ИММУНОКОНЪЮГАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новому конъюгату золото-белок-гаптен и способу получения указанного нового конъюгата.

Более конкретно, оно относится к набору для быстрого анализа образца для мониторинга за пестицидами, в котором используется новый конъюгат золото-белок-гаптен.

Предпосылки изобретения и предшествующий уровень техники

Пестициды, синтезированные из химикатов, являются существенным фактором увеличения сельскохозяйственного производства, предотвращая потери урожая до и после уборки. Однако их беспорядочное применение, помимо того, что оно представляет эксплуатационную опасность, серьезно угрожает здоровью человека. Эти органические токсины попадают в животных и людей напрямую или опосредованно по пищевой цепи или через питьевую воду. Поскольку эти химикаты разлагаются медленно, они оставляют после себя остатки в источниках пищи и воды и концентрируются по мере продвижения по пищевой цепи. Из-за их серьезной токсичности даже при ничтожных количествах важно контролировать уровень этих пестицидов в окружающей среде, продуктах питания и почве. Вследствие их трудноразложимости и токсичной природы они входят в список особо опасных загрязняющих веществ. Быстрое обнаружение этих загрязняющих веществ имеет жизненно важное значение для чистоты состояния окружающей среды.

О быстром обнаружении этих загрязняющих веществ с помощью стержневых указателей уровня сообщалось ранее (Giersch, T., J. Agric. Food Chem. 1993, 41: 1006-1011; Mosiello, L. et al., J. Agric. Food Chem. 1998, 46: 3847-3851; Heiss, C, Weller, MG and Niessner, R., Anal. Chim. Acta 1999, 396: 309-316), где Giersch, T. (J. Agric. Food Chem. 1993, 41: 1006-1011) разработал иммунологический анализ на основе указателей уровня, в котором используются нитроцеллюлозная мембрана, покрытая точками козьих антимышиных IgG-антител. В этом методе полоски обрабатывались специфичными антителами к атразину (моноклональное антитело, K4E7). Стандартные растворы атразина и маркера (атразин, меченный пероксидазой хрена) добавляли на пятна антитела. После промывки мембраны фосфатным буфером при обработке полосок субстратом тетраметилбензидина (TMB) появлялся цвет. Этот метод представляет собой по существу простой дот-блот иммуноанализ, где в твердой фазе образуется комплекс антитело-антиген. Этот подход требует достаточно долгого времени (5-6 часов) для завершения анализа. Равным образом в работах Mosiello, L и др. (J. Agric. Food Chem. 1998, 46: 3847-3851) и Heiss, C, Weller, MG and Niessner, R. (Anal. Chim. Acta 1999, 396: 309-316) также описывается этот же подход к проведению анализа в стационарной фазе с использованием указателя уровня. Недостатками опубликованных способов является то, что эти подходы требуют очень большого времени для анализа (более 7-8 часов на один анализ) и также используют иммунореактивы, которые не очень стабильны для длительного применения.

Цели изобретения

Главной целью настоящего изобретения является создание нового конъюгата золото-белок-гаптен.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения указанного нового конъюгата.

Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление набора для быстрого определения уровня пестицидов в пробе жидкости с использованием нового конъюгата.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа обнаружения и измерения пестицидов в пробе воды, использующего указанный набор.

Краткое описание чертежей

На снимках, сопровождающих настоящее описание, показано:

Фиг.1 - стандартная концентрация атразина в диапазоне от 0 ppb до 1 ppm;

Фиг.2 - тест на стабильность разработанного конъюгата золото-белок-гаптен.

Суть изобретения

Настоящее изобретение относится к набору, основанному на принципе растекания капли жидкости вбок, в котором антитела против пестицида иммобилизованы в зоне обнаружения на нитроцеллюлозной мембране, а другое антитело нанесено вблизи. Количество свободных пестицидов, присутствующих в пробе воды, конкурирует с конъюгатом золото-белок-гаптен в соединении с доступным ограниченным количеством центров связывания антигенов. Окраска, возникающая из-за иммуноконъюгата, коррелирует с концентрацией пробы. Способ довольно прост и специфичен для целевого соединения - атразина. Новый конъюгат золото-белок-гаптен очень стабилен в условиях хранения при 4°C.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение основано на боковом течении иммуноконъюгата на мембране указателя уровня, оно является быстрым и легким для применения в скрининге пестицидов. Конъюгат (золото-белок-гаптен), который используется в настоящем изобретении как индикаторный реагент, примерно в два раза стабильнее, чем существующий конъюгат белка с золотом, использующийся в приложениях с указателем уровня. Настоящий анализ мог бы быть полезен также для обнаружения других токсичных соединений, таких как наркотики, тяжелые металлы и т.д., если использовать антигены, специфичные против анализируемого вещества.

Составными частями настоящего изобретения являются:

- приготовление нового конъюгата,

- нанесение антител на нитроцеллюлозную мембрану с использованием стандартных методов,

- создание формата указателя уровня с использованием конъюгата, полученