 133, 135, 147, 169, 172 и 177, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов). В предпочтительных воплощениях изобретения замены выбирают из аминокислотных замещений в SEQ ID NO:210, представленной далее в таблице 6, где первая из списка аминокислота замещена второй аминокислотой в указанной позиции; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения модифицированный G-CSF включает аминокислотную последовательность, соответствующую любой SEQ ID NOs:631-662, и дополнительно включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

Полипептидные варианты человеческого гормона роста

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазо-резистентный вариант цитокина представляет собой модифицированный цитокин человеческого гормона роста (hGH), включающий одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:216 (как представлено далее на фиг.6), соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта G-CSF, где замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеазам, измеренной инкубацией с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше), по сравнению с не модифицированным hGH. В некоторых из этих воплощений изобретения модифицированный hGH выбирают из протеинов, включающих одну или более единичных аминокислотных замен в одном или более положениях мишени в SEQ ID NO:216 (как представлено далее на фиг.6), соответствующих любым аминокислотным положениям: 56, 59, 64, 65, 66, 88, 92, 94, 101, 129, 130, 133, 134, 140, 143, 145, 146, 147, 183 и 186, где мутации включают инсерции, делеции и замены нативного аминокислотного остатка(ов). В предпочтительных воплощениях изобретения замены выбирают из аминокислотных замещений в SEQ ID NO:216, представленной далее в таблице 7, где первая из списка аминокислота замещена второй аминокислотой в указанном положении; где вариант дополнительно включает аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности родительского полипептида до такой степени, что вариант включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения модифицированный hGH включает аминокислотную последовательность, соответствующую любой SEQ ID NOs:850-895, и дополнительно включает один или более сайтов гликозилирования, которые не присутствуют в родительском полипептиде.

В других воплощениях изобретения гипергликозилированный протеазорезистентный вариант представляет собой модифицированной цитокин, который обладает большей устойчивостью к протеолизу по сравнению с соответствующим не модифицированным (родительским) цитокином, где модифицированный цитокин включает одну или более аминокислотных замен в одном или более положениях мишени цитокина, соответствующих структурно-связанному модифицированному аминокислотному положению в трехмерной структуре описанного выше полипептидного варианта IFN-β. Аминокислотная (ые) замена(ы) приводит к большей устойчивости к протеолизу по сравнению с не модифицированным (родительским) цитокином. Повышенную устойчивость к протеолизу оценивают путем инкубации с протеазой или с лизатом крови, или инкубацией с сывороткой крови (как описано выше) сравнивая с не модифицированным hGH.

Дополнительные модификации

Типичный, протеазо-резистентный или протеазо-резистентный, гипер-гликозилированный полипептидный вариант, имеет аминокислотную последовательность, которая существенно сходна с аминокислотной последовательностью родительского полипептида. Например, гипергликозилированный полипептидный вариант имеет аминокислотную последовательность, которая отличается, по крайней мере, на одну аминокислоту, и может отличаться, по крайней мере, на две, но не более чем на 10 аминокислот, по сравнению с аминокислотной последовательностью родительского полипептида. Изменения последовательностей могут представлять собой замены, вставки или делеции. Сканирование мутаций, которые систематически привносят аланин или другие остатки, может быть осуществлено через использование аминокислотного кода. Специфические аминокислотные замены включают консервативные и неконсервативные замены. Консервативные аминокислотные замены обычно включают замены в пределах следующих групп: (глицин, аланин); (валин, изолейцин, лейцин); (аспаргиновая кислота, глютаминовая кислота); (аспаргин, глютамин); (серии, треонин); (лизин, аргинин); или (фенилаланин, тирозин).

Дополнительные модификации вставок, которые могут менять, а могут не менять первичной аминокислотной последовательности родительского терапевтического белка, включают химические производные полипептидов, например, ацетилированные или карбоксилированные; изменения аминокислотной последовательности, которая делает белок чувствительным к полиэтиленгликолированию (ПЭГгликолирование); и подобному. Гипергликозилированный, протеазорезистентный полипептидный вариант белка может быть модифицирован одной или более полиэтиленгликольными группами. В одном из исполнений, изобретение предполагает использование полипептидных вариантов с одной или более неприродных ПЭГгликолированых сайтов, которые введены для получения ПЭГ-производных полипептидов с уменьшенным сывороточным клиренсом. Также используют последовательности, которые имеют фосфорилированные аминокислотные остатки, например, фосфотирозин, фосфосерин или фосфотреонин.

Также могут быть использованы в сочетании с представленными в изобретении полипептидами, полипептиды, свойства которых были модифицированы использованием обычных химических технологий, обладающие большей резистентностью к протеолитической деградации, с оптимизированной растворимостью, или представляющие их более подходящими для использования в качестве терапевтического средства. Например, каркас пептида может быть циклизован для повышения его стабильности (см., например, Friedler et al. 2000, J Biol. Chem. 275:23783-23789). Могут быть использованы аналоги, включающие другие остатки, чем встречающиеся L-аминокислоты, например, D-аминокислоты или не встречающиеся в природе аминокислоты. Белок может быть пэгилирован (pegylated) для повышения его стабильности.

Модификации интересны тем, что могут менять, а могут и не менять первичную аминокислотную последовательность полипептидов, включая химическую дериватизацию полипептидов, например, ацетилирование или карбоксилирование; изменения в аминокислотных последовательностях, которые делают белок чувствительным к ПЭГгликолированию (добавлением полиэтиленгликольной группы); и подобные. В одном воплощении изобретения предполагается использование вариантов синтетического агониста рецептора интерферона I типа, в гипергликозилированные, протеазо-резистентные полипептидные варианты которого в дальнейшем включаются один или более неприродных сайтов пэгилирования, которые сконструированы для получения PEG-дериватизированных полипептидов с уменьшенным сывороточным клиренсом. Таким образом, изобретение включает ПЭГилированный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа. Также оно включает модификации гликозилирования, например те, которые могут быть получены через модифицирование гликозилированных образцов полипептида во время его синтеза и процессинга или в последующих процессах поэтапно; например, через экспозицию полипептида к ферментам, которые осуществляют реакцию гликозилирования, к таким как ферменты гликозилирования или дегликозилирования млекопитающих. Изобретение рассматривает использование любых ПЭГилированных гипергликозилированных, ПЭГилированных протеазо-резистентных и ПЭГилированных протеазо-резистентных гипергликозилированных полипептидных вариантов. Также оно охватывает последовательности, которые имеют фосфорилированные аминокислотные остатки, например, фосфотирозин, фосфосерин или фосфотреонин.

Слитые протеины

В отдельных воплощениях изобретения, гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант в дальнейшем включает гетерологичный полипептид (например, партнер), необходимый для формирования слитые протеины. В качестве подходящих партнеров для слияния включали пептиды и полипептиды, которые повышали стабильность in vivo (например, удлиняющие период полужизни в сыворотке); упрощающие очистку, например, (His)n, например, 6His, и подобные; обеспечивающие секрецию слитого протеина из клетки; обеспечивающие сохранение эпитопов, например, GST, гемагглютинин (НА; например, CYPYDVPD YA; SEQ ID NO:1304), FLAG (например, DYKDDDDK; SEQ ID NO:1305), c-myc (например, CEQKLISEEDL; SEQ ID NO:1306) и подобные; обеспечивающие сигнал для детекции, например, ферменты, которые образуют легко выявляемые продукты (например, [бета]-галатозидаза, люцифераза) или протеин, который используется для детекции, например, зеленый флюоресцентный протеин и т.п.; обеспечивающие мультимеризацию, например, мультимеризацию таких доменов как Fc-фрагмент иммуноглобулина и подобные.

Слитый протеин может быть включен в аминокислотную последовательность, которая предназначена для обеспечения секреции слитого протеина из клетки. Из области техники квалифицированному специалисту известны сигнальные последовательности секреции. Сигналы секреции, которые подходят для использования в бактериях, включают, но не лимитируются ими, секреционный сигнал липопротеина Брауна Е. coli, S. Marcescens, Е. amylosora, М. morganii, и Р. mirabilis; TraT белок Е. coli и Salmonella; белок пенициллиназы (РепР) В. licheniformis и В. cereus и S. aureus; пуллуланазные белки Klebsiella pneumoniae и Klebsiella aerogenese; липропротеины Е. coli lpp-28, Pal, RpIA, RpIB, OsmB, NIpB и Ог117; белок шитобазы V. harseyi; [бета]-1,4-ендоглюконазный белок Pseudomonas solanaceamm. Pal и Pep белки Н. influenzae; Oprl-белок P. aeruginosa; MalX и AmiA белки S. pneumoniae; 34 kda антиген и TpmA белок Treponema pallidum; P37 белок Mycoplasma hyorhinis; нейтральная протеаза Bacillus amyloliquefaciens; и 17 kda антиген Rickettsia rickettsii. Из уровня техники известны последовательности сигнала секреции, подходящие для использования в дрожжах, и они могут быть использованы. См., например, U.S. Patent No. 5,712,113.

В отдельных применениях изобретения, используют сигнальный пептид из IFN-[альфа]. В других применениях используют сигнальные пептиды из IFN-[бета]. В примере 2 приведены варианты использования синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа, включающего IFN-[альфа] 14 или IFN-[бета]-сигнальный пептид. Такие сигнальные пептиды обеспечивают секрецию из клеток млекопитающих.

В отдельных применениях, гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант включает партнера слияния и сайт расщепления протеазами, который позиционирован между партнером слияния и остатком полипептидного варианта.

Сайты протеолитического расщепления известны специалистам из уровня техники; их известно очень много и они хорошо описаны в литературе, включающей, например, Handbook of Proteolytic Enzymes (1998) AJ Barrett, ND Rawlings, и JF Woessner, eds., Academic Press. Сайты протеолитического расщепления включают, но не ограничиваются ими, сайт расщепления энтерокиназой: (Asp)4Lys (SEQ ID NO: 1307); сайт расщепления фактором Ха: Ile-Glu-Gly-Arg (SEQ ID NO:1308); сайт расщепления тромбином, например, Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ID NO:1309); сайт расщепления ренином, например, His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His (SEQ ID NO: 1310); сайт расщепления коллагеназой, например, X-Gly-Pro (где Х - любая аминокислота); сайт расщепления трипсином, например, Arg-Lys; сайты расщепления вирусными протеазами, такие как 2А или 3С сайты расщепления протеазой, включающие, но не ограничивающиеся сайтом расщепления протеазой 2А из пикорновирусов (см., например, Sommergruber et al. [0635] (1994) Virol. 198:741-745), 3С сайт расщепления вируса гепатита А (см., например, Schultheiss et al. [0636] (1995) J. Virol. 69:1727-1733), сайт расщепления протеазой человеческого риновируса 2А (см., например., Wang et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 235:562-566), сайт расщепления протеазой 3 пикорновируса (см., например, Walker et al. (1994) Biotechnol. 12:601-605).

Получение гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида

Заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа может быть просто приготовлен путем использования любых известных методов, включающих методы химического синтеза, получение посредством стандартных технологий рекомбинантной ДНК, и их сочетаниями. Например, заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа может быть синтезирован использованием автоматизированных твердофазных tert-butyloxycarbonyl и benzyl защищающих стратегий.

Заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа может быть синтезирован посредством нативного химического лигирования, например, фрагментов длиной приблизительно от около 15, до, приблизительно, 40 аминокислот (например, фрагменты длиной от, приблизительно, около 15, до, приблизительно, 20 аминокислот; длиной от, приблизительно, около 20, до, приблизительно, 25 аминокислот; длиной, приблизительно, от около 25, до, приблизительно, 30 аминокислот; длиной, приблизительно, от около 30, до, приблизительно, 35 аминокислот; длиной от, приблизительно, около 35, до, приблизительно, 40 аминокислот), могут быть синтезированы с использованием стандартных методов химического синтеза; и фрагментов, дотированных с использованием процесса, описанного Dawson, et al. (1994) Science 266:176-779. Очистка синтезированных пептидов может быть оценена посредством обратно-фазовой жидкостной хроматографии с высоким разрешением (HPLC) и изоэлектрическим фокусированием. Первичные структуры лигандов могут быть проверены с помощью способов сиквиенса по Эдману.

Во многих применениях изобретения, вектор экспрессии включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, полученный путем использования удобных способов, и внедрен в клетки-хозяева, в особенности в эукариотические клетки, которые способны гликозилировать белки. Вектор экспрессии обеспечивает продукцию заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа в клетках-хозяевах. Поэтому, представленное изобретение обеспечивает способ получения синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, включающий культивирование эукариотических клеток-хозяев, для осуществления которого клетки-хозяева включают заявленный рекомбинантный вектор экспрессии, обеспечивающий благоприятные условия для продукции синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа; и получение синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа из культуры. Заявленный полипептид-агонист может быть выделен и очищен до более чем 80%, до более чем 90%, до более чем 95%, до более чем 98%, или до более чем 99%.

Полипептиды могут быть экспрессированы в прокариотах или эукариотах, обычными путями, выбор которых зависит от цели экспрессии. Как отмечено выше, во многих применениях заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа синтезировали в эукариотических клетках. Для крупномасштабной продукции белка, как экспресссиирующие клетки-хозяева, могут быть использованы: одноклеточный организм, такой как S. cerevisiae; клетки насекомых в сочетании с бакуловирусными векторами; клетки высших организмов, таких как позвоночные, в частности, млекопитающих, например, COS 7 клетки, СНО клетки, НЕК293 клетки и подобные. Во многих применениях изобретения необходима экспресссия гена в эукариотической клетке, где белок должен сохранить нативный фолдинг и посттрансляционную модификацию.

Белок или его фрагменты, полученные в больших количествах посредством экспрессии в клетках-хозяевах, могут быть выделены и очищены удобным образом. Из экспрессирующих клеток-хозяев могут быть приготовлены лизаты и очищены с помощью HPLC, хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC), анион-обменной хроматографии, катион-обменной хроматографии, размер-исключающей хроматографии, ультрафильтрации, гель-электрофореза, аффинной хроматографией или другими способами очистки.

Заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа может также быть выделен и очищен удобными способами из супернатанта клеточной культуры или из клеточных лизатов. Например, лизат может быть приготовлен из экспрессирующих клеток хозяина и очищен использованием HPLC, хроматографией гидрофобных взаимодействий (HIC), анионобменной хроматографией, катионобменной хроматографией, размер-исключающей хроматографией, ультрафильтрацией, гель-электрофорезом, аффинной хроматографией или другими способами очистки. В большинстве случаев, смеси, которые используются, должны включать, по крайней мере, 20% по весу желаемого продукта; предпочтительно они должны включать, по крайней мере, около 75% продукта по весу; наиболее предпочтительно, они должны включать около 95% продукта по весу; и для терапевтических целей, обычно, по крайней мере, около 99.5% продукта по весу, по отношению к контаминантам, связанным с методами получения продукта и его очистки. Обычно проценты основываются на содержании общего белка.

Во многих применениях изобретения, заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа является очищенным, например, заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа является свободным от других, не заявленных белков, и свободным от других макромолекул (например, карбонгидратов, липидов и т.п). Во многих применениях, заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа является, по крайней мере, очищенным приблизительно на 75%; по крайней мере, очищенным приблизительно на 80%; по крайней мере, очищенным приблизительно на 85%; по крайней мере, очищенным приблизительно на 90%; по крайней мере, очищенным приблизительно на 95%; по крайней мере, очищенным приблизительно на 98%; или, по крайней мере, очищенным приблизительно на 99%, или более 99%. Способы определения того, действительно ли белок является свободным от других белков и других макромолекул, известны специалистам из уровня техники.

Гипергликозилированные, протеазо-резистентные варианты полипептида могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, используя удобные технологии, известные специалистам из уровня техники. Отдельные последовательности и способы получения могут быть выбраны в зависимости от того, как это удобно, экономично, какая необходима чистота продукта и т.п.

Обычно, олигонуклеотиды, кодирующие аминокислотные последовательности необходимого полипептидного варианта, готовят посредством химического синтеза, например, путем использования олигонуклеотидного синтезатора. Необходимые олигонуклеотиды подбирают по аминокислотной последовательности необходимого полипептида и во многих различных его воплощениях, выбирая те кодоны, которые наиболее предпочтительны для клетки-хозяина, в которой рекомбинантный полипептид будет синтезироваться. Например, отдельные небольшие олигонуклеотиды, кодирующие часть функции необходимого полипептида, могут быть синтезированы и собраны посредством PCR, лигирования или дотирования цепочечной реакции (LCR). Индивидуальные олигонуклеотиды обычно содержат 5' или 3' перекрытия для комплементарной сборки. Один раз собранная нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептидный вариант, будет вставлена в рекомбинантный вектор и поставлена под контроль последовательности, экспрессирующей необходимую нуклеиновую кислоту и последующую продукцию заявленного полипептида в желаемой трансформированной клетке.

В отдельных применениях изобретения, необходимая нуклеиновая кислота создается таким образом, чтобы, по меньшей мере, около 10%; по меньшей мере, около 20%; по меньшей мере, около 30%; по меньшей мере, около 40%; по меньшей мере, около 50%; по меньшей мере, около 60%; по меньшей мере, около 70%; по меньшей мере, около 80%; или, по меньшей мере, около 90%; или более, кодонов являлись кодонами, которые являются предпочтительно человеческими последовательностями. См., например, ниже табл.8.

Таблица 8
Кодоны, обычно встречающиеся у людей^* Аминокислота Частота встречаемости в белках людей (%) Кодоны и их встречаемость в белках людей (%) Аланин 6,99 GCU (28.0) GCC     GCA (20.0) (41,6)       GCG       (10,3) Аргинин 5,28 CGU (8,9) CGC     CGA (5,4) (21,4)     AGA (9,9) CGG       (10,4)       AGG       (11,1) Аспаргин 3,92 AAU (42,3) AAC       (57,7) Аспаргиновая 5,07 GAU (42,8) GAC кислота     (57,2) Цистеин 2,44 UGU (40,6) UGC       (59,4) Глутаминовая 6,82 GAA (39,2) GAG кислота     (60,7) Глутамин 4,47 CAA (24,8) CAG       (75,2) Глицин 7,10 GGU (15,8) GGC     GGA (24,1) (35,8)       GGG       (24,3) Гистидин 2,35 CAU (39,6) CAC       (60,4) Изолейцин 4,50 AUU (33,1) AUC     AUA (12,9) (54,0) Лейцин 9,56 UUA (5,5) UUG     CUU (11,1) (11,5)     CUA (6,5) CUC       (20,8)       CUG       (44,5) Лизин 5,71 ААА (38,9) AAG       (61,1) Метионин 2,23 AUG (100)   Фенилаланин 3,84 UUU (41,1) UUC       (58,2) Пролин 5,67 CCU (27,3) CCC     ССА (25,7) (35,2)       CCG       (11,6) Серии 7,25 UCU (18,3) UCC     UCA (12,9) (23,7)     AGU (13,2) UCG (5,9)       AGC       (25,9) Треонин 5,68 ACU (22,4) ACC     АСА (25,4) (40,5)       ACG       (11,8) Триптофан 1,38 UGG (100)   Тирозин 3,13 UAU (40,0) UAC       (60,0) Валин 6,35 GUU (16,4) GUC     GUA (9,3) (25,7)       GUG       (48,7) *Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Sambrook J. and Russell D. W. Third Edition (c)2001 by Cold Spring Harbor Press.

Полипептидкодирующие молекулы нуклеиновых аминокислот обычно размножают путем вставления в молекулярный вектор. Используются вирусные и не вирусные векторы, включая плазмиды. Выбор плазмид зависит от типа клеток, в которых предполагается их размножение, и цели размножения. Определенные векторы пригодны для амплификации и наработки больших количеств желательных последовательностей ДНК.

Рекомбинантный вектор экспрессии используется для эффективной экспрессии полипептидов, закодированных нуклеиново-кислотной молекулой в клетке, например, для продукции гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта. Выбор соответствующего вектора хорошо известен специалистам из уровня техники. Многие такие векторы доступны коммерчески.

Экспрессионные векторы подходят для экспрессии в клеточной культуре. Эти векторы обычно включают регуляторные последовательности ("контрольные последовательности" или "контрольные регионы"), которые являются необходимыми для эффективной экспрессии необходимого полинуклеотида, к которому они непосредственно присоединены.

Экспрессионные векторы обычно имеют удобные рестрикционные сайты, расположенные вблизи промоторной последовательности. Они предназначены для вставления нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих необходимый белок или другие белки. В таком векторе могут быть представлены маркеры селекции, эффективно экспрессирующиеся в выбранном хозяине. Экспрессионные векторы могут быть использованы для продуцирования слитых белков, когда экзогенные белки слияния обеспечивают дополнительную функциональность, например, увеличение белкового синтеза, стабильность, взаимодействие со диагностической антисывороткой, ферментативный маркер, например, [бета]-галактозидазу, люциферазу и т.п.

Экспрессионные кассеты готовят таким образом, чтобы они включали регион инициации транскрипции, промоторный регион (например, промотор, который функционирует в эукариотической клетке), необходимый полинуклеотид и регион терминации транскрипции. После интродукции ДНК клетки, содержащие такие конструкции, селекционируют посредством маркера селекции, клетки размножают и используют для экспрессии.

Экспрессионные кассеты интродуцируют в различные векторы, подходящие для экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, например, в плазмиду, НАС, YAC, векторы из вирусов животных; например, в вирус мышиной лейкемии Молони, SV40, вирусы вакцины, бакуловирусы, ретровирусы; или вирусы растений, например, вирус мозаики цветной капусты, вирус мозаики табака, и в подобные, где векторы обычно способны обеспечивать селекцию клеток, включающих векторы экспрессии. Векторы могут быть использованы для экстрахромосомального существования, в частности, такие как плазмиды или вирусы; или для интеграции в хромосому хозяина. Когда необходимо экстрахромосомальное существование вектора в хозяине, последовательность ориджина, необходимая для репликации, берется из плазмиды, которая может иметь большое или малое количество копий. Существует большое разнообразие маркеров, пригодных для селекции, в особенности те, которые защищают против токсических веществ, в частности, против антибиотиков. Индивидуальный маркер, пригодный для селекции, выбирают в соответствии с природой хозяина, в отдельных случаях может быть использована комплементация ауксотрофного хозяина. Для введения ДНК-конструкции в клетки хозяина может использоваться любой удобный способ, например, кальций-преципитация ДНК, электропорация, слияние, трансфекция, инфицирование вирусными векторами, биобаллистика и т.п.

Представленное изобретение в дальнейшем предусматривает использование продукции гипергликозилированного, протеазо-резистентного полипептида в генетически модифицированных клетках-хозяевах, который может быть изолирован из клеток-хозяев, включающих полинуклеотиды, кодирующие полипептидный вариант; или, в отдельных применениях изобретения, экспрессионный вектор, способный экспрессировать такие полинуклеотиды. Подходящие эукариотические клетки включают клетки насекомых в комбинации с бакуловирусными векторами; дрожжевые клетки, такие как Saccharomyces cerevisiae; или клетки высших организмов, таких как позвоночные, включая клетки амфибий (например, ооциты Xenopus laevis) и млекопитающих, в частности клетки млекопитающих, например, COS-клетки, СНО-клетки, НЕК293-клетки, МА-IO-клетки, и подобные, можно использовать как клетки-хозяева для экспрессии. В частности, клетки-хозяева, являющиеся эукариотическими клетками, которые способны гликозилировать белок.

Гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант может быть получен из клеток-хозяев и затем выделен и очищен любым удобным способом рекомбинантного синтеза. Лизат может быть получен из экспрессирующего хозяина и очищен с помощью высокоразрешающей жидкостной хроматографии, исключающей хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и других технологий очистки. В большинстве случаев, композиции, которые используются, включают, по крайней мере, около 20% от веса желаемого продукта; наиболее обычно эта величина составляет приблизительно 75% от веса; предпочтительно, чтобы она достигала приблизительно 95% от веса; и для терапевтических целей, обычно она составляет не менее 99.5% от веса, в отношении контаминантов, связанных со способом выделения продуктов и способов их очистки. Обычно процент основывается на общем белке.

ПЭГилированный полипептид агониста рецептора интерферона I типа

Как замечено выше, в отдельных применениях, заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа является модифицированным одной или более полиэтиленгликольными группами, т.е. ПЭГилированным. Молекула ПЭГ присоединена к одной или более аминокислотных цепей заявленного полипептидного агониста. В отдельных применениях, заявленный ПЭГилированный полипептидный агонист содержит ПЭГ-группу только на одной аминокислоте. В других воплощениях изобретения, заявленный ПЭГилированный полипептидный агонист содержит ПЭГ-группу у двух и более аминокислот, например, заявленный ПЭГилированный полипептид агонист содержит ПЭГ-группу, присоединенную к двум, трем, четырем, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти различным аминокислотным остаткам.

Заявленный полипептид может быть присоединен непосредственно к ПЭГ (т.е., без линкерной группы) через аминогруппу, сульфгидрильную группу, гидроксильную группу или карбоксильную группу.

В отдельных применениях, ПЭГилированный заявленный полипептид является ПЭГилированным в аминокислотных концах (N-концы) или вблизи них заявленного полипептида, например, ПЭГ-группа конъюгирована к заявленному полипептиду в одном и более аминокислотных остатках от аминокислоты 1, через аминокислоту 4; или от аминокислоты 5, через приблизительно 10. В других применениях, ПЭГилированный заявленный полипептид является ПЭГилированным в одном или более аминокислотных остатках от приблизительно 10, до приблизительно 28. В других применениях, ПЭГилированный заявленный полипептид является ПЭГилированным в карбоксильных концах (С-концы) или рядом, например, в одном или более остатках от аминокислот 156-166, или аминокислот от 150 до 155. В других применениях, ПЭГилированный заявленный полипептид является ПЭГилированным в одном или более аминокислотных остатках в одном или более остатков аминокислот 100-114.

Получение полиэтиленгликолевых производных аминокислотных остатков в рецептор-связывающем сайте или вблизи от него, и/или домене активных сайтов заявленного белка, могут привести к нарушению функции этих доменов. В отдельных применениях изобретения, аминокислоты не ПЭГилированы по аминокислотным остаткам от аминокислоты 30 до амиинокислоты 40, и от аминокислоты 113 до 149.

В отдельных применениях, ПЭГ присоединяли к заявленному полипептиду через линкерную группу.

Линкерной группой является любая биологически совместимая линкерная группа, где «биосовместимость» показывает, что состав или группа являются нетоксичными и могут быть утилизированы in vitro или in vivo без нанесения вреда, причинения болезни или смерти. ПЭГ может быть присоединен к линкерной группе, например, через любую группу простого эфира, сложного эфира, тиольную группу или амидную группу. Соответствующие биосовместимые линкерные группы включают, но не лимитируются ими, сложноэфирную группу, амидную группу, имидную группу, карбонгидратную группу, карбоксильную группу, гидроксильную группу, карбонгидраты, янтарнокислотную группу (включая, например, сукцимидилсукцинат (SS), сукцимидилпропионат (SPA), сукцимидилбутаноат (SBA), сукцимидилкарбоксиметилат (SCM), сукцимидилсукцинамид (SSA) или N-гидроксисукцинимид (NHS), эпоксидную группу, оксикарбонилимидахольную группу [включающую, например, карбонилдиимидазол (CDI)], нитрофенильную группу [включающую, например, нитрофенилкарбонат (NPC); или трихлорфенилкарбонат (ТРС)], трисилатную группу, альдегидную группу, изоцианидную группу, винилсульфоновую группу, тирозиновую группу, цистеиновую группу, гистидиновую группу или первичный амин.

Способы приготовления сукцинимидилпропианата (SPA) и суцинимидилбутаноата (SBA) эфир-активированных ПЭГов описаны в U.S. Pat. No. 5,672,662 (Harris, et al.) и WO 97/03106.

Способы присоединения ПЭГ к полипептидам известны из уровня техники, для этого могут быть использованы любые известные способы. Например, см. работу Park et al, Anticancer Res., 1:373-376 (1981); Zaplipsky и Lee, Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, ed., Plenum Press, NY, Chapter 21 (1992); U.S. Patent No. 5,985,265; U.S. Pat. No. 5,672,662 (Harris, et al.) и WO 97/03106.

Во многих применениях, ПЭГ является монометоксиПЭГ-молекулой, прореагировавшей с первичными аминогруппами заявленного полипептида. Способы модификации полипептидов монометокси-ПЭГ через уменьшение алкилирования, известны из уровня техники. См., например, работу Chamow et al. (1994) Bioconj. Chem. 5:133-140.

Полиэтиленгликоль

Полиэтиленгликоль, подходящий для конъюгации с заявленным полипептидом, растворим вводе при комнатной температуре, и имеет общую формулу R(O-CH₂-CH₂)nO-R, где R является водородом или протективной группой, такой как алкильная или алканольная группа, и где n находится в пределах от 1 до 1000. Когда R является проективной группой, она обычно имеет от 1 до 8 углеродов.

Во многих применениях, ПЭГ имеет, по крайней мере, одну гидроксильную группу, например, терминальную гидроксильную группу, которая является гидроксильной группой, которая модифицирована для образования функциональной группы, которая взаимодействует с аминогруппой, например, эпсилон аминогруппой остатка лизина, свободной аминогруппой N-концов полипептида, или любой другой аминогруппой, такой как аминогруппа аспаргина, глютамина, аргинина или гистидина.

В других применениях, ПЭГ является производным, предназначенным для того, чтобы взаимодействовать со свободными карбоксильными группами заявленного полипептида, например, свободной карбоксильной группой у карбоксильных концах заявленного полипептида. Соответствующие производные ПЭГ, которые реагируют со свободной карбоксильной группой в карбоксильных концах заявленного полипептида, включают, но не ограничиваются ПЭГ-амин и гидразиновым производными ПЭГ (например, PEG-NH-NH2).

В других применениях, ПЭГ дериватизирован таким образом, чтобы он включал терминальную тиокарбоксильную кислотную группу, -COSH, которая избирательно реагирует с аминогруппам, образующими амидные производные. Реакционная природа тиокислоты селективна к отдельным аминокислотам больше к другим. Например, -SH, при соответствующих условиях рН, проявляет достаточную способность к реагированию с N-терминальными [эпсилон]-аминогруппами остатков лизина, протонированных или остающихся не нуклеофильными. С другой стороны, реакции под воздействием подходящих условий рН, могут придавать отдельным Лизиновым остаткам способность вступать в реакцию селективно.

В других применениях, ПЭГ включает реакционноспособные эфиры, такие как N-гидроксисукцинамидат в конце цепи ПЭГ. Так молекула N-гидроксисукцинамидатсодержащего ПЭГ, реагирует с отдельными аминокислотными группами в особых условия рН, таких как нейтральная среда 6.5-7.5. Например, N-концевые аминогруппы могут быть селективно модифицированы в условиях нейтральной рН. Однако если реакционная способность реагента будет чрезмерной, также могут вступить в реакцию NHz-группы лизина.

ПЭГ может быть конъюгирован непосредственно с заявленным полипептидом или через линкер. В отдельных применениях линкер добавляется к заявляемому полипептиду, формируя линкемодифицированный полипептид. Такие линкеры обеспечивают различные функции, например, реактивные группы, такие как сульфгидрильная, амино или карбоксильная, соединяют ПЭГ с линкермодифицированным пептидом.

В отдельных применениях, ПЭГ, конъюгированный с заявленным полипептидом, является линейным. В других применениях, ПЭГ, конъюгированный с заявленным полипептидом, является разветвленным. Разветвленные производные ПЭГ, такие как те, что описаны в U.S. Pat. No. 5,643,575, звездчатые ПЭГи и мультиармированные ПЭГи, такие как описанные в кА-талоге Shearwater Polymers, Inc. «Polyethylene Glycol Derivatives, 1997-1998». Звездчатые ПЭГи известны специалистам из уровня техники, включающем, например, U.S. Patent No. 6,046,305.

ПЭГ имеет молекулярный вес в интервале от приблизительно 2 kDa, до приблизительно 100 kDa, где обычно используемый термин «приблизительно» в контексте ПЭГ обозначает, что молекулярный вес ПЭГ больше или меньше чем указанный молекулярный вес. Например, ПЭГ, наиболее пригодный для конъюгирования с заявленным полипептидом, имеет молекулярный вес в пределах от приблизительно 2 kDa, до приблизительно 5 kDa; от приблизительно 5 kDa, до приблизительно 15 kDa, до приблизительно 20 kDa; от приблизительно 20 kDa, до приблизительно 25 kDa; от приблизительно 25 kDa, до приблизительно 30 kDa; от приблизительно 30 kDa, до приблизительно 40 kDa; от приблизительно 40 kDa, до приблизительно 50 kDa; от приблизительно 50 kDa; до приблизительно 60 kDa; от приблизительно 60 kDa, до приблизительно 70 kDa; от приблизительно 70 kDa, до приблизительно 80 kDa; от приблизительно 80 kDa, до приблизительно 90 kDa; или от приблизительно 90 kDa, до приблизительно 100 kDa.

Совокупность заявленных синтетических полипептидов агониста рецептора интерферона I типа

Непосредственно изобретение обеспечивает композицию, которая включает совокупность синтетических полипептидов агониста рецептора интерферона I типа, как описано выше. Заявленная композиция включает совокупность заявленных полипептидов, когда совокупность включает, по крайней мере, два различных заявленных синтетических полипептидов агониста рецептора интерферона I типа (например, полипептидов-агонистов, которые отличаются один от другого по аминокислотным последовательностям, по крайней мере, на одну аминокислоту).

Обычно, полученный заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа соответствует приблизительно от 0.5%, до приблизительно 99.5% от всей совокупности синтетических полипептидов агонистов рецептора интерферона I типа; например, полученный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа соответствует приблизительно от 0.5%, до приблизительно 1%; приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4%, приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25%, приблизительно 30%, приблизительно 35%, приблизительно 40%, приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 99%, или приблизительно 99.5% всей совокупности полипептидных агонистов рецептора интерферона I типа.

Композиции

Настоящее изобретение описывает композиции, включая фармацевтические композиции, включающие синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазорезистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант, например, полипептидный вариант родительского терапевтического протеина, который включает по крайней мере один мутантный сайт протеазного расщепления в месте нативного сайта протеазного расщепления, присутствующего в родительском терапевтическом протеине; и который включает (1) углеводную часть, ковалентно связанную по крайней мере с одним не нативным сайтом гликозилирования, который не присутствует в родительском терапевтическом протеине, и/или (2) углеводную часть, ковалентно связанную по крайней мере с одним нативным сайтом гликозилирования, который присутствует, но не гликозилирован в родительском терапевтическом протеине. Композиции могут включать синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант; и один или более дополнительный компонентов, которые выбирают в зависимости от используемого полипептидного варианта. Подходящие дополнительные компоненты включают, но не ограничиваются ими, соли, буферы, солюбилизаторы, стабилизаторы, детергенты, ингибирующие протеазу агенты и тому подобное.

В некоторых воплощениях изобретения объект композиция включает синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант и фармацевтически приемлемый эксципиент. Из уровня техники известно большое разнообразие фармацевтически приемлемых эксципиентов и нет необходимости в их детальном обсуждении. Фармацевтически приемлемые эксципиенты описаны в различных публикациях, например, A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy", 20th edition, Lippincott, William, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7 th ed., Lippincott, William, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A.H.Kibbe et al., eds., 3th ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.

В некоторых воплощениях изобретения в фармацевтических лекарственных формах синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант присутствуют в виде фармацевтически приемлемых солей, используемых отдельно или в подходящей смеси, так же как и в комбинации в другими фармацевтически активными соединениями.

Составы, пригодные для инъекций

В некоторых воплощениях изобретения синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения изготовлен в виде препарата для инъекций (например, подкожных, внутримышечных, внутрикожных, трансдермальных или других способов инъекции) путем растворения, суспендирования или эмульгирования агониста в водном растворителе (например, физиологический раствор и тому подобное) или в неводном растворителе, таком как растительные или другие аналогичные масла, глицериды синтетических алифатических кислот, сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоль; и, при желании, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты.

Составы для доставки в тонкий кишечник

При изготовлении пероральных препаратов объект изобретения агент (например, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа) используется один или в комбинации с подходящими для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул добавками, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный или картофельный крахмал; со связующими, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, камедь, кукурузный крахмал или желатин; с дезинтеграторами, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмалили натрий карбоксиметилцеллюлоза; с лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния; и, при желании, с разбавителями, буферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами и ароматизаторами.

Объект изобретения агонист может входить в состав суппозиториев смешиванием с различными основами, такими как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Объект изобретения агонист может вводиться ректально с помощью суппозитория. Суппозиторий может включать носители, такие как кокосовое масло, карбовакс и полиэтиленгликоль, которые расплавляются при температуре человеческого тела, но затвердевают при комнатной температуре.

Стандартные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, могут быть изготовлены таким образом, что каждая дозируемая единица, например, полная чайная ложка, полная столовая ложка, таблетка или суппозиторий, содержит предварительно определенное количество композиции, содержащей один или более активных компонентов. Аналогично, единичные лекарственные формы для инъекционного или внутривенного введения могут включать в своем составе агонист(ы) в виде раствора в стерильной воде, обычном физиологическом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе.

В некоторых воплощениях изобретения объект композиция для энтеральной доставки включает энтеросолюбильный материал для покрытия. Пригодный энтеросолюбильный покрывающий материал включает сукцинат ацетатгидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCAS), фталат гидрокси-пропилметилцеллюлозы (НРМСР), фталат ацетата целлюлозы (CAP), поливинилфталевый ацетат (PVPA), Eudragit и щеллак.

В одном не ограничивающем изобретение примере подходящего перорального состава синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения может быть изготовлен вместе с одним или более фармацевтическими эксципиентами и покрыт энтеральным покрытием, как описано в патенте США 6346269. Например, раствор, включающий растворитель, синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и стабилизатор, наносят на ядро, включающее фармацевтически приемлемые эксципиенты, с образованием покрытого активным агентом ядра; на покрытое активным агентом ядро наносят нижний покрывающий слой, который затем покрывают энтеральным покрывающим слоем. Ядро в основном включает фармацевтически не активные компоненты, такие как лактоза, крахмал, маннит, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, натрийгликолят крахмала, хлорид натрия, хлорид калия, пигменты, соли альгиновой кислоты, тальк, двуокись титана, стеариновую кислоту, стеарат, микрокристаллическую целлюлозу, глицерин, полиэтиленгликоль, триэтилцитрат, трибутилцитрат, пропанилтриацетат, двухосновный фосфат кальция, трехосновный фосфат натрия, сульфат кальция, циклодекстрин и касторовое масло. Подходящие для активного агента растворители включают водные растворители. Пригодные стабилизаторы включают щелочные и щелочно-земельные металлы, основные фосфаты и соли органических кислот и органические амины. Нижний покрывающий слой включает один или более адгезивов, пластификатор и агент против слеживания. Пригодные агенты против слеживания включают тальк, стеариновую кислоту, стеарат, стеарил фумарат натрия, глицерил бегенат, каолин и аэросил. Подходящие адгезивы включают поливинилпирролидон (PVP), желатин, гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), гидроксипропилцеллюлозу (НРС), гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), винилацетат (VA), поливиниловый спирт (PVA), метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу (ЕС), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), фталат ацетата целюлозы (CAP), ксантановую смолу, альгининовую кислоту, соли альгининовой кислоты, Eudragit^TM, сополимер метилакриловой кислоты и метилметакрилата с фталатполивинилацетатом (PVAP). Подходящие пластификаторы включают глицерин, полиэтиленгликоль, триэтилцитрат, трибутилцитрат, пропанилтриацетат и касторовое масло. Подходящий энтеросолюбильный материал включает сукцинат ацетатгидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCAS), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), фталат ацетата целлюлозы (CAP), поливинилфталевый ацетат (PVPA), Eudragit^TM и щеллак.

Подходящие пероральные составы включают также синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, сформированный с любыми из следующих: микрогранулы (см., например, патент США 6458398); бидеградируемые макромеры (см., например, патент США 6703037); биодеградируемые гидрогели (см., например, Graham and McNeil (1989) Biomaterials 5:27-36); отдельные биодеградируемые векторы (см., например, патент США 5736371); биодеградируемые содержащие лактон полимеры, (см., например, патент США 5631015); полимеры, обеспечивающие замедленное высвобождение протеина, (см., например, патент США 6699504; Relias Technologes, Inc.); блоксополимер поли(лактид-гликолид)/полиэтиленгликоля (см., например, патент США 6630155); Atrix Laboratories, Inc.,); композиции, включающие биосовместимый полимер и диспергированные в полимере частицы стабилизированного катионом металла агента, (см., например, патент США 6379701; Alkermers Controlled Therapeutics, Inc); или микросферы (см., например, патент США 6303148); Octoplus, B.V.).

Пригодные пероральные составы включают также синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, сформированный с любым из: носителем, таким как Emisphere^® (Emisphere Technologies, Inc.); TIMERx гидрофильной комбинированной матрицей из ксантановой смолы и смолы рожкового дерева, которая в присутствии декстрозы образует в воде крепкий связующий гель (Penwest); Geminex^TM (Penwest); Procise^TM (GlaxoSmithKline); SAVIT^TM(Mistral Pharma Inc.); RingCap^TM(Alza Corp.); Smartrix^® (Smatrix Technologies, Inc.); SQZgel^TM(MacroMed, Inc.); Geomatrix^TM(Skye Pharma, Inc); Oros^® Tri-layer (Alza Corporation); и тому подобное.

Подходят для использования также такие составы, которые описаны в патентах США 6296842 (Alkermes Controlled Therapeutics, Inc.); 6187330 (Scios, Inc.); и подобные.

Составы для пероральной доставки

Настоящее изобретение касается также фармацевтических композиций, включающих синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазорезистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный, протеазорезистентный полипептидный вариант; и фармацевтический эксципиент, пригодный для пероральной доставки.

Для пероральных препаратов синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант одни или в комбинации с подходящими добавками формуют в таблетки, порошки, гранулы или капсулы, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный или картофельный крахмал; со связующими, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, камедь, кукурузный крахмал или желатин; с дезинтеграторами, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или натрий карбоксиметилцеллюлоза; с лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния; и, при желании, с разбавителями, буферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами и ароматизаторами.

Стандартные лекарственные формы для перорального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, могут быть изготовлены таким образом, что каждая дозируемая единица, например, полная чайная ложка, полная столовая ложка, таблетка содержит предварительно определенное количество композиции, содержащей один или более активных компонентов.

В некоторых воплощениях изобретения объект композиция для пероральной доставки включает энтеросолюбильный покрывающий материал. Пригодный энтеросолюбильный покрывающий материал включает сукцинат ацетатгидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCAS), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), фталат ацетата целлюлозы (CAP), поливинилфталевый ацетат (PVPA), Eudragit и шеллак.

В одном не ограничивающем изобретение примере подходящего перорального состава синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант могут быть сформированы вместе с одним или более фармацевтическими эксципиентами и покрыты энтеральным покрытием, как описано в патенте США 6346269. Например, ядро, включающее фармацевтически приемлемые эксципиенты, покрывают раствором, включающим растворитель, известный гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант и стабилизатор, с образованием покрытого активным агентом ядра; на покрытое активным агентом ядро наносят нижний покрывающий слой, который затем покрывают энтеральным покрывающим слоем. Ядро в основном включает фармацевтически не активные компоненты, такие как лактоза, крахмал, маннит, натрийкарбокси-метилцеллюлоза, натрийгликолят крахмала, хлорид натрия, хлорид калия, пигменты, соли альгиновой кислоты, тальк, двуокись титана, стеариновую кислоту, стеарат, микрокристаллическую целлюлозу, глицерин, полиэтиленгликоль, триэтилцитрат, трибутилцитрат, пропанилтриацетат, двухосновный фосфат кальция, трехосновный фосфат натрия, сульфат кальция, циклодекстрин и касторовое масло. Подходящие для активного агента растворители включают водные растворители. Пригодные стабилизаторы включают щелочные и щелочно-земельные металлы, основные фосфаты и соли органических кислот и органические амины. Нижний покрывающий слой включает один или более адгезивов, пластификатор и агент против слеживания. Пригодные агенты против слеживания включают тальк, стаериновую кислоту, стеарат, стеарил фумарат натрия, глицерил бегенат, каолин и аэросил. Подходящие адгезивы включают поливинилпирролидон (PVP), желатин, гидроксиэтилцеллюлозу (НЕС), гидроксипропилцеллюлозу (НРС), гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), винилацетат (VA), поливиниловый спирт (PVA), метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу (ЕС), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), фталат ацетата целлюлозы (CAP), ксантановую смолу, альгининовую кислоту, соли альгининовой кислоты, Eudragit^TM, сополимер метилакриловой кислоты и метилметакрилата с фталатполивинилацетатом (PVAP). Подходящие пластификаторы включают глицерин, полиэтиленгликоль, триэтилцитрат, трибутилцитрат, пропанилтриацетат и касторовое масло. Подходящий энтеросолюбильный материал включает сукцинат ацетатгидроксипропилметилцеллюлозы (НРМС-AS), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), фталат ацетата целюллозы (CAP), поливинилфталевый ацетат (PVPA), Eudragit^TM и шеллак.

Подходящие пероральные составы включают также синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант, сформированные с любым из: микрогранулами (см., например, патент США 6458398); бидеградируемыми макромерами (см., например, патент США 6703037); биодеградируемыми гидрогелями (см., например Graham and McNeil (1989) Biomaterials 5:27-36); отдельными биодеградируемыми векторами (см., например, патент США 5736371); биодеградируемыми содержащими лактон полимерами, (см., например, патент США 5631015); полимерами, обеспечивающими замедленное высвобождение протеина, (см., например, патент США 6699504; Relias Technologes, Inc.); блоксопо-лимером поли(лактид-гликолид) / полиэтиленгликоля (см., например, патент США 6630155); Atrix Laboratories, Inc.,); композицией, включающей биосовместимый полимер и диспергированные в полимере частицы стабилизированного катионом металла агента (см., например, патент США 6379701; Alkermers Controlled Therapeutics, Inc); и микросферами (см., например, патент США 6303148); Octoplus, B.V.).

Пригодные пероральные составы включают также синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант, сформированные с любым из следующих: носителем, таким как Emisphere^® (Emisphere Technologies, Inc.); TIMERx гидрофильной комбинированной матрицей из ксантановой смолы и смолы рожкового дерева, которая в присутствии декстрозы образует в воде крепкий связующий гель (Penwest); Geminex^TM (Penwest); Precise^TM (GlaxoSmithKline); SAVIT^TM(Mistral Pharma Inc.); RingCap^TM(Alza Соф.); Smartrix^® (Smatrix Technologies, Inc.); SQZgel^TM(MacroMed, Inc.); Geomatrix^TM(Skye Pharma, Inc); Oros^® Tri-layer (Alza Corporation); и тому подобное.

Подходят для использования также такие составы, которые описаны в патентах США 6296842 (Alkermes Controlled Therapeutics, Inc.); 6187330 (Scios.Inc.); и подобные.

Пригодными для использования являются также составы, включающие агент, повышающий всасывание в кишечнике. Подходящие повышающие всасываемость в кишечнике агенты включают, но не ограничиваются ими, хелаты кальция (например, цитрат, этилендиаминтетрауксусная кислота);

поверхностноактивные вещества (например, додецилсульфат натрия, желчные соли, пальмитоилкарнитин и натриевые соли жирных кислот); токсины (например, токсин, блокирующий малую зону); и тому подобное.

В одном воплощении изобретения синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, известный гипергликозилированный полипептидный вариант, известный протеазо-резистентный полипептидный вариант или известный гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант присутствует в первой единичной лекарственной форме состава для пероральной доставки. Известный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа, гипергликозилированный полипептидный вариант, протеазо-резистентный полипептидный вариант или гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант представляет собой вариант родительского терапевтического протеина. В этом воплощении изобретения первая единичная лекарственная форма включает первое число молей известного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированный полипептидный вариант, протеазо-резистентный полипептидный вариант или гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант. Родительский терапевтический протеин является одним, который обычно вводят в дозе второго числа молей родительского терапевтического протеина во второй единичной лекарственной форме, где вторая единичная лекарственная форма является формой с немедленным высвобождением, например, составом с немедленным высвобождением, который пригоден для подкожных инъекций. Родительский терапевтический протеин доставляется с помощью подкожных болюсных инъекций при выбранной частоте дозирования. Родительский терапевтический протеин как доказано может быть эффективен при лечении расстройств у пациента при его введении пациенту во второй единичной лекарственной форме путем подкожной болюсной инъекции при выбранной частоте дозирования. Первое число молей в первой единичной лекарственной форме больше, чем второе число молей во второй единичной лекарственной форме. При этом, при пероральном введении пациенту первой единичной лекарственной формы, временной период высвобождения первого числа молей известного гипергликозилированного, протеазо-резистентного полипептидного варианта первой единичной лекарственной формой не больше, чем интервал времени между дозами родительского терапевтического протеина при выбранной частоте дозирования.

В другом аспекте изобретения пероральная фармацевтическая композиция настоящего изобретения включает первую дозу известного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированный полипептидный вариант, протеазо-резистентный полипептидный вариант или гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант в первой единичной лекарственной форме. В этих воплощениях изобретения родительский терапевтический протеин является таким, который обычно вводят во второй дозе родительского протеина в парентеральной фармацевтической композиции, где парентеральная фармацевтическая композиция является композицией с немедленным высвобождением, например, композицией с немедленным высвобождением для болюсной инъекции второй дозы при выбранной частоте дозирования. Как доказано, родительский терапевтический протеин эффективен при лечении заболевания при его введении пациенту посредством подкожной болюсной инъекции в парентеральной формацевтической композии, где пациент получает вторую дозу родительского терапевтического протеина при выбранной частоте дозирования. При пероральном введении пациенту первой дозы известного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазо-резистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта время, необходимое для высвобождения всего количества известного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазо-резистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта в первой дозе, не больше, чем время между дозами в выбранном интервале дозирования. Количество известного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазо-резистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта в молях лекарственного вещества на килограмм веса тела пациента в первой дозе больше, чем количество родительского терапевтического протеина в молях лекарственного вещества на килограмм веса тела пациента во второй дозе, где первая и вторая дозы рассчитаны для пациента среднего веса в общей популяции страдающих от заболевания пациентов.

В некоторых воплощениях изобретения вторая доза является дозой, зависящей от веса тела пациента, и первая доза в молях лекарственного вещества больше, чем продукт второй дозы в молях лекарственного вещества на килограмм веса тела пациента, умноженных на средний вес тела пациента (например, 75 кг).

В других воплощениях изобретения вторая доза является стратифицированной в зависимости от веса тела пациента, то есть вторая доза выбирается из набора двух или более доз, стратифицированных в зависимости от веса тела пациента (например, 1000 мг лекарственного вещества для пациентов, имеющих вес ≤75 кг, и 1200 мг для пациентов, имеющих вес >75 кг), и первая доза больше в молях лекарственного вещества, чем наибольшая доза набора стратифицированных в зависимости от веса тела пациента ДОЗ.

Еще в других воплощениях изобретения вторая доза является фиксированной дозой и первая доза больше, чем вторая доза в молях лекарственного вещества.

В одном, не ограничивающем изобретение примере, изобретение касается любых пероральных фармацевтических композиций, используемых для перорального введения известного синтетического полипептидного агониста рецептора IFN-α, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазо-резистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта в описанном ниже, в разделе «Методы лечения, использующие IFN-α», способе лечения.

В другом, не ограничивающем изобретение примере, изобретение касается любых пероральных фармацевтических композиций, используемых для перорального введения известного синтетического полипептидного агониста рецептора IFN-β настоящего изобретения, известного гипергликозилированного полипептидного варианта, известного протеазо-резистентного полипептидного варианта или известного гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта в описанном ниже, в разделе «Методы лечения, использующие IFN-β», способе лечения.

В другом, не ограничивающем изобретение примере, изобретение касается любых пероральных фармацевтических композиций, используемых для перорального введения известного синтетического полипептидного агониста рецептора IFN-γ настоящего изобретения, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазо-резистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного протеазо-резистентного полипептидного варианта в описанном ниже, в разделе «Методы лечения, использующие IFN-γ», способе лечения.

Пероральные составы с пептидным носителем

Дополнительные пероральные составы, пригодные для указанного использования, включают известный заявляемый синтетический вариант полипептида рецептора интерферона типа 1, известный гипергликолизированный полипептидный вариант, или известный гипергликолизированный, протеазо-резистентный полипептидный вариант смешанный с носителем для пероральной доставки, как описано в WO 03/066859. Например, пригодная пероральная форма включает желательный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона типа 1, гипергликолизированный полипептидный вариант, протеазо-резистентный полипептидный вариант, или гипергликозилированный протеазо-резистентный полипептидный вариант; и проникающий пептид (также называемый как "пептидный носитель"). Проникающим пептидом является любой пептид, который облегчает транслокацию вещества вдоль биологического барьера, например, эпителиального слоя выстилающего желудочно-кишечный тракт. Пригодные пептидные носители включают те носители, которые являются производными от различных протеинов, включающих, но не ограниченных ими, интегральный мембранный протеин, бактериальный токсин, непатогенные бактерии, вирусный протеин, экстраклеточный протеин и подобные протеины. Аминокислотная последовательность пептидного носителя может быть той же самой, как и аминокислотная последовательность пептида природного происхождения, или может быть измененной версией такого пептида (например, включать одно или более аминокислотных замещений в пептиде природного происхождения)

Пептидные носители включают от 10 до 30 аминокислот в длину, например от 10 до 15 аминокислот, от 15 до 20 аминокислот, от 20 до 25 аминокислот, или от 25 до 30 аминокислот в длину.

Пригодные пептидные носители включают, но не ограничены одним любым пептидом 1-34, как показано в таблице 9, ниже (SEQ ID NOs: 1311-1326).

Таблица 9 Пептид/Организм Последовательность Пептид 1: из ORF H10638 Haemophilus influenzae NYHDIVLALAGVCQSAKLVHQLA Пептид 2: из РМ 1850 Pasteutrella multoclda NYYDITLALAGVCQAAKLVQQFA Пептид 3: из YCFC Escherichia coli NYYDITLALAGICQARLVQQLA Пептид 4: из VCI127 Vibrio cholerae AIYDRTIAFAGICQAVALVQQVA Пептид 5: из BU262 Buchnera aphidicola KIHLITLSLAGICQSAHLVQQLA Пептид 6: из РА2627 Pseudomonas acruginasa DPRQQLIALGAVFESAALVDKLA Пептид 7: из ХР1439 Xylella fastidiasa LIDNRVLALAGVVQALQQVRQLA Пептид 8: из MLRO 187 Rhizoblum loti NLPPIVLAVIGICAAVFLLQQYV Пептид 9: из Рецептора человека NK-2 NYFIVNLALADLCMAAFNAAFNF Пептид 10: из CPN0710/C Chlamydia pneumoniae TAFDFNKMLDGVCTYVKGVQQY
L Пептид 11: из MLR4119 RA1LIPLALAGLCQVARAGDISS Rhizoblum loti   Пептид 12: из NprB bacillus subillis MRNLTKTSLLLAGLCTAAQMVFV TH Пептид 13: из Pilin Kingella dentrificans IELMIVIAIIGILAAIALPAYQEYV Пептид 14: из Pilin Eikenella corrodens reLMrVIAnOILAAIAU»AYQOYV Пептид 15: из zonula occludens toxin (ZOT) ASFGFCIGRLCVQDGF Пептид 29: из Рецептора человека NK-1 NYFLVNLAFAEASMAAFNTVVNF Пептид 30: из YCFC Escherichia coli MNYYDITLALAGICQSARLVQQL A Пептид 31: из YCFC Escherichia coli MYYDITLALAGICQSARLVQQLA Пептид 32: из YCFC Escherichia coli MYDITLALAGICQSARLVQQLA Пептид 33: из NprB Bacillus subtilis MRNLTRTSLLLAGLCTAAQMVFV Пептид 34: из ORF NI0638 Haemophilus influenzae NYHDIVLALAGVCQSARLVHQLA

Природные пептидные носители также включают варианты любого одного пептида 1-34, как показано в таблице 9, например, вариант, который отличается от одного любого пептида 1-34 от одной до пяти аминокислот; и фрагменты любого одного пептида 1-34. Варианты любого одного пептида 1-34 включают те варианты, которые имеют от одного до пяти консервативных аминокислотных замещений любого одного пептида из 1-34. Фрагменты любого одного пептида из 1-34 включают фрагменты, содержащие от 10 до 15 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, фрагментов, содержащих от 15 до 20 непрерывно следующих друг за другом аминокислот, фрагменты, содержащие от около 20 до около 25 непрерывно следующих друг за другом аминокислот любого одного пептида из 1-34.

Пептидный носитель может быть "ассоциированным с" (также называемым здесь "слитым с", "спаренным с", "связанным с" или "прикрепленным к") желаемым синтетическим рецептором интерферона типа 1, гипергликозилированным, протеазо-резистентным, или гипергликозилированным, протеазо-резистентным протеином любым из методов, включающих, например, ковалентное взаимодействие, ионное взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, водородную связь или другой тип ассоциации (например, взаимодействие посредством Вандер-Ваальсовых сил; неспецифическая ассоциация благодаря предпочтительному растворителю; и подобное). Прикрепление пептидного носителя к желательному протеину достигается любым химическим, биохимическим, энзиматическим, или генетическим методом спаривания, известным из предшествующего уровня техники.

Если пептидный носитель спаривается с желательным синтетическим рецептором интерферона типа 1, гипергликозилированным, протеазо-резистентным, или гипергликозилированным, протеазо-резистентным протеином, типично N-конец желательного протеина спаривается с карбоксильным концом пептидного носителя. Желательный синтетический рецептор интерферона типа 1, гипергликозилированный, протеазо-резистентный или гипергликозилированный, протеазо-резистентный протеин могут быть спарены с пептидным носителем непосредственно или косвенно, например, посредством ковалентного связывания. Например, ковалентная связь может быть пептидной связью, или ковалентное связывание может достигаться гомо- или гетеро-функциональным связывающим реагентом. Связывающим реагентом может быть сукцинимидил-(N-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилатный (SMCC) тип носителя. Ковалентное связывание может достигаться с использованием пептидного линкера.

В некоторых воплощениях изобретения, желательный синтетический рецептор интерферона типа 1, гипергликозилированный, протеазо-резистентный или гипергликозилированный, протеазо-резистентный протеин спариваются с пептидным носителем посредством линкерного пептида, который может быть расщепляемым. Линкерный пептид может включать любое разнообразие аминокислотных последовательностей. Протеины могут быть связаны спейсерным пептидом обычно гибкой структуры, хотя и другие химические связи не исключены. В настоящее время полагают, что наиболее полезные линкерные последовательности будут преимущественно пептидами между от около 6 до около 40 аминокислот в длину, или между от около 6 до около 25 аминокислот в длину. Эти линкеры в основном получаются с использованием синтетических, линкер-кодирующих олигонуклеотидов, используемых для спаривания с протеинами. Предпочтительны пептидные линкеры с некоторой степенью гибкости. Линкерные пептиды могут иметь виртуальные любые аминокислотные последовательности, имея в виду, что предпочтительные линкеры будут иметь последовательности, которые приведут обычно к гибкому пептиду. Использование небольших аминокислот, таких как глицин и аланин, полезно для создания гибкого пептида. Создание таких последовательностей является рутиной работой исходя из предшествующего уровня техники. Рассматривается разнообразие различных коммерчески пригодных линкеров для использования согласно настоящему изобретению.

Известно, что аминокислотные последовательности богатые аланиновыми и пролиновыми остатками являются важными для гибкости мультидоменовых протеиновых структур. Например, такие последовательности связывают домены так называемых Е2 компонентов 2-оксодегидрогеназных кислотных комплексов, таких как пируват дегидрогеназный комплекс и 2-оксо глутарат дегидрогеназный комплекс. Аланинпролин обогащенные области также найдены в легких цепях миозина. Типичные линкеры, используемые по изобретению, имеют комбинации глициновых, аланиновых, пролиновых и метиониновых остатков, таких как AAAGGM (SEQ ID NO:1332); AAAGGMPPAAAGGM (SEQ ID NO:1333); AAAGGM (SEQ ID: 1334) и PPAAAGGM2 (SEQ ID NO:1335). Другие типичные линкерные пептиды включают IEGR (SEQ ID NO:1336); который может расщепляться фактором Ха) и GGKGGK (SEQ ID NO: 1337). Однако любые гибкие линкеры в основном могут быть использованы длиной в промежутке между аминокислотами от примерно 6 до примерно 40 аминокислот. Линкеры могут иметь виртуально любые последовательности, которые в результате приведут к созданию гибкого пептида, включая аланин-пролин обогащенные последовательности типа последовательностей, приведенных выше.

В некоторых воплощениях желательный синтетический рецептор интерферона типа 1 представляет собой гипергликозилированный, протеазо-резистентный или гипергликозилированный, протеазо-резистентный протеин, спаренный с пептидным носителем через линкерный пептид, который расщепляется пептидом. В некоторых воплощениях энзим удобно активируется при особых физиологических условиях.

В других воплощениях желательный синтетический рецептор интерферона типа 1, гипергликозилированный, протеазо-резистентный или гипергликозилированный, протеазо-резистентный протеин спариваются с пептидным носителем через нековалентную связь, где нековалентная связь достигается приклеплением гидрофобной части к пептидному носителю таким образом, что гидрофобная часть дает возможность пептидному носителю быть включенным в поверхность гидрофобной везикулы, в которой находится желательный синтетический рецептор интерферона типа 1, гипергликозилированный, протеазо-резистентный или гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептид. В других воплощениях нековалентная связь является нековалентной, высокоаффинной связью, такой как биотин-авидиновая или биотин-стрептавидиновая связь.

Пептиды могут быть синтезированы химически или энзиматически, могут быть произведены рекомбинантным методом, могут быть выделены из природного источника или комбинированием методов. Пептиды могут быть выделены из природных источников с использованием стандартных методов очистки белков, известных из предшествующего уровня техники, включая, но не ограничиваясь ими, жидкостную хроматографию высокого разрешения, эксклюзивную хроматографию, гель-электрофорез, аффинную хроматографию или другие методы очистки. Можно использовать технику твердофазного синтеза, где такая техника также хорошо известна из предшествующего уровня техники. Смотри Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994). В основном в таких методах пептид получают посредством последовательного добавления активированных мономерных единиц к твердой фазе, связанной с наращиванием пептидной цепи. Также для производства пептидов могут быть использованы хорошоразработанные рекомбинантные ДИК технологии.

Типичная пероральная форма включает энтерально покрытые таблетки и желатиновые капсулы, которые включают пептидный носитель; и желательный синтетический рецептор интерферона типа 1, гипергликозилированный, протеазо-резистентный или гипергликозилированный, протеазо-резистентный полипептид; и один или более: а) разбавитель, например, лактозу, декстрозу, сахарозу, маннит, сорбит, целлюлозу и/или глицин; b) протеазный ингибитор, такой как аротинин или тразилол; с) смазывающее вещество, например, кремний, тальк, стеариновую кислоту их магниевые и кальциевые соли, полоксамер или полиэтиленгликоль; d) связывающее вещество (например, для таблеток), например, алюмосиликат магния, крахмальная паста, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон; е) ионное поверхностно-активное вещество, такое как желчные кислоты; f) разрыхлители, например, крахмалы, агар, альгиновая кислота или ее натриевая соль, или шипучие смеси; и g) один или более адсорбентов, краситель, корректор вкуса и подсластитель. В некоторых воплощениях пероральная форма далее включает один или более консервантов, стабилизатор, увлажнитель, эмульгирующий агент, промотор растворения, соль и буфер.

Пероральная форма в некоторых воплощениях изобретения далее включает один или более неионных детергентов, ионный детергент, протеазный ингибитор и восстанавливающий агент. Неионный детергент может быть полоксомером, таким как Pluronic F-68; ионный детергент может быть солью желчной кислоты, такой как тауродезоксихолат; протееазный ингибитор может быть апротинином или ингибитором трипсина из соевых бобов; восттанавливающий агент может N-ацетил-L-цистеином.

Комбинированные композици

Настоящее изобретение описывает также фармацевтическую композицию, включающую синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, который является гликозилированным; гликозилированный IFN-γ; и фармацевтически приемлемый эксципиент. В некоторых воплощениях изобретения гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированный IFN-γ смешивают в совместный состав. В некоторых воплощениях изобретения гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированный IFN-γ смешивают в отдельный жидкий состав, который помещают в отдельный резервуар для использования в устройстве для доставки лекарственных веществ. В некоторых воплощениях изобретения гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированный IFN-γ входят в композицию, пригодную для доставки путем инъекций. В других воплощениях изобретения гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированный IFN-γ входят в композицию, пригодную для пероральной доставки. Композиции для пероральной доставки включают описанные выше составы.

Настоящее изобретение описывает также фармацевтическую композицию, включающую разовую дозу гликозилированного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и разовую дозу гликозилированного IFN-γ, достаточные для применения в любом описываемом здесь методе, который использует совместное введение гликозилированного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированного IFN-γ при лечении пациента. В некоторых аспектах настоящее изобретение описывает резервуар для лекарственного вещества или другой контейнер, содержащий гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированный IFN-γ, совместно изотовленные в виде жидкости, где как гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения, так и гликозилированный IFN-γ присутствуют в композиции в пригодном для одной дозы количестве каждый. Количественные дозы здесь описаны. Резервуар может быть выполнен в любом разнообразии форм, включая, но не ограничиваясь ими, патрон, шприц, резевуар устройства для непрерывной доставки и т.д.

В некоторых воплощениях изобретения фармацевтическую композицию, включающую гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения и гликозилированный полипептид IFN-γ, готовят смешиванием (а) фармацевтической композиции, включающей гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа настоящего изобретения в стерильном водном растворе; и (b) фармацевтической композиции, включающей гликозилированный IFN-γ в стерильном водном растворе.

Полинуклеотиды, векторы и хозяйские клетки

[00626] Заявленное изобретение представляет собой нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность, кодирующую заявляемый синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа; векторы, включающие заявленный полинуклеотид; и хозяйские клетки, включающие заявленный полинуклеотид или вектор. Заявленный полинуклеотид используют для создания заявленного экспрессионного вектора и генетически модифицированных хозяйских клеток, которые используют для продуцирования заявленного пептида агониста.

Заявленное изобретение обеспечивают нуклеиновокислотные композиции, кодирующие заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа. Как использовано здесь, термин «композиция нуклеиновой кислоты» охватывает последовательность нуклеиновой кислоты, включающую открытую рамку считывания, которая кодирует заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа и является способной под воздействием соответствующих условий, начать ее экспрессию таким образом, чтобы синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа продуцировался в хозяйских клетках, включающих нуклеиновую кислоту. Этот термин также подразумевает нуклеиновую кислоту, которая является гомологичной или в значительной мере сходной с нуклеиновой кислотой, кодирующей синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа.

Полипептид агониста рецептора интерферона I типа. Как использовано здесь, термин «композиция нуклеиновой кислоты» имеет отношение к композиции, включающей последовательность нуклеиновой кислоты с открытой рамкой считывания, которая кодирует заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа и является способной под воздействием соответствующих условий начать экспрессию таким образом, чтобы синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа продуцировался в клетки хозяина, содержащие нуклеиновую кислоту. Этот термин также подразумевает то, что нуклеиновая кислота является гомологичной или существенно сходной или идентичной нуклеиновой кислоте, кодирующей заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа.

Следовательно, заявленное изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты, включающие нуклеотидные последовательности, кодирующие заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, и нуклеиновые кислоты, обладающие существенной идентичностью с такой нуклеиновой кислотой (т.е. гомологи). Во многих варианта исполнения, заявленная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа и который имеет, по меньшей мере, около 75%; по меньшей мере, около 80%; по меньшей мере, около 85%; по меньшей мере, около 90%; по меньшей мере, около 95%; по меньшей мере, около 98%; по меньшей мере, около 99%; или более, нуклеотидной последовательности, идентичной с нуклеотидной последовательностью (в особенности заявленной полипептид-кодирующей области нуклеотидной последовательности) кодирующей заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа.

В отдельных воплощениях, заявленная нуклеиновая кислота включает нуклеотидные последовательности, кодирующие синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, включающий аминокислотную последовательность как установлено далее в любой одной из SEQ ID NOs:9-19. В отдельных воплощениях, заявленная нуклеиновая кислота включает нуклеотидную последовательность как установлено в любой одной из SEQ ID NOs:24-34.

В отдельных воплощениях, заявленная нуклеиновая кислота включает нуклеотидные последовательности, кодирующие синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, включающий аминокислотную последовательность как установлено далее, в любой из SEQ ID NOs:48-52. В отдельных воплощениях изобретения, заявленная нуклеиновая кислота включает нуклеотидные последовательности, кодирующие синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, включающий аминокислотную последовательность как установлено далее, в любой из SEQ ID NOs:55-59.

Сходной последовательностью является тогда, когда она вычислена на основе референс-последовательности, которая может быть множеством больших последовательностей, таких как консервативный мотив, кодирующая область, фланкирующая область и т.д. и т.п. Референс-последовательность обычно бывает, по крайней мере, около 18 нуклеотидов длиной, обычно, по крайней мере, 30 нуклеотидов длиной, и может быть расширена до полной последовательности, с которой будет сравниваться. Алгоритмы для анализа последовательностей уже известны, это такие как BLAST, описанный Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215:403-10 (использование заменяющих установок, т.е. параметров w=4 и Т=I1).

Также включает нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с вышеописанными нуклеиновыми кислотами в строго контролируемых условиях. Как пример гибридизации, проводимой в строгих условиях, является гибридизация при 50°С или выше, и при 0.1×SSC (15 mM натрия хлорид/1.5 mM натрия цитрат). Другим примером гибридизации, проводимой в строгих условиях, является инкубирование в течение ночи при 42°С в следующем растворе: 50% формамид, 5×SSC (150 mM NaCl, 15 mM тринатрий цитрат), 50 mM натрий фосфат (рН 7.6), 5×раствор Денхарда, 10% декстрана сульфат, and 20 [mu]g/ml денатурированной, разрезанная ДНК спермы лосося, вслед за промыванием фильтров в 0.1×SSC при температуре около 65°С. Строгими условиями гибридизации являются условия гибридизации, которые, по крайней мере, соответствуют вышеприведенным условиям. Другими строгими условиями гибридизации являются известные в уровне техники и могут также быть использованы для идентификации нуклеиновых кислот в частных воплощениях изобретения.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки и полипептиды, заявленного изобретения имеют много воплощений ДНК, включая кДНК. Термин «нуклеиновая кислота синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа», как использовано здесь, соответствует открытой рамке считывания, кодирующей заявленные специфические полипептиды, так же как прилегающий 5'- и 3'-некодирующие нуклеотидные последовательности, вовлеченные в регуляцию экспрессии, например, от 100 bp до около 20 kb за кодирующим регионом, но возможно продвижение в любом направлении. Нуклеиновые кислоты могут быть вставлены в соответствующий вектор для экстрахромосомального поддержания в клетке, или для интеграции в геном хозяина, как описано более детально ниже.

Композиция нуклеиновых кислот заявленного изобретения может кодировать весь или часть заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа. Двойные или одноцепочечные фрагменты могут быть получены из ДНК-последовательностей через химически синтезированные олигонуклеотиды в соответствии с выбранными удобными методами, посредством переваривания рестрикционными эндонуклеазами, посредством амплификации с помощью полимеразной цепной реакции и т.п. способами.

В отдельных воплощениях, заявленная нуклеиновая кислота может быть приготовлены посредством химического синтеза, т.е. использованием синтезатора олигонуклеотидов, когда олигонуклеотиды выбираются на основе аминокислотной последовательности желательного полипептида, и во многих воплощениях, выбирая кодоны, которые наиболее подходят к клетке-хозяину, в которой рекомбинантный полипептид будет синтезироваться.

Для примера, отдельные небольшие олигонуклеотиды, для кодирования участков желательных полипептидов, могут быть синтезированы и собраны посредством PCR, лигирования или реакции лигирования цепей (LCR). Индивидуальные олигонуклеотиды обычно содержат 5'- или 3'-концы для комплементарной сборки. После сборки нуклеотидную последовательность, кодирующую заявленный полипептид, вставляют в рекомбинантный вектор под контролем последовательности, необходимой для экспрессии заявленных нуклеиновых кислот, и последующей продукции заявленного полипептида в желательных трансформированных клетках.

В отдельных воплощениях изобретения, заявленная нуклеиновая кислота может быть создана таким образом, что, по крайней мере, около 10%; по крайней мере, около 20%; по крайней мере, около 30%; по крайней мере, около 40%; по крайней мере, около 50%; по крайней мере, около70%; по крайней мере, около80%; или, по крайней мере, около 90%, или более, кодонов, которые предпочтительны в последовательностях ДНК человека. См., например, табл.8 (ниже).

Заявленные молекулы нуклеиновой кислоты в основном размножают через включение в молекулярный вектор. Используются вирусные и не вирусные векторы, включая плазмидный. Выбор плазмиды будет зависеть от типа клетки, в которой предпочтительно размножение нуклеиновой кислоты и цели ее размножения. Отдельные векторы используют для амплификации и приготовления больших количеств желаемой последовательности ДНК.

Представленное изобретение далее касается рекомбинантных векторов ("конструкций"), включающих заявленный полинуклеотид. Рекомбинантные векторы включают векторы, используемые для размножения заявленного полинуклеотида, и экспрессионные векторы. Рекомбинантные векторы являются пригодными для размножения заявленных полинуклеотидов (клонирующие векторы). Заявленный рекомбинантный экспрессионный вектор является необходимым для эффективной экспрессии заявленного полинуклеотида в клетке, например, для продуцирования заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа. Выбор соответствующего вектора хорошо представлен в предшествующем уровне технике. Многие такие векторы коммерчески доступны.

Экспрессионные векторы пригодны для экспрессии в клеточных культурах. Такие векторы обычно включают регуляторные последовательности ("контролирующие последовательности" или "контролирующие области"), которые необходимы для эффективной экспрессии заявленного полинуклеотида, с которым они оперативно связаны. Кроме того, другие векторы могут быть использованы для переноса и экспрессии в клетках в целом организме или пациенте.

Экспрессионные векторы обычно имеют удобные сайты рестрикции, расположенные вблизи промоторных последовательностей, обеспечивающих экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих гетерологичные белки. Могут быть представлены селекционные маркеры, показывающие экспрессию в хозяине. Экспрессионные векторы могут быть использованы для продукции слитых белков, где экзогенный слитый пептид дополнительно обеспечивает функциональное назначение заявленного, т.е. увеличивает синтез белка клеткой, повышает его стабильность, реакцию с антисывороткой. В качестве энзимного маркера может использоваться, например, [бета]-галактозидаза, люцифераза и т.п.

Экспрессионные кассеты могут быть приготовлены таким образом, что быони включали область инициации транскрипции, промоторный регион (например, промотор, который функционирует в эукариотической клетке), заявленный полинуклеотид, и регион терминации транскрипции. После интродукции ДНК клетки, содержащие конструкцию, могут быть селекционно отобраны с помощью селекционного маркера, клетки размножают и затем используют для экспрессии.

Экспрессионные кассеты могут быть интродуцированы в различные векторы, например, плазмиды, [0758] ВАС, НАС, YAC, бактериофаги такие как лямбда, P1, M1 3 и т.п. вирусы животных или растений, и подобные, где векторы обычно охарактеризованы посредством их способности обеспечивать селекцию клеток, включающих вектор экспрессии. Векторы могут обеспечивать экстрахромосомальное существование гена, особенно когда в качестве векторов используются плазмиды или вирусы; или предназначаться для интеграции в хромосому хозяина. Когда желательно экстрахромосомальное существование гена, заявляемую последовательность реплицируют с помощью плазмиды, которая может быть с низким или высоким числом копий. Большое разнообразие доступных маркеров для селекции, в частности тех, что защищают против токсических веществ, и в особенности против антибиотиков. Селективный маркер, который выбирается и который для селекции в соответствии с природой хозяина; в некоторых случаях может быть использована комплементация с ауксотрофными хозяевами. Введение ДНК-конструкции в клетку хозяина может быть достигнуто с помощью удобного метода, например, конъюгации, бактериальной трансформации, кальций-преципитации ДНК, электропорации, слияния, трансфекции, инфекции посредством вирусных векторов и т.п.

Общие аспекты трансформации клеточных систем млекопитающих были описаны Axel в U.S. Pat. No. 4,399,216, опубликованном 16 августа 1983. Трансформация в дрожжи осуществляется обычно по типовому способу Van Solingen et al., J. Bact., 130: 946 (1977) и Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76: 3829 (1979). Оптимизированный способ кальцийфосфатной трансфекции клеток эукариотического хозяина описан Wumi и Jordan в U.S. Pat. Nos. 5,484,720 and 5,593,875. Тем не менее, могут быть использованы и другие способы введения ДНК в клетки, среди них такие как введение ДНК посредством инъекции в ядро, электропорация или слияние протопластов.

Представленное изобретение позволяет генетически модифицировать клетки хозяина, которые могут быть изолированы от клеток хозяина, вводя в них заявленный полинуклеотид или в отдельных воплощениях, заявленный экспрессионный вектор. Подходящие клетки хозяев включают прокариоты, такие как Е. coli, В. subtilis; эукариоты; клетки насекомых в комбинации с бакуловирусными векторами; клетки дрожжей, таких как Saccharomyces cerevisiae; или клетки высших организмов, таких как позвоночные, включая амфибий (например, ооциты Xenopus laevis); и млекопитающих, например, COS клетки, СНО клетки, НЕК293 клетки, МА-10 клетки, и подобные, могут быть использованы для экспрессии клеток хозяев. Клетки хозяев могут быть использованы для целей размножения заявленного полинуклеотида, для продукции синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа. Во многих воплощениях изобретения, в качестве клеток хозяина используют клетки эукариотического хозяина. В частности, во многих воплощениях изобретения, используют эукариотические клетки хозяина, которые способны гликозилировать белки.

Клетки млекопитающих используют для синтеза заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, которые могут культивироваться во многих различных средах. Для культивирования таких клеток используют коммерчески доступные среды, такие как Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium [(MEM), Sigma], RPMI-1640 (Sigma), и Dulbecco's Modified Eagle's Medium [(DMEM), Sigma)]. В качестве дополнения могут быть использованы среды, описанные Ham и Wallace, Meth. Enz., 58: 44 (1979); Bames и Sato, Anal Biochem., 102: 255 (1980); U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; или U.S. Pat. No.4,560,655; WO 90/03430; WO 87/00195; U.S. Pat. Re. No. 30,985; или U.S. Pat. No. 5,122,469. Все среды, описанные в этих источниках, могут быть использованы как культуральная среда для клеток-хозяев. Любая из этих сред может быть обогащена как это необходимо гормонами и/или другими ростовыми факторами (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как натрия хлорид, кальций, магний и фосфаты), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), антибиотиками (такими как гентамицин), следовыми элементами (определяются как неорганические компоненты, обычно представленные конечными концентрациями в микромолярном интервале) и глюкозой или эквивалентным ей источником энергии. Любые другие необходимые добавки могут быть также включены в соответствующих концентрациях, в соответствии со знаниями квалифицированного специалиста. Условия культивирования, такие как температура, рН и подобные, ранее использованные для экспрессии селекционированных хозяйских клеток и понятные квалифицированному специалисту как очевидные из предшествующего уровня техники.

Композиции антител

Также предусмотрены антитела, которые являются специфичными к заявленному синтетическому полипептиду агониста рецептора интерферона I типа. Подходящие антитела были получены путем иммунизации животного-хозяина пептидами, включающими заявленный протеин полностью либо его часть. В число подходящих животных-хозяев включены мыши, овцы, крысы, козы, хомяки, кролики и др. Во многих воплощениях заявленные антитела были изолированы; и во многих воплощениях заявленные антитела были очищены.

Иммуноген может включать целый протеин или его производные и фрагменты. Типовые иммуногены включают весь протеин или его части, если они прошли пострансляционную модификацию, обнаруженную у нативного целевого протеина. Иммуногены создаются различными путями, известными для специалиста из уровня техники, например, экспрессией клонированных генов, используя подходящие рекомбинантные методы, химический синтез, химический синтез полипептидов агониста рецептора интерферона I типа и т.п.

Для приготовления поликлональных антител, первым этапом была иммунизация животного-хозяина целевым белком, когда целевой протеин был в высокоочищенной форме, включающей менее чем 1% контаминирующих примесей. Иммуноген может включать полный целевой белок, его фрагменты и производные. Для увеличения иммунного ответа животного-хозяина, целевой белок может быть в комбинации с адъювантами, включающими алюминий, декстран сульфат, большие полимерные анионы, масляные и водные эмульсии, например, адъювант Фрейнда, полный адъювант Фрейнда и подобные. Целевой белок может также быть конъюгирован с синтетическим носителем белков или синтетическими антигенами. Для образования поликлональных антител могут быть иммунизированы различные хозяева. Такие хозяева включают кроликов, морских свинок, грызунов, например, мышей, крыс, козлов, баранов и т.п. Целевой белок вводится хозяину обычно подкожно, с первоначальной дозой, вводимой однократно или более, обычно, по крайней мере, дважды, с дополнительной бустерной дозой. После иммунизации у животного берут кровь, затем отделяют сыворотку от клеток крови. Иммуноглобулины (Ig), представленные в полученной антисыворотке, могут быть в дальнейшем фракционированы с использованием известных методов, таких как фракционирование сульфатом аммония, DEAE-хроматографии и подобных.

Моноклональные антитела нарабатывают известными приемами. Обычно, источником плазматических клеток были селезенка и/или лимфатические узлы иммунизированного животного-хозяина. Плазматические клетки были иммортализованы посредством слияния с клетками миеломы для образования гибридомных клеток. Культуральный супернатант индивидуальных гибридом был исследован с использованием стандартных приемов для идентификации тех из них, которые продуцируют антитела желаемой специфичности. Подходящими животными для продуцирования моноклональных антител к белку человека являются мыши, крысы, хомячки и т.п. Для получения антител к мышиному белку использовали хомячков, морских свинок, кроликов и т.п. Антитела могли быть очищены из супернатанта гибридомных клеток или асцитической жидкости стандартными приемами, например, аффинной хроматографией, используя протеин, связанный с нерастворимой подложкой, протеин-А-сефарозу и т.п.

Антитела могут продуцироваться как отдельные цепи вместо нормальных мультимерных структур. Одноцепочечные антитела описаны в работе Jost et al. (1994) J Biol. Chem. 269:26267-73 и других авторов. ДИК последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелых цепей и вариабельные области легких цепей, лигировали с помощью спейсера, закодированного таким образом, что он включает, по крайней мере, четыре небольшие нейтральные аминокислоты, глицин и/или серии. Белок, кодированный этим слиянием, позволяет собирать функционально вариабельный регион, который сохраняет специфичность и аффинность первоначального антитела.

Представляют интерес отдельные воплощения гуманизированных антител. Метод гуманизации антител известен специалистам из уровня техники. Гуманизированные антитела могут быть продуктом животных, имеющих гены с константным регионом человеческого иммуноглобулина (см. International Patent Applications WO 90/10077 и WO 90/04036). Альтернативно, такие антитела могут быть сконструированы посредством технологий рекомбинантной ДНК путем замены СН1, СН2, СН3, шарнирных доменов, и/или каркасного домена на соответствующие последовательности из генома человека (см. WO 92/02190).

Использование Ig кДНК для конструирования химерных иммуноглобулиновых генов, уже известно [Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439 и (1987) J. Immunol. 139:3521]. мРНК, изолированная из гибридомы или других клеток, продуцирующих антитела, была использована для получения кДНК. Интересующая кДНК может быть амплифицирована посредством ПЦР с использованием специфического праймера (U.S. Patent nos. 4,683,195 и 4,683,202). Альтернативно, может быть получена библиотека и выбран изолят с интересующей последовательностью. Полученную последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, затем сливают с человеческой константной последовательностью. Последовательности константных регионов человеческих генов могут быть найдены в Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Предпочтительно используются гены С региона людей из известных клонов. Выбор изотипа происходит по критериям желательной эффекторной функции, такой как фиксация комплемента, или активности в антителозависимой клеточной цитотоксичности. Образцовыми изотипами являются IgG1, IgG3 и IgG4. Также могут быть использованы области каппа и лямбда из легкой цепи иммуноглобулина человека. Химерные, гуманизированные антитела затем экспрессируют стандартными методами.

Фрагменты антител, такие как Fv, F(ab')2 и Fab, могут быть приготовлены путем переваривания интактных антител, например, протеазой или химическим агентом. В качестве альтернативы может использоваться усеченный ген. Например, химерный ген, кодирующий часть F(ab')2 фрагмента, включает ДНК-последовательность, кодирующую домен СН1 и регион петли Н-цепи, следующий за трансляционным стоп-кодоном, что позволяет получить усеченную молекулу.

Консенсусные последовательности Н и L J регионов могут быть использованы для выбора олигонуклеотидов, предназначенных для использования в качестве праймеров для введения нужных рестрикционных сайтов в J регион для последующего связывания сегментов V региона с сегментами человеческого С региона. кДНК С региона может быть модифицирована посредством сайт-направленного мутагенеза в участке рестрикционного сайта в аналогичной позиции человека.

Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, YAC и EBV производные эписом и им подобные. Подходящим вектором является тот, который кодирует функционально полноценную СН или CL последовательность иммуноглобулина человека с соответствующими рестрикционными сайтами, сконструированными так, чтобы любая VH или VL последовательность могла быть легко вставлена и экспрессирована. В таких векторах сплайсинг обычно осуществляется между сплайсинг-донорным сайтом, вставленным в J регион, и сплайсинг-акцепторном сайтом, предшествующим человеческому С региону; а также в сплайсинг-регионах, которые имеются в пределах человеческих СН экзонов. Полиаденирование и транскрипционная терминация имеют место в нативных хромосомных сайтах ниже кодирующих регионов. Получившиеся химерные антитела могут быть соединены с любым сильным промотором, в том числе и с ретровирусными LTR; например, с ранним промотором SV-40 (Okayama et al. (1983) Mol. Cell. Bio. 3:280), LTR вируса саркомы Рауса (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777), LTR вируса лейкемии мышей Молони (Grosschedl et al. (1985) Cell 41:885); нативными промоторами Ig и т.п.

Диагностическое использование

Синтетические полипептиды агониста рецептора интерферона I типа по данному изобретению являются уникальными исследовательскими реагентами, которые обеспечивают тип I интерфероновой активности матрицы для использования при скрининге в химической библиотеке, там, где практикующий врач может использовать сигнальную трансдукцию в тесте, как начальный тест с высокой разрешающей способностью, предназначенный для агентов, которые ингибируют в широкой области активности интерферонов I типа заявляемого синтетического агониста рецептора интерферона I типа. В этом направлении, кандидатные агенты, вероятно, ингибируют широкий спектр интерфероновых активностей I типа (схожи с профилем активности заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа), которые могли быть получены ранее, во избежание чрезмерного удорожания и организационно невыполнимого количества исследований по ингибированию вирусного роста или клеточной пролиферации на больших химических библиотеках.

В одном из воплощений изобретения синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа был использован для скрининга химических библиотек в тесте киназно-рецепторной активации (KIRA), как описано в WO 95/14930 (опубликовано 1 июня 1995). KIRA-тест является подходящим для использования по этому изобретению, потому что лиганд присоединяется in situ к комплексу интерферонового рецептора I типа на поверхности клетки-хозяина, экспрессирующей этот рецептор, и индуцирует быстрое нарастание фосфорилирования тирозиновых остатков во внутриклеточном пространстве обоих компонентов (IFNAR1 и IFN AR2) рецептора, как это изложено Platanias и Colamonici, J. Biol. Chem., 269: 17761-17764 (1994). Уровень фосфорилирования тирозина может быть использован для измерения сигнальной трансдукции. Воздействие компонентов библиотеки на уровень тирозин фосфорилирования, индуцированного синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа в KIRA-тесте, является индикацией сложной ингибиторной активности, направленной против большого массива интерферонов I типа, мимикрированных посредством синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа.

KIRA-тест может быть использован для определения (а) клеток-хозяев, экспрессирующих рецептор интерферона I типа (оба компонента рецептора - IFNAR1 и IFN AR2), и (b) клеток, экспрессирующих заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, ингибирующий профиль которого представляет интерес. В качестве клеток, которые в природных условиях экспрессируют рецептор интерферона I типа, могут быть использованы такие клетки человека как Daudi или клетки миеломы U-266, описанные Colamonici и Domanski, J. Biol. Chem. 268: 10895-10899 (1993). Дополнительно могут быть использованы клетки, которые были трансфецированы IFNAR1 и IFNAR2 компонентами и содержащие внутриклеточный сигнальный протеин, необходимый для сигнальной трансдукции интерферона I типа, такие как клетки мыши L-929, описанные Domanski et al, J. Biol. Chem., 270: 21606-21611 (1995). Для исследования в KIRA-тесте, кандидат антагонист был инкубирован с заявленным синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа, и инкубационная смесь содержала клетки, экспрессирующие рецептор интерферона I типа. Обработанные клетки лизировали и IFNAR2 белок в лизате был иммобилизован на твердой фазе, содержащей анти-IFNAR2-антитело. Сигнальная трансдукция оценивалась через измерение количества фосфорилированного тирозина во внутриклеточном домене, улавливаемого IFN AR2, и количества фосфорилированного тирозина, который имеется во внутриклеточном домене любого совместно улавливаемого IFNAR1. Альтернативно, клеточный лизис и иммунопереципитацию можно выполнить в денатурирующих условиях, чтобы избежать совместного улавливания IFNAR1 и позволить измерить тирозиновое фосфорилирование IFNAR2 отдельно, т.е. как описано у Platanias et al., J. Biol. Chem., 271: 23630-23633 (1996). Уровень тирозинового фосфорилирования может быть точно измерен с помощью меченных антифосфотирозин-антител, которые распознают фосфорилированные тирозиновые остатки.

В другом воплощении изобретения, хозяйские клетки коэкспрессируют IFNAR1 и химерную конструкцию, содержащую IFNAR2, слитый по его карбоксильному концу с аффинно присоединенным полипептидом, который используют в KIRA-тесте. Химерная конструкция IFNAR2 позволяет сорбировать конструкцию из клеточного лизата посредством использования твердофазного сорбирующего агента (вместо анти-IFNAR2 антител), специфичного к аффинному полипептиду. В предпочтительном воплощении, аффинно присоединенный пептид получают из гликопротеина D (gD) вируса Herpes simplex; связывающим агентом являются анти-gD моноклональные антитела, как описано в примерах 2 и 3 WO 95/14930.

В этой системе, синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, который обладает профилем интерфероновой активности I типа, интересен для использования в качестве стандарта при анализе способности к ингибированию тирозинфосфорилирующей активности у образцов, образованных членами скринируемых химических библиотек. IFNAR2 ICD тирозинфосфорилированный образец, генерированный синтетическим агонистом рецептора полипептида интерферона типа I в качестве стандарта, был сравнен с тирозинфосфорилированными образцами, полученными с применением стандарта в присутствии соединений библиотек; и было обнаружено, что образцы указывающего на ингибирование тирозинфосфорилирования идентичны агентам-кандидатам, которые, скорее всего, ингибируют область активностей интерферона типа I, мимикрированные стандартом. Соответственно, синтетический полипептид агониста рецептора интерферона типа I по изобретению обеспечивает получение средства для быстрого и эффективного скрининга соединений, которые, скорее всего, ингибируют индивидуальные спектры активностей интерферона типа I, представленного заявленным синтетическим полипептидом агониста рецептора I типа.

В дополнение, синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа по данному изобретению является полезным в диагностических анализах на экспрессию рецепторов интерферона I типа в специифических клетках или тканях. В этих анализах, заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа метится, как описано ниже, и/или иммобилизируется на нерастворимой матрице, которая позволяет выявлять рецептор интерферона I типа в образце.

Заявленный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа может быть использован для выявления рецептора интерферона I типа любым из хорошо известных диагностических способов. Например, биологические образцы могут быть исследованы на активность рецептора интерферона I типа посредством получения образца из выбранного источника, смешивая образцы с заявленным синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа, позволив синтетическому полипептиду агониста рецептора интерферона I типа сформировать комплекс агонист/рецептор интерферона I типа с любым рецептором интерферона I типа, представленном в смеси. Биологические образцы могут быть подготовлены для исследования с помощью способов, известных из уровня техники, которые являются подходящими для частных случаев. Способы смешивания образцов с заявленным синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа и детектирования комплекса агонист/рецептор интерферона I типа, могут быть выбраны в соответствии с типом использованного исследования. Такие анализы включают конкурентный и сэндвич-анализы, и анализ на основе стерического ингибирования. Конкурентный и сэндвич-способы используют этап разделения фаз как неотъемлемую часть способа, тогда как анализ на основе стерического ингибирования может быть осуществлен только в однородной реакционной смеси.

Все аналитические способы для рецептора интерферона I типа используют один или более следующих реагентов: меченный аналог рецептора интерферона I типа, иммобилизованный аналог рецептора интерферона I типа, меченный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, иммобилизированный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа и стерические конъюгаты. Мечащие агенты также известны как «трассеры».

Используют метку с любой обнаруживаемой (детектекторной) функцией, которая не интерферирует по связыванию с рецептором интерферона I типа и заявляемым синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа. Известно большое количество меток, предназначенных для использования в иммуноанализе, например, включающие группы, которые могут быть обнаружены непосредственно, такие как флюрохром, хемилюминисцент и радиоактивные метки, также как фрагменты, такие как ферменты, которые должны вступать в реакцию, либо быть производными для того, что бы быть обнаруженными. Примеры таких меток включают радиоизотопы ^<32>Р, ^<14>С, ^<125>1, ^<3>Н, и ^<131>I; флюорофоры, такие как редкоземельные хелаты; или флюоресцеин и его производные; родамин и его производные; дансил; умбеллиферон; люциферазы, например, люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (U.S. Pat. No. 4737456]; 72,3-Hihydropnthalazinediones, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза; бета-галактозидаза; глюкоамилаза, лизоцим, сахарид оксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозооксидаза, и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа; гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантин оксидаза, связанные с ферментом, который применяет перекись водорода для окисления прекурсора красителя, такого как HRP, лактопероксидазу, или микропероксидазу, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, устойчивые свободные радикалы и подобное.

Удобные способы, пригодные для ковалентного связывания меток с белками или полипептидами. Например, для мечения антител вышеописанными флюоресценатами, хемилюминисцентами и ферментами, могут быть использованы такие соединяющие агенты, как диалдегиды, карбодиимиды, дималеимиды, бис-имидаты, бис-диазотиды бензидина и подобные. В качестве примера см. U.S. Pat. Nos. 3,940,475 (флюориметрия) и 3,645,090 (ферменты); Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); and Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982). Предпочтительными метками являются ферменты, такие как пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза.

Конъюгирование такой метки включает присоединение фермента к антителу, и является стандартным способом иммунологического исследования образцов. Для примера см. O'Sullivan et al. "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay", в Methods in Enzymology, ed. J. J. Langone и Н. Van Vunakis, Vol.73 (Academic Press, New York, N.Y., 1981), p.147-166.

Для осуществления отдельных способов анализа необходима иммобилизация реагентов. Акт иммобилизации отделяет синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа от рецептора интерферона любого типа, остающегося в растворе в свободном состоянии. Что обычно осуществляется либо через приведение в нерастворимое состояние синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, либо аналог рецептора интерферона перед исследованием подвергают адсорбции с нерастворимым в воде матриксом, либо поверхностью (Bennich et al., U.S. Pat. No. 3,720,760), через ковалентное связывание (например, используя перекрестную сшивку глютаральдегидом), или через приведение в нерастворимое состояние синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, например, посредством иммунопреципитации.

Другие аналитические способы, известные как конкурирующие или сандвич способы, хорошо разработаны и широко используются в индустрии коммерческих диагностикумов.

Конкурирующие способы, основанные на способности меченного аналога рецептора интерферона I типа к соперничеству за ограниченное число сайтов с рецептором интерферона I типа, содержащимся в тестовом образце, и связывающихся с синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа. Синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа обычно переводят в нерастворимое состояние либо перед, либо после конкуренции, и затем меченный высушенный рецептор интерферона I типа связывают с синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа, отделенным от несвязанной метки и интерферонового рецептора I типа. Это разделение завершают через декантирование (связывающий агент был предварительно переведен в растворимое состояние) или с помощью центрифугирования (связывающий агент был осажден после завершения реакции конкуренции). Количество тестируемого образца рецептора интерферона I типа обратно пропорционально количеству связанной метки, измеренной по количеству маркирующей субстанции. Кривая «доза-ответ» количества рецептора интерферона I типа известна; и сравнена с результатами количественного определения содержания рецептора интерферона I типа в исследуемом образце. В тех случаях, когда в качестве маркеров детекции используются ферменты, эти исследования выполняются с помощью ELISA-систем.

Существует еще одна разновидность конкурентного анализа, названная «гомогенным» анализом и не требующая фазовой сепарации (разделения фаз). Для выполнения такого анализа готовят конъюгат фермента с рецептором интерферона I типа и используют его так, чтобы когда синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа свяжется с рецептором интерферона I типа, присутствие синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа модифировало ферментативную активность. В этом случае рецептор интерферона I типа или его иммунологически активные фрагменты были конъюгированы бифункциональными органическими мостиками с таким ферментом как пероксидаза. Конъюгаты отбирают для использования с синтетическим полипептидом агонистом рецептора интерферона I типа таким образом, чтобы связывание синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа ингибировало или потенцировало ферментативную активность метки. Этот метод per se уже широко практикуется под названием EMIT.

Стерические конъюгаты используют в методах стерических препятствий для гомогенного анализа. Эти конъюгаты синтезируют посредством ковалентного связывания низкомолекулярного гаптена с небольшим фрагментом рецептора интерферона I типа, так чтобы антитело к гаптену было способно прочно связывать конъюгат в тоже самое время, что и синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа. В условиях этого исследования рецептор интерферона I типа, представленный в тестируемом образце, связывает синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа, посредством этого позволяя антигаптену связать конъюгат, приводя к изменению свойств конъюгированного гаптена, например, к изменению флюоресценции, когда гаптен является флюорофором.

Сэндвич-исследования обычно выполняются для определения в образце наличие рецептора интерферона I типа. В последовательности операций сэндвич-анализа иммобилизированный синтетический полипептид агониста рецептора интерферона I типа используют для адсобции в тестируемой пробе рецепторов интерферона I типа, тестируемый образец удаляют через промывание, связанный рецептор интерферона I типа используют для адсорбции меченных антител к рецептору интерферона I типа и полученный материал затем отделяют от следов метки. Количество связанной метки прямо пропорционально количеству рецептора интерферона I типа в тестируемом образце. В «одновременном» сэндвич-тесте исследуемый образец не отделяют перед добавлением предварительно меченных антител к рецептору интерферона I типа.

Упомянутое выше является только примерами типичных диагностических исследований на рецептор интерферона I типа. Другие способы сегодня и в будущем, разработанные для использования синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа для определения рецепторов интерферона I типа, включены в пределы этих границ, включая биологические анализы, описанные выше.

Терапевтические методы

Представленное изобретение обеспечивает выполнение способа лечения фиброзных болезней. Заявленные способы предполагают в основном введение эффективных комбинаций синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида и агониста рецептора интерферона II типа. В отдельных вариантах выполнения изобретения, заявленный способ лечения включает введение больному, по крайней мере, одного дополнительного антифибротического агента.

Представленное изобретение в более отдаленной перспективе может быть использовано для лечения онкологических болезней. Заявленные способы обычно включают введение больному индивидуальных эффективных количеств заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида. В отдельных воплощениях заявленный способ предполагает в будущем включение, по крайней мере, одного дополнительного антиракового агента.

Представленное изобретение дополнительно обеспечивает выполнение способов лечения вирусной инфекции. Заявленные способы обычно включают введение больному, если это необходимо, эффективных количеств заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазо-резистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида. В отдельных воплощениях, заявленный способ в будущем предполагает включение в схему лечения, по крайней мере, одного дополнительного антивирусного агента.

В отдельных воплощениях, заявленный способ лечения в будущем предполагает включение в схему агента, направленного на устранение побочных эффектов лечения, для лечения побочных эффектов, вызванных терапевтическим агентом.

Фиброзные болезни

Представленное изобретение обеспечивает выполнение способов лечения фиброзных болезней у индивидуума, имеющего такую болезнь. Способ обычно включает введение эффективных комбинаций заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа. Способы позволяют осуществить лечение фиброзных болезней, включающих воздействующие на легкие, такие как идиопатический пульмонарный фиброз, пульмонарный фиброз известной этиологии, фиброз печени или цирроз, кардиальный фиброз и ренальный фиброз. Этиология может быть следствием любых острых или хронических поражений, включая токсические, метаболические, генетические нарушения или инфекционные агенты.

Фиброзы обычно характеризуются патологическим или избыточным накоплением коллагенизированной соединительной ткани. Фиброзные болезни включают, но не ограничиваются коллагеновой болезнью, интерстициальной болезнью легких, фиброзной болезнью легких человека (например, облитеративный бронхиолит, идиопатический пульмонарный фиброз, пульмонарный фиброз известной этиологии, рак стромы легкого, системный склероз с поражением легкого, Hermansky-Pudlak-синдром, пневмокониоз рабочих угольных копей, асбестоз, силикоз, хроническая легочная гипертензия, AIDS-ассоциированная легочная гипертензия, саркоидоз и подобные), фибротическое васкулярное заболевание, артериальный склероз, атерогенный склероз, атеросклероз, варикоз вен, коронарные инфаркты, церебральные инфаркты, миокардиальный фиброз, мускулескелетный фиброз, постхирургические адгезии, болезни почек человека (например, нефритический синдром; синдром Альперта; ВИЧ-ассоциированная нефропатия; полицистическая болезнь почек; болезнь Фабри; диабетическая нефропатия; хронический гломерулонефрит; нефриты, ассоциированные с системной волчанкой и подобными болезнями), келоидное рубцевание ран, прогрессивный системный склероз (PSS), первичные склерозирующие холангиты (PSC), фиброз печени, цирроз печени, ренальный фиброз, легочный фиброз, хроническая постпрививочная болезнь, склеродерма (локальная и системная), офтальмопатия Граве, диабетическая ретинопатия, глаукома, болезнь Перрона, фиброз пениса, уретростеноз после цистоскопического исследования, внутреннее разрастание после хирургической операции, множественное развитие рубцов, миелофиброз, идиопатический ретроперитонеальный фиброз, перитонеальный фиброз известной этиологии, лекарственно-индуцированный эрготизм, фиброз вследствие развития рака, фиброзные проявления микробной инфекции (например, вирусной, бактериальной, паразитической, грибковой и т.д.), болезнь Альцгеймера, фиброзные перерождения кишечника, развивающиеся на фоне воспалительных болезней (включая формирование стриктуры на фоне болезни Крона и микроскопических колитов), фиброзы, вызванные химическими или внешними повреждениями (например, рак, вызванный хемотерапией, пестицидами, радиацией и подобными воздействиями; например, рак радиотерапии; и подобные), и подобные.

В отдельных воплощениях, эффективные количества синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа и агониста рецептора интерферона II типа могут быть использованы в любых сочетаниях доз, которые, когда их вводят больному с фиброзной болезнью, будут эффективно уменьшать развитие фиброза, или уменьшать скорость его прогрессирования, по крайней мере, около 19%; по крайней мере, около 15%; по крайней мере, около 20%; по крайней мере, около 25%; по крайней мере, около 30%; по крайней мере, около 35%; по крайней мере, около 40%; по крайней мере, около 45%; или, по крайней мере, около 50%; или более, сравнивая со степенью развития фиброза у лиц, ранее не леченных, или сравнивая со скоростью прогрессирования фиброза, которая наблюдалась у пациентов в отсутствии лечения.

В отдельных воплощениях, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, могут быть использованы в сочетанных дозах у пациентов, имеющих фиброзную болезнь, они будут эффективно уменьшать развитие фиброза, или уменьшать скорость его прогрессирования, по крайней мере, одной функции органа, подверженного фиброзным изменениям (например, легкого, печени, почки и т.д.) по крайней мере, около 15%; по крайней мере, около 20%; по крайней мере, около 25%; по крайней мере, около 30%; по крайней мере, около 35%; по крайней мере, около 40%; по крайней мере, около 45%; или, по крайней мере, около 50%; или более, сравнивая с базовым уровнем функции органа у индивидуумов перед лечением или сравнивая со скоростью ухудшения функции органа, исследуемого у индивидуума в отсутствии его лечения.

Способы измерения пораженности фиброзом отдельного органа и способы измерения функции органа известны из уровня техники.

Идиопатический легочный фиброз

Представленное изобретение обеспечивает выполнение способов лечения идиопатического легочного фиброза (IPF).

Способ в основном предполагает введение лицам, страдающим IPF, эффективных количеств заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа.

В отдельных воплощениях, диагноз IPF устанавливают по обнаружению обычных интерстициальных пневмоний (1ЛР) на гистопатологических отборах ткани из легкого, полученных хирургической биопсией. Критерии диагноза общеизвестны: Ryu et al. (1998) Mayo Clin. Proc. 73:1085-1101.

В других воплощениях диагноз IPF устанавливают или предполагают с помощью высокоразрешающей компьютерной томографии (HRCT). При установке диагноза с помощью HRCT учитывают следующие известные характеристики: (1) присутствие ретикулярной аномалии и/или признаков бронхоэктаза с базальным или периферийным преобладанием; (2) присутствие пустот с базальным или периферийным преобладанием; и (3) отсутствие атипичных особенностей, таких как микроузлы, периваскулярные узлы, уплотнения, изолированные цисты (не ячеистые) и медиастинальнальна аденопатия (маловыраженная, но достаточная, чтобы быть обнаруженной с помощью рентгенографического исследования грудной клетки).

Диагноз устанавливают как соответствующий IPF, если выявлены следующие характеристики: (1), (2), и (3) встречаются вместе. Предположительный диагноз IPF ставят, если были обнаружены вместе характеристики, приведенные в (1) и (3)

В других воплощениях изобретения, "эффективные количества" заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, применяются комбинированно, в дозе, которая является эффективной для замедления прогрессирования болезни, по крайней мере, около 10%; по крайней мере, около 15%; по крайней мере, около 20%; по крайней мере, около 25%; по крайней мере, около 30%; по крайней мере, около 35%; по крайней мере, около 40%; по крайней мере, около 45%; по крайней мере, около 50%; по крайней мере, около 55%; по крайней мере, около 60%; по крайней мере, около 65%; по крайней мере, около 70%; или более, в сравнении с плацебо-контролем или с контролем без лечения.

Прогрессирование болезни оценивается по одному или более следующих критериев: (1) уменьшение прогнозируемого FVC на 10% или более; (2) или более в отдельном вдохе DL_co. Любой из двух критериев прогрессии болезни может быть определен через измерение одного или более из этих параметров в течение от двух 4 до 14 недель и в сравнении полученных величин с базовыми.

Таким образом, например, когда нелеченный пациент или пациент, получающий плацебо, показывает снижение FVC на 50% и более в указанный период времени, то пациент, которому вводили эффективные комбинации синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа и агониста рецептора интерферона II типа, показывает уменьшение FVC на 45%, около 42%, около 40%, около 37%, около 35%, около 32%, около 30%, или менее, за тот же период или более длительный.

В отдельных воплощениях, "эффективные количества" заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа, в любом сочетании и дозе, которые являются эффективными для увеличения временени выживания, без прогрессирования болезни, например, времени от базовой линии (например, на момент времени от 1 до 28 дней перед началом лечения), количество смертельных исходов или случаев прогрессирования болезни возрастают, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 25%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 50%; по крайней мере, приблизительно на 60%; по крайней мере, приблизительно на 70%; по крайней мере, приблизительно на 80%; по крайней мере, приблизительно на 90%; по крайней мере, приблизительно 2-кратно; по крайней мере, приблизительно 3-кратно; по крайней мере, приблизительно 4-кратно; по крайней мере, приблизительно 5-кратно; или более, в сравнении с плацебо-контролем или контролем, в котором больные не получали лечения. Таким образом, например, в отдельных воплощениях эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, в любых сочетаниях дозы, которая эффективно увеличивает время выживания пациентов, по меньшей мере, около 1-й недели; по меньшей мере, около 2-х недель; по меньшей мере, около 3-х недель; по меньшей мере, около 4-х недель; по меньшей мере, около 2-х месяцев; по меньшей мере, около 3-х месяцев; по меньшей мере, около 4-х месяцев; по меньшей мере, около 5 месяцев; по меньшей мере, около 6 месяцев; по меньшей мере, около 8 месяцев; по меньшей мере, около 10 месяцев; по меньшей мере, около 12 месяцев; по меньшей мере, около 18 месяцев; по меньшей мере, около 2-х лет; по меньшей мере, около 3-х лет; и больше, в сравнении с пациентами, получавшими плацебо, либо вообще не получавших лечение.

В отдельных воплощениях изобретения, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, применяют с любым сочетанием дозы, которая является эффективной для улучшения, по крайней мере, одного параметра функции легких, например, комбинирование дозы, которая увеличивает, по крайней мере, один параметр, по меньшей мере, приблизительно на 10%; по меньшей мере, приблизительно на 20%; по меньшей мере, приблизительно на 25%,; по меньшей мере, приблизительно на 30%; по меньшей мере, приблизительно на 40%; по меньшей мере, приблизительно на 50%; по меньшей мере, приблизительно на 60%; по меньшей мере, приблизительно на 20%; по меньшей мере, приблизительно на 80%; по меньшей мере, приблизительно на 90%; по меньшей мере, двукратно; по меньшей мере, трехкратно; по меньшей мере, четырехкратно; по меньшей мере, пятикратно; или более, в сравнении с нелеченными людьми, или принимавшими плацебо; в отдельных из этих воплощений определяли действительные параметры легочной функции, являющиеся увеличенными, путем сравнения базовой величины с величиной в любой временной точке после начала лечения, например, через 48 недель лечения, или между двумя временными точками, например, интервалами от 4 до 14 недель после начала лечения.

В отдельных воплощениях изобретения, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа, применяют с любым сочетанием дозы, являющейся эффективной для увеличения FVC по крайней мере приблизительно около 10% по крайней мере приблизительно около 20%, по крайней мере приблизительно около 25%, по крайней мере приблизительно около 30%, по крайней мере приблизительно около 40%, по крайней мере приблизительно около 50%, по крайней мере приблизительно около 60%, по крайней мере приблизительно около 70%, по крайней мере приблизительно около 80%, по крайней мере приблизительно около 90%, по крайней мере приблизительно около 2-кратно, по крайней мере приблизительно 3-кратно, по крайней мере приблизительно 4-кратно, по крайней мере приблизительно 5-кратно, или более в сравнении с исходными замерами в интервале от 4 до 14 недель.

В отдельных воплощениях изобретения, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа применяются в любом сочетании дозы, которая приводит к уменьшению в альвеолах: артериального (А-а) градиента, по крайней мере, около 5 мм Hg; no крайней мере, около 7 мм Hg; по крайней мере, около 10 мм Hg; по крайней мере, около 12 мм Hg; по крайней мере, около 15 мм Hg; или более, в сравнении с исходным.

В отдельных воплощениях изобретения, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа применяют в любом сочетании дозы, которая увеличивает вдох DLCO, по крайней мере, на 15%; по крайней мере, на 20%; по крайней мере, на 30%; по крайней мере, на 40%; по крайней мере, на 50%; по крайней мере, на 60%; по крайней мере, на 70%; по крайней мере, на 80%; по крайней мере, на 90%;

по крайней мере, 2-кратно; по крайней мере, 3-кратно; по крайней мере, 4-кратно; по крайней мере, 5-кратно; или более, а сравнении с исходной величиной. CL_C0 является показателем легочной емкости по углекислому газу и выражается как мл CO/mm Hg/second.

Параметры легочной функции включают, но не являются лимитирующими, форсированную жизненную емкость (FVC); форсированный объем выдоха (FEV1); общую легочную емкость; частичное давление артериального кислорода в покое; частичное давление артериального кислорода на максимуме усилий.

Легочная функция может быть определена использованием любых известных методов, включая, спирометрию, но не ограничиваясь ею.

Печеночный фиброз

Представленное изобретение включает способ лечения печеночного фиброза, включая уменьшение клиники фиброза, снижение вероятности развития печеночного фиброза и уменьшение параметров, связанных с сами печеночным фиброзом. Способы включают введение комбинации эффективных количеств заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа в индивидуально необходимых количествах. Особый интерес для воплощения изобретения представляет лечение людей.

Печеночный фиброз является предшественником ряда болезней. Он сложно ассоциирован с циррозом печени, портальной гипертензией, прогрессирующей печеночной недостаточностью, гепатоцеллюлярной карциномой. Уменьшение печеночного фиброза приводит к уменьшению риска таких осложнений. Соответственно с этим, представленное изобретение в дальнейшем предполагает использование способов снижения вероятности того, что у пациента разовьется ассоциированный с фиброзом цирроз печени.

Представленные способы в основном включают введение терапевтически эффективных количеств заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа. Использованный здесь термин "эффективные количества" заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа означает сочетание дозы, которая эффективно уменьшает печеночный фиброз или снижает скорость прогрессирования печеночного фиброза; и/или которое эффективно снижает параметры, ассоциированные с печеночным фиброзом; и/или которые эффективно снижают расстройства, связанные с циррозом печени.

Изобретение также позволяет осуществить способ лечения печеночного фиброза у лиц, получающих индивидуальные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, которые в сочетании эффективны для профилактики или терапии печеночного фиброза, например, увеличивая вероятность выживания больных, уменьшая риск их смерти, облегчая "бремя болезни" или замедляя ее прогрессирование у больных.

Действительно ли лечение сочетаниями заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа является эффективным для уменьшения печеночного фиброза определяют посредством любых, хорошо разработанных способов диагностики печеночного фиброза и степени нарушения функции печени. Действительно ли печеночный фиброз уменьшается под воздействием лечения, определяют посредством анализа образцов печени, полученных биопсией. Анализы биоптатов печени включают исследование двух главных компонентов: некротического воспаления, выявленного посредством "ранжирования", по оценке тяжести и активности болезни в текущий период времени; и поражения фиброзом и паренхимальным или васкулярным изменениям, как определено "стадией", отражающей прогрессию болезни за длительный период времени. См., например, Brunt (2000) Hepatol. 31:241-246; и METAVIR (1994) Hepatology 20:15-20. В основе анализа печеночной биопсии лежат общепринятые критерии оценки. Существуют разные количественные стандартизированные оценочные системы (скоринг-система или балловая система), позволяющие проводить количественные оценки степени и тяжести фиброза. Они включают такие системы, как METAVIR, Knodell, Scheuer, Ludwig и Ishak.

METAVIR-балловая система основана на анализе различных особенностей печеночной биопсии, включающих фиброз (портальный фиброз, центролобулярный фибоз и цирроз); некроз (частичный и лобулярный некроз, ацидофилическую реакцию и баллонирующую дегенерацию); воспаление (воспаление портального тракта, портальные лимфоидные агрегаты и распространенное портальное воспаление); изменения желчных протоков; и индекс Кноделля (множественный перипортальный некроз, лобулярный некроз, портальное воспаление, фиброз и общая активность болезни). Определение каждой стадии посредством METAVIR-системы оценкой в баллах по установленным критериям. Оценка в баллах: 0, без фиброза; оценка в баллах: 1, звездчатое расширение портального тракта, но без формирования перегородок; оценка в баллах: 2, расширение портального тракта с редким формированием перегородок; оценка в баллах: 3, многочисленные перегородки, но без цирроза; и оценка в баллах: 4, цирроз.

Балловая система Кноделля, также называемая, Hepatitis Activity Index, классифицирует образцы на основе баллов в четырех категориях гистологических особенностей: I, перипортальный и/или перекрывющийся некроз; II, интралобулярная дегенерация и фокальный некроз; III, портальное воспаление; и IV, фиброз. В стадийной системе Кноделя баллы подсчитываются следующим образом: 0, без фиброза; 1, умеренный фиброз (портальная фиброзная экспансия); 2, средний фиброз; 3, тяжелый фиброз (перекрывающийся фиброз); 4, цирроз. Высший балл, более серьезные повреждения печени. Knodell (1981) Hepatol. 1:431.

В балловой системе Шеура баллы определяются следующим образом: 0, нет фиброза; 1, увеличенный, фибротические изменения портальных трактов; 2, перипортальный, обнаружены портально-портальные септы, но интактная архитектура; 3, фиброз с архитектурными искажениями, но нет очевидного цирроза; 4, предполагаемый или явный цирроз. Система описана Шеуром в J. Hepatol. (199I) 13:372.

Балловая система Ишака описана им в J. Hepatol. (1995) 22:696-699. Stage 0, [0825] нет фиброза; стадия 1, фиброз распространился на отдельные портальные области, с короткими септами или без коротких септ (перегородок); стадия 2, фиброз распространился на большинство портальных областей, с короткими фиброзными септами или без коротких фиброзных септ; стадия 3, фиброзная экспансия большинства портальных областей со случайными портально-портальными (Р-Р) перекрываниями; стадия 4, фиброзная экспансия портальных областей с явным портально-портальным перекрыванием (Р-Р), также как портально-центральное (Р-С); стадия 5, заметное перекрывание (Р-Р и/или Р-С) со случайными узлами (незавершенный цирроз); стадия 6, цирроз, вероятный или точный. Преимущества анти-фибротической терапии могут быть оценены использованием Чилд-Пуг-цифровой системы, которая включает мультикомпонентную точечную систему, основанную на оценке уровня билирубина в сыворотке, протромбинового времени, наличия и опасности асцита, наличия и опасности энцефалопатии. Основываясь на наличии и тяжести этих отклонений, пациент может быть помещен в одну из трех категории по тяжести болезни: А, В или С.

В отдельных воплощениях изобретения, терапевтически активные комбинации заявленных синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазо-резистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа применяются в любых сочетаниях дозы, эффективной для изменения одной единицы или более в стадии фиброза, оцененных по результатам биопсий, сделанных перед лечением и после него. В отдельных воплощениях изобретения, терапевтически эффективные сочетания дозы уменьшают фиброз печени, по крайней мере, на одну единицу по METAVIR, Knodell, Scheuer, Ludwig или Ishak балловой системе.

Вспомогательно или непрямо, для оценки эффективности лечения заявленными синтетическими полипептидными агонистами рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа, используют их способность индуцировать функцию печени.

Для количественной оценки степени фиброза печени используют морфометрическую компьютеризированную полуавтоматическую систему, основанную на специфическом окрашивании коллагена и/или сывороточных маркеров фиброза печени. Эти показатели могут быть также измерены как свидетельство эффективности заявленного метода лечения.

Вторично индуцированная функция печени включает, но не лимитирует, уровни сывороточных трансаминаз, протромбиновое время, билирубин, количество тромбоцитов, портальное давление, уровень альбумина и определение количества Child-Pugh баллов.

В другом воплощении изобретения, эффективную комбинацию заявленных синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, используют в любом сочетании дозы, которая является эффективной для увеличения индекса печеночной функции на приблизительно 10%; на приблизительно 20%; на приблизительно 25%; на приблизительно 30%; на приблизительно 35%; на приблизительно 40%; на приблизительно 45%; на приблизительно 50%; на приблизительно 55%; на приблизительно 60%; на приблизительно 65%; на приблизительно 70%; на приблизительно 75%; или по крайней мере около 80%; или больше, в сравнении с индексом печеночной функции не леченных людей, или принимающих плацебо. Квалифицированный специалист может легко измерить такие индексы функции печени, используя стандартные диагностические способы, многие из которых коммерчески доступны и используются в повседневных клинических исследованиях.

Сывороточные маркеры фиброза печени могут быть измерены как показатели эффективности заявленного способа лечения. Сывороточные маркеры фиброза печени включают, но не ограничиваются, гиалуронат, N-терминальный проколлаген III пептид, 7S домен коллагена IV типа, С-терминальный проколлаген I пептид и ламинин. Дополнительные биохимические маркеры фиброза печени включают альфа-2-макроглобулин, гаптоглобулин, гаммаглобулин, аполипопротеин А и гаммаглютамилтрансферазу.

В другом воплощении изобретения, терапевтически эффективную комбинацию заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазо-резистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, используют в любом сочетании дозы, которая является эффективной для уменьшения уровня маркеров печеночного фиброза в сыворотке, по крайней мере, на 10%; по крайней мере, на 20%; по крайней мере, на 25%; по крайней мере, на 30%; по крайней мере, на 35%; по крайней мере, на 40%; по крайней мере, на 45%; по крайней мере, на 50%; по крайней мере, на 55%; по крайней мере, на 60%; по крайней мере, на 65%; по крайней мере, на 70%; по крайней мере, на 75%; или, по крайней мере, на 80%; или более, в сравнении с уровнем печеночных маркеров нелеченных людей, или принимавших плацебо. Квалифицированный специалист может без особого труда определить такие маркеры фиброза печени, используя стандартные способы диагностики, многие из которых коммерчески доступны и используются в повседневных клинических исследованиях

Способы измерения сывороточных маркеров включают иммунологические способы, например, тест на основе использования связывания с иммуносорбентами, например, фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA), радиоиммунный анализ и подобные, использующие антитела, специфичные к исследуемому сывороточному маркеру.

Для оценки эффективности лечения синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированным вариантом пептида, протеазорезистентным вариантом пептида или гипергликозилированным, протеазорезистентным вариантом полипептида, и агонистом рецептора интерферона II типа, используют резервные количественные тесты функционального состояния печени. Они включают: клиренс индоцианина зеленого (ICG), емкость галактозной элиминации (GEC), тест на аминопурин в выдыхаемом воздухе (АВТ), клиренс антипирирна, клиренс моноэтилглицина (MEG-X) и клиренс кофеина.

Как использовано здесь, "осложнение, связанное с циррозом печени" имеет отношение к расстройству, которое является следствием декомпенсации болезни печени, т.е. или встречается в следствии и как результат развившегося фиброза печени, и включает, но не ограничивается, обнаружением асцита; варикозных кровотечений; портальной гипертензии; желтухи; прогрессирующей печеночной недостаточности; энцефалопатии; гепатоцеллюлярной карциномы; печеночной недостаточности, требующей трансплантации печени; и связанной с печенью смертностью.

В другом воплощении изобретения, терапевтически эффективная комбинация заявленных синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазо-резистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазо-резистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, может быть в любой дозе компонентов, которая является эффективной для уменьшения осложнений (например, тех, которые развиваются вследствие индивидуальной переносимости), связанных с циррозом печени, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 35%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 45%; по крайней мере, приблизительно на 50%; по крайней мере, приблизительно на 55%; по крайней мере, приблизительно на 60%; по крайней мере, приблизительно на 65%; по крайней мере, приблизительно на 70%; по крайней мере, приблизительно на 75% или, по крайней мере, приблизительно на 80%, или более, в сравнении с пациентами, не получающими лечения, или пациентами, получающими плацебо.

Действительно ли комбинированная терапия заявленными синтетическим полипептидом агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированным вариантом пептида, протеазорезистентным вариантом пептида или гипергликозилированным, протеазорезистентным вариантом полипептида, и агонистом рецептора интерферона II типа, является эффективной в уменьшении расстройств, связанных с циррозом печени, может быть легко определено из уровня техники.

[00715] Уменьшение фиброза печени проявляется улучшением ее функции. Поэтому, изобретение предоставляет способы, позволяющие улучшить функцию печени, обычно включающие введение терапевтически эффективных сочетаний доз заявленных синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа. Функции печени включают, но не ограничиваются, следующими: 1) синтез белков, таких как белки сыворотки (например, альбумин; факторы свертывания крови; щелочная фосфатаза; аминотрансферазы, например, аланин трансаминаза; аспартат тран-саминаза; 5'-нуклеозидаза, [гамма]-глутаминилтранспептидаза и т.п.); 2) синтез билирубина; 3) синтез холестерола; 4) и синтез желчных кислот. Метаболическая функция печени включает, но не ограничивается ими: карбонгидратный метаболизм, аминокислотный и аммонийный метаболизм, метаболизм гормонов и метаболизм липидов; детоксикацию экзогенных лекарств; поддержание гемодинамической функции, включая внутреннюю и портальную гемодинамику; и подобное.

Действительно ли функция печени улучшается, легко установить из уровня техники, используя известные тесты функции печени. Поэтому, синтез маркеров функции печени, таких как альбумин, щелочная фосфатаза, аланин трансаминаза, аспартат трансаминаза, билирубин и подобные, могут быть определены через измерение уровня этих маркеров сыворотке, используя стандартные иммунологические и ферментативные способы. Внутренняя циркуляция и портальная гемодинамика могут быть измерены через определение давления и/или сопротивления в портальной вене, используя стандартные способы. Метаболические функции могут быть измерены по измерению уровня аммиака в сыворотке.

Действительно ли сывороточные белки синтезируются в печени в диапазоне нормы, можно определить через измерение уровней таких белков в сыворотке, используя стандартные иммунологические и ферментативные способы. Из уровня техники известны интервалы нормы для таких сывороточных белков. Частично они приведены ниже. Диапазон нормы для аланинтрансаминазы находится в пределах от приблизительно 7 до приблизительно 56 единиц на литр сыворотки. Диапазон нормы для аспартаттрансаминазы находится в пределах от приблизительно 5 до приблизительно 40 единиц на литр сыворотки. Билирубин измеряют стандартным способом. В норме уровень билирубина обычно меньше чем приблизительно 1.2 mg/dL. Уровень сывороточного билирубина определяют стандартным способом. В норме он находится в интервале от приблизительно 35 до приблизительно 55 g/L. Продолжительность протромбинового времени определяют стандартным способом. В норме продолжительность протромбинового времени меньше или больше контрольного в пределах 4 сек.

В другом воплощении изобретения, [0841] терапевтически эффективное сочетание синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, комбинируется в дозе, которая является эффективной для того чтобы улучшить функцию печени, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 50%; по крайней мере, приблизительно на 60%; по крайней мере, приблизительно на 70%; по крайней мере, приблизительно на 80%; или более. Например, терапевтически эффективное сочетание заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, включает любую комбинацию дозы, которая является эффективной для снижения повышенного уровня сывороточных маркеров функции печени, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 50%; по крайней мере, приблизительно на 60%; по крайней мере, приблизительно на 70%; по крайней мере, приблизительно на 80%; или более; или снижение уровня сывороточных маркеров до интервалов нормы. Терапевтически эффективное сочетание заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа также включает любую комбинацию дозы, которая увеличивает сниженный по сравнению с нормой уровень маркеров функции печени, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 50%; по крайней мере, приблизительно на 60%; по крайней мере, приблизительно на 70%; по крайней мере, приблизительно на 80%; или более; или увеличивает уровень маркеров функции печени до интервалов нормы.

Ренальный фиброз

Представленное изобретение позволяет осуществлять способы лечения ренального фиброза. Способы в основном заключаются во введении пациенту с ренальным фиброзом эффективных количеств заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа. Как используется здесь, термин "эффективные количества" заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа подразумевает любое сочетание доз, которое эффективно уменьшает ренальный фиброз; и/или которое является эффективным для снижения вероятности того, что у пациента будет развиваться ренальный фиброз; и/или, иначе говоря эффективно в снижении параметров, ассоциированных с ренальным фиброзом; и/или эффективно в уменьшении осложнений, связанных с фиброзом почки.

В одном из воплощений изобретения, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа используются в любом сочетании дозы, которые достаточны для снижения ренального фиброза, или уменьшает скорость прогрессирования ренального фиброза, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 15%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 25%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 35%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 45%; по крайней мере, приблизительно на 50%; в сравнении со степенью ренального фиброза у индивидуумов перед лечением, или в сравнении со скоростью прогрессирования ренального фиброза, которая может иметь место у пациентов в отсутствии лечения.

В какой степени имеет место снижение фиброза почки под воздействием лечения, определяется с использованием известных способов. Например, путем выполнения гистохимического анализа образца биопсии почки для определения ЕСМ-депозиции и/или фиброза. Другие способы известны из уровня техники. См., например, Masseroli et al. (1998) Lab. Invest. 78:511-522; U.S. Patent No. 6,214,542.

В отдельных воплощениях, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа используют в любом сочетании дозы, которые являются эффективными для усиления функции почек, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 15%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 25%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 35%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 45%; по крайней мере, приблизительно на 50%; в сравнении с базовым уровнем функции почки у индивидуума перед лечением.

В отдельных воплощениях, эффективные количества заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона I типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида и агониста рецептора интерферона II типа используют в любом сочетании дозы, которая эффективна замедляет снижение почечной функции, по крайней мере, приблизительно на 10%; по крайней мере, приблизительно на 15%; по крайней мере, приблизительно на 20%; по крайней мере, приблизительно на 25%; по крайней мере, приблизительно на 30%; по крайней мере, приблизительно на 35%; по крайней мере, приблизительно на 40%; по крайней мере, приблизительно на 45%; по крайней мере, приблизительно на 50%; по сравнению с ухудшением функции почек, которое будет иметь место при отсутствии лечения.

Функция почек может быть измерена путем использования известных тестов, включая, но не ограничиваясь ими, уровень креатинина в плазме крови (когда нормальный уровень находится в пределах приблизительно от 0.6 до приблизительно 1.2 mg/dL); клиренс креатинина (когда нормальный уровень клиренса креатинина находится в пределах приблизительно от 97 до приблизительно 137 mL/minute у мужчин, и от приблизительно 88 до 128 mL/minute у женщин); скорость гломерулярной фильтрации (либо вычисляется или ее определяют по клиренсу инулина либо другими способами), азот мочевины крови (интервал нормы находится в пределах от 7 до приблизительно 20 mg/dL); и содержание белков в моче.

Дополнительные антифибротические агенты

Любое из вышеописанных сочетаний терапии может быть адаптировано для лечения фибротического расстройства, включая совместное введение одного или более дополнительных антифибротических агентов. Соответственно, представленное изобретение позволяет осуществлять способ лечения фибротического расстройства, в основном включая введение заявленного синтетического полипептида агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного варианта пептида, протеазорезистентного варианта пептида или гипергликозилированного, протеазорезистентного варианта полипептида, и агониста рецептора интерферона II типа, в комбинированной терапии, которая, по меньшей мере, включает один дополнительный антифибротический агент. Соответствующие антифибротические дополнительные агенты включают, но не ограничиваются ими, SAPK ингибиторы (например, пирфенидон или его аналоги), TNF-антагонисты, ТОР-[бета]-антагонисты, антагонисты рецептора эндотелина и подобные.

Как не ограничивающие примеры, любой из вышеприведенных способов лечения, особенно терапии с использованием комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективных для лечения фиброзных расстройств у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместно с ними применяемых для лечения пациентов количеств SAPK-ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00727] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фибророзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства TNF антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба), эффективного для увеличения антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00728] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликрзилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC) в количествах, эффективных для увеличения антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00729] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства количеств антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00730] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов посредством комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога) и TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00731] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога) и ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа, для желаемой продолжительности лечения.

[00732] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога) и антагонист рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа,

[00733] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба) и ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00734] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба) и антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00735] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC) и антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа,.

[00736] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога), TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба) и ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00737] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога), TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба) и антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта при комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00738] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба), ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC) и антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00739] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога), ТОР-[бета] антагониста (например, GLEEVEC) и антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа, для желаемой продолжительности лечения.

[00740] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением в качестве дополнительного лечебного средства у пациентов комбинированной дозы SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога), TNF-антагониста (например, этанерцепта, инфлюксимаба или адалимумаба), ТОР-[бета] антагониста (например, GLE-EVEC) и антагониста рецептора эндотелина (например, TRACLEER), эффективных для усиления антифиброзного эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и агонистом рецептора интерферона II типа.

[00741] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии с применением комбинированной дозировки заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и агониста рецептора интерферона II типа, эффективные для лечения фиброзных расстройств у пациента, вместе или без совместного введения одного или более дополнительного (дополнительных) антифиброзного (антифиброзных) агента (агентов), может быть в будущем модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного введения количеств N-ацетилцистеина (NAC), эффективных для увеличения антифиброзного эффекта комбинированной терапии.

РАК

[00742] Представленное изобретение обеспечивает способ лечения пролиферативных расстройств (например, рака), способ обычно включает введение индивидууму эффективных количеств синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта

[00743] Способы эффективно снижают скорость роста опухоли приблизительно, по крайней мере, на 5%; приблизительно, по крайней мере, на 10%; приблизительно, по крайней мере, на 20%; приблизительно, по крайней мере, на 25%; приблизительно, по крайней мере, на 50%; приблизительно, по крайней мере, на 75%; приблизительно, по крайней мере, на 85%; или приблизительно, по крайней мере, на 90%; вплоть до полного ингибирования ее роста в сравнении с подходящим контролем.

Таким образом, в этом воплощении изобретения, "эффективное количество" синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, являются тем количеством, которое достаточно для уменьшения роста размера опухоли приблизительно, по крайней мере, на 5%; приблизительно, по крайней мере, на 10%; приблизительно, по крайней мере, на 20%; приблизительно, по крайней мере, на 25%; приблизительно, по крайней мере, на 50%; приблизительно, по крайней мере, на 75%; приблизительно, по крайней мере, на 85%; или приблизительно, по крайней мере, на 90%; вплоть до полного ингибирования ее роста в сравнении с подходящим контролем. В системах экспериментальных животных, подходящим контролем могут быть генетически идентичные животные, не леченные синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа. В неэкспериментальных системах, подходящим контролем может быть опухоль, развившаяся до лечения синтетическим полипептиднымо агонистом рецептора интерферона 1 типа. Другим подходящим контролем может быть плацебо контроль.

[00744] Действительно ли имеет место ингибирование роста опухоли, можно определить с помощью известных способов, включая, но не ограничиваясь ими, оценку пролиферации, как это описано в примере; тестом на поглощение ³H-тимидина и подобными способами.

[00745] Способы могут быть использованы для лечения различных раковых болезней, включая карциномы, саркомы, лейкемии и лимфомы.

[00746] Карциномы, которые можно лечить, используя заявленный способ, включают, но не ограничиваются ими, эзофагиальную карциному, гепатоцеллюлярную карциному, базальноклеточную карциному (в форме рака кожи), чешуйчатоклеточную карциному (различных тканей), карциному мочевого пузыря, включая промежуточно-клеточную карциному (злокачественная неоплазма мочевого пузыря), бронхогенную карциному, карциному толстой кишки, колоректальную карциному, карциному желудка, карциному легких, включая мелкоклеточную карциному и немелкоклеточную карциному легких, адренокортикальную карциному, карциному щитовидной железы, карциному поджелудочной железы, карциному молочной железы, карциному яичников, карциному простаты, аденокарциному, карциному потовых желез, карциному сальных желез, папиллярную карциному, папиллярную адреносаркому, цистоаденокарциному, медуллярную карциному, карциному клеток почки, карциному протоков in situ или карциному желчных протоков, хориокарциному, семиному, эмбриональную карциному, опухоль Вильма, цервикальную карциному, карциному матки, карциному яичка, остеогенную карциному, эпителиальную карциному, назофарингеальную карциному и подобные болезни.

[00747] Саркомы, которые можно лечить, используя заявленный способ, включают, но не ограничиваются ими, фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, хордому, остеогенную саркому, остеосаркому, ангиосаркому, эндотелиальную саркому, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Эвинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому и другие саркомы мягких тканей.

[00748] Другие плотные опухоли, которые можно лечить, используя заявленный способ, включают, но не ограничиваются ими, глиому, астроцитому, медуллобластому, краниофарингому, эпендиому, пинеалому, гемангиобластому, акустическую нейрому, олигодендроглиому, менангиому, меланому, нейробластому и ретинобластому.

[00749] Лейкемии, которые можно лечить, используя заявленный способ, включают, но не ограничиваются ими, следующие: а) хронические миелопролиферативные синдромы (неопластические расстройства мультипотенциальных гематопоэтических стволовых клеток); b) острые миелогенные лейкемии (неопластическая трансформация мультипотенциальных гематопоэтических стволовых клеток или гематопоэтических клеток с ограниченным потенциалом; с) хронические лимфатические лейкемии (CLL; клональная пролиферация иммунологически незрелых и функционально некомпетентных маленьких лимфоцитов), включающие В-клеточную CLL, Т-клеточную CLL полиморфную лейкемию и волосато-клеточную лейкемию; и d) острые лимфобластические лейкемии (характеризуются через аккумуляцию лимфобластов). Лимфомы, которые можно лечить, используя заявленный способ, включают, но не ограничиваются ими, В-клеточные лимфомы (например, лимфому Буркетта); лимфома Ходчкинса; и подобные.

Комбинированная терапия

[00750] В отдельных применениях, представленное изобретение позволяет осуществлять комбинированную терапию рака. Соответственно, представленное изобретение обеспечивает осуществление способа лечения рака, в основном включающего введение заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта в комбинированной терапии с, по крайней мере, со вспомогательными терапевтическими агентами.

[00751] В других воплощениях, представленное изобретение обеспечивает осуществление способов лечения рака, которые включают введение синергичных комбинаций заявленных синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и вспомогательного терапевтического агента. Как использовано здесь, «синергичная комбинация» заявленных синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта и вспомогательного терапевтического агента представляет собой сочетание доз, которые более эффективны при терапевтическом и профилактическом лечении рака, чем пошаговые улучшения в лечении, результат которых может быть предсказан или ожидаем из всего лишь простого сочетания (i) терапевтических и профилактических выгод заявленных синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, когда они вводятся в дозе, принятой для монотерапии; и (ii) терапевтической и профилактической выгоды от вспомогательного терапевтического агента, когда его вводят в дозе, принятой для монотерапии.

[00752] В отдельных применениях, заявленные синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированный полипептидный вариант, протеазорезистентный полипептидный вариант или гипергликозилированный, протеазорезистентный полипептидный вариант используются в качестве вспомогательной терапии при стандартной терапии рака. Стандартная терапия рака включает хирургическое лечение (например, хирургическое удаление раковой ткани), лучевую терапию, трансплантацию костного мозга, химиотерапевтическое лечение, лечение модификаторами биологического ответа и применение отдельных сочетаний выше упомянутых способов.

[00753] Радиационная терапия включает, но не ограничивается, рентгеновское или гамма-излучения, которые создаются либо специальными устройствами, либо через имплантацию небольших радиоактивных источников.

[00754] Хемотерапевтические агенты представляют собой непептидные (т.е., не белковые) соединения, которые уменьшают пролиферацию раковых клеток, цитотоксические и цитостатические агенты. Не ограничивающие примеры хемотерапевтических агентов включают алкилирующие агенты, нитрозомочевины, антиметаболики, антиопухолевые антибиотики, растительные (барвинок) алкалоиды и стероидные гормоны.

[00755] Из уровня техники известны и широко используются агенты, уменьшающие клеточную пролиферацию. Такие агенты включают алкилирующие агенты, такие как азотистые иприты, нитрозомочевины, производные этилениминов, алкилсульфонаты и триазены, включающие (но не ограничивающиеся ими) мехлорэтамин, циклофосфамид (Cytoxan(TM)), мелфан (L-сарколизин), кармустин (BCNU), ломустин (CCNU), семистин (метил-CCNU), стрептозоцин, хлорозотоцин, урацилиприт, хлорметин и фосфамид, хлорамбицил, пипоброман, триэтиленмеламин, триэтилентиофосфоромин, бисульфан, дикарбазин и темозоломид.

[00756] Антиметаболические агенты включают аналоги фолиевой кислоты, пиримидиновые аналоги, пуриновые аналоги и ингибиторы аденозиндезаминазы, включающие (но не ограничивающиеся ими) цитарабин (CYTO-SAR-LJ), цитозинарабинозу, фторурацил (5-FU), флоксуридин (FudR), 6-тиогуанин, 6-меркаптопурин (6-МР), пентостатин, 5-флюороурацил (5-FU), метотрексат, 10-пропаргил-5,8-дидеазофолат (PDDF, CB3717), 5,8-дидеазотетраксидрофолиевую кислоту (DDATHF), лейковорин, флюдаробинфосфат, пентостатин и гемцитабин.

[00757] Подходящие природные продукты и их производные (например, алкалоиды барвинка, антиопухолевые антибиотики, ферменты, лимфокины и эпиподофиллотоксин) включают (но не ограничиваются ими) Ara-С, паклитаксел (Taxol(R)), доцетаксел (Taxotere(R)), деоксикоформицин, митомицин-С, L-аспаргиназу, азатиоприн; бреквинар; алкалоиды, например, винкристин, винбластин, винорельбин, виндезин и т.п.; подофиллотоксины, например, этопозид, тенипозид и т.п.; антибиотики, например, антрациклин, гидрохлорида дианорбицин (дианомицин, рубидомицин, церубидин), идарубицин, доксорубицин, эпирубицин и морволиновые производные и т.п.; феноксизон бисциклопептиды, например, диастомицин; основные гликопептиды, например, блеомицин; антраквиновые гликозиды, например, пликамицин (митрамицин); антрацендионы, например, митоксантрон; азиринопирролоиндоледионы, например, митомицин; макроциклические иммуносупрессанты, например, циклоспорин, FK-506 (такролимус, програф), рапамицин и т.д. и т.п.

[00758] К другим антипролиферативным цитоксическим агентам относятся навелбен, CPT-11, анастрозол, летразол, капецитабин, релоксафин, ЦИК-лофосфамид, ифозамид и дролокафин.

[00759] Агенты, воздействующие на микротубулы, также пригодны для использования и включают (но не ограничиваются ими), аллоколхамицин (NSC 406042), Галихондрин В (NSC 609395), колхицин (NSC 757), производные колхицина (например, NSC 33410), дольстатин 10 (NSC 376128), майтансин (NSC 153858), ризоксин (NSC 332598), паклитаксель (Taxol(R)), производные Taxol(R), доцетаксель (Taxotere(R)), тиоколхицин (NSC 361-792), тритил цистерин, сульфат винбластина, сульфат винкристина, природные и синтетические эпотилоны, включающие (но не ограничивающиеся) эоптилон А, эоптилон В, дискордемолид; эстрамустин, нокодазол и подобные препараты.

[00760] Гормональные модуляторы и стероиды (включая синтетические аналоги), которые пригодны для применения, включают (но не ограничиваются ими) адронокортикостероиды, например, преднизон, дексаметазон и т.п.; эстрогены и прогестины, например, гидроксипрогестерона капроат, медроксипрогестерона ацетат, мегестрола ацетат, эстрадиол, хломифен, тамоксифен; и т.п.; и адренокортикальные супрессанты, например, аминоглутемид; 17[альфа]-этинилэстрадиол; диэтилстилбестрол, тестостерон, флюоксиместерон, пропионат дроместанолона, тестолактон, метилпреднизолон, триамцинолон, хлоротрианизин, гидроксипрогестерон, аминоглютетимид, эстрамустин, ацетат медроксипрогестерона, леупролид, Флютамид (Дрогенил), Торимефен (Фарестон) и Золадекс (R). Эстрогены стимулируют пролиферацию и дифференциацию, следовательно, соединения, которые связывают рецепторы эстрогенов, могут быть использованы для блокирования их активности. Кортикостероиды могут ингибировать пролиферацию Т-клеток.

[00761] Другие хемотерапевтические агенты включают металлокомплексы, например, цисплатин (cis-DDP), карбоплатин и т.п.; мочевину, например, гидроксимочевину; и гидразины, например, N-метилгидразин; эпидофилотоксин; ингибитор полимеразы; прокарбазин; митоксантрон; лейковорин; тегафур и т.п. Другие, представляющие интерес антипролиферативные агенты, включают иммуносупрессанты, например, микофеноликовую кислоту, талидомид, дезоксиспергуалин, азаспорин, лефлуномид, мизорибин, азаспиран (SKF 105685); Iressa(R) (ZD 1839, 4-(3-хлоро-4-флюорофенил)-7-метокси-6-(3-(4-орфолинил)пропокси)квиназолин); и т.п.

[00762] "Таксаны" включают паклитаксел, также как любое активное производное таксанов или пролекарство. "Паклитаксел" (который рассматривается здесь, включает аналоги, составы и производные, например, доцетаксел, TAXOL(TM), TAXOTERE(TM) (производное доксетаксела), 10-десацетильные аналоги паклитаксела и 3'N-десбензоил-3'N-t-битоксикарбоильные аналоги паклитаксела) могут быть легко приготовлены с помощью использования технологий, известных из уровня техники (см. также WO 94/07882, WO 94/07881, WO 94/07880, WO 94/07876, WO 93/23555, WO 93/10076; U.S. Pat. Nos. 5,294,637; 5,283,253; 5,279,949; 5,274,137; 5,202,448; 5,200,534; 5,229,529; и ЕР 590,267), или получить из различных коммерческих источников, включающих, например, Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. (T7402 из Taxus brevifolia; или Т-1912 из Taxus yannanensis).

[00763] Паклитаксел соответствует не только общей химически пригодной форме паклитаксела, но аналогам и производным (например, Тахоtere(TM) docetaxel, как отмечено выше) и конъюгатам паклитаксела (например, паклитаксела-ПЭГ, паклитакселадекстран, или паклитакселксилоза).

[00764] Так же включены в пределы термина "таксан" различные известные производные, включающие гидрофильные и гидрофобные производные. Производные таксана включают (но не ограничиваются ими), галактозные и маннозные производные, описанные в приложении к международному патенту No. WO 99/18113; пиперазиновые и другие производные, описанные в WO 99/14209; таксановые производные, описанные в WO 99/09021, WO 98/22451, и U.S. патенте No.5,869,680; 6-тио производные, описанные в W098/28288; сульфенамидные производные, описанные в U.S. патенте No.5,821,263; и таксоловые производные, описанные в U.S. патенте No.5,415,869. В будущем будут включены пролекарства паклитаксела, включающие, но не ограничивающиеся теми, что описаны в WO 98/58927; WO 98/13059; и U.S. патенте No. 5,824,701.

[00765] Включены модификаторы биологических ответов, пригодные для использования в соединении со способами, включенными в изобретение, но они не ограничивают их по отношению к (1) ингибиторам активности тирозинкиназы (RTK); (2) ингибиторам серин/треонин киназной активности; (3) опухоль-ассоциированным антигенным антагонистам, таким как антитела, специфически связывающие опухолевой антиген; (4) агонисты рецептора апоптоза; (5) интерлейкин-2; (6) 1РМ-[альфа]; (7) IFN-[гамма] (8) колоний-стимулирующие факторы; и (9) ингибиторы ангиогенеза.

[00766] В одном аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательное средство при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим лекарственным препаратом, где добавочным препаратом является ингибитор тирозинкиназы. В отдельных применениях, тирозинкиназным ингибитором являются ингибиторы рецептора тирозин киназы (RTK), такие как ингибиторы рецептора тирозинкиназы I типа (например, ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста), ингибиторы рецептора тирозинкиназы II типа (например, ингибиторы рецептора инсулина), ингибиторы рецептора тирозинкиназы III типа (например, ингибиторы рецептора фактора роста кровяных пластинок) и ингибиторы рецептора тирозинкиназы IV типа (например, рецептора роста фибробластов). В других воплощениях изобретения, тирозинкиназным ингибитором являются ингибиторы, не имеющие отношения к рецепторам тирозинкиназы, такие как ингибиторы дгс-киназ или j anus-киназ.

[00767] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства применяется ингибитор рецептора тирозинкиназы, вовлеченный в сигнальный (сигнальные) путь (пути) фактора роста. В отдельных применениях, ингибитором является Генистеин. В других применениях, ингибитором является EGFR тирозин Киназо-специфичный антагонист, такой как IRESSA(TM) гефитиниб (ZD1 8398; Novartis), TARCEVA(TM) эролотиниб (OSI-774; Roche; Genentech; OSI Pharmaceuticals), или тирфостин AG1 478 (4-(3-chloroanilino)-6,7-деми-токсиквиназолин. В оставшихся других применениях, ингибитором является любой индолинон антагонист FIk-1/KDR (VEGF-R2) тирозинкиназной активности, описанный в описании к патенту U.S. No. 2002/0183364 A1, такие как индолиноновые антагонисты Flk-1/KDR (VEGF- R2) тирозинкиназной активности, раскрытой в таблице 1 на страницах 4-5 этого документа. В будущих применениях изобретения, ингибитор может быть любым из замещенных 3-[(4,5,6,7-тетрагидро-1Н-индол-2-у1) метилен]-1,3-дигидроин-дол-2-один антагонистов Flk-1/KDR (VEGF-R2), FGF-R1 или PDGF-R тирозинкиназной активности, раскрытой в работе Sun, L., et al., J. Med. Chem.. 43(14: 2655-2663 (2000). В дополнительных воплощениях, ингибитором может быть любой замещенный is any substituted 3 -[(3- or 4-карбоксиэтил-пиррол-2-y1) метилиденил]индолин-2-один антагонист FIt-I (VEGF-R1), Flk-1/KDR (VEGF-R2), FGF-R1 или PDGF-R тирозинкиназной активности, раскрытой в работе Sun, L., et al., J. Med. Chem., 42(25): 5120-5130 (1999).

[00768] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазо-резистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства применяется ингибитор нерецепторной тирозинкиназы, вовлеченной в сигнальный (сигнальные) путь (пути) фактора роста. В отдельных воплощениях, ингибитором является антагонист JAK2 тирозинкиназной активности, такой как тирфостин AG490 (2-циано-3-(3,4-дегидроксифенил)-N-(бензил)-2-пропенамид). В других воплощениях ингибитором является антагонист bcr-ab1 тирозинкиназной активности, такой как GLEEVEC(TM) иматиниб мезилат (STI-571; Novartis).

[00769] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства применяется ингибитор одной или более киназ, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла. В отдельных воплощениях, ингибитором является антагонист активации CDK2, такой как триптостин AG490 (2-циано-3-(3,4-дигидроксифенил)-N-(бензил)-2-пропенамид). В других воплощениях ингибитором является антагонист В-активности CDK1/циклина, такой как альстерпаиллон. В оставшихся других воплощениях, ингибитором является антагонист CDK2 киназной активности, такой как индирубин-3'-моноксим. В дополнительных воплощениях, ингибитором является АТР пул антагонист, такой как лометрексол (описанный в U.S. No. 2002/0156023 A1).

[00770] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства применяется антагонист опухоль-ассоциированного антигена, такой как антитело-антагонист. В отдельных воплощениях, включающих лечение НЕК2-экспрессирующих опухолей, опухоль ассоциированным антигенным антагонистом является анти-НЕК2 моноклональное антитело, такое как HERCEPTIN(^TM) трастузумаб. В отдельных воплощениях, включающих лечение СD20-экспрес-сирующих опухолей, таких как В-клеточные лимфомы, используется антагонист опухоль ассоциированного антигена, такой как анти-СD20 моноклональное антитело, такое как RITUXAN(^TM) ритуксимаб.

[00771] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства используется антагонист фактора роста опухолей. В отдельных воплощениях, антагонистом фактора роста опухолей является антагонист эпидермального фактора роста EGF, такой как анти-EGF моноклональное антитело. В отдельных воплощениях, антагонистом фактора роста опухолей является антагонист рецептора эпидермального фактора роста erbB1 (EGFR), такой как анти-EGFR моноклональное тело ингибитор EGFR активации или сигнальной трансдукции, например, ERBITUX(^TM) цетуксимаб.

[00772] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства применяется агонист Аро-2 лиганда. В отдельных воплощениях, агонист Аро-2 лиганда является любыми Аро-2 лигандпептидами, описанными в WO 97/25428.

[00773] В другом аспекте, изобретение рассматривает комбинацию заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, как вспомогательные при любой терапии, при которой больной раком пациент получает лечение с, по крайней мере, одним дополнительным антинеопластическим средством, где в качестве дополнительного лекарственного средства применяется анти-ангиогенный агент. В отдельных воплощениях, анти-агиогенным агентом является антагонист фактора роста васкулярных эндотелиальных клеток (VEGF), такой как анти-VEGF моноклональное антитело, например, AVASTIN(^TM) бевацизумаб (Genentech). В других воплощениях, анти-анги-огенным агентом является антагонист VEGF-R1, такой как анти-VEGF-R1 моноклональное антитело. В других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является антагонист VEGF-R2, такой как анти-VEGF-R2 моноклональное антитело. В других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является антагонист фактора роста основных фибробластов (bFGF), такой как анти-bFGF моноклональное антитело. В других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является антагонист рецептора bFGF, такой как анти-bFGF-рецептор моноклональное антитело. В других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является антагонист ТОР-[бета], такой как анти-ТОР-[бета] моноклональное антитело. В других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является антагонист ТОР-[бета] рецептора, такой как анти-ТОР-[бета]-рецептор моноклональное антитело. В других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является лиганд рецептора ретиноиковой кислоты (RXR), такой как любой RXR-лиганд, описанный в описании к патенту U.S. No. 2001/0036955 А1 или в любом из следующих: U.S. Pat. Nos. 5,824,685; 5,780,676; 5,399,586; 5,466,861; 4,810,804; 5,770,378; 5,770,383; или 5,770,382. В оставшихся других воплощениях, анти-ангиогенным агентом является гамма-лиганд пероксомо пролифератор-активирующего рецептора (PPAR), такой как любой PPAR гамма-лиганд, описанный в описании к патенту U.S. No. 2001/0036955 А1.

[00774] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии эффективными количествами заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного лечения пациента IFN-[гамма], взятом в количествах, эффективных для увеличения антиракового эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона I типа.

[00775] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии эффективными количествами заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного лечения пациента SAPK-ингибитором (например, пирфенидоном или его аналогом), взятом в количествах, эффективных для достижения антиракового эффекта терапии полипептидным синтетическим агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00776] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии эффективными количествами заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного введения пациентам IFN-[гамма] и SAPK-ингибитора (например, пирфенидон или его аналоги), взятых в количествах, достаточных для проявления антиракового эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00777] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии эффективными количествами заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного введения пациентам дополнительного антиракового агента, другого, чем IFN-[гамма], эффективного для лечения рака у пациента, может быть модифицирован включением совместного введения пациенту IFN-[гамма] в количествах, эффективных для проявления антиракового эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона I типа и дополнительным антираковым агентом.

[00778] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии эффективными количествами заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован включением совместного введения пациентам дополнительного антиракового агента, иного чем SAPK-ингибитор (например, пирфенидон или его аналог), эффективного для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналогов) в количествах, эффективных для проявления антиракового эффекта комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и дополнительным антираковым агентом.

[00779] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно терапии эффективными количествами заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного введения пациентам дополнительного антиракового агента, иного чем IFN-[гамма] или SAPK-ингибитор (например, пирфенидона или его аналогов), для эффективного лечения рака у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения включением совместного введения пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств SAPK-ингибитора (например, пирфенидона и его аналогов), что эффективно повышает антираковый эффект комбинированной терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа и дополнительным антираковым агентом.

ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ

[00780] Представленное изобретение обеспечивает способ лечения вирусной инфекции и способ снижения вирусной нагрузки или уменьшения времени освобождения организма от вирусов, или уменьшения заболеваемости или смертности в клинических исходах болезни у пациентов, страдающих от вирусной инфекции. Представленное изобретение в дальнейшем обеспечивает способы уменьшения риска осложнений, возникающих у индивидуумов как последствия развившейся вирусной инфекцией.

Способы в основном включают введение терапевтических эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, для лечения вирусной инфекции.

[00781] В отдельных воплощениях, заявленный способ лечения является профилактическим. В тех случаях, когда заявленный способ используется как профилактический, он снижает риск развития патологической вирусной инфекции у индивидуумов. Эффективные количества заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, являются количествами, которые снижают риск или уменьшают вероятность того, что у индивидуума разовьется вирусная патологическая инфекция. Например, эффективное количество снижает риск развития патологической инфекции у индивидуума, приблизительно, по крайней мере, на 10%; приблизительно, по крайней мере, на 20%; приблизительно, по крайней мере, на 30%; приблизительно, по крайней мере, на 35%; приблизительно, по крайней мере, на 40%; приблизительно, по крайней мере, на 50%; приблизительно, по крайней мере, на 60%; приблизительно, по крайней мере, на 70%; приблизительно, по крайней мере, на 80%; или приблизительно, по крайней мере, на 90%; или более, в сравнении с риском развития патологической вирусной инфекции в отсутствии лечения заявленным средством.

[00782] В отдельных воплощениях, эффективные количества заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, являются количествами, уменьшающими вирусную нагрузку приблизительно, по крайней мере, на 10%; приблизительно, по крайней мере, на 20%; приблизительно, по крайней мере, на 30%; приблизительно, по крайней мере, на 35%; приблизительно, по крайней мере, на 40%; приблизительно, по крайней мере, на 50%; приблизительно, по крайней мере, на 60%; приблизительно, по крайней мере, на 70%; приблизительно, по крайней мере, на 80%; или приблизительно, по крайней мере, на 90%; или более, в сравнении с вирусной нагрузкой в отсутствии лечения заявленным средством.

[00783] В отдельных воплощениях, эффективные количества заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, являются количествами, уменьшающими время освобождения организма от вируса приблизительно, по крайней мере, на 10%; приблизительно, по крайней мере, на 20%; приблизительно, по крайней мере, на 30%; приблизительно, по крайней мере, на 35%; приблизительно, по крайней мере, на 40%; приблизительно, по крайней мере, на 50%; приблизительно, по крайней мере, на 60%; приблизительно, по крайней мере, на 70%; приблизительно, по крайней мере, на 80%; или приблизительно, по крайней мере, на 90%; или более, в сравнении с продолжительность освобождения организма от вируса в отсутствии лечения.

[00784] В отдельных воплощениях, эффективные количества заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, являются количествами, уменьшающими заболеваемость или смертность вследствие вирусной инфекции приблизительно, по крайней мере, на 10%; приблизительно, по крайней мере, на 20%; приблизительно, по крайней мере, на 30%; приблизительно, по крайней мере, на 35%; приблизительно, по крайней мере, на 40%; приблизительно, по крайней мере, на 50%; приблизительно, по крайней мере, на 60%; приблизительно, по крайней мере, на 70%; приблизительно, по крайней мере, на 80%; или приблизительно, по крайней мере, на 90%; или более, в сравнении с заболеваемостью или смертностью в отсутствии лечения.

[00785] Действительно ли заявленный способ лечения является эффективным для уменьшения риска патологической вирусной инфекции, снижения вирусной нагрузки и уменьшения времени освобождения организма от вируса, или снижения заболеваемости, или смертности от вирусной инфекции, легко установить из уровня техники. Вирусная нагрузка легко может быть определена по титру или количеству вируса в сыворотке. Количество вируса в сыворотке может быть определено использованием любых известных тестов, включающих, например, количественную полимеразную цепную реакцию, использующую олигонуклеотидные праймеры, специфичные для тестируемого вируса. Действительно ли уменьшается заболеваемость можно определить через выявление любых симптомов, ассоциированных с вирусной инфекцией, включающих, например, лихорадку, респираторные симптомы (например, кашель, ослабление или затруднение дыхания и подобные).

[00786] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения вирусной нагрузки и/или сокращения продолжительности освобождения организма от вируса, и/или уменьшает заболеваемость или смертность у лиц, которые были экспонированы к вирусу (например, лица, имевшие контакт с лицами, инфицированными вирусом), способ включает введение эффективного количества заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа. В таком воплощении изобретения лечение начинают приблизительно от 1 часа до приблизительно 14 суток, последовавших после экспозиции к вирусу, например, от приблизительно 1 часа, до, приблизительно, 24 часов; от приблизительно 24 часов, до, приблизительно, 48 часов; от приблизительно 48 часов, до, приблизительно, 3 суток; от приблизительно 48 часов, до, приблизительно, 3 суток; от приблизительно 3 суток, до, приблизительно, 4 суток; от приблизительно 4 суток, до, приблизительно, 7 суток; от приблизительно 7 суток, до, приблизительно, 10 суток; или от, приблизительно, 10 суток, до, приблизительно, 14 суток после экспозиции к вирусу.

[00787] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения риска, который имеется у индивидуума, экспонированного к вирусу (например, индивидуум, который был в контакте с индивидуумом, инфицированным вирусом) с обнаруженной патологической вирусной инфекцией с клиническими проявлениями, способ включает введение эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта. В таком воплощении изобретения лечение начинают приблизительно от 1 часа до приблизительно 36 суток, последовавших после экспозиции к вирусу, например, от приблизительно 1 часа, до, приблизительно, 24 часов; от приблизительно 24 часов, до, приблизительно, 48 часов; от приблизительно 48 часов, до, приблизительно, 3 суток; от приблизительно 48 часов, до, приблизительно, 3 суток; от приблизительно 3 суток, до, приблизительно, 4 суток; от приблизительно 4 суток, до, приблизительно, 7 суток; от приблизительно 7 суток, до, приблизительно, 10 суток; от приблизительно, 10 суток, до, приблизительно, 14 суток; от, приблизительно, 14 суток, до, приблизительно, 21 суток; или от, приблизительно, 21 суток, до, приблизительно, 35 суток после экспонирования к вирусу.

[00788] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения вирусной нагрузки и/или сокращения продолжительности освобождения организма от вируса, и/или уменьшает заболеваемость или смертность у лиц, которые могли быть инфицированы вирусом и которые были инфицированы, но не имели признаков инфекции. В отдельных этих воплощениях, способы включают введение эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта в пределах 24 часов после экспонирования к вирусу.

[00789] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения вирусной нагрузки и/или сокращения продолжительности освобождения организма от вируса, и/или уменьшает заболеваемость или смертность у лиц, которые не были инфицированы вирусом, и которые были экспонированы к вирусу. В отдельных воплощениях, способы включают введение эффективных количеств SAPK-ингибитора (например, пирфенидона или его аналога) и агониста рецептора интерферона 1 типа в пределах 48 часов после экспонирования к вирусу.

[00790] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения вирусной нагрузки и/или сокращения продолжительности освобождения организма от вируса, и/или уменьшает заболеваемость или смертность у лиц, которые не были инфицированы вирусом и которые были экспонированы к вирусу. Способы включают введение заявленного агента более чем через 48 часов после экспонирования к вирусу, например, от приблизительно 72 часа, до, приблизительно, 35 суток; например, в течение 72 часов, 4 суток, 5 суток, 6 суток или 7 суток после экспонирования; или приблизительно от 7 суток, до, приблизительно, 10 суток; от, приблизительно, 10 суток, до, приблизительно, 14 суток; от, приблизительно, 14 суток, до, приблизительно, 17 суток; от, приблизительно, 17 суток, до, приблизительно, 21 суток; от, приблизительно, 21 суток, до, приблизительно, 25 суток; от, приблизительно, 25 суток, до, приблизительно, 30 суток; или от, приблизительно, 30 суток, до, приблизительно, 35 суток после экспонирования к вирусу.

В отдельных этих воплощениях, способы включают введение эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта более чем через 48 часов после экспонирования к вирусу.

[00791] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения риска, которому подвергается индивидуум, экспонированный к вирусу с развившейся патологической вирусной инфекцией с клиническими проявлениями. В отдельных этих воплощениях, способы включают введение эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта в пределах 24 часов после экспонирования к вирусу.

[00792] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способ уменьшения риска, которому подвергается индивидуум, экспонированный к вирусу (например, индивидуум, который был в контакте с индивидуумом, инфицированным вирусом) с развившейся патологической вирусной инфекцией с клиническими проявлениями. В отдельных этих воплощениях, способы включают введение эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта в пределах 48 часов после экспонирования к вирусу.

Инфицирование вирусом гепатита

[00793] Представленное изобретение обеспечивает способы лечения инфекции, вызванной вирусом гепатита. В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает способы лечения инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV); способов уменьшения случав осложнений, ассоциированных с HCV и циррозом печени; и способов уменьшения вирусной нагрузки, или уменьшения продолжительности освобождения организма от вируса, или уменьшения заболеваемости или смертности как результата клинического течения болезни у пациентов, страдающих от HCV-инфекци. Способы в основном включают введение эффективных количеств заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазо-резистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта.

[00794] Во многих воплощениях, заявленный способ лечения является эффективным для уменьшения вирусной нагрузки у индивидуума и достижения длительного вирусного ответа. Дополнительно, заявленный способ в будущем обеспечит введение индивидуумам эффективных количеств нуклеозидных аналогов, таких как рибавирин, леворин и вирамидин. Особый интерес во многих применениях представляет лечение людей.

[00795] Действительно ли заявляемый способ эффективен при лечении HCV-инфекции, может быть установлено по определению вирусной нагрузки или посредством измерения параметров инфекции, ассоциированной с HCV, включая (но, не ограничиваясь ими), фиброз печени, повышения уровня сывороточных трансаминази некровоспалительной активности в печени. Индикаторы фиброза печени будут детально приведены ниже.

[00796] Вирусная нагрузка может быть определена по измерению титра или уровня вируса в сыворотке. Эти способы включают (но не ограничиваются ими), количественную полимеразную цепную реакцию (PCR) и бранхиальный, ДНК(bDNA)-тест. Разработаны количественные тесты для измерения вирусной нагрузки (титра) HCV РНК. Многие такие тесты, доступные коммерчески, включают количественную обратную транскрипцию-PCR (RT-PCR) (Amplicor HCV Monitor(^TM), Roche Molecular Systems, New Jersey); и тест на сигнальную амплификацию разветвленной ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) (Quantiplex(^TM) HCV RNA Assay (bDNA), Chiron Corp., Emeryville, California). См., например, у Gretch et al. (1995) Ann. Intern. Med. 123:321-329. Так же интерес представляет тест на нуклеиновую кислоту (NAT), разработанный Gen-Probe Inc. (San Diego) и Chiron Corporation, продаваемый Chiron Corporation под торговым наименованием Procleix(R), в котором NAT одновременно является тестом на присутствие HIV-I и HCV. См., например, Vargo et al. (2002) Transfusion 42:876-885.

[00797] В основном, эффективные количества заявленного агента (например, заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта), используются в количествах, которые эффективно снижают вирусную нагрузку до не выявляемого уровня, например, менее чем около 5000, менее чем около 1000, менее чем около 500, или менее чем около 200 геномных копий/мл сыворотки. В отдельных воплощениях, эффективными количествами заявленного агента являются количества, которые снижают вирусную нагрузку до менее чем 100 геномных копий/мл сыворотки. Во многих воплощениях, способы по изобретению достигают длительной ответной реакции со стороны вируса, например, вирусная нагрузка уменьшается до не выявляемого уровня на период, по крайней мере, до приблизительно одного месяца; на период, по крайней мере, до приблизительно двух месяцев; на период, по крайней мере, до приблизительно трех месяцев; на период, по крайней мере, до приблизительно четырех месяцев; на период, по крайней мере, до приблизительно пяти месяцев; или на период, по крайней мере, до приблизительно шести месяцев после прекращения лечения.

[00798] Действительно ли заявляемый способ эффективен при лечении HCV-инфекции, может быть установлено по измерению параметров, связанных с HCV-инфекцией, таких как фиброз печени. Способы определения выраженности фиброза печени детально обсуждаются ниже. В отдельных воплощениях, уровень сывороточных маркеров печеночного фиброза показывает степень печеночного фиброза.

[00799] Как отдельный не ограничивающий пример, уровень сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) может быть измерен с использованием стандартного теста. Обычно считается нормальным уровень ALT меньше, чем приблизительно 45 международных единиц (U/ml). В отдельных воплощениях, эффективными количества терапевтического агента которые, будучи введенными как часть заявленной комбинированной терапии, считаются достаточно эффективными, если они снижают уровни ALT менее чем до 45 U/ml сыворотки.

Комбинированная терапия

[00800] В отдельных воплощениях, представленное изобретение обеспечивает комбинированную терапию для лечения вирусных инфекций. Поэтому, представленное изобретение обеспечивает способ лечения вирусной инфекции, обычно включающий введение заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта в комбинированной терапии, с, по крайней мере, вторым терапевтическим агентом. Подходящий дополнительный терапевтический агент включает (но не ограничивается ими) нуклеозидные аналоги, такие как рибавирин или вирамидин; L-нуклеозиды, такие как леворин; агонисты рецептора интерферона II типа; (например, IFM-[гамма]); TNF антагонисты; тимозин-[альфа]; SAPK ингибиторы (например, пирфенидон или его аналоги); амантадин и подобные. В соединении с комбинированной терапией для лечения HCV-инфекции, подходящие терапевтические агенты включают (но не ограничиваются ими), нуклеозидные аналоги, такие как рибавирин, леворин или вирамидин; агонисты рецептора интерферона II типа; (например, IFN-[гамма]); TNF антагонисты; NS3 ингибиторы; NS5B ингибиторы; ингибиторы альфа-гликозидазы; тимозин-[альфа]; SAPK ингибиторы (например, пирфенидон или его аналоги); амантадин и подобные.

[00801] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00802] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00803] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00804] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств рибаверина, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00805] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств L-нуклеозида (например, леворина), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00806] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств пирамидина, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00807] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00808] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00809] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS5B ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00811] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции, например, HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств ингибитора альфа-глюкозидазы, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00812] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00813] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств нуклеозидного аналога, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00814] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств рибаверина, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00815] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств L-нуклеозида (например, леворин), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00816] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств вирамидина, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00817] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимумаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00818] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств тимозина-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00819] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств NS 3 ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00820] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств NS5B ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00821] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств IFN-[гамма] и количеств ингибитора альфа-гликозидазы, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00822] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств IFN-[гамма], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00823] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств TNF антагониста (например, энтанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00824] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00825] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения вирусной инфекции (например, HCV-инфекции) у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00826] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного анналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств NS3 ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00827] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств NS5B ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00828] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00829] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS3 ингибитора и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00830] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS5B ингибитора и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00831] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств ингибитора альфа-гликозидазы и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00832] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог) и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00833] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств тимозин-[альфа] и количеств TNF антагониста (например, этанерцепт, инфлюксимаб или адалимунаб), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00834] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного анналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00835] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог) и количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00836] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS3 ингибитора и количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00837] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS5B ингибитора и количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00838] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств ингибитора альфа-глюкозидазы и количеств тимозин-[альфа], эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00839] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств ингибитора нуклеозидного аналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00840] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS3 ингибитора и количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00841] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS5B ингибитора и количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00842] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств ингибитора альфа-глюкозидазы и количеств SAPK ингибитора (например, пирфенидон или его аналог), эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00843] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств нуклеозидного анналога (например, рибавирин, вирамидин или L-нуклеозид, такой как леворин) и количеств ингибитора альфа-глюкозидазы, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00844] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS5B ингибитора и количеств NS3 ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00845] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, гипергликозилированного полипептидного варианта, протеазорезистентного полипептидного варианта или гипергликозилированного, протеазорезистентного полипептидного варианта, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств ингибитора альфа-глюкозидазы и количеств NS3 ингибитора, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

[00846] Как не ограничивающие примеры, любой из вышеописанных способов лечения, особенно с эффективным количеством заявленного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона 1 типа, предназначенный для лечения HCV-инфекции у пациентов, может быть модифицирован для желаемой продолжительности лечения совместным введением пациентам количеств NS5B ингибитора и количеств ингибитора альфа-глюкозидазы, эффективных для увеличения антивирусного эффекта терапии синтетическим полипептидным агонистом рецептора интерферона 1 типа.

Идентификация пациента

[00847] В отдельных воплощениях, специфический режим лекарственной терапии, используемый в лечении HCV-пациентов, выбирается в соответствии с отдельными параметрами болезни, проявившимися у пациента, такими как начальная вирусная нагрузка, генотип инфекции HCV у пациента, и/или стадия печеночного фиброза у пациента.

[00848] Поэтому, в отдельных воплощениях, представленное изобретение позволяет любым вышеописанным способам лечения HCV-инфекции, в которых заявленный способ является модифицированным, быть использованными для лечения тяжелых пациентов в течение 48 недель.

[00849] В других воплощениях, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения [0974] HCV, в которых заявленный способ является модифицированным для лечения не отвечающих на терапию пациентов, когда пациент получал 48-недельный курс терапии.

[00850] В других воплощениях, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ является модифицированным для лечения рецидивирующих пациентов, когда пациент получал 48-недельный курс лечения.

[00851] В других воплощениях, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован для лечения первичного пациента, инфицированного HCV генотипа 1, когда пациент принимал 48-недельный курс терапии.

[00852] В других воплощениях, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован для лечения первичного пациента, инфицированного HCV генотипа 4, когда пациент принимал 48-недельный курс терапии.

[00853] В других воплощениях, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован для лечения первичного пациента, инфицированного HCV генотипа 1, когда пациент имел высокую вирусную нагрузку (HVL), где "HVL" отражает то, что HCV вирусная нагрузка превышает 2×10⁶ HCV геномных копий на мл сыворотки, когда пациент принимал 48-недельный курс терапии.

[00854] В одном воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, имеющих далеко зашедшую болезнь или отдельную серьезную стадию печеночного фиброза, по балловой системе Кноделля, соответствующей 3 или 4; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период времени около от, приблизительно, 24 недель, до, приблизительно, 60 недель; или около 30 недель, до, приблизительно, одного года; или около 36 недель, до, приблизительно, 50 недель; или около 40 недель, до, приблизительно, 48 недель; или, по крайней мере, около 24 недель; или, по крайней мере, около 30 недель; или, по крайней мере, около 36 недель; или, по крайней мере, около 40 недель; или, по крайней мере, около 48 недель; или, по крайней мере, около 60 недель.

[00855] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, имеющих далеко зашедшую болезнь или отдельную серьезную стадию печеночного фиброза, по балловой системе Кноделля, соответствующей 3 или 4; (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период около от 40 недель, до приблизительно 50 недель, или около 48 недель.

[00856] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой более чем 2 млн вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период около от 24 недель, до, приблизительно, 60 недель; или около 30 недель, до, приблизительно, одного года; или около 36 недель, до, приблизительно, 50 недель; или около 40 недель, до, приблизительно, 48 недель; или, по крайней мере, 24 недели; или, по крайней мере, 30 недель; или, по крайней мере, 36 недель; или, по крайней мере, 40 недель; или, по крайней мере, 48 недель; или, по крайней мере, 60 недель.

[00857] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой более чем 2 млн. вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период около от 40 недель, до, приблизительно, 50 недель, или около 48 недель.

[00858] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой более чем 2 млн вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; и либо не имел, либо имел раннюю стадию фиброза, оцененную по Кноделлю, как 0, 1, или 2; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 24 недель, до, приблизительно, 60 недель; или около 30 недель, до, приблизительно, один год; или около 36 недель, до, приблизительно, 50 недель; или около 40 недель, до, приблизительно, 48 недель; или, по крайней мере, около 24 недель; или, по крайней мере, около 30 недель; или, по крайней мере, около 36 недель; или, по крайней мере, около 40 недель; или, по крайней мере, около 48 недель; или, по крайней мере, около 60 недель.

[00859] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой более чем 2 млн вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; и либо не имел, либо имел раннюю стадию фиброза, оцененную по Кноделлю, как 0, 1, или 2; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 40 недель, до, приблизительно, 50 недель, или около 48 недель.

[00860] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой меньшей или эквивалентной 2 млн вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 20 недель, до, приблизительно, 50 недель; или около 24 недель, до, приблизительно, 48 недель; или около 30 недель, до, приблизительно, 40 недель; или около 20 недель, до, приблизительно, 24 недель; или около 24 недель, до, приблизительно, 48 недель; или в пределах 20 недель; или в пределах 24 недель; или в пределах 30 недель; или в пределах 36 недель; или в пределах 48 недель.

[00861] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой меньшей или эквивалентной 2 млн вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 20 недель, до, приблизительно, 24 недель.

[00862] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипа 1 и с начальной вирусной нагрузкой меньшей или эквивалентной 2 млн вирусных геномных копий на мл сыворотки пациента; (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 24 недель, до, приблизительно, 48 недель.

[00863] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипов 2 или 3; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 24 недель, до, приблизительно, 60 недель; или около 30 недель, до приблизительно одного года; или около 36 недель, до, приблизительно, 50 недель; или около 40 недель, до, приблизительно, 48 недель; или, по крайней мере, около 24 недель; или, по крайней мере, около 30 недель или, по крайней мере, около 36 недель или, по крайней мере, около 40 недель или, по крайней мере, около 48 недель; или, по крайней мере, около 60 недель.

[00864] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипов 2 или 3; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 24 недель, до, приблизительно, 50 недель; или около 24 недель, до, приблизительно, 48 недель; или около 30 недель, до, приблизительно, 40 недель; или, около 20 недель, до, приблизительно, 24 недель; или в пределах 30 недель; или в пределах 36 недель; или в пределах 48 недель.

[00865] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипов 2 или 3; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом за период от 20 недель, до, приблизительно, 24 недель.

[00866] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипов 2 или 3; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом в период времени, по крайней мере, около 24 недель.

[00867] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV генотипов 1 или 4; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом в период времени, по крайней мере, около 24 недель, до около 60 недель; или около 30 недель, до, приблизительно одного года; или около 36 недель, до, приблизительно 50 недель; или около 40 недель, до, приблизительно, 48 недель; или, по крайней мере, около 24 недель; или, по крайней мере, около 30 недель; или, по крайней мере, около 36 недель; или, по крайней мере, около 40 недель; или, по крайней мере, около 48 недель; или, по крайней мере, около 60 недель.

[00868] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV любым из генотипов 5, 6, 7, 8 и 9; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом в период времени, по крайней мере, около 20 недель, до около 50 недель.

[00869] В другом воплощении, изобретение обеспечивает любой вышеописанный способ лечения HCV-инфекции, в котором заявленный способ был модифицирован включением этапов: (1) идентификации пациентов, инфицированных HCV любым из генотипов 5, 6, 7, 8 и 9; и затем (2) осуществления пациентам лекарственной терапии заявленным способом в период времени, по крайней мере, около 24 недель, до около 48 недель.

Агонисты рецепторов интерферона II типа

[00870] Используемый здесь термин «агонист рецептора интерферона II типа» включает в себя любые природные или неприродные лиганды II типа рецепторов интерферона человека, которые связываются с этим рецептором или вызывают трансдукцию сигнала через этот рецептор. Агонисты рецепторов интерферона II типа включают в себя интерфероны, в том числе природные интерфероны, модифицированные интерфероны, синтетические интерфероны, пегилированные интерфероны, слитые белки, содержащие интерферон и гетерологичный белок, интерфероны, полученные в результате шаффлинга; антитела, специфичные к рецептору интерферона; непептидные химические агонисты; и подобное.

[00871] Особым примером агониста рецепторов интерферона II типа является IFN-гамма и его варианты. Хотя настоящее изобретение приводит в качестве примера применение полипептида IFN-гамма, будет совершенно очевидно, что в рассматриваемом способе может быть использован любой агонист рецепторов интерферона II типа.

Ингибиторы SAPK

[00872] Ингибиторы SAPK, подходящие для применения в рассматриваемом способе лечения, в особенности включают в себя пирфенидон и аналоги пирфенидона; а также в особенности включают в себя любое соединение Формулы I, указанное в публикации патента США №20030149041.

[00873] Дополнительные ингибиторы SAPK, подходящие для использования в данном изобретении, включают в себя агенты, которые ингибируют ферментативную активность SAPK по крайней мере примерно на 10%, по крайней мере примерно на 20%, по крайней мере примерно на 25%, по крайней мере примерно на 30%, по крайней мере примерно на 35%, по крайней мере примерно на 40%, по крайней мере примерно на 50%, по крайней мере примерно на 60%, по крайней мере примерно на 70%, по крайней мере примерно на 80%, или, по крайней мере примерно на 90%, или более, по сравнению с ферментативной активностью SAPK в отсутствие ингибитора SAPK.

[00874] Пути передачи сигнала, в которых задействованы митогенактивированные протеинкиназы (МАРК), играют важную роль в разнообразных ответных реакциях клетки, включая рост, активированную стрессом экспрессию генов, и компенсаторные функции при изменениях окружающей среды. МАРК включают в себя группу SAPK, включающую c-Jun N-концевую киназу (JNK) и киназы р38. р38 группа МАРКиназ включает в себя по крайней мере четыре члена, обозначенных р38 или р38α, р38β, р38γ, и р38δ. Известны аминокислотные последовательности р38α, р38β, and p38γ различных видов. Например, аминокислотные последовательности р38α, р38β p38γ человека находятся под следующими регистрационными номерами в GenBank: I) Q16539, NP_620583 и NP_001306 предоставляют аминокислотные последовательности полипептидов р38а человека; 2) NP_620478, NP_002742 и Q15759 предоставляют аминокислотные последовательности полипептидов р38β человека; и 3) NP_002960, P53778, и JC5252 предоставляют аминокислотные последовательности полипептидов p38γ человека.

[00875] В некоторых вариантах осуществления, подходящим ингибитором SAPK является агент, который ингибирует ферментативную активность р38α, р38β и p38γ. В других вариантах осуществления, подходящим ингибитором SAPK является агент, который предпочтительно ингибирует ферментативную активность р38α и р38β, т.е. этот агент является более мощным ингибитором ферментативной активности р38α и р38β, чем активности p38γ, например, IC50 этого агента в отношении р38α и р38β по крайней мере примерно в два раза ниже, или примерно в пять раз ниже, или примерно в десять раз ниже, или еще ниже, чем IC50 этого агента в отношении p38γ.

[00876] В других вариантах осуществления, подходящим ингибитором SAPK является агент, который предпочтительно ингибирует p38γ, т.е. этот агент является более мощным ингибитором ферментативной активности p38γ, чем активности р38α и р38β, напримбер, IC50 этого агента в отношении p38y по крайней мере примерно в два раза ниже, или примерно в пять раз ниже, или примерно в десять раз ниже, или еще ниже, чем IC50 этого агента в отношении р38α и р38β.

[00877] В некоторых вариантах осуществления, ингибитором SAPK является конкурентный ингибитор SAPK, например, р38α, a p38β, or a p38γ. In some of these embodiments, a SAPK inhibitor is one that competes for adenosine triphosphate (ATP) for binding to the ATP binding site of р38α, р38β, or p38γ.

[00878] Кроме того, ингибиторы стресс-активированной протеинкиназы (SAPK), которые подходят для применения в рассматриваемой комбинированной терапии, включают в себя любой 2-алкилимидазол, описанный в патенте США №6548520; любое из соединений 1,4,5-замещенного имидазола, описанных в патенте США №6489325; соединения 1,4,5-замещенного имидазола, описанные в патенте США №6569871; соединения гетероариламинофенилкетона, описанные в опубликованной патентной заявке США №2003/0073832; соединения пиридилимидазола, описанные в патенте США №6,288,089; и гетероариламинобензофеноны, описанные в патенте США №6432962. Также подходящими для использования являются соединения, описанные в патенте США №6214854. Также подходящими для использования являются гетероциклические соединения, которые рассматривались в международной публикации WO 99/61426.

Специально включенные пирфенидон и аналоги пирфенидона подробно описаны ниже. Как уже обсуждалось выше особенно включаются соединения формулы I из патентной публикации США 20030149041. Формула I является следующей:

где R¹ выбирают из -Н, углеводорода С₁-С₂₀, аминокарбонилалкила, алкоксиалкила, замещенного арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, гетероциклилалкила и замещенного гетероциклилалкила;

R² выбирают из галогена, углеводорода C₁-C₂₀, гидрокси, гетероарила, замещенного гетероарила, гетероциклила, замещенного гетероциклила;

R⁵ выбирают из -Н, алкила замещенного алкила;

R⁶ выбирают из прямой связи, алкила, арила, замещенного арила и гетероарила;

R⁷ выбирают из -Н, ацила, алкила, замещенного алкила, алкоксикарбонила, амидина, арила, аралкила, гетероциклила, гетероарила, замещенного гетероарила 1, замещенного алкокси, гетероарилсульфонамидо, диалкилсульфонамидо,

-C(O)NR⁸R⁹, -C(NH)NR⁸R⁹ и -NR⁸R⁹;

R⁸ выбирают из -Н и алкила;

R⁹ выбирают из -Н, алкила, замещенного алкила, арила, гетероарила, алкилкарбонила и арилкарбонила;

R³ выбирают из прямой связи,

где левая связь является местом присоединения к кольцу и правая связь является местом присоединения к R⁴;

R⁴ выбирают из -Н, галогена, алкила, гетероциклила, алкиламино, аминокарбонила,

и

где R¹⁰ выбирают из -Н, -ОН, алкила, циклоалкила и замещенного циклоалкила;

R¹¹ выбираютиз -Н, -ОН, -СООН, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, арил замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, алкокси, аминокарбонила, аминокарбонилалкила,

R¹² выбирают из алкила и арила; R13 выбирают из "Н и арила;

R¹⁴ выбирают из арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного алкила, арил замещенного алкила и алкокси замещенного алкила;

R¹⁵ выбирают из алкила, арила, замещенного арила и замещенного алкила;

R¹⁶ выбирают из арила, замещенного арила, гетероарила, карбоксила, алкокси, замещенного алкила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, аминокарбонила, замещенного аминокарбонила, гетероциклила и

R¹⁷ выбирают из алкила и диалкиламина; R¹⁸ выбирают из углеводорода С₁-С₂₀, замещенного углеводорода C₁-C₂₀, и гетероарила; Y выбирают из -Н и низшего алкила, или Y и R¹ взятые вместе с присоединенным N могут быть выбраны из гетероциклила, замещенного гетероциклила, гетероарила и замещенного гетероарила; где по крайней мере два X, X¹ и Х представляют -N=, и другой выбирают из -С(Н)= и --N=.

Особый интерес в некоторых воплощениях изобретения представляет использование любого из следующих соединений ингибиторов SAPK, или их фармацевтически приемлемых солей, производных, сложных эфиров или аналогов:

которое имеет название по IUPAC (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(1Н-индол-5-ил)-метанон. Также пригодными для использования являются любые из следующих соединений: (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(6-хлор-1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-хлор-Н-индол-5-ил-[4-(4-фтор-бензил)-пиперидин-1-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(4-метокси-1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-{1-[3-(циклогексилметиламино)-2-гидроксипропил]-1Н-индол-5-ил}-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-{1-[2-гидрокси-3-(4-метилпиперазин-1-ил)-пропил]-1Н-индол-5-ил}-метанон; [1-(3-бензила-мино-2-гидроксипропил)-1Н-индол-5-ил]-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-{1-[2-гидрокси-3-(4-метокси-бензилами-но)-пропил]-1Н-индол-5-ил}-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(2-гидрокси-3-пропиламино-пропил)-1Н-индол-5-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(пиридин-4-карбонил)-1Н-индол-5-ил]-метанон; 1-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-этанон; 2-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-N-(4-метокси-бензил)-ацетамид; (2-метокси-этил)-амид (2-метокси-этил)-5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; (2-метиламино этил)-амид 5-(4бензилпиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; (2-амино-этил)-амид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; [3-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-5-ил]-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-метанон; [3-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-6-ил]-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-метанон; 4-фтор-бензиламид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-ин-дол-3-карбоновой кислоты; [2-(3,5-диметокси-фенил)-этил]-амид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(6-метокси-1Н-индол-5-ил)-метанон; 1-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-ил]-2,2,2-трифтор-этанон; (2-диметиламино-этил)-амид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-6-метокси-1Н-индол-3-карбоновая кислота; 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновая кислота; (2-диметиламино-этил)-амид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-фтор-бензил)-пиперидин-1-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(3-морфолин-4-илметил-1Н-индол-5-ил)-метанон; 1-[6-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-ил]-2,2,2-трифтор-этанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(пиридин-4-карбонил)-1Н-индол-6-ил]-метанон; (3-бензил-8-аза-бицикло[3.2.1]окт-8-ил)-(6-метокси-1Н-индол-5-ил)-метанон; (3Н-бензоимидазол-5-ил)-(3-бензил-8-аза-бицикло[3.2. 1]окт-8-ил)-метанон; [3-(4-фтор-бензил)-пирролидин-1-ил]-(1Н-индол-6-ил)-метанон; (1Н-бензимидазол-5-ил)-[4-(2,6-дифтор-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-метилсульфанил-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(2,3-дифтор-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(3,5-дифтор-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(3-хлор-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; метиловый эфир 4-[4-(1Н-бензо-имидазол-5-карбонил)-пиперазин-1-ил-метил]-бензойной кислоты; (1H-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-метокси-бензил)-пиперазин-1-у1]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-трифторметокси-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-метил-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(2,4-дихлор-бензоил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(3,4-дихлор-бензоил)-пиперазин-1-ил]-метанон; транс-1-[4-(1Н-бензоимидазол-5-карбонил)-пиперазин-1-ил]-3-(3-трифторметил-фенил)-пропенон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-хлор-бензоил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-(4-бензоил-пиперазин-1-ил)-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(2-трифторметил-бензоил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-метокси-бензоил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(3,4-дихлор-фенил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-{4-[(4-хлорфенил)-фенил-метил]-пиперазин-1-ил}-метанон; транс-(1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(3-фенил-аллил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-{4-[бис-(4-фтор-фенил)-метил]-пиперазин-1-ил}-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-хлор-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(2-хлор-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(3,4,5-трифторметокси-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-диэтиламинро-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (1Н-бензоимида-зол-5-ил)-(4-бифенил-4-илметил-пиперазин-1-ил)-метанон; (1H-бензоимидазол-5-ил)-[4-(4-фенокси-бензил)-пиперазин-1-ил]-метанон; (4-бензилпиперидин-1-ил)-(6-метокси-1Н-ензоимидазол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пипе-ридин-1-ил)-(1-изопропил-1Н-бензоимидазол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(3-изопропил-3Н-бензоимидазол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(1-изопропил-1 Н-индол-5-ил)-метанон; [4-(4-хлор-бензил)-пиперазин-1-ил]-(1-изопропил-1Н-индол-5-ил)-метанон; (1Н-бензотриазол-5-ил)-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(1-изопропил-1Н-бензотриазол-5-ил)-метанон; [4-(4-хлор-бензил)-пиперидин-1-ил]-(1Н-индол-5-ил)-метанон; [4-(3-хлор-бензил)-пиперидин-1-ил]-(1Н-индол-5-ил)-метанон; [4-(2-хлор-бензил)-пиперидин-1-ил]-(1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-бензил-2-метил-пиперидин-1-ил)-(1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(4-хлор-1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[7-хлор-1-(пиридин-3-карбонил)-1Н-индол-6-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(5-хлор-1Н-индол-6-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(7-хлор-1Н-индол-6-ил)-метанон; (2-диметиламиноэтил)-амид 6-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-7-хлор-1-(пиридин-3-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(1-пиридин-4-илметил-1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[6-метокси-1-(пиридин-3-карбонил)-1Н-индол-5-ил]-метанон; метиловый эфир [5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-уксусной кислоты; 1-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-3-изопропиламино-пропан-1-он; 1-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-3-пиперазин-1-ил-пропан-1-он; 3-бензиламино-1-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-пропан-1-он; 1-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-3-морфолин-4-ил-пропан-1-он; 2-[5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-индол-1-ил]-N-пропил-ацетамид; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(2-диэтиламиноэтил)-6-метокси-1Н-индол-5-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(3-диэтиламинопропил)-1Н-индол-5-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(2-диэтиламино-этил)-1Н-индол-5-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[6-хлор-1-(3-диэ-тиламинопропил)-1Н-индол-5-ил]-метанон; [1-(2-диэтиламиноэтил)-1Н-индол-5-ил]-[4-(4-фтор-бензил)-пиперидин-1-ил]-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-[1-(3-диэтиламинопропил)-6-метокси-1Н-индол-5-ил]-метанон; (2-аминоэтил)-метил-амид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; [2-(3,4-диметокси-фенил)-этил]-амид 5-(4-бензил-пиперидин-1-карбонил)-1Н-индол-3-карбоновой кислоты; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(3-диэтиламинометил-1Н-индол-5-ил)-метанон; [4-(4-фтор-бензил)-пиперидин-1-ил]-(6-метокси-1Н-индол-5-ил)-метанон; (4-бензил-пиперидин-1-ил)-(1-пиридин-4-ил-1Н-индол-5-ил)-метанон; и 4-(4-бензил-пиперидин-1-ил)-(4-хлор-2-метил-1Н-индол-5-ил)-метанон; или фармацевтически приемлемые соли, или производные, или эфиры, или аналоги любого из предшествующих соединений.

Особый интерес при воплощении изобретения представляет применение любого из следующих соединений ингибиторов SAPK или их фармацевтически приемлемых солей, или производных, или эфиров, или аналогов:

которое имеет название по IUPAC '[2-(2-хлор-фенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил амин. Также пригодными для использования являются любые из следующих соединений: [2-(2,6-дихлорфенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; пиридин-4-ил-(2-о-толил-хиназолин-4-ил)-амин; [2-(2-бромфе-нил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; [2-(2-фторфенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; [2-(2,6-дифторфенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-4-ил-амин; [2-(4-фторфенил)-хиназолин-4-ил]-придин-4-ил-амин; [2-(4-метоксифенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; [2-(3-фторфенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; изопропил-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-4-ил-амин; (4-метокси-бензил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-4-ил-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-4-илметил-амин; [2-(4-хлор-фенил)-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-илметил-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-3-ил-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-2-илметил-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиридин-3-илметил-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-(2-пиридин-2-ил-этил)-амин; (2-фенил-хиназолин-4-ил)-пиримидин-4-ил-амин; (2-фенил-хи-назолин-4-ил)-пиримидин-2-ил-амин; фенил-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; бензил-[2-(3-хлорфенил)-хиназолин-4-ил]-амин; 3-(2-фенил-хиназолин-4-иламино)-фенол; 2-(2-фенил-хиназолин-4-иламино)-фенол; 4-(2-фенил-хиназолин-4-иламино)-фенол; (1Н-индол-4-ил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; (1Н-индол-5-ил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; (4-метокси-фенил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; (3-метокси-фенил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; (2-метоксифенил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; 2-[4-(2-фенил-хиназолин-4-иламино)-фенил]-этанол; 3-(2-фенил-хиназолин-4-ила-мино)-бензонитрил; (2,5-дифтор-бензил)-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; [4-(2-бутил)-фенил]-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-амин; N,N-диметил-N'-(2-фенил-хиназолин-4-ил)-бензол-1,4-диамин; [2-(2-хлор-фенил)-6,7-диметокси-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; [2-(2-фтор-фенил)-6-нитро-хиназолин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; 2-(2-фтор-фенил)-N4-пиридин-4-ил-хиназолин-4,6-диамин; 2-(2-фторфенил)-N4-пиридин-4-ил-хиназолин-4,7-диамин; 2-(2-фторфенил)-N6-(3-метокси-бензил)-N4-пиридин-4-ил-хиназолин-4,6-диамин; 2-(2-фторфенил)-N6-(4-метокси-бензил)-N4-пиридин-4-ил-хиназолин-4,6-диамин; N6-изобутил-2-(2-фторфенил)-N4-пиридин-4-ил-хиназолин-4,6-диамин; 2-(2-фторфенил)-N6-(4-метилсульфанил-бензил)-N4-пиридин-4-ил-хиназолин-4,6-диамин; 4-(4-пиридиламино)-2-(4-хлорфенил)-хиназолин; 2-фенил-4-(2-пиридиламино)-хиназолин; и [2-(2-фторфенил)-пиридо[2,3-d]пиримидин-4-ил]-пиридин-4-ил-амин; или фармацевтически приемлемые соли, или производные, или эфиры, или аналоги любого из предшествующих соединений.

Еще пригодным ингибитором SAPK является BIRB796 (1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-[4-(2-морфолин-4-ил-этокси)-нафтален-1-ил]-мочевина); см. патент США №6,319,921. BIRB796 имеет следующую структуру:

Также пригодными для использования являются фармацевтически активные производные, аналоги, эфиры или соли BIRB796.

Другим пригодным ингибитором SAPK является 2(1Н)-хиназолинон, как показано ниже:

Также пригодными для использования являются фармацевтически активные производные, аналоги, эфиры или соли 2(1Н)-хиназолинона.

Дополнительно пригодным для использования является VX-745 (Phar-maceuticals and Kissei Pharmaceutical Co.) Сообщается, что VX-745 ингибирует некоторые изотипы р38, включая р38-альфа, р38-бета и р38-гамма.

Пирфенидон и его аналоги

Пирфенидон (5-метил-1-фенил-2-(1Н)-пиридон) и специфические аналоги пирфенидона могут использоваться для усиления методов лечения упомянутой здесь HCV инфекции.

Пирфенидон

Аналоги пирфенидона

Описание заместителей R₁, R₂, X

R₁: карбоцикл (насыщенный и ненасыщенный), гетероцикл (насыщенный или ненасыщенный), алкилы (насыщенный и ненасыщенные). Например фенил, бензил, пиримидил, нафтил, индолил, пирролил, фурил, тиенил, имидазолил, циклогексил, пиперидил, пирролидил, морфолинил, циклогексенил, бутидиенил и тому подобное.

R₁ может далее включать заместители на карбоциклических или гетероциклических фрагментах с такими заместителями, как галоид, нитро, амино, гидроксил, алкокси, карбоксил, циано, тио, аклил, арил, гетероалкил, гетероарил и их комбинации, например, 4-нитрофенил, 3-хлорфенил, 2,5-динитрофенил, 4-метоксифенил, 5-метилпирролил, 2,5-дихлорцикло-гексил, гуанидинил-циклогескил и тому подобное.

R₂: алкил, карбоцикл, арил, гетероцикл, гидроксил, алкокси, карбоксил. Примеры включают: метил, этил, пропил, изопропил, фенил, 4-нитрофенил, тиенил, гидроксил, метокси, карбокси и так далее.

Х может быть любым числом (от 1 до 3) заместителей на карбоциклическом или гетероциклоческом кольце. Заместители могут быть одинаковыми или разными. Заместители могут включать водород, алкил, гетероалкил, арил, гетероарил, галоид, нитро, карбоксил, гидроксил, циано, амино, тио, алкиламино, галоарил и тому подобное.

Заместители могут быть далее замещенными 1-3 заместителями из группы, состоящей из алкильных, арильных, нитро, алкокси, гидроксильных и галоидных групп. Примеры включают: метил, 2,3-диметил, фенил, р-толил, 4-хлорфенил, 4-нитрофенил, 2,5-дихлорфенил, фурил, тиенил и тому подобные.

Специальные примеры, включающие такие соединения, приведены в таблице 10:

Таблица 10 IA IIВ 5-Метил-1-(2'-пиридил)-2-(1Н)пиридин, 6-Метил-1-фенил-3-(1Н)пиридон, 6-Метил-1-фенил-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-р-толил-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-3-фенил-1-(2'-тиенил)-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(2'-нафтил)-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(2'-нафтил)-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-фенил-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-р-толил-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(5'-хинолил)-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(1'-нафтил)-2-(1Н)пиридон, 5-Этил-1-фенил-3-(1Н)пиридон, 5-Этил-1-фенил-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(4'-метоксифенил)-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(5'-хинолил)-2-(1Н)пиридон, 4-Метил-1-фенил-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(4'-хинолил)-2- 5-Метил-1-(3'-пиридил)-3-(1Н)пиридон, (1Н)пиридон,   5-Метил-1-(4'-пиридил)-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(2'-тиенил)-3-(1Н)пиридон, 3-Метил-1-фенил-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(2'-пиридил)-3-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(4'-метоксифенил)-2-(1Н)пиридон, 5-Метил-1-(2'-хинолил)-3-(1Н)пиридон, 1-Фенил-2-(1Н)пиридон, 1-Фенил-3-(1Н)пиридон, 1,3-Дифенил-2-(1Н)пиридон, 1-(2'-Фурил)-5-метил-3-(1Н)пиридон, 1,3-дифенил-5-метил-2-(1Н)пиридон, 1-(4'-Хлорфенил)-5-метил-3-(1Н)пиридин. 5-Метил-1-(3'-трифторметилфенил)-2-(1Н)пиридон,   3-Этил-1-фенил-2-(1Н)пиридон,   5-Метил-1-(3'-пиридил)-2-(1Н)пиридон,   5-Метил-1-(3-нитрофенил)-2-(1Н)пиридон,   3-(4'-хлорфенил)-5-метил-1-фенил-2-(1Н)пиридон,   5-Метил-1-(2'-тиенил)-2-(1Н)пиридон,   5-Метил-1-(2'-тиазолил)-2-(1Н)пиридон,   3,6-Диметил-1-фенил-2-(1Н)пиридон,   1-(4'-хлорфенил)-5-метил-2-(1Н)пиридон,   1-(2'-имидазолил)-5-метил-2-(1Н)пиридон,   1-(4'-нитрофенил)-2-(1Н)пиридон,   1-(2'-фурил)-5-метил-2-(1Н)пиридон,   1-Фенил-3-(4'-хлорфенил)-2-(1Н)пиридин.  

Патенты США №3974281; 3839346; 4042699; 4052509; 5310562; 5518729; 5716632; и 6090822 описывают способы синтеза и приготовление фармацевтических композиций пирфенидона и специфических аналогов пирфенидона для использования в методах настоящего изобретения.

Антагонисты TNF

[00913] Для использования в настоящем изобретении подходящие антагонисты TNF-α включают в себя агенты, которые снижают уровень синтеза TNF-α, агенты, блокирующие или ингибирующие связывание TNF-α с рецептором к TNF-α (TNFR), и агенты, блокирующие или ингибирующие передачу сигнала, опосредованную TNFR. Если не указано особо, будет понятно, что здесь каждая ссылка на «антагонист TNF-α» или «антагонист TNF» означает антагонист TNF-α, а не ингибиторы SAPK (в том числе пирфенидон и аналоги пирфенидона).

[00914] Используемые здесь термины «полипептид рецептора TNF» и «полипептид TNFR» относятся к полипептидам, которые являются производными TNFR (любых видов), которые способны к связыванию с TNF. Были описаны два различных TNFR клеточной поверхности: TNFR II типа (или р75 TNFR или TNFR II) и TNFR I типа (или р55 TNFR или TNFR I). Зрелый р75 TNFR человека полной длины представляет собой гликопротеин, с молекулярной массой около 75-80 килодальтон (kD). Зрелый р55 TNFR человека полной длины представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 55-60 kD. Характерные полипептиды TNFR являются производными TNFR I типа и/или TNFR II типа. Растворимый TNFR включает в себя полипептид р75 TNFR; слияния р75 TNFR с гетерологичными партнерами слияния, например, Fc частью иммуноглобулина.

[00915] Полипептид TNFR может быть интактным TNFR или подходящим фрагментом TNFR. В патенте США №5605690 приведены примеры полипептидов TNFR, в том числе полипептидов растворимых TNFR, подходящих для использования в настоящем изобретении. Во многих вариантах осуществления полипептид TNFR содержит внеклеточный домен TNFR. В некоторых вариантах осуществления полипептид TNFR представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен TNFR, связанный с константным доменом молекулы иммуноглобулина. В других вариантах осуществления полипептид TNFR представляет собой слитый полипептид, содержащий внеклеточный домен р75 TNFR, связанный с константным доменом молекулы IgG1. В некоторых вариантах осуществления, когда рассматривается введение людям, Ig, используемый для слитых белков, представляет собой иммуноглобулин человека, например, IgG1 человека.

[00916] В настоящем изобретении могут быть использованы моновалентные и мультивалентные формы полипептидов TNFR. Мультивалентные формы полипептидов TNFR имеют более одного сайта связывания с TNF. В некоторых вариантах осуществления, TNFR представляет собой бивалентную или димерную форму TNFR. Например, как описано в патенте США №5605690 и у Mohler et al., 1993, J. Immunol, 151:1548-1561, химерный полипептид антитела с внеклеточными доменами TNFR, замещенными на вариабельные домены любой из тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина, или их обеих, могут представлять полипептид TNFR для настоящего изобретения. В основном, когда такой химерный полипептид ТNFR:антитело продуцируется клетками, он образует бивалентную молекулу посредством дисульфидных связей между доменами иммуноглобулина. Такой химерный полипептид TNFR:антитело называется TNFR:Fc.

[00917] В одном варианте осуществления, рассматриваемый способ включает в себя введение эффективного количества растворимого TNFR ENBREL® этанерцепта. ENBREL® представляет собой димерный слитый белок, состоящий из внеклеточной лигандсвязывающей части TNFR человека 75 килодальтон (р75), связанной с Fc частью IgG1 человека. Fc компонент ENBREL® содержит СН2 домен, СH3 домен и шарнирную область, но не СН1 домен IgG1. ENBREL® продуцируется в клеточной экспрессионной системе млекопитающих овоцитах китайского хомячка. Он состоит из 934 аминокислот и имеет среднюю малекулярную массу приблизительно 150 килодальтон. Smith et al. (1990) Science 248:1019-1023; Mohler et al. (1993) J. Immunol 151:1548-1561; патент США №5395760; и патент США №5605690.

[00918] Для использования также подходят моноклональные антитела, которые связываются с TNF-α. Моноклональные антитела включают в себя «гуманизированные» мышиные моноклональные антитела; химерные антитела; моноклональные антитела, которые являются по крайней мере примерно на 80%, по крайней мере примерно на 90%, по крайней мере примерно на 95% или 100% антителами человека по аминокислотной последовательности; и подобные. Смотри, например, WO 90/10077; WO 90/04036; и WO 92/02190. Подходящие моноклональные антитела включают в себя фрагменты антител, такие как Fv, F(ab')₂ и Fab; синтетические антитела; искусственные антитела; антитела, полученные методом фагового дисплея; и подобные.

[00919] Примеры подходящих моноклональных антител включают в себя инфликсимаб (REMICADE®, Centocor); и адалимумаб (HUMIRA^TM, Abbott) REMICADE® представляет собой химерное моноклональное антитело к TNF-α, которое содержит около 25% аминокислотной последовательности мыши и около 75% аминокислотной последовательности человека. REMICADE® содержит вариабельный участок мышиного моноклонального анти-TNF-α антитела к константному участку IgG1 человека. Elliott et al. (1993) Arthritis Rheum. 36:1681-1690; Elliott et al. (1994) Lancet 344:1105-1110; Baert et al. (1999) Gastroenterology 116:22-28. HUMIRA^TM представляет собой моноклональное IgG1 антитело человека полной длины, которое было идентифицировано с использованием технологии фагового дисплея. Piascik (2003) J. Am. Pharm. Assoc. 43:327-328.

[00920] Способы оценки антагонистической активности в отношении TNF известны в данной области и продемонстрированы здесь. Например, антагонистическую активность в отношении TNF можно оценить с помощью анализа конкурентного связывания с использованием клеток. В таком исследовании радиоактивно меченный TNF смешивают с антагонистом TNF в серийном разведении и клетками, экспрессирующими TNFR, связанный с клеточной мембраной. Части этой суспензии центрифугируют для разделения свободного и связанного TNF и определяют величину радиоактивности в свободных и связанных фракциях. Активность антагониста TNF оценивают по ингибированию связывания TNF с клетками в присутствии антагониста TNF.

[00921] В качестве другого примера, способность антагонистов TNF нейтрализовать активность TNF in vitro может быть проанализирована в биологическом исследовании с использованием клеток, у которых предполагают наличие цитотоксической активности TNF, в качестве клеток-мишеней. В таком исследовании, клетки-мишени, культивированные с TNF, обрабатывают различными количествами антагониста TNF и последовательно исследуют на наличие цитолиза. Антагонистическую активность в отношении TNF оценивают по снижению цитолиза клеток-мишений, индуцированного TNF в присутствии антагониста TNF.

Антагонисты TGF-β

[00922] Антагонисты TGF-β, подходящие для использования в рассматриваемом способе лечения, включают в себя агенты, которые снижают уровень синтеза TGF-β, агенты, которые блокируют или ингибируют связывание TGF-β с рецептором к TGF-β, и агенты, которые блокируют или ингибируют передачу сигнала, опосредованную рецептором к TGF-β. Используемый здесь термин «антагонист TGF-β» относится к любому агенту, который снижает уровень синтеза TGF-β, любому агенту, который блокирует или ингибирует связывание TGF-β с рецептором к TGF-β, и любому агенту, который блокирует или ингибирует передачу сигнала, опосредованную рецептором к TGF-β. Если не указано особо, здесь будет понятно, что каждая ссылка на «антагонист TGF-R» означает антагонист TGF-β, а не ингибиторы SAPK (включая пирфенидон и аналоги пирфенидона). Используемый здесь термин «TGF-β» включает в себя любой подтип TGF-β, в том числе TGF-β 1, TGF-β2 и TGF-β3. Подходящие антагонисты TGF-β включают в себя, но не только, антитела, специфичные к TGF-β (в том числе антитела, специфичные к конкретному подтипу TGF-β; и антитела, перекрестно реагирующие с двумя или более подтипами TGF-β); антитела к рецептору TGF-β; растворимый рецептор TGF-β; декорин; и агенты, ингибирующие передачу сигнала TGF-β.

[00923] Подходящие антагонисты TGF-β включают в себя антитела, специфичные к TGF-β. Антитела, специфичные к TGF-β, известны в данной области. Смотри, например, патенты США №5783185, 5772998, 5674843, 5571714, 5462925 и 5426098; WO 97/13844; и патентные публикации США №20030064069 и 20030091566. Неограничивающие примеры подходящих анти-TGF-β антител включают в себя CAT-152 (лерделибумаб; Tfabio^TM; Cambridge Antibody Technology), моноклональное антитело человека к TGF-β2; CAT-192 (метелимумаб; Cambridge Antibody Technology), моноклональное антитело человека к TGF-β 1; и GC-1008 (Genzyme Corp.), полиспецифичное моноклональное антитело человека к TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3.

[00924] Подходящие антагонисты TGF-β включают в себя растворимые TGF-β рецепторы. Растворимые TGF-β рецепторы лишены большинства или всей трансмембранной части природного TGF-β рецептора, так, что белок, не связанный с мембраной, еще сохраняет связывание с TGF-β. Растворимые TGF-β рецепторы включают в себя растворимые слитые белки, включающие в себя часть TGF-β рецептора, слитого в рамке считывания с гетерологичным белком (не с рецептором TGF-β) («партнером слияния»). Неограничивающими примерами партнеров слияния являются Fc иммуноглобулина, полигистидин, и подобное. Растворимые TGF-β рецепторы уже были описаны в уровне техники. Смотри, например, Wang et al. (1999) Thorax 54:805-812; George et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12719-12724; Muraoka et al. (2002) J. din. Invest. 109:1551-1559; и Yata et al. (2002) Hepatology 35:1022-1030.

[00925] Антагонисты TGF-β включают в себя Gleevec^TM. Gleevec^TM (также известный как STI-571 или CGP57148B), имеющий химическое название 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино-фенил]бензамид метансульфонат, широко известен как иматиниб мезилат и продается под товарным знаком Gleevec^TM. Gleevec^TM представляет собой 2-фениламинопиримидин, который нацелен на АТФ-связывающий сайт киназного домена Bcr-Abl тирозинкиназы (смотри, например, Druker et al. (1996) Nature Med. 2, 561; и Buchdunger et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2558-2562).

В некоторых воплощениях изобретения агенты представляют собой производные пиримидина, как описано в патенте США No. 5521184, которые включены здесь в качестве ссылки. В этих воплощениях изобретния интерес представляют производные М-фенил-2-пиримидинамина формулы (I):

где R_9' означает водород или низший алкил,

Х означает оксо, тио, имино, N-низший алкил-имино, гидроксимино или O-низший алкил-гидроксимино,

Y означает кислород или группу NH,

k равно 0 или 1 и

R₁₀ означает алифатический радикал, имеющий по крайней мере 5 углеродных атомов, или ароматический, ароматический-алифатический, циклоалифатический, циклоалифатический-алифатический, гетероциклический или гетероциклический-алифатический радикал, и оставшиеся радикалы R_4', R_5', R_6', R_7' и R_8' каждый независимо от других означают водород, низший алкил, который является незамещенным или замещенным свободной или алкилированной аминогруппой, пиперазинилом, пиперидинилом, пирролидинилом или морфолинилом, или низший алканоил, трифторметил, свободная или этерифицированная до простого или сложного эфира оксигруппа, свободная, алкилированная или ацилированная аминогруппа или свободная или этерифицированная до сложного эфира карбоксигруппа, и соли таких соединений, которые имеют по крайней мере одну солеобразующую группу.

В этих воплощениях изобретения: 1-метил-1H-пирролил преимущественно означает 1-метил-1Н-пиррол-2-ил или 1-метил-1H-пиррол-3-ил.

Амино- или амино-низший алкил-замещенный фенил R₁, где амино группа в каждом случае является свободной, алкилированной или ацилированной, представляет собой фенил, замещенный в любом желаемом положении (орто, мета или пара), где алкилированная аминогруппа представляет собой преимущественно моно- или ди-низший алкиламиногруппу, например, диметиламино, и низший алкильный фрагмент низшей алкил-аминогруппы преимущественно представляет собой линейный C₁-С₃ алкил, предпочтительно такой как метил или этил.

1H-Индолил, связанный с углеродным атомом пятичленного кольца, представляет собой 1Н-индол-2-ил или IH-индол-3-ил.

Незамещенный или замещенный низшим алкилом пиридил, связанный с кольцевым углеродным атомом, представляет собой замещенный низшим алкилом или преимущественно незамещенный 2-, или предпочтительно 3- или 4-пиридил, например, 3-пиридил, 2-метил-3-пиридил, 4-метил-3-пиридил или 4-пиридил. Пиридил, замещенный по атому азота кислородом, представляет собой радикал, произведенный от пиридин N-оксида, то есть N-оксидо-пиридил, например, М-оксидо-4-пиридил.

Фторзамещенная низшая алкоксигруппа представляет собой низший алкокси, имеющий в качестве заместителя по крайней мере один, но преимущественно несколько атомов фтора, особенно трифторметокси или предпочтительно 1,1,2,2-тетрафторэтокси.

Когда Х представляет собой кислород, тио, имино, N-низший алкилимино, гидроксимино или O-низший алкил-гидроксимино, группа С=Х представляет собой, в вышеупомянутом порядке, радикал С=O, C=S, C=N-Н, С=N-низший алкил, C=N-OH или CN-O-низший алкил, соответственно. Х предпочтительно представляет собой оксо. k предпочтительно 0, то есть группа Y отсутствует. Y, если присутствует, предпочтительно представляет собой группу NH.

Термин "низший" в объеме этого текста означает радикал, имеющий до, включительно, 7, предпочтительно до, включительно, 4, атомов углерода.

Низший алкил R_1', R_2', R_3' и R_9' предпочтительно означает метил или этил. Алифатический радикал R₁₀, имеющий по крайней мере 5 атомов углерода, преимущественно имеет не более 22 атомов углерода, в основном не более 10 атомов углерода, и является замещенным или предпочтительно незамещенным алифатическим радикалом, то есть замещенным или предпочтительно незамещенным алкинильным, алкенильным или предпочтительно алкильным радикалом, таким как C₅-C₇ алкил, например, н-пентил. Ароматический радикал R₁₀ имеет до 20 углеродных атомов и является незамещенным или замещенным, например, в каждом случае незамещенный или замещенный нафтил, особенно такой, как 2-нафтил, или предпочтительно фенил, где заместители преимущественно выбраны из циано, незамещенного или окси-, амино- или 4-метил-пиперазинил-замещенного низшего алкила, особенно такого, как метил, трифторметил, свободный, этерифицированная до простого или сложного эфира оксигруппа, свободная, алкилированная или ацилированная аминогруппа и свободная или этерифицированная до сложного эфира карбоксигруппа. В ароматическом-алифатическом радикале R₁₀ ароматическая часть является такой, как определено выше, и алифатическая часть преимущественно представляет собой низший алкил, особенно, такой как C₁-C₂ алкил, который является замещенным или преимущественно незамещенным, например бензил. Циклоалифатический радикал R₁₀ имеет главным образом до 30, более предпочтительно до 20, и наиболее предпочтительно до 10 атомов углерода, является моно- или полициклическим и замещенным или преимущественно незамещенным, например, циклоалкильным радикалом, главным образом 5- или 6-членным циклоалкильным радикалом, предпочтительно циклогексилом. В циклоалифатическом-алифатическом радикале R₁₀ циклоалифатическая часть является такой, как определено выше, и алифатическая часть преимущественно представляет собой низший алкил, особенно, такой как C₁-C₂ алкил, который является замещенным или преимущественно незамещенным. Гетероциклический радикал R₁₀ содержит в основном до 20 атомов углерода и является преимущественно насыщенным или ненасыщенным моноциклическим радикалом, имеющим 5 или 6-членное кольцо и 1-3 гетероатома, которые преимущественно выбраны из азота, кислорода и серы, особенно, например, тиенил или 2-, 3- или 4-пиридил, или би- или три-циклическим радикалом, в котором, например, один или два бензольных радикала являются конденсированными с образованием указанного моноциклического радикала. В гетероциклическом-алифатическом радикале R₁₀ гетероциклическая часть является такой, как определено выше, и алифатическая часть преимущественно представляет собой низший алкил, особенно, такой как C₁-C₂ алкил, который является замещенным или преимущественно незамещенным.

Этерифицированная до простого эфира оксигруппа преимущественно означает низший алкокси. Этерифицированная до сложного эфира оксигруппа преимущественно представляет собой оксигруппу, этерифицированную до сложного эфира органической карбоновой кислотой, такой как низшая алифатическая кислота, или минеральной кислотой, такой как галоидоводородная кислота, например, низший алканоилокси или, преимущественно, галоид, такой как иод, бром или особенно фтор или хлор.

Алкилированная аминогруппа представляет собой, например, низшую алкиламиногруппу, такую как метиламино, или ди-низший алкиламино-группу, такую как диметиламино. Ацилированная аминогруппа представляет собой, например, низшую алканоиламиногруппу или бензоиламино-группу.

Этерифицированная до сложного эфира карбоксигруппа представляет собой, например, низший алкоксикарбонил, такой как метоксикарбонил.

Замещенный фенильный радикал может иметь до 5 заместителей, таких как фтор, но в основном, в случае относительно больших заместителей, он имеет от 1 до 3 заместителей. В качестве примеров замещенного фенила могут быть специально указаны 4-хлорфенил, пентафторфенил, 2-карбо-ксифенил, 2-метоксифенил, 4-фторфенил, 4-цианофенил и 4-метилфенил.

Солеобразующими группами в соединении формулы (I) являются группы или радикалы, обладающие основными или кислотными свойствами. Соединения, имеющие по крайней мере одну основную группу или по крайней мере один основной радикал, например, свободную аминогруппу, пиразинильный радикал или пиридильный радикал, могут образовывать кислотно-аддитивные соли, например с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, серная кислота или фосфорная кислота, или с подходящими органическими карбоновыми или сульфоновыми кислотами, например алифатическими моно- или ди-карбоновыми кислотами, такими как трифторуксусная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, гидроксималеиновапя кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота или щавелевая кислота, или аминокислотами, такими как аргинин или лизин, ароматическими карбоновыми кислотами, такими как бензойная кислота, 2-феноксибензойная кислота, 2-ацетоксибензойная кислота, салициловая кислота, 4-аминосалициловая кислота, ароматическими-алифатическими карбоновыми кислотами, такими как миндальная кислота или коричная кислота, гетероароматическими карбоновыми кислотами, такими как никотиновая или изоникотиновая кислота, алифатическими сульфоновыми кислотами, такими как метан -, этан- или 2-гидроксиэтан-сульфокислота, или ароматическими сульфоновыми кислотами, например, бензол-, р-толуол- или нафталин-2-сульфокисло-та. Когда присутствует несколько основных групп, могут образовываться моно- или поли-кислотно-аддитивные соли.

Соединения формулы (I), имеющие кислотные группы, например свободную карбоксильную группу в радикале R₁₀, могут образовывать металические или аммониевые соли, такие как соли щелочных или щелечноземельных металлов, например натриевые, калиевые, магниевые или кальциевые соли, или аммониевые соли с амиаком или подходящими органическими аминами, такими, как третичные моноамины, например триэтиламин или три-(2-гидроксиэтил)-амин, или гетероциклическими основаниями, например N-этилпиперидином или N,N'-диметил-пиперазином.

Соединения формулы (I), имеющие как кислотные, так и основные группы, могут образовывать внутренние соли. Особый интерес в этих воплощениях изобретения представляет производное пиримидина, где R_1' является 3-пиридилом, R_2', R_3', R_5', R_6' и R_8' каждый является водородом, R_7' является метилом и R_9' является группой формулы (II), в которой R₁₀ представляет водород, Х представляет оксо, k равен 0 и R₁₀ представляет 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]фенил. Мезилатная соль этого соединения, имеющая химическое название 4-[(4-метил-1-пиперазинил)мептил]-N-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил] амино-фенил] бензамид метансульфонат, обычно известна как иматиниб мезилат и продается под торговой маркой Gleevec(TM).

Антагонисты эндотелинового рецептора

Пригодные для использования в настоящем изобретении антагонисты эндотелина включают агенты, которые уменьшают уровень синтеза эндотелина, агенты, которые блокируют или ингибируют связывание эндотелина с эндотелиновым рецептором, и агенты, которые блокируют или ингибируют опосредованную эндотелиновым рецептором сигнальную трансдукцию. Как здесь используется, термин "антагонист эндотелина" означает любой агент, который уменьшает уровень синтеза эндотелина, любой агент, который блокирует или ингибирует связывание эндотелина с эндотелиновым рецептором, и любой агент, который блокирует или ингибирует опосредованную эндотелиновым рецептором сигнальную трансдукцию.

В некоторых воплощениях изобретения антагонист эндотелинового рецептора является селективным к эндотелиновым А (ЕТА) рецепторам. В некоторых воплощениях изобретения антагонист эндотелинового рецептора является селективным к эндотелиновым В (ЕТВ) рецепторам. В других воплощениях изобретения антагонист эндотелинового рецептора является антагонистом как ЕТА, так и ЕТВ рецепторов.

Специальные примеры полезных в настоящем изобретении антагонистов эндотелина включают, но не ограничиваются ими, атрасентан (АВТ-627; Abbott Laboratories), Veletri^TM (тезосентан; Actelion Pharmaceuticals, Ltd.), ситаксентан (ICOS-Texas Biotechnology), энтрасентан (GlaxoSmith-Kline), дарусентан (LU1 35252; Myogen) BMS-207940 (Bristol-Myers Squibb), BMS-193884 (Bristol-Myers Squibb), BMS-182874 (Bristol-Myers Squibb), J-104132 (Banyu Pharmaceutical), VML 588/Ro 61-1790 (Vanguard Medica), T-0115 (Tanabe Seiyaku), TAK-044 (Takeda), BQ-788 (Banyu Pharmaceutical), BQ123, YM-598 (Yamanouchi Pharma), PD 145065 (Parke-Davis), A-127722 (Abbott Laboratories), A-192621 (Abbott Laboratories), A-182086 (Abbott Laboratories), TBC3711 (ICOS-Texas Biotechnology), BSF208075 (Myogen), S-0139 (Shionogi), TBC2576 (Texas Biotechnology), TBC3214 (Texas Biotechnology), PD156707 (Parke-Davis), PD180988 (Parke-Davis), ABT-546 (Abbott Laboratories), ABT-627 (Abbott Laboratories), SB247083 (GlaxoSmithKline), SB 209670 (GlaxoSmithKline); и антагонисты эндотелинового рецептора, описанные в уровне техники, например, Davenport and Battistini (2002) Clinical Science 103:15-35, Wu-Wong и др. (2002) Clinical Science 103:1075-1115, и Luescher and Barton (2000) Circulation 102:2434-2440.

Пригодным антагонистом эндотелинового рецептора является TRACLEER^TM (босентан; произведенный Actelion Pharmaceuticals, Ltd.). TRACLEER^TM является перорально активным двойным антагонистом эндотелинового рецептора и блокирует связывание эндотелина с обоими из его рецепторов, эндотелиновым рецептором А и эндотелиновым рецептором В. TRACLEER^TM принадлежит к классу высоко замещенных пиримидиновых производных, не имеющих хиральных центров. Он имеет химическое наименование 4-трет-бутил-N-[6-(2-гидрокси-этокси)-5-(2-метокси-фенокси)-[2,2']-бипиримидин-4-ил]-бензолсульфонамид моногидрат и соответствует следующей структурной формуле:

В некоторых воплощениях изобретения лечение с помощью TRACLEER^TM заключается в пероральном введении дозы 62,5 мг в течение 4 недель с последующей дозой 125 мг перорально.

N-Ацетилцистеин (NAC)

N-ацетилцистеин (NAC) представляет собой устойчивую форму сульфаминокислоты L-цистеина. NAC является антиоксидантом, который удаляет Н₂O₂ и другие радикалы. Он является предшественником глутатиона (главного антиоксиданта), обеспечивая цистеиновым субстратом в синтезе глутатиона. NAC является коммерчески доступной разрешенной пищевой добавкой или пищевым продуктом. Пригодные для использования NAC продукты включают NAC пищевые добавки производства Source Naturals (таблетки 1000 мг), Biochem (таблетки 750 мг), Twinlab (таблетки 600 мг), Nutricology / Allergy Research Group (таблетки 500 мг) и тому подобное. Такие продукты могут быть куплены по минимальной стоимости со складов здоровой пищи и пищевых добавок и у розничных продавцов, таких как General Nutrion Corporation (GNC).

Тимозин-α

Тимозин-α (Zadaxin^TM; предоставляемый SciClone Pharmaceuticals, Inc., San Mateo, CA) представляет собой синтетическую форму альфа-тимозина 1, гормона, участвующего в кровообращении и продуцируемого вилочковой железой. Тимозин-α увеличивает активность Т клеток и NK клеток. Zadaxin^TM, изготовленыый для подкожных инъекций, представляет собой очищенный стерильный лиофизированный препарат химически синтезированного альфа-тимозина 1, идентичного альфа-тимозину 1 человека. Альфа-тимозин 1 представляет собой ацетилированный полипептид со следующей последовательностью: Ас-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ue-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH (SEQ ID NO:103) и имеющий молекулярный вес 3,108 дальтон. Лиофилизированный препарат содержит 1,6 мг синтетического альфа-тимозина, 50 мг маннита и натрий фосфатный буфер для юстирования рН до 6,8.

Рибавирин

Рибавирин, 1-β-D-рибофуранозил-1Н-1,2,4-троиазол-3-карбоксамид, предоставляемый ICN Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, Calif, описан в Merck Index под соединением №8199, Eleventh Edition. Его получение и изготовление лекарственных форм описано в патенте США №4211771. Изобретение рассматривает также применение производных рибавирина (см., например, патент США №6277830). Рибавирин можно вводить перорально в капсулированной или таблетированной форме, или в одинаковой или разной форме введения и одинаковым или разным путем, что и IFN-α (или ПЭГлированной или не ПЭГлированной форме). Очевидно, что возможны другие типы введения обоих медикаментов, если они являются доступными, такие как назальное впрыскивание, трансдермальное введение, введение с помощью суппозитория, лекарственная форма с отсроченным высвобождением и т.д. Любая форма введения будет работать, пока доставляются надлежащие дозировки без разрушения активного компонента.

Рибавирин в основном вводят в количестве от около 400 мг до примерно 1200 мг, от около 600 мг до примерно 1000 мг, от около 700 мг до примерно 900 мг в день. В некоторых воплощениях изобретения рибавирин вводят в течение всего курса терапии ПЭГлированным IFN-α или не ПЭГ-лированным IFN-α. В других воплощениях изобретения рибавирин вводят только в течение первого периода времени. Тем не менее еще в других воплощениях изобретения рибавирин вводят только в течение второго периода времени.

Левовирин

Левовирин представляет собой L-энантиомер рибавирина и обладает свойством усиления ТhI иммунного ответа против Th2 иммунного ответа. Левовирин производится ICN Pharmaceuticals. Левовирин имеет следующую структуру:

Вирамидин

Вирамидин представляет собой 3-карбоксамидиновое производное рибавирина и действует как пролекарство рибавирина. Он эффективно превращается в рибавирин аденозин деаминазой.

Вирамидин имеет следующую структуру:

Нуклеозидные аналоги

Нуклеозидные аналоги, которые пригодны для использования в описываемом способе лечения, включают, но не ограничиваются ими, рибавирин, левовирин, вирамидин, изаторибин, L-рибофуранозил нуклеозид, описанные в патенте США №5559101 и охватываемые формулой I патента США №5559101 (например, 1-β-L-рибофуранозилурацил, 1-β-L-рибофуранозил-5-фторурацил, 1-β-L-рибофуранозилцитозин, 9-β-L-рибофуранозиладенин, 9-β-L-рибофуранозилгипоксантин, 9-β-L-рибофуранозилгуанин, 9-β-L-рибофуранозил-6-тиогуанин, 2-амино-α-L-рибофуран1[1',2':4,5]оксазолин, О²,О²-ангидро-1-α-L-рибофуранозилурацил, 1-α-L-рибофуранозилурацил, 1-(2,3,5-три-O-бензоил-α-рибофуранозил)-4-тиоурацил, 1-α-L-рибофуранозил-цитозин, 1-α-L-рибофуранозил-4-тиоурацил, 1-α-L-рибофуранозил-5-фтору-рацил, 2-амино-β-L-арабинофурано [1',2':4,5]оксазолин, О²,О²-ангидро-β-L-арабинофуранозилурацил, 2'-деокси-β-L-уридин, 3'5'-ди-O-бензоил-2'-деокси-4-тио-β-L-уридин, 2'-деокси-β-L-цитидин, 2'-деокси-β-L-4-тиоуридин, 2'-деокси-β-L-тимидин, 2'-деокси-β-L-5-фторуридин, 2',3'-дидеокси-β-L-уридин, 2'-деокси-β-L-5-фторуридин и 2'-деокси-β-L-инозин); соединение, описанное в патенте США №6423695 и охватываемое формулой I патента США №6423695; соединение, описанное в патентной публикации США №2002/0058635 и охватываемое формулой 1 патентной публикации США №2002/0058635; нуклеозидный аналог, описанный в WO 01/90121 А2 (Idenix); нуклеозидный аналог, описанный в WO 02/069903 А2 (Biocryst Pharmaceuticals Inc.); нуклеозидный аналог, описанный в WO 02/057287 А2 или WO 02/057425 А2 (оба Merck/Isis); и тому подобное.

Ингибиторы NS3 HCV

Пригодные ингибиторы не-структурного белка-3 (NS3) HCV включают, но не ограничиваются ими, три-пептид, описанный в патенте США №6642204, 6534523, 6420380, 6410531, 6329417, 6329379 и 6323180 (Boeh-ringer-Ingelheim); соединение, описанное в патенте США №6143715 (Boeh-ringer-Ingelheim); макроциклическое соединение, описанное в патенте США №6608027 (Boehringer-Ingelheim); ингибитор NS3, описанный в патенте США №6617309, 6608067 и 6265380 (Vertex Pharmaceuticals); азапептидное соединение, описанное в патенте США №6624290 (Sobering); соединение, описанное в патенте США №5990276 (Schering); соединение, описанное Pause и др. (2003) в J. Biol. Chem. 278:20374-20380; ингибитор NS3 BILN 2061 (Boehringer-Ingelheim; Lamarre и др. (2002) Hepatology 36:3 01 А; и Lamarre и др. (Oct. 26, 2003) Nature doi:10.1038/nature02099); ингибитор NS3 VX-950 (Vertex Pharmaceuticals; Kwong и др. (Oct. 24-28, 2003) 54th Ann. Meeting AASLD); ингибитор NS3 SCH6 (Abib и др. (October 24-28, 2003) Abstract 137. Program and Abstracts of the 54th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD). October 24-28, 2003. Boston, MA.); любые ингибиторы протеазы NS3, раскрытые в WO 99/07733, WO 99/07734, WO 00/09558, WO 00/09543, WO 00/59929 или WO 02/060926 (например, описанные в WO 02/060926 в таблице на страницах 224-226 соединения 2, 3, 5, 6, 8, 10, 11, 18, 19, 29, 30, 31, 32, 33, 37, 38, 55, 59, 71, 91, 103, 104, 105, 112, 113, 114, 115, 116, 120, 122, 123, 124, 125, 126 и 127); и ингибитор протеазы NS3, описанный в любой патентной публикации США №2003019067, 20030187018 и 20030186895; и тому подобное.

Особый интерес во многих воплощениях настоящего изобретения представляют ингибиторы NS3, которые являются специфическими ингибиторами NS3, например, ингибиторы NS3, которые ингибируют активность сериновой протеазы NS3, но которые не обнаруживают значительной ингибирующей активности по отношению к другим сериновым протеазам, таким как лейкоцитарная эластаза человека, эластаза поджелудочной железы свиньи или химотрипсин поджелудочной железы быка, или цистеиновым протеазам, таким как катепсин В печени человека.

Особый интерес в некоторых воплощениях настоящего изобретения представляют ингибиторы NS3, которые ингибируют активность геликазы не-структурного протеина-4 (NS4) HCV и которые не обнаруживают значительной ингибирующей активности по отношению к другим сериновым протеазам, таким как лейкоцитарная эластаза человека, эластаза поджелудочной железы свиньи или химотрипсин поджелудочной железы быка, или цистеиновым протеазам, таким как катепсин В печени человека.

Ингибиторы NS5B

Пригодные ингибиторы не-структурного протеина-5 (NS5) (NS5; РНК-зависимая РНК полимераза) HCV включают, не не ограничиваются ими, соединение, описанное в патенте США №6479508 (Boehringer-Ingelheim); соединение, раскрытое в любой из Международных патентных заявок №РСТ/СА02/01127, РСТ/СА02/01128 и РСТ/СА02/01129, поданных 18 июля 2002, заявитель Boehringer Ingelheim; соединение, описанное в патенте США №6440985 (ViroPharma); соединение, раскрытое в WO 01/47883, например, JTK-003 (Japan Tobacco); динуклеотидный аналог, описанный Zhong и др. в (2003) Antimicrob. Agents Chemother. 47:2674-2681; соединение Бензотиадиазина, описанное Dhanak и др. (2002) в J. Biol Chem. 277(41):3 8322-7; ингибитор NS5B, раскрытый в WO 02/100846 А1 или WO 02/100851 A2 (оба Shire); ингибитор NS5B, раскрытый в WO 01/85172 А1 или WO 02/098424 А1 (оба Glaxo SmithKline); ингибитор NS5B, описанный в WO 00/06529 или WO 02/06246 А1 (оба Merck); ингибитор NS5B, описанный в WO 03/000254 (Japan Tobacco); ингибитор NS5B, раскрытый в ЕР 1256628 A2 (Agouron); JTK-002 (Japan Tobacco); JTK- 109 (Japan Tobacco); и тому подобное.

Особый интерес во многих воплощениях настоящего изобретения представляют ингибиторы NS5, которые являются специфическими ингибиторами NS5, например, ингибиторы NS5, которые ингибируют РНК-зависимую РНК полимеразу NS5 и которые обладают недостаточным ингибирующим действием в отношении других РНК-зависимых РНК полимераз и в отношении ДНК-зависимых РНК полимераз.

Ингибиторы альфа-глюкозидазы

Ингибиторы альфа-глюкозидазы представляют собой класс пероральных лекарственных средств для лечения диабета 2 типа, которые понижают всасывание углеводов в кишечнике, в результате чего замедляется повышение уровня глюкозы в крови в течение дня, особенно после приема пищи, у пациентов, страдающих диабетом 2 типа. Пригодные для использования в описываемом в настоящем изобретении комбинированном способе лечения ингибиторы альфа-глюкозидазы включают, но не ограничиваются ими, n-(n-нонил)-деоксигалактоноджиримицин (n,n-DGJ); N-нонил-деоксиноджиримицин (N-nonyl-DNJ); N-бутил-деоксиноджиримицин (NB-DNJ); 1-део-ксиноджиримицин (DNM); пербутилированный-N-бутил-1-деоксиноджиромицин (p-N-бутил-DNJ); и 6-O-бутаноил кастаноспермин; и тому подобное.

Дополнительные противовирусные терапевтические агенты

Дополнительные противовирусные терапевтические агенты, которые могут вводиться в описываемом в настоящем изобретении комбинированном способе лечения, включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы альфа-глюкозидазы; ингибиторы инозин монофосфат дегидрогеназы (IMPDH); рибозимы, которые комплементарны к вирусным нуклеотидным последовательностям; антисмысловые ингибиторы РНК; и тому подобное.

Ингибиторы альфа-глюкозидазы

Ингибиторы альфа-глюкозидазы представляют собой класс пероральных лекарственных средств для лечения диабета 2 типа, которые понижают всасывание углеводов в кишечнике, в результате чего замедляется повышение уровня глюкозы в крови в течение дня, особенно после приема пищи, у пациентов, страдающих диабетом 2 типа. Пригодные для использования в описываемом в настоящем изобретении комбинированном лечении ингибиторы альфа-глюкозидазы включают, но не ограничиваются ими, n-(n-нонил)-деоксигалактоноджиримицин (n,n-DGJ); N-нонил-деоксиноджиримицин (N-нонил-DNJ); N-бутил-деоксиноджиримицин (NB-DNJ); 1-деоксино-джиримицин (DNM); пербутилированный-N-бутил-1-деоксиноджиромицин (p-N-бутил-DNJ); и 6-O-бутаноил кастаноспермин; и тому подобное.

Ингибиторы IMPDH

Пригодные для использования в описываемом комбинированном способе лечения ингибиторы IMPDH включают, но не ограничиваются ими, VX-497 (сложный эфир тетрагидрофуран-3-ил (5)-N-3-[3-(3-метокси-4-оксазол-5-ил-фенил)-уреидо]бензилкарбаминовой кислоы); Vertex Pharmaceuticals; см, например, Markland и др. (2000) Antimicrob. Agents Chemother. 44:859-866); рибавирин; левовирин (Ribapharm; см. например, Watson (2002) Curr Opin Investig Drugs 3(5):680-3); вирамидин (Ribapharm); и тому подобное.

Рибозим и антисмысловые агенты

Рибозим и антисмысловые противовирусные агенты, которые пригодны для использования в описываемом комбинированном способе лечения, включают, но не ограничиваются ими, ISIS 14803 (ISIS Pharmaceuticals/Elan Corporation; см. например, Witherell (2001) Curr Opin Investig Drugs. 2(11): 1523-9); Heptazyme^TM; и тому подобное.

Средства, регулирующие побочные эффекты

В некоторых воплощениях изобретения комбинированное лечение включает введение паллиативного средства (например, средства, которые уменьшают дискомфорт, вызванный у пациента терапевтическим агентом), или другого средства для предотвращения, лечения или снижения побочного эффекта терапевтического агента. Такие средства упоминаются также как «средства, регулирующие побочные эффекты».

Подходящие средства, регулирующие побочные эффекты, включают средства, которые эффективны при устранении боли; средства, которые уменьшают желудочно-кишечный дискомфорт; болеутоляющие средства, противовоспалительные, антипсихотические, антиневропатические, седативные и гемопоэтические агенты. Кроме того, изобретение рассматривает применение любого вещества, облегчающего состояние пациентов, страдающих от боли или от любого другого побочного эффекта в ходе описываемого в изобретении способа лечения. Типичные паллиативные средства включают ацетаминофен, ибупрофен и другие NSAIDs, блокаторы Н2 и нейтрализующие кислоту средства.

Болеутоляющие средства, которые могут использоваться, чтобы облегчить боль в методах настоящего изобретения, включают ненаркотические болеутоляющие средства, такие как нестероидные противовоспалительные средства (NSAIDs) ацетаминофен, салицилат, ацетилсалициловая кислота (аспирин, дифлюнизал), ибупрофен, Мотрин, Напросин, Налфон и Трилисат, индометацин, глюкаметацин, ацеметацин, сулиндак, напроксен, пироксикам, диклофенак, беноксапрофен, кетопрофен, оксапрозин, этодолак, кеторолак трометамин, кеторолак, набуметон и тому подобное и смеси двух или более упомянутых выше средств.

Другие пригодные болеутоляющие средства включают фентанил, бупренорфин, кодеин сульфат, морфин гидрохлорид, кодеин, гидроморфон (Дилаудид), леворфанол (Лево-Дроморан), метадон (Долофин), морфин, оксикодон (Перкодан) и оксиморфон (Нуморфан). Также подходящими для использования являются бензодиазепины, включая, но не ограничиваясь ими, флуразепам (Далман), диазепам (Валиум) и Версед, и т.п

Противовоспалительные средства

Подходящие противовоспалительные средства включают, но не органичиваются ими, стероидные противовоспалительные средства и нестероидные противовоспалительные средства.

Пригодные стероидные противовоспалительные средства включают, но не органичиваются ими, гидрокортизон, гидроксилтриамцинолон, альфа-метил дексаметазон, дексаметазонфосфат, беклометазон дипропионат, клобетазон валерат, дезонид, дезоксиметазон, дезоксикортикостерон ацетат, дексаметазон, дихлоризон, дифлоразон диацетат, дифлукортолон валерат, флуадренолон, флуклоролон ацетонид, флудрокортизон, флуметазон пивалат, флуозинолон ацетонид, флуоцинонид, флукортин бутиловый эфир, флуокортолон, флупредниден (флупреднилиден) ацетат, флурандренолон, халцинонид, гидрокортизон ацетат, гидрокортизон бутират, метилпреднизолон, триамцинолон ацетонид, конизон, кортодоксон, флуцетонид, флудрокортизон, дифлурозон диацетат, флурадренолон ацетонид, медризон, амцинафел, амцинафид, бетаметазон и их эфиры, хлоропреднизон, хлорпреднизон ацетат, клокортелон, клесцинолон, дихлоризон, дифлупреднат, флуклоронид, флунизолид, флуорометалон, флуперолон, флупреднизолон, гидрокортизон валерат, гидрокортизон циклопентилпропионат, гидрокортамат, мепреднизон, параметазон, преднизолон, преднизон, беклометазон дипропионат, триамцинолон и смеси двух или более упомянутых выше средств.

Пригодные нестероидные противовоспалительные средства включают, но не органичиваются ими, 1) оксикамы, такие как пироксикам, изоксикам, теноксикам и судоксикам; 2) салицилаты, такие как аспирин, дисальцид, бенорилат, трилизат, сафаприн, солприн, дифлунисал и фендосал; 3) производные уксусной кислоты, такие как диклофенак, фенклофенак, индометацин, сулиндак, толметин, изоксепак, флурофенак, тиопинак, зидометацин, асеметацин, фентиазак, зомепиракт, клиданак, оксепинак и фелбинак; 4) фенаматы, такие как мефенамик, меклофенамик, флуфенамик, нифлумик и толфенамовые кислоты; 5) производные пропионовой кислоты, такие как ибупрофен, напроксен, беноксапрофен, флурбипрофен, кетопрофен, фенопрофен, фенбуфен, индопрофен, пирпрофен, карпрофен, оксапрозин, пранопрофен, миропрофен, тиоксапрофен, супрофен, алминопрофен и тиапрофен; и 6) пиразолы, такие как фенилбутазон, оксифенбутазон, фепразон, азапропазон и триметазон.; могут также использоваться смеси этих нестероидных противовоспалительных средств, также как и их фармацевтически приемлемые соли и эфиры.

Пригодные противовоспалительные средства включают, но не органичиваются ими, Алклофенак; Алклометазон дипропионат; Алгестон ацетонид; Альфа амилазу; Амцинафал; Амцинафид; Амфенак натрий; Амиприлоз гидрохлорид; Анакинра; Аниролак; Анитразафен; Апазон; Балсалазид динатрий; Бендазак; Беноксапрофен; Бензидамин гидрохлорид; Бромелайны; Броперамол; Будесонид; Карпрофен; Циклопрофен; Цинтазон; Клипрофен; Клобетазол пропионат; Клобетазон бутират; Клопирак; Клотиказон пропионат; Корметазон ацетат; Кортодоксон; Дефлазакорт; Десонид; Дезоксиметазон; Дексаметазон дипропионат; Диклофенак калий; Диклофенак натрий; Дифлоразон диацктат; Дифлумидон нитрий; Дифлунисал; Дифлупреднат; Дифталон; Диметилсульфоксид; Дроцинонид; Этдризон; Энлимомаб; Эноликам натрий; Эпиризол; Этодолак; Этофенамат; Фелбинак; Фенамол; Фенбуфен; Фенклофенак; Фенклорак; Фендозал; Фенпипалон; Фентиазак; Флазалон; Флуазакорт; Флуфенамовая кислота; Флумизол; Флунизолид ацетат; Флуниксин; Флуниксин Меглумин; Флуокортин бутил; Фторметолон ацетат; Флукуазон; Флурбипрофен; Флуретофен; Флутиказон пропионат; Фурапрофен; Фуробуфен; Галцинонид; Галобетазол пропионат; Галопредон ацетат; Ибуфенак; Ибупрофен; Ибупрофен алюминий; Ибупрофен Пиконол; Илонидап; Индометацин; Индометацин натрий; Индопрофен; Индоксол; Интразол; Изофлупредон ацетат; Изоксепак; Изоксикам; Кетопрофен; Лофемизол гидрохлорид; Лорноксикам; Лотепреднол этабонат; Меклофенамат натрий; Меклофенамовая кислота; Меклоризон дибутират; Мефенамовая кислота; Мезаламин; Мезеклазон; Метилпреднизолон сулептанат; Морнифлумат; Набуметон; Напроксен; Напроксен натрий; Напроксол; Нимазон; Олсалазин натрий; Орготеин; Орпаноксин; Оксапрозин; Оксифенбутазон; Паранилин гидрохлорид; Пентозан натрий полисульфат; Фенбутазон натрий глицерат; Пирфенидон; Пироксикам; Пироксикам циннамат; Пироксикам оламин; Пирпрофен; Предназат; Прифелон; Прокуазон; Проксазол; Проксазол цитрат; Римексолон; Ромазарит; Салколекс; Салнацедин; Салсалат; Сангуинариум хлорид; Секлазон; Серметацин; Судоксикам; Сулиндак; Супрофен; Талметацин; Талнифлумат; Талосалат; Тебуфелон; Тенидап; Тенидап натрий; Теноксикам; Тесикам; Тесимид; Тетридамин; Тиопинак; Тиксокортол пивалат; Толметин; Толметин натрий; Триклонид; Трифлумидат; Зидометацин; Зомепирак натрий.

Антипсихотические и антиневропатические лекарственные средства, которые могут использоваться для облегчения побочного психиатрического эффекта в методах настоящего изобретения, включают любые все селективные ингибиторы рецептора серотонина (SSRIs) и другие антидепрессанты, анксиолитики (например, алпразолам) и т.д. Антидепрессанты включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы обратного поглощения серотонина, такие как Celexa^®, Desyrel^®, Effexor^®, Luvox^®, Paxil^®, Prozac^®, Zoloft^® и Serzone^®; трициклы, такие как Adapin^®, Anafrinil^®, Elavil^®, Janimmine^®, Ludiomil^®, Pamelor^®, Tofranil^®, Vivactil^®, Sinequan^® и Surmontil^®; ингибиторы моноаминоксидазы, такие как Eldepryl^®, Marplan^®, Nardil^® и Pamate^®. Антианксиолитические средства включают, но не ограничиваются ими, азаспироны, такие как BuSpar^®, бензидиазепины, такие как Ativan^®, Librium^®, Tranxene^®, Centrax^®, Klonopin^®, Paxipam^®, Serax^®, Valium^® и Xanax^®; и бета-блокаторы, такие как Inderal^® и Tenormin^®.

Средства, которые уменьшают желудочнокишечный дискомфорт, например, тошноту, диарею, желудочнокишечные спазмы и тому подобное, являются приемлемыми паллиативными агентами для использования в комбинированной терапии настоящего изобретения. Пригодные агенты включают, но не ограничиваются ими, противорвотные, антидиарейные агенты, блокаторы Н2, нейтрализующие кислоту средства и тому подобное.

Пригодные блокаторы Н2 (антагонисты рецептора гистамина 2 типа), которые пригодны для использования в качестве паллиативного средства в описываемых в настоящем изобретении способах лечения, включают, но не ограничиваются ими, Циметидин (например, Тагамет, Пептол, Ну-цимет, апо-циметидин, нон-циметидин); Ранитидин (например, Зантак, Ну-ранит, Ново-рандин и апо-ранитидин); и Фамотидин (Пепцид, Апо-Фамотидин и Ново-Фамотидин).

Пригодные нейтрализующие кислоту средства включают, но не ограничиваются ими, гидроксид алюминия и гидроксид магния (Maalox, Mylanta^®); гель карбоната алюминия (Basajel^®); гидроксид алюминия (Amphojel^®, AltemaGEL^®); карбонат кальция (Turns^®, Titralac^®); гидроксид магния и бикарбонат натрия.

Противорвотные средства включают, но не ограничиваются ими, ингибиторы 5-гидрокситриптофана-3 (5НТ3); кортикостероиды, такие как дексаметазон и метилпреднизолон; Marinol^® (дронабинол); прохлорперазин; Бензидиазепины; прометазин; и метоклопрамид цисаприд; Алосетрон гидрохлорид; Батаноприд гидрохлорид; Бемесетрон; Бензхинамид; Хлорпромазин; Хлорпромазин гидрохлорид; Клебоприд; Циклизин гидрохлорид; Дименгидринат; Дифенидол; Дифенидол гидрохлорид; Дифенидол памоат; Доласетрон мезилат; Домперидон; Дронабинол; Флудорекс; Флумеридон; Галдансетрон гидрохлорид; Гранисетрон; Гранисетрон гидрохлорид; Лусетрон мезилат; Меклизин гидрохлорид; Метоклопромид гидрохлорид; Метопимазин; Ондансетрон гидрохлорид; Панкоприд; Прохлорперазин; Прохлорперазин эдисилат; Прохлорперазин малеат; Прометазин гидрохлорид; Тиэтилпиразин; Тиэтилпиразин малат; Тиэтилпиразин малеат; Триметобензамид гидрохлорид; Закоприд гидрохлорид.

Антидиарейные средства включают, но не ограничиваются ими, Ролгамидин, Дифеноксилат гидрохлорид (Ломотил), Метронидазол (Флагил), Метилпреднизолон (Медрол), Сульфасалазин (Азулфинид) и тому подобное.

Пригодные гемопоэтические агенты, которые могут использоваться для предотвращения или восстановления пониженной численности гемоцитов в способах настоящего изобретения, включают эритропоэтины, такие как EPOGEN^® эпоэтин-альфа, гранулоцитарные колониестимулирующие факторы (G-CSFs), такие как NEUPOGEN^® филграстим, факторы, стимулирующие колонии гранулоцитов-макрофагов (GM-CSFs), тромбопоэтины, и т.д.

СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ

[00996] Настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания, нарушения или патологического состояния пациента. В одном аспекте, в способе лечения пациента используется пероральная фармацевтическая композиция, содержащая известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, полипептидный вариант родительского лечебного белка, указанный известный вариант полипептида, устойчивый к действию протеаз, содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления протеазой, который присутствует в родительском лечебном белке; и включающая в себя: i) углеводную часть, ковалентно присоединенную по меньшей мере к одному ненативному сайту гликозилирования, который отсутствует в родительском лечебном белке; или ii) углеводную часть, ковалентно присоединенную по меньшей мере к одному нативному сайту гликозилирования, который присутствует, но не является гликозилированным в родительском лечебном белке. Пероральную фармацевтическую композицию вводят пациенту перорально в количестве, при котором пациент получает первое число молей известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида в первый интервал дозирования. Первое число молей известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта превышает второе число молей родительского лечебного белка в парентеральной фармацевтической композиции. Парентеральная фармацевтическая композиция представляет собой состав немедленного высвобождения, подходящий для подкожной болюсной инъекции, и доказано, что родительский полипептид является эффективным при лечении заболевания, нарушения или патологического состояния пациента при подкожном болюсном введении пациенту в парентеральной фармацевтической композиции в количестве, при котором пациент получает второе число молей родительского лечебного белка во второй интервал дозирования. В рассматриваемом способе лечения заболевания пациента способ включает в себя пероральное введение пациенту пероральной фармацевтической композиции в количестве, при котором пациент получает первое число молей известного гипергликозилированного варианта полипептида, устойчивого к действию протеаз, в первый интервал дозирования, такой же, как второй интервал дозирования, или более короткий.

[00997] Таким образом, известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант полипептида является эффективным при лечении заболевания, нарушения или патологического состояния у пациента при пероральном введении пациенту в дозе первого числа молей в первый интервал дозирования на протяжении необходимого периода лечения.

[00998] В другом аспекте изобретение относится к модификации описанного выше способа лечения заболевания, нарушения или патологического состояния пациента, где пероральную фармацевтическую композицию, содержащую известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант полипептида вводят пациенту перорально в первой дозе с первой частотой дозирования, где доказано, что парентеральная фармацевтическая композиция эффективна при лечении заболевания пациента при введении пациенту путем подкожной болюсной инъекции второй дозы родительского лечебного белка со второй частотой дозирования, где первая доза известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида в молях на килограмм массы тела пациента превышает вторую дозу родительского лечебного белка в молях на килограмм массы тела пациента, при этом первую и вторую дозы рассчитывают на массу тела одного и того же пациента, и где при пероральном введении пациенту первой дозы известного гликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида, весь известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант полипептида в первой дозе высвобождается за период времени не больше, чем период времени между дозами при второй частоте дозирования. В некоторых вариантах осуществления, доказано, что парентеральная фармацевтическая композиция является эффективной при лечении заболевания, нарушения или патологического состояния у пациента при введении пациенту в дозе, в расчете на массу тела, родительского лечебного белка во второй интервал дозирования, т.е. вторая доза представляет собой дозу в расчете на массу тела, а парентеральная фармацевтическая композиция находится в форме, которая позволяет осуществлять подбор дозы, исходя из массы тела. В некоторых из вышеупомянутых вариантов осуществления, первая доза представляет собой дозу в расчете на массу тела, известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида, а пероральная фармацевтическая композиция находится в форме, позволяющей осуществлять подбор дозы, исходя из массы тела.

[00999] В другом аспекте изобретение относится к модификации описанного выше способа лечения заболевания, нарушения или патологического состояния пациента, в котором пероральную фармацевтическую композицию, содержащую известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант полипептида вводят пациенту перорально в первой дозе с первой частотой дозирования, причем доказано, что парентеральная фармацевтическая композиция является эффективной при лечении заболевания, нарушения или патологического состояния пациента при введении этому пациенту подкожной болюсной инъекции второй дозы родительского лечебного белка со второй частотой дозирования, где первая доза известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида в молях на килограмм массы тела пациента превышает вторую дозу в молях на килограмм массы тела пациента родительского лечебного белка, когда первая и вторая доза рассчитаны для массы тела того же пациента, и где период времени между дозами при первой частоте дозирования является таким же или короче, чем период времени между дозами при второй частоте дозирования. В некоторых вариантах осуществления доказано, что парентеральная фармацевтическая композиция является эффективной при лечении заболевания, нарушения или патологического состояния пациента при введении пациенту родительского лечебного белка в дозе, рассчитанной на массу тела, во второй интервал дозирования, т.е. вторая доза является дозой, зависящей от массы тела, а парентеральная фармацевтическая композиция находится в форме, которая позволяет осуществлять дозирование, исходя из массы тела. В некоторых вариантах осуществления, изложенных выше, первая доза устанавливается исходя из массы тела, а пероральная фармацевтическая композиция находится в форме, позволяющей осуществлять такое дозирование, рассчитанное на массу тела.

[001000] Выбор гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида частично будет зависеть от заболевания, нарушения или патологического состояния, подвергаемого лечению. Как отмечено выше, желаемый гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант полипептида является эффективным для лечения заболевания, нарушения или патологического состояния, которое поддается лечению родительским лечебным белком. Далее представлены неограничивающие примеры.

Способы лечения с использованием IFN-α

[001001] В одном аспекте, где известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, вариант полипептида представляет собой известный гипергликозилированный, устойчивый к действию протеаз, IFN-α, рассматриваемый способ относится к введению индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, IFN-α при лечении вирусной инфекции, например, инфекции, вызванной вирусом гепатита С (HCV). В некоторых вариантах осуществления этот способ в основном включает в себя пероральное введение индивидууму, нуждающемуся в этом, известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида родительского IFN-α 2 в первой дозе с первой частотой дозирования, по меньшей мере также, или более часто, чем при второй частоте дозирования, эффективность которого подтверждена при лечении инфекции, вызванной HCV, включающий в себя введение индиивидууму, нуждающемуся в этом, парентеральной композиции родительского IFN-α 2 во второй дозе со второй частотой дозирования, где первая доза содержит первое число молей известного гипергликозилированного, устойчивого к действию протеаз, варианта полипептида, которое превышает второе число молей родительского IFN-α 2 во второй дозе.

[001002] В одном неограничивающем примере доказано, что родительский IFN-α 2 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 3 миллионов единиц (или 15 микрограмм) IFN-α 2 путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского IFN-α 2 может быть выбран, например, из группы вариантов гликопептида [D99N]IFN-α 2а, [D99N, D105N]IFN-α 2а, [D99N]IFN-α 2b и [D99N, D105N]IFN-α 2b (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 24); где этот вариант дополнительно содержит одну или несколько одиночных аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из аминокислотных положений: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 2), или любую мутацию, указанную в Таблице 1, так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления протеазой, находящегося в родительском IFN-α 2. Этот вариант вводят пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей этого варианта с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает число молей родительского IFN-α 2, в 3 миллионах единиц (или 15 микрограммах) родительского IFN-α 2, и где первая частота дозирования составляет по меньшей мере три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день.

[001003] В некоторых вариантах осуществления, это изобретение относится к любому из вышеизложенных способов лечения HCV инфекции с использованием известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида IFN-α 2, в которых известный устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой из пептидов-переносчиков, описанных в Таблице 9, приведенной выше, в ковалентной или нековалентной связи с желаемым вариантом полипептида. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой такой пептид-переносчик в прямой или опосредованной ковалентной связи с желаемым вариантом полипептида, в том числе, без ограничения, любой такой пептид-переносчик, слитый с N-концом желаемого варианта полипептида.

[001004] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский IFN-α 2 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 15 микрограмм (или 8,0×10^-10 моль) IFN-α 2 путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского IFN-α 2 может быть выбран, например, из группы гли-копептидных вариантов [D99N]IFN-α 2а, [D99N, D105N]IFN-α 2а, [D99N]IFN-α 2b и [D99N, D105N]IFN-α 2b (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 24); где этот вариант дополнительно содержит одну или несколько одиночных аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из положений аминокислот: 41, 58, 78, 107,117, 125, 133 и 159 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 2), или одну из мутаций, указанных в Таблице 1, так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления протеазой, находящегося в родительском IFN-α 2; и этот вариант вводят пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей этого варианта с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 8,0×10^-10 моль, или составляет по меньшей мере 1,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,4×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,2×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 5,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 6,4×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 7,2×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 8,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 8,0×10^-8 моль, и где первая частота дозирования составляет по меньшей мере три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день.

[001005] В другом аспекте, где известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз, гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный консенсусный IFN-α, рассматриваемый способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтичести эффективного количества известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного консенсусного IFN-α при лечении вирусной инфекции, например, инфекции, вызванной вирусом гепатита С. В некоторых вариантах осуществления этот способ главным образом включает в себя пероральное введение индивидууму, нуждающемуся в этом, известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз, гипергликозилированного варианта полипептида родительского консенсусного IFN-α в первой дозе и с первой частотой дозирования, по меньшей мере также часто, или чаще, чем при второй частоте дозирования, эффективность которого подтверждена при лечении HCV инфекции, которое включает в себя введение индивидууму, нуждающемуся в этом, парентеральной композиции родительского консенсусного IFN-α во второй дозе со второй частотой дозирования, где первая доза содержит первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз, гипергликозилированного варианта полипептида, которое превышает второе число молей родительского консенсусного IFN-α во второй дозе.

[001006] В одном неограничивающем примере доказано, что родительский интерферон альфакон-1 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 9 миллионов единиц (или 9 микрограмм) интерферона альфакон-1 INFERGEN® путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз, гипергликозилированный вариант полипептида родительского интерферона альфакон-1 может быть выбран, например, из группы гликопептидов |Т)99М]интерферон альфакон-1, [D99N, 0105М]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N, Е134М]интерферон альфакон-1, [D105N, E134N]-интерферон альфакон-1, [Е134М]интерферон альфакон-1 и [D99N, E134N]-интерферон альфакон-1 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 24); где данный гликопептид дополнительно содержит одну или несколько одиночных аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из положений аминокислот: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 9), так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском консенсусном IFN-α; и вводимый перорально пациенту в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает число молей интерферона альфакон-1 в 9 миллионах единиц (или 9 микрограммах) интерферона альфакон-1 и где первая частота дозирования составляет по меньшей мере три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001007] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский интерферон альфакон-1 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 15 миллионов единиц (или 15 микрограмм) интерферона альфакон-1 INFERGEN® путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского интерферона альфакон-1, например, может быть выбран из группы гликопептидов [D99N]интерферон альфакон-1, [D99N, 0105М]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N, Е134К]интерферон альфакон-1, [D105N, Е134М]интерферон альфакон-1, [Е134"К]интерферон альфакон-1 и [D99N, Е134М]интерферон альфакон-1 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 24); где данный гликопептид дополнительно содержит одну или несколько одиночных аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из аминокислотных положений: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 9), так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском консенсусном IFN-α; и вводимый перорально пациенту в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает число молей интерферона альфакон-1 в 15 миллионах единиц (или 15 микрограммах) интерферона альфакон-1 и где первая частота дозирования составляет по меньшей мере три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001008] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский интерферон альфакон-1 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 9 микрограммов (или 4,6×10'10 моль) интерферона альфакон-1 путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского интерферона альфакон-1 может быть выбран, например, из группы гликопептидов [099М]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N, Е134М]интерферон альфакон-1, [D105N, Е134N]интерферон альфакон-1, [Е134N]интерферон альфакон-1 и [D99N, Е134N]интерферон альфакон-1 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 24); где данный гликопептид дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из аминокислотных положений: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159 (где нумерация аминокислот приведена на Фигуре 9), так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском консенсусном IFN-α; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 4,6×10^-10 моль, или по меньшей мере примерно 9,2×10^-10 моль, или по меньшей мере примерно 1,4×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 1,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,3×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,2×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,7×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,1×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,6×10^-8 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю, Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001009] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский интерферон альфакон-1 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 15 микрограммов (или 7,6×10^-10 моль) интерферона альфакон-1 путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского интерферона альфа-кон-1 например, может быть выбран из группы гликопептидов [D99N]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N, Е134N]интерферон альфакон-1, [D105N, Е134N]интерферон альфакон-1, [Е134N]интерферон альфакон-1 и [D99N, Е134N]интерферон альфакон-1, где данный гликопептид дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из аминокислотных положений: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159, так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском консенсусном IFN-α; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 7,6×10^-10 моль, или по меньшей мере примерно 1,5×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,3×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 5,3×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 6,1×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 6,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 7,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 7,6×10^-8 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001010] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский интерферон альфакон-1 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 9 микрограммов (или 4,5×10^-8 моль) интерферона альфакон-1 путем подкожной болюсной инъекции один раз в день в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского интерферона альфакон-1 может быть выбран, например, из группы гликопептидов [D99N]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N, E134N]-интерферон альфакон-1, [D105N, E134N] интерферон альфакон-1, [E134N]-интерферон альфакон-1 и [D99N, Е134M]интерферон альфакон-1, где данный гликопептид дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из аминокислотных положений: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159, так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском консенсусном IFN-α; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 4,6×10^-10 моль, или по меньшей мере примерно 9,2×10^-10 моль, или по меньшей мере примерно 1,4×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 1,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,3×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,2×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,7×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,1×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,6×10^-9 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет один раз в день. Альтернативно, первая частота дозирования составляет два раза в день или три раза в день.

[001011] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский интерферон альфакон-1 является эффективным при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 15 микрограммов (или 7,5×10^-8 моль) интерферона альфакон-1 путем подкожной болюсной инъекции один раз в день в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского интерферона альфакон-1 может быть выбран, например, из группы гликопептидов [D99N] интерферон альфакон-1, [D99N, D105N]интерферон альфакон-1, [D99N, D105N, E134N] интерферон альфакон-1, [D105N, Е134N]интерферон альфакон-1, [E134N]-интерферон альфакон-1 и [D99N, E134N] интерферон альфакон-1, где данный гликопептид дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких заданных положениях, соответствующих любому из аминокислотных положений: 41, 58, 78, 107, 117, 125, 133 и 159, так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском консенсусном IFN-α; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 7,6×10^-10 моль, или по меньшей мере примерно 1,5×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 2,3×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 3,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 5,3×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 6,1×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 6,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 7,6×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 7,6×10^-8 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет один раз в день. Альтернативно, первая частота дозирования составляет два раза в день или три раза в день.

[001012] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к любому из вышеизложенных способов лечения HCV инфекции с использованием известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида консенсусного IFN-α, в которых известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой из пептидов-переносчиков, описанных в Таблице 9, приведенной выше, в ковалентной или нековалентной связи с желаемым вариантом полипептида. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит такой пептид-переносчик в прямой или опосредованной ковалентной связи с желаемым вариантом полипептида, в том числе, без ограничения любой такой пептид-переносчик, слитый с N-концом желаемого варианта полипептида.

Способы лечения использованием IFN-γ

[001013] В другом аспекте, в котором известный, устойчивый к действию протеазы, или устойчивый к действию протеазы гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой гипергликозилированный IFN-γ, рассматриваемый способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества известного, устойчивого к действию протеаз, гипергликозилированного IFN-γ в способе лечения вирусной инфекции, например, инфекции, вызванной HCV. В некоторых вариантах осуществления этот способ главным образом включает в себя пероральное введение известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида родительского IFN-γ индивидууму, нуждающемуся в этом, в первой дозе с первой частотой дозирования, также часто, или чаще чем при второй частоте дозирования, эффективность которого подтверждено при лечении HCV инфекции, которое включает в себя введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества IFN-α и совместное введение этому индивидууму парентеральной композиции родительского IFN-γ во второй дозе со вторым интервалом дозирования, где первая доза включает в себя первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида, которое превышает второе число молей родительского IFN-γ во второй дозе.

[001014] В одном неограничивающем примере, родительский IFN-γ представляет собой IFN-γ 1b, эффективность которого доказана при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества IFN-α и совместное введение этому пациенту 100 микрограммов (6,0×10^-9 моль) IFN-γ 1b путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского IFN-γ 1b может быть выбран, например, из группы гликопептидов [S99T]IFN-γ, [E38N]IFN-γ, [E38N, S40T]IFN-γ, [E38N, S99T]IFN-γ и [E38N, S40T, S99T]IFN-γ, где указанный вариант гликопептида дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 3 (IFN-γ), так, что указанный вариант гликопептида содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском IFN-γ полипептиде; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает число молей IFN-γ 1b в 100 микрограммах (6,0×10^-9 моль) IFN-γ 1b и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001015] В другом неограничивающем примере, родительский IFN-γ представляет собой IFN-γ 1b и эффективность которого доказана при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества IFN-α и совместное введение этому пациенту 50 микрограммов (3,0×10^-9 моль) IFN-γ 1b путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского IFN-γ 1b может быть выбран, например, из группы гликопептидов [S99T]IFN-γ, [E38N]IFN-γ, [E38N, S40T]IFN-γ, [E38N, S99T]IFN-γ и [E38N, S40T, S99T]IFN-γ, где указанный вариант гликопептида дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 3 (IFN-γ), так, что указанный вариант гликопептида содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском полипептиде IFN-γ; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает число молей IFN-γ 1b в 50 микрограммах (3,0×10^-9 моль) IFN-γ 1b и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день.

[001016] В другом неограничивающем примере, родительский IFN-γ представляет собой IFN-γ 1b и эффективность которого доказана при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества IFN-α и совместное введение этому пациенту 100 микрограммов (6,0×10^-9 моль) IFN-γ 1b путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гиперглизилированный вариант полипептида родительского IFN-γ 1b может быть выбран, например, из группы гликопептидов [S99T]IFN-γ, [E38N]IFN-γ, [E38N, S40T]IFN-Y, [E38N, S99T]IFN-γ и [E38N, S40T, S99T]IFN-γ, где указанный вариант гликопептида дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 3 (IFN-γ), так, что указанный вариант гликопептида содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском полипептиде IFN-γ; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 6,0х10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 1,2×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,8×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,4×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 3,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 3,6×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 4,2×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 4,8×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 5,4×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 6,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 6,0×10^-7 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001017] В другом неограничивающем примере, родительский IFN-γ представляет собой IFN-γ 1b и эффективность которого доказана при лечении HCV инфекции в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества IFN-α и совместное введение этому пациенту 50 микрограммов (3,0×10^-9 моль) IFN-γ 1b путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 48 недель. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского IFN-γ 1b может быть выбран, например, из группы гликопептидов [S99T]IFN-γ, [E38N]IFN-γ, [E38N, S40T]IFN-γ, [E38N, S99T]IFN-γ и [E38N, S40T, S99T]IFN-γ, где указанный вариант гликопептида дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 3 (IFN-γ), так, что указанный вариант гликопептида содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском полипептиде IFN-γ; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 3,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 6,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 9,0×10^-9 моль, или по меньшей мере примерно 1,2×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,5×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,8×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,1×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,4×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,7×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 3,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 3,0×10^-7 моль, и где первая частота дозирования составляет по меньшей мере три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001018] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к любому из вышеизложенных способов лечения HCV инфекции известным, устойчивым к действию протеаз, или устойчивым к действию протеаз гипергликозилированным вариантом полипептида IFN-γ, в котором известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой из пептидов-переносчиков, описанных в Таблице 9, приведенной выше, в ковалентной или нековалентной связи с желаемым вариантом полипептида. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой из таких пептидов-переносчиков в прямой или опосредованной ковалентной связи с желаемым вариантом полипептида, в том числе, без ограничения любой такой пептид-переносчик слитый с N-концом желаемого варианта полипептида.

[001019] Терапевтически эффективные количества IFN-α, подходящие для использования в настоящих способах лечения HCV инфекции с использованием IFN-α и IFN-γ комбинированной терапии даны в способах лечения HCV инфекции с использованием IFN-α терапии, описанной выше под заголовком «Способы лечения с использованием IFN-α». Кроме того, терапевтически эффективные количества IFN-α, подходящие для использования в настоящих способах лечения HCV инфекции с использованием IFN-α и IFN-γ комбинированной терапии представлены в способах лечения HCV инфекции с использованием IFN-α и IFN-γ комбинированной терапии, описанных в WO 03/030613.

[001020] В другом аспекте, где известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой гипергликозилированный IFN-γ, рассматриваемый способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного IFN-γ в способе лечения фиброза, например, легочного фиброза или фиброза печени. В некоторых вариантах осуществления этот способ главным образом включает в себя пероральное введение известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида родительского IFN-γ индиивидууму, нуждающемуся в этом, в первой дозе с первой частотой дозирования, также часто, или чаще, чем при второй частоте дозирования, эффективность которого доказана при лечении фиброза, которое включает в себя введение индивидууму, нуждающемуся в этом, парентеральной фармацевтической композиции родительского IFN-γ во второй дозе со второй частотой дозирования, где первая доза содержит первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида, которое превышает второе число молей родительского IFN-γ во второй дозе.

[001021] В одном неограничивающем примере, родительский IFN-γ представляет собой IFN-γ 1b и эффективность которого доказана при лечении фиброза в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 200 микрограммов (1,2×10^-8 моль) IFN-γ 1b путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю в течение 1 года или более. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида родительского IFN-γ 1b может быть выбран, например, из группы гликопептидов [S99T]IFN-γ, [E38N]IFN-γ, [E38N, S40T]IFN-γ, [E38N, S99T]IFN-γ и [E38N, S40T, S99T]IFN-γ, где указанный вариант гликопептида дополнительно содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 3 (IFN-γ), так, что указанный вариант гликопептида содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления, находящегося в родительском полипептиде IFN-γ; и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 1,2×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,4×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 3,6×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 4,8×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 6,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 7,2×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 8,4×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 9,6×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,1×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,2×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,0×10^-6 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четрые раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день.

[001022] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к любому из вышеизложенных способов лечения фиброза известным, устойчивым к действию протеазы, или устойчивым к действию протеазы гипергликозилированным вариантом полипептида IFN-γ, где фиброз представляет собой легочный фиброз, такой как идиопатический фиброз легких, или фиброз печени. В некоторых из рассматриваемых способов лечения идиопатического фиброза легких начальная форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ) пациента составляет >55% от ожидаемой нормальной ФЖЕЛ. В других способах по изобретению для лечения идиопатического фиброза легких, начальная диффузионная способность легких по оксиду углерода (DL_CO) У пациента составляет >35% от ожидаемой нормальной величины DL_CO. В других способах по изобретению для лечения идиопатического фиброза легких, начальная форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ) пациента составляет >55% от ожидаемой нормальной величины ФЖЕЛ, начальная диффузионная способность легких по оксиду углерода (DL_CO) ≥35% от ожидаемой нормальной величины DL_CO.

[001023] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к любому из вышеописанных способов лечения фиброза известным, устойчивым к действию протеаз, или устойчивым к действию протеаз известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой из пептидов-переносчиков, описанных в Таблице 9, приведенной выше, в ковалентной или нековалентной связи с желаемым вариантом полипептида. В некоторых из этих вариантов осуществления известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида содержит любой такой пептид-переносчик в прямой или опосредованной ковалентной связи с желаемым вариантом полипептида, в том числе, без ограничения, любой такой пептид-переносчик, слитый с N-концом желаемого варианта полипептида.

[001024] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к любому из вышеописанных способов лечения заболевания у пациента известным, устойчивым к действию протеаз, или устойчивым к действию протеаз гипергликозилированным вариантом полипептида лечебного родительского IFN-γ 1b, где этот способ модифицирован для использования любого устойчивого к действию протеазы варианта гликозилированного нативного (дикого типа) IFN-γ человека (описано в WO 02/081507) в качестве известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида лечебного родительского IFN-γ 1b. В одном неограничивающем примере устойчивый к действию протеаз, вариант гликозилированного нативного IFN-γ человека включает в себя одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 3 (IFN-γ), так, что указанный вариант содержит по меньшей мере один мутантный сайт расщепления протеазой вместо нативного сайта расщепления в родительском полипептиде IFN-γ 1b.

Способы лечения с использованием IFN-β

[001025] В некоторых вариантах осуществления, где известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный IFN-β, рассматриваемый способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного IFN-β в способе лечения рассеянного склероза. Этот способ главным образом включает в себя пероральное введение известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида родительского IFN-β индивидууму, нуждающемуся в этом, в первой дозе с первой частотой дозирования, по меньшей мере такой же, или чаще, чем вторая частота дозирования, эффективность которой доказана при лечении рассеянного склероза, включающего в себя введение индивидууму, нуждающемуся в этом, парентеральной композиции родительского IFN-β во второй дозе со второй частотой дозирования, где первая доза включает в себя первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида, которое превышает второе число молей родительского IFN-β во второй дозе.

[001026] В одном неограничивающем примере, лечебный родительский IFN-β1 представляет собой IFN-β 1b, и эффективность которого доказана при лечении рассеянного склероза в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 0,25 мг (или 1,35×10^-8 моль) IFN-β 1b (BETASERON®) путем подкожной болюсной инъекции через день в течение необходимого периода лечения. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой известный, устойчивый к действию протеаз, вариант активного ингредиента IFN-β 1a AVONEX®, (например, где вариант, устойчивый к действию протеаз, содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 2) и вводимый перорально пациенту в первой дозе, содержащей первое число молей этого варианта с первой частотой дозирования, где первое число молей превышает 1,35×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,7×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 4,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 5,4×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 6,75×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 8,1×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 9,45×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,1×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,2×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,35×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,35×10^-6 моль, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет один раз в два дня. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

Способы лечения с использованием эритропоэтина (ЕРО)

[001027] В некоторых вариантах осуществления, где известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный ЕРО, рассматриваемый способ предусматривает введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного ЕРО в способе лечения анемии. Этот способ главным образом включает в себя пероральное введение индивидууму, нуждающемуся в этом, известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида родительского ЕРО в первой дозе с первой частотой дозирования, по меньшей мере такой же, или чаще, чем вторая частота дозирования, эффективность которой доказана при лечении анемии, включающем в себя введение индивидууму, нуждающемуся в этом, парентеральной композиции родительского ЕРО во второй дозе со второй частотой дозирования, где первая доза содержит первое число молей известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида, превышающее второе число молей родительского ЕРО во второй дозе.

[001028] В одном неограничивающем примере доказано, что родительский ЕРО является эффективным при лечении анемии в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 100 Единиц (770 микрограмм или 2,5×10^-8 моль) эритропоэтина альфа EPOGEN® на килограмм массы тела пациента, путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю на протяжении необходимого периода лечения. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой устойчивый к действию протеаз вариант активного ингредиента дарбепоэтина альфа ARANESP® (например, где устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант содержит одну или несколько аминокислотных замен, представленных в Таблице 4), и вводимый пациенту перорально в первой дозе, содержащей первое число молей этого варианта с первой частотой дозирования, где первое число молей является произведением величины, превышающей 2,5×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 5,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 7,5×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,0×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,25×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,5×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,75×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 2,0×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 2,25×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 2,5×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 2,5×10^-6 моль, на килограмм массы тела пациента, умноженной на массу тела пациента, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день, или три раза в день.

[001029] В другом неограничивающем примере доказано, что родительский ЕРО является эффективным при лечении анемии в способе, включающем в себя введение пациенту, нуждающемуся в этом, 50 Единиц (385 микрограмм или 1,25×10^-8 моль) эпоэтина альфа EPOGEN® на килограмм массы тела пациента, путем подкожной болюсной инъекции три раза в неделю на протяжении необходимого периода лечения. В некоторых из этих вариантов осуществления, известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида представляет собой известный, устойчивый к действию протеаз, вариант активного ингредиента дарбепоэтина альфа ARANESP®, (например, где устойчивый к действию протеаз или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант содержит одну или несколько амиинокислотных замен, представленных в Таблице 4) и вводимый перорально пациенту в первой дозе, содержащей первое число молей этого варианта с первой частотой дозирования, где первое число молей представляет собой произведение величины, превышающей 1,25×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 2,5×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 3,75×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 5,0×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 6,25×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 7,5×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 8,75×10^-8 моль, или по меньшей мере примерно 1,0×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,125×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,25×10^-7 моль, или по меньшей мере примерно 1,25×10^-6 моль, на килограмм массы тела пациента, умноженную на массу тела пациента, и где первая частота дозирования по меньшей мере составляет три раза в неделю. Альтернативно, первая частота дозирования составляет четыре раза в неделю, пять раз в неделю, шесть раз в неделю, один раз в день, два раза в день или три раза в день.

НАБОРЫ И КОНТЕЙНЕРЫ

[001030] Настоящее изобретение относится к контейнеру, содержащему известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида. Изобретение дополнительно относится к набору, содержащему композицию, включающую в себя единичную лекарственную форму известного, устойчивого к действию протеаз, или устойчивого к действию протеаз гипергликозилированного варианта полипептида в контейнере, и этикетку с инструкциями по применению этого набора.

[001031] Подходящие контейнеры включают в себя контейнеры, приспособленные для введения подкожной инъекции, в том числе шприц (для использования с иглой), шприц-карандаш, и подобное. В некоторых вариантах осуществления, рассматриваемый агонист вводят с помощью инжектора в виде карандаша (например устройство в виде карандаша для доставки лекарственного средства), целый ряд которых известен в данной области. Типичные устройства, которые могут быть приспособлены для использования в настоящих способах, представляют собой любые из различных устройств в виде инжекторов-карандашей от фирмы Becton Dickinson, например, BD^TM Pen, BD^TM Pen II, BD^TM Auto-Injector; инжектор-карандаш от фирмы Innoject, Inc.; любые устройства в виде карандашей для доставки лекарственного средства, описанные в патентах США №5728074, 609-6010, 6,146,361, 6248095, 6277099 и 6221053; и подобные. Устройства в виде карандашей для доставки лекарственного средства могут быть одноразовыми или многоразовыми и перезаряжаемыми. Для использования также подходят безигольные инъекционные системы Intraject® (Aradigm Corp.).

[001032] Изобретение дополнительно относится к устройству для доставки лекарственного средства, включающему в себя (например, предварительно заполненный) резервуар, содержащий жидкую композицию, которая содержит единичную дозу гликозилированного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к предварительно заполненному шприцу, содержащему фармацевтическую композицию, включающую в себя гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа в соответствии с настоящим изобретением.

[001033] Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа и гликозилированный IFN-γ, в соответствии с настоящим изобретением, в единичной дозе жидкой композиции, содержащейся в отдельном резервуаре, для использования в устройстве для доставки лекарственного средства. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к резервуару для лекарственного средства или другому контейнеру, содержащему гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа и гликозилированный IFN-γ, в соответствии с настоящим изобретением, совместно смешанные в жидкости, где и гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа, и гликозилированный IFN-γ по настоящему изобретению, присутствуют в композиции в количестве, подходящем для одной дозы каждого. Резервуар может быть в виде любой из разнообразных форм, в том числе, но не только, в виде картриджа, шприца, резервуара для устройства, обеспечивающего непрерывную доставку лекарственного средства, и подобного.

[001034] Изобретение дополнительно относится к устройству для доставки лекарственного средства, содержащего (например, предварительно заполненный) резервуар, содержащий жидкую композицию, которая содержит единичную дозу гликозилированного синтетического полипептидного агониста рецептора интерферона I типа в соответствии с настоящим изобретением, и единичную дозу гликозилированного IFN-γ. Устройства для доставки лекарственного средства, приводимые в качестве примера, без ограничения включают в себя инъекционные устройства, такие как инжекторы-карандаши, иглы/шприцы, устройства непрерывной доставки, и подобное. Любые количества доз, в том числе синергически эффективные количества, описанные здесь, могут быть использованы в фармацевтической композиции, в резервуаре или в устройстве для доставки лекарстенного средства.

[001035] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к предварительно заполненному шприцу, содержащему фармацевтическую композицию, включающую в себя гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа, гликозилированный IFN-γ, в соответствии с настоящим изобретением, и фармацевтически приемлемый эксципиент, где гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа и гликозилированный IFN-γ, в соответствии с настоящим изобретением, составляют композицию совместно.

[001036] В других вариантах осуществления настоящее изобретение относится к шприцу, содержащему (а) первый цилиндр, предварительно заполненный фармацевтической композицией, содержащей гликозилированный синтетический полипептидный агонист рецептора интерферона I типа в соответствии с настоящим изобретением; (b) второй цилиндр, предварительно заполненный фармацевтической композицией, содержащей гликозилированный IFN-γ.

[001037] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к контейнеру, содержащему известный, устойчивый к действию протеаз, или устойчивый к действию протеаз гипергликозилированный вариант полипептида в композиции, подходящей для пероральной доставки. Композиции, подходящие для пероральной доставки, включают в себя жидкие композиции, твердые композиции (например, таблетки, капсулы и подобное) и полутвердые композиции (например, гели, гелевые капсулы и т.д.).

ПАЦИЕНТЫ, КОТОРЫМ ПОДХОДЯТ ЭТИ СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ

[001038] Способы по настоящему изобретению подходят для лечения пациентов, страдающих различными заболеваниями, или имеющих риск развития таких заболеваний. В большинстве вариантов осуществления пациентом является человек.

Фиброзы

[001039] Способы по настоящему изобретению для лечения фиброзов подходят для лечения пациентов, у которых диагностирован фиброз. Фиброзы включают в себя, но не только, легочный фиброз, в том числе идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) и легочный фиброз известной этиологии, фиброз печени и фиброз почек. Другие фиброзные состояния, приводимые в качестве примера, включают в себя фиброз скелетной мускулатуры, кардиальный фиброз, спаечные процессы после хирургических вмешательств, склеродермию, глаукому и поражения кожи, такие как келоиды.

Злокачественные опухоли

[001040] Пациенты, которым подходит лечение способом лечения злокачественных опухолей по настоящему изобретению, включают в себя пациентов, страдающих любым типом злокачественной опухоли. Это лечение также подходит пациентам, у которых предыдущее лечение злокачественной опухоли стандартным химиотерапевтическим средством было неудачным. Это лечение также подходит пациентам, ранее получавшим стандартное лечение химиотерапевтическим средством, которые сначала реагировали на такое лечение и у которых впоследствии развился рецидив. Это лечение также подходит пациентам, у которых лечение другим средством для лечения злокачественных опухолей было неудачным.

HCV инфекция

[001041] Пациенты, которые получают лечение способами по изобретению для лечения HCV инфекции, включают в себя пациентов, у которых была клинически диагностирована HCV инфекция. У пациентов, инфицированных HCV, обнаруживают в крови РНК HCV, и/или анти-HCV антитела в сыворотке.

[001042] Пациенты, у которых диагностирована HCV инфекция, включают в себя интактных пациентов (например, пациентов, которые ранее не получали лечения от HCV, в частности те пациенты, которые ранее не получали лечения на основе IFN-α и/или на основе рибавирина) и пациентов, у которых предыдущее лечение от HCV было неудачным (пациентов «неудачного лечения»). Пациенты, результат лечения которых был неудачным, включают в себя не отвечающих (т.е. пациентов, у которых титр HCV не был существенно или достаточно снижен под действием предыдущего лечения от HCV, например, предыдущей монотерапии с использованием IFN-α, предыдущей комбинированной терапии с использованием IFN-α и рибавирина, или предыдущей комбинированной терапии с использованием пегилированного IFN-α и рибавирина); и рецидивирующих (т.е. пациентов, которые ранее получали лечение от HCV, например, которые ранее получали монотерапию с использованием IFN-α, комбинированную терапию с использованием IFN-α и рибавирина или комбинированную терапию с использованием пегилированного IFN-α и рибавирина, у которых титр HCV снизился, а впоследствии повысился).

[001043] В конкретных вариантах осуществления, представляющих интерес, титр HCV у пациентов составляет по меньшей мере примерно 10⁵, по меньшей мере примерно 5×10⁵ или по меньшей мере примерно 10⁶, или по меньшей мере примерно 2×10⁶ геномных копий HCV на миллилитр сыворотки. Пациент может быть инфицирован любым генотипом HCV (генотипом 1, в том числе 1а и 1b, 2, 3, 4, 6 и т.д., и подтипами (например, 2а, 2b, 3а, и т.д.)), особенно трудно поддаются лечению такие генотипы HCV, как генотип 1 и особенно подтипы HCV и квази-виды.

[001044] Также интерес представляют HCV-позитивные пациенты (описанные выше), у которых наблюдается тяжелый фиброз или ранний цирроз (компенсированный, класс А или менее по системе Child-Pugh), или более распространенный цирроз (декомпенсированный, класс В или С по системе Child-Pugh) вследствие хронической HCV инфекции и которые заражены вирусом несмотря на проводимое ранее противовирусное лечение, основанное на использовании IFN-α, или которые не могут переносить лечение, на основе IFN-α, или у которых имеются противопоказания к такому лечению. В конкретных вариантах осуществления, представляющих интерес, HCV-позитивные пациенты с фиброзом печени 3 или 4 стадии по шкале METAVIR подходят для лечения способами по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления, пациентами, которым подходит лечение способами по настоящему изобретению, являются пациенты с декомпенсированным циррозом с клиническими проявлениями, в том числе пациенты с терминальной стадией цирроза печени, в том числе ожидающие трансплантации печени. В других вариантах осуществления пациенты, которым подходят способы лечения по данному изобретению, включают в себя пациентов с умеренным фиброзом, в том числе пациенты с ранним фиброзом (стадии 1 и 2 по системам METAVIR, Ludwig и Scheuer; или стадии 1, 2 или 3 по системе Ishak.).

ПРИМЕРЫ

[001045] Следующие примеры предоставляют специалистам в данной области полное раскрытие и описание реализации и использования настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения и представленные ниже эксперименты не представляют собой все проведенные эксперименты. Были предприняты попытки обеспечить точность в отношении используемых количественных параметров (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые погрешности эксперимента и отклонения. Если не указано иное, части являются массовыми частями, молекулярная масса представляет собой среднюю молекулярную массу, температура дана в градусах Цельсия, а давление является атмосферным или близким к атмосферному. Могут быть использованы стандартные аббревиатуры, например, п.н., пары нуклеотидных оснований; т.п.н., тысяча пар нуклеотидов; пл, пиколитр(ы); с или сек, секунда (секунды); мин, минута (минуты); ч или час, час(ы); а.к., аминокислота (аминокислоты); н.т., нуклеотид(ы); и.м., внутримышечный (внутримышечно); и.п., интраперитонеально (интраперитонеальный); п.к., подкожный (подкожно); и подобные.

Пример 1: Получение полипептидных агонистов рецептора интерферона I типа с ненативными сайтами гликозилирования

[001046] Среди интерферонов I типа два подтипа интерферона альфа (IFN альфа 2b и 14), IFN бета 1 и IFN омега 1 по своей природе являются гликозилированными в клетках млекопитающих (Фигура 24). На Фигуре 24 представлено сравнение аминокислотных последовательностей Инфергена (SEQ ID NO:**) и разновидностей интерферона I типа (SEQ ID NOs:**-**) которые, по имеющимся сведениям, в природе являются гликозилированными. Аминокислотные остатки, по которым происходит гликозилирование, отмечены жирными рамками. Остатки аспарагина представляют собой якорный сайт N-гликозилирования, а остаток треонина представляет собой якорный сайт для O-гликозилирования. Большинство последовательностей показано выше (SEQ ID NO:**).

[001047] Основываясь на высокой степени индентичности последовательностей Инфергена и других интерферонов I типа, сайты гликозилирования в Инфергене создавали на основе выравнивания аминокислотной последовательности Инфергена с природно гликозилированными интерферонами (Фигура 25). На Фигуре 25 представлено сравнение аминокислотных последовательностей аминокислот 61-120 Инфергена (SEQ ID NO:**) и различных гликозилированных мутантных вариантов (SEQ ID NOs:**-**). Сайты 1, 2 и 3 представляют собой примеры положений, в которых образуются сайты гликозилирования. В сайтах 1 и 2 образуются только сайты N-гликозилирования. В сайте 3 образуются сайты как N-гликозилирования, так и O-гликозилирования. В Инфергене были созданы сайты N-гликозилирования и O-гликозилирования. N-гликозилирование включает в себя уникальную олигосахаридную разветвленную структуру, которая присоединена к остатку аспарагина, находящегося в мотиве Asn-X-Ser/Thr. O-гликозилирование состоит из олигосахаридной цепи или цепей гликозаминогликанов, присоединенных к ОН группе остатка серина или треонина. Большинство последовательностей показано выше (SEQ ID NO:**).

План эксперимента

[001048] Получение гена Инфергена, оптимизированного для экспрессии в клетках человека.

В настоящее время Инферген продуцируется в E.coli и, следовательно, содержит кодоны, оптимизированные для бактериальной экспрессии. Гликозилированный Инферген должен продуцироваться в клеточных линиях млекопитающих. Для повышения уровня экспрессии белка в клетках млекопитающих был создан и синтезирован новый ген Инфергена с предпочтительным использованием кодонов человека (Таблица 8) с использованием наиболее распространенного кодона для каждой выбранной аминокислоты (Фигура 26). На Фигуре 26 изображена характерная синтетическая нуклеотидная последовательность Инфергена млекопитающих (SEQ ID NOs:**H **) с предпочтительным использованием кодона человека. Открытая рамка считывания обозначена транслируемой аминокислотной последовательностью Инфергена (SEQ ID NO:**). Шесть пар комплементарных праймеров от А до F показаны попеременно курсивом и жирным текстом. Верхние смысловые цепи пары праймеров обозначены нечетными числами, а нижние несмысловые цепи обозначены четными числами. В области, расположенной в обратном направлении от стартового кодона ATQ, короткая последовательность GCCACC, консенсусная последовательность Козак, созданы для повышения эффективности эукариотической трансляции. Два следующих друг за другом стоп кодона - ТАА и TGA - используют для обеспечения полного окончания трансляции. В Таблице 8 (выше) представлен предпочтительно используемый кодон человека. Из книги "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook J. и Russell D. W. Third Edition (2001) Cold Spring Harbor Press.

[001049] Способы получения синтетического гена Инфергена млекопитающих.

Поскольку новая ДНК последовательность Инфергена млекопитающих является синтетической, а не природной, целесообразным путем синтеза гена является химический путь. Обычно химический синтез гена включает в себя синтез коротких олигонуклеотидов, их отжиг, лигирование и клонирование в плазмиду. Для получения синтетического гена Инфергена млекопитающих всего использовали 6 олигонуклеотидов (Фигура 26).

[001050] Каждая пара праймеров имеет терминальную последовательность, которая позволяет им после отжига присоединиться к смежному олигонуклеотиду. 5' и 3' концы синтетического гена содержат соответственно Hind III и Eco RI сайты рестрикции эндонуклеазой, которые дают возможность лигирования в плазмиду. Дана подробная информация о последовательностях этих праймеров (Таблица 11).

Таблица 11
Последовательности праймеров для химического синтеза гена Инфергена млекопитающих Прайм Смысло Последовательность (в направлении от 5' к 3')   Да [Фосф]АОСТТОССАССАТОТОСОАССТОССССАОАСССА CAGCCTGGGCAACCGCCGCGCCCTGATCCTGCTGGCCC AGATGCGCCGCATCAGCCCC (SEQ ID NO:**)   Нет [Фосф]СССССССАТСТСССССАССАССАТСАССССССССС GGTTGCCCAGGCTGTGGGTCTGGGGCAGGTCGCACAT GGTGGCA (SEQ ID NO:**)   Да [Фосф]ТТСАОСТОССТОАА(ЭОАССОССАСОАСТТСОССТТ CCCCCAGGAGGAGTTCGACGGCAACCAGTTCCAGAAG GCCCAGGCCATCAGCG (SEQ ID NO:**)   Нет [Фосф]ССТСССССТТСТССААСТССТТССССТССААСТСС TCCTGGGGGAAGCCGAAGTCGTGGCGGTCCTTCAGGC AGCTGAAGGGGCTGAT (SEQ ID NO:**)   Да [Фосф]TGCTGCACGAGATGATCCAGCAGACCTTCAACCTGT TCAGCACCAAGGACAGCAGCGCCGCCTGGGACGAGA GCCTGCTGGAGAAG (SEQ ID NO:**)   Нет [Фосф]AGGCTCTCGTCCCAGGCGGCGCTGCTGTCCTTGGTG CTGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATCTCGTGC AGCACGCTGATGG (SEQ ID NO:**)   Да [Фосф]ТТСТАСАССОАОСТОТАССАОСАОСТОААСОАССТО GAGGCCTGCGTGATCCAGGAGGTGGGCGTGGAGGAG ACCCCCCTGATGAACGTGG (SEQ ID NO:**)   Нет [Фосф]ТСАССССССТСТССТССАСССССАССТССТССАТСА CGCAGGCCTCCAGGTCGTTCAGCTGCTGGTACAGCT CGGTGTAGAACTTCTCCAGC (SEQ ID NO:**)   Да [Фосф]ACAGCATCCTGGCCGTGAAGAAGTACTTCCAGCGC ATCACCCTGTACCTGACCGAGAAGAAGTACAGCCCCT GCGCCTGGGAGGTGG (SEQ ID NO:**)   Нет [Фосф]АGGСGСАОСООСТОТАСТТСТТСТСООТСАООТАС AGGGTGATGCGCTGGAAGTACTTCTTCACGGCCAGGA TGCTGTCCACGTTCA (SEQ ID NO:**)   Да [Фосф]ТОСОСОССОАОАТСАТОС(ХАОСТТСАОССТОАОС ACCAACCTGCAGGAGCGCCTGCGCCGCAAGGAGTAAT GAG (SEQ ID NO:**)   Нет [Фосф]ААТТСТСАТТАСТССТТОСООСОСАОСОСТССТО CAGGTTGGTGCTCAGGCTGAAGCTGCGCATGATCTCG GCGCGCACCACCTCCC (SEQ ID NO:**)

[001051] Способы получения гликозилированных мутантных Инфергенов млекопитающих.

Изменения последовательности, необходимые для получения гликозилированного, соответствующего требованиям, Инфергена являются минимальными и могут быть введены в синтетический ген с помощью стандартной методики сайт-направленного мутагенеза. (Фигура 27). На Фигуре 27 показано сравнение последовательностей нуклеиновых кислот Инфергена млекопитающих (SEQ ID NO:**) и его гликозилированных мутантов (SEQ ID NOs:**-**); с доминирующей последовательностью, показанной (SEQ ID NO:**). Нуклеотиды, которые отличаются, показаны в рамках. Использованные кодоны основаны на кодонах, предпочтительно используемых у млекопитающих (Таблица 8). Нуклеотиды, которые отличаются от доминирующей последовательности, показаны в рамках.

[001052] На Фигуре 28 изображено сравнение аминокислотной последовательности интерферона бета 1 человека (SEQ ID NO:**) и приведенных в качестве примера мутантных гликозилированных IFN-β1 (SEQ ID NOs:**-**); доминирующая последовательность (SEQ ID NO:**) показана выше. Сайты 1 и 2 представляют собой положения, в которых образуются гликозилированные мутанты. В основном, только сайты N-гликозилирования образуются в сайте 1. Оба сайта N-гликозилирования и O-гликозилирования образуются в сайте 2. Природные сайты N-гликозилирования в IFN-β1 человека и мутантные показаны в рамках.

[001053] На Фигуре 29 изображено сравнение аминокислотной последовательности интерферона омега-1 человека (SEQ ID NO:**) и приведенных в качестве примера гликозилированных мутантов (SEQ ID NOs:**-**); с доминирующей последовательностью (SEQ ID NO:**), показанной выше. Сайты 1 и 2 представляют собой положения, в которых образуются гликозилированные мутанты. В основном, только сайты N-гликозилирования образуются в сайте 1. Оба сайта N-гликозилирования и O-гликозилирования образуются в сайте 2. Природные сайты N-гликозилирования в IFN-ω человека и мутантные показаны в рамках.

Пример 2: Разработка, создание, экспрессия и получение сайтов гликозилирования слитых конструкций Инфергена млекопитающих с другими сигнальными пептидами интерферона I типа.

Материалы и методы

Конструирование слитых генов

[001054] Аминокислотные выравнивания Инфергена и слитые белки Инфергена, приведенные в качестве примера, интерферон человека альфа 14 и бета показаны на Фигуре 30. Для синтеза слитых генов для получения предполагаемых слитых белков был разработан способ двухстадийной полимеразно-цепной реакции. Праймеры, используемые в ПЦР реакциях, перечислены в Таблице 12, приведенной ниже.

Таблица 12 Название праймера Последовательность (от 5' к 3') IFNa14_Inner GCCCTGGTGGTGCTGAGCTGCAAGAGCAGC-TGCAGCCTGGGCTGCGACCTGCCCCAGACCCACAGC (SEQ IDNO: 1350) IFNa14_Outer TATAAAGCTTGCCACCATGGCCCTGCCCTTC-GCCCTGATGATGGCCCTGGTGGTGCTGAGCTGCAAG (SEQ ID NO:1351) NO:1351) IFNb_Inner GCCCTGCTGCTGTGCTTCAGCACCACCGCCC-TGAGCATGAGCTGCGACCTGCCCCAGACCCACAGC (SEQ IDN0:1352) IFNb_Outer TATAAAGCTTGCCACCATGACCAACAAGTGC-CTGCTGCAGATCGCCCTGCTGCTGTGCTTCAGCACC (SEQ ID NO:1353) INFERGEN_End TATAGAATTCTCATTACTCCTTGCGGCGCAGGCG (SEQ ID NO: 1354)

[001055] Ген Инфергена млекопитающих был синтезирован и клонирован в pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) плазмиду и был использован в качестве матрицы. Для первого цикла ПЦР для получения слитого гена Инфергена с сигнальным пептидом интерферона человека альфа 14, праймер IFNa14_Inner объединяли с праймером INFERGEN_End для получения ПЦР матриц для второго цикла ПЦР, который проводили с использованием праймера IFNa14_Outer в комбинации с праймером INFERGEN_END. Конечный продукт ПЦР расщеплялся под действием как Hind III, так и EcoRI и его клонировали в предварительно расщепленный pcDNA3.1 вектор. Ту же методику использовали для получения гена Инфергена с сигнальным пептидом интерферона бета человека, за исключением того, что использовали праймеры IFNb_Inner и Outer вместо праймеров IFNa14_Inner и Outer, соответственно.

Транзиторная трансфекция и Вестерн-анализ

[001056] Для транзиторной гиперэкспрессии Инфергена была выбрана клеточная линия Cos-7. В качестве реактива для трансфекции использовали Fugene-6 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) и следовали инструкциям производителя. Через три дня после трансфекции кондиционную среду собирали, затем фильтровали через 0,22 мкМ фильтровальную установку для клеточных культур и концентрировали с использованием Centriplus YM-10 фильтрующей центрифуги (Millipore, Billerica, MA). Определяли концентрацию белка. Прикрепленные клетки собирали и получали клеточный лизат с помощью обычных способов. В качестве первичных антител в Вестерн-анализе использовали кроличьи поликлональные антитела, полученные к Инфергену, гиперэкспрессированному E.coli.

Сайт-направленный мутагенез

[001057] Расположение характерных сайтов гликозилирования в двух слитых белках Инфергена показано на Фигуре 25. Для получения этих мутаций использовали набор для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA).

Результаты

[001058] Были получены слитые конструкции и подтверждены последовательности. На Фигуре 30 изображено выравнивание аминокислотной последовательности Инфергена (SEQ ID NO:**), IFN-α14 человека (SEQ ID NO:**), IFN-β1 человека (SEQ ID NO:**), и примеры слитых белков с сигнальными пептидами IFN-α14 и IFN-β человека (SEQ ID NOs:** и **, соответственно). Доминирующая последовательность показана выше (SEQ ID NO:**).

[001059] Затем эти конструкции транзиторно трансфектировали в клетки Cos-7 и результаты трансфекции анализировали с помощью вестерн-блота с использованием кроличьих поликлональных антител к Инфергену. Результаты показаны на Фигуре 32.

[001060] На Фигуре 32 изображен Вестерн-блот анализ результатов транзиторной трансфекции. Дорожки 1-4 были нагружены кондиционной средой клеток Cos-7, трансфектированных плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую: Инферген с сигнальным пептидом IFN-α 14 (дорожка 1); Инферген с сигнальным пептидом IFN-β (дорожка 2); Инферген без сигнального пептида (дорожка 3); и (3-галактозидазу (дорожка 4). Дорожки 5-8 были нагружены клеточным лизатом клеток Cos-7, трансфектированных плазмидами, содержащими нуклеотидные последовательности, кодирующие: Инферген с сигнальным пептидом IFN-α 14 (дорожка 5); Инферген с сигнальным пептидом IFN-β (дорожка 6); Инферген без сигнального пептида (дорожка 7); и (3-галактозидазу (дорожка 8). Дорожку 9 нагружали 30 нг Инфергена, продуцируемого Е. coli, полученного из коммерческого источника.

[001061] Результаты показали, что оба слитых белка хорошо экспрессировались и главным образом секретировались клетками в кондиционированную среду, тогда как Инферген без сигнального пептида плохо экспрессировался и существовал внутриклеточно. Два слитых гена были выбраны в качестве матриц для получения сайтов гликозилирования.

[001062] Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на его конкретные варианты осуществления, специалисту в данной области должно быть понятно, что могут быть сделаны различные изменения и произведены эквивалентные замены без отклонения от сущности и объема заявленного изобретения. Кроме того, может быть сделано большое количество модификаций для приспособления конкретной ситуации, материала, композиции, способа, этапа или этапов способа, к целям, сущности и объему настоящего изобретения. Все такие модификации входят в объем представленной здесь формулы изобретения.

Изобретение относится к медицине и касается гипергликолизованного варианта родительского интерферона типа 1, в котором гипергликолизованный вариант родительского интерферона типа 1 был модифицирован для включения, по меньшей мере, трех дополнительных гликолизованных сайтов. Изобретение обеспечивает сохранение в субъекте гораздо большее время в сравнении с родительским интерфероном типа 1, что позволяет понизить дозировку лекарства. 3 н. и 93 з.п. ф-лы, 32 ил., 12 табл.

1. Гипергликозилированный вариант родительского интерферона типа 1, в котором гипергликозилированный вариант родительского интерферона типа 1 был модифицирован для включения, по меньшей мере, трех дополнительных гликозилированных сайтов, причем, по меньшей мере, один из сайтов гликозилирования представлен заменителем аминокислоты, выбранным из группы, включающей [D99N], [S99N], [R99N], [D105N], [E134N], [Е134Т], [G134N], [G134T] и [F136T], при этом позиции заменителя аминокислоты пронумерованы в соответствии с поддержанием родительского интерферона типа 1 в последовательностях, показанных на Фиг.24, с использованием принятой на этой фигуре нумерации.

2. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где добавленный сайт гликозилирования находится в месте родительского интерферона типа 1 в положении, гомологичном положению сайта гликозилирования во втором интерфероне типа 1.

3. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительскому интерферону типа 1 контролирующим органом была предана форма, пригодная для терапии человека.

4. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.2, где второй тип интерферона выбран из группы, включающей интерферон α2b (IFN-α2b), интерферон α 14 (IFN-α14), интерферон β (IFN-β) и интерферон ω (IFN-ω).

5. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном α (IFN-α).

6. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном β (IFN-β).

7. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном - τ (IFN-τ).

8. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном - ω (IFN-ω).

9. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительский интерферон типа 1 является консенсусным интерфероном типа 1.

10. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, где родительский интерферон типа 1 является гибридным интерфероном типа 1.

11. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.5, где, по крайней мере, один из заменителей аминокислоты выбран из группы, включающей [D99N], [D105N], [E134N], [Е134Т], [G134N] и [G134T].

12. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.5, где интерферон α является интерфероном алфакон-1.

13. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, включающей [D99N], [D105N], [E134N], [Е134Т], [D99N, D105N], [D99N, E134N], [D99N, Е134Т], [D105N, E134N], [D105N, Е134Т], [D99N, D105N, E134N], [D99N, D105N, Е134Т].

14. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты [D99N].

15. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты [D105N].

16. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты [E134N].

17. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты [Е134Т].

18. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [D105N].

19. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [E134N].

20. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [Е134Т].

21. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D105N] и [E134N].

22. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D105N] и [Е134Т].

23. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N], [D105N] и [E134N].

24. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.12, где гипергликозилированный вариант интерферона является родительским интерфероном алфакон-1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N], [D105N] и [Е134Т].

25. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.5, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном α2а (IFN-α2a).

26. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.25, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2а, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, состоящей из [D105N] и [D99N, D105N].

27. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.25, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2а, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты [D99N].

28. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.25, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2а, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты [D105N].

29. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.25, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2а, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [D105N].

30. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.5, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном α2b (IFN-α2b).

31. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.30, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2b, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, содержащей [D99N], [D105N] и [D99N, D105N].

32. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.30, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2b, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D99N].

33. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.30, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2b, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D105N].

34. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.30, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α2b, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D99N] и [D105N].

35. Гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона по п.5, где родительский интерферон типа 1 является интерфероном α14 (IFN-α14).

36. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.35, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α14, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, состоящей из [D105N], [E134T] и [D105N,E134T].

37. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.35, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α 14, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D105N].

38. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.35, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α14, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [Е134Т].

39. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.35, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном α14, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D105N] и [Е134Т].

40. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.5, где родительский интерферон типа 1 выбран из группы, включающей интерферон αс, интерферон α2с, интерферон αd, интерферон α5, интерферон α6, интерферон α4, интерферон α4b, интерферон α1, интерферон αJ, интерферон αН, интерферон αF и интерферон α8.

41. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где, по крайней мере, один заменитель аминокислоты выбран из группы, включающей [S99N], [E134N], [Е134Т] и [F136T].

42. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, включающей [S99N], [Е134Т], [E134N], [S99N, Е134Т], [S99N, E134N], [Е134Т, F136T], [E134N, F136T], [S99N, F134N, F136T] и [S99N, Е134Т, F136T].

43. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [S99N].

44. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [Е134Т].

45. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [E134N].

46. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [S99N] и [Е134Т].

47. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [S99N] и [E134N].

48. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [Е134Т] и [F136T].

49. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [E134N] и [F136T].

50. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [S99N], [E134N] и [F136T].

51. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, где гипергликозилированный вариант типа 1 интерферона является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [S99N], [Е134Т] и [F136T].

52. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8 где, по крайней мере, один заменитель аминокислоты выбран из группы, включающей [R99N], [G134N] и [G134T].

53. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном ω, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, включающей [R99N], [G134T], [G134N], [R99N, G134N] и [R99N, G134T].

54. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном ω, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [R99N].

55. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном ω, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [G134T].

56. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном ω, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [G134N].

57. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном ω, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [R99N] и [G134N].

58. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.8, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном ω, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [R99N] и [G134T].

59. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, в котором, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты выбран из группы, включающей [D99N], [D105N], [E134N] и [Е134Т].

60. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы [D99N], [D105N], [E134N], [Е134Т], [D99N, D105N], [D99N, E134N], [D99N, Е134Т], [D105N, E134N], [D105N, Е134Т], [D99N, D105N, E134N] и [D99N, D105N, Е134Т].

61. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [R99N].

62. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D105N].

63. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [E134N].

64. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [Е134Т].

65. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [D105N].

66. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [E134N].

67. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [Е134Т].

68. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D105N] и [E134N].

69. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D105N] и [Е134Т].

70. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N], [D105N] и [E134N].

71. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.9, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским консенсусным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N], [D105N] и [Е134Т].

72. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где, по крайней мере, один заменитель аминокислоты выбран из группы, включающей [D99N], [D105N], [E134N] и [Е134Т].

73. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном, содержащим, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты, выбранный из группы, включающей [D99N], [D105N], [E134N], [Е134Т], [D99N, D105N], [D99N, E134N], [D99N, Е134Т], [D105N, E134N], [D105N, Е134Т], [D99N, D105N, E134N] и [D99N, D105N, Е134Т].

74. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D99N].

75. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [D105N].

76. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [E134N].

77. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [Е134Т].

78. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [D105N].

79. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [E134N].

80. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [Е134Т].

81. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D105N] и [E134N].

82. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N] и [Е134Т].

83. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N], [D105N] и [E134N].

84. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.10, где гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским гибридным интерфероном типа 1, содержащим, по меньшей мере, заменители аминокислоты [D99N], [D105N] и [Е134Т].

85. Фармацевтическая композиция, включающая гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по одному из пп.1-12, 13-84, 93-96 и фармацевтически пригодный эксципиент.

86. Фармацевтическая композиция по п.85, где фармацевтически пригодный эксципиент является эксципиентом, пригодным для орального применения.

87. Применение терапевтически эффективного количества гипергликозилированного варианта интерферона типа 1 по одному из пп.1-12, 13-84, 93-96 для производства медикамента для лечения заболевания, применяемого для лечения интерфероном типа 1.

88. Применение по п.87, где заболевание является фиброзным заболеванием.

89. Применение по п.87, где заболевание является пролиферативным заболеванием.

90. Применение по п.89, где пролиферативное заболевание является раком.

91. Применение по п.87, где заболевание является вирусной инфекцией.

92. Применение по п.91, где вирусная инфекция является вирусом гепатита С.

93. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, в последствии содержащий заменитель аминокислоты [S101T].

94. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.1, в последствии содержащий заменитель аминокислоты [E107S].

95. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.6, в котором гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 является родительским интерфероном β, содержащим, по меньшей мере, заменитель аминокислоты [F136T].

96. Гипергликозилированный вариант интерферона типа 1 по п.40, в котором, по меньшей мере, один заменитель аминокислоты выбран из группы, состоящей из [D99N], [D105N], [E105N], [G134N], [G134T], [Е134М] и [Е134Т].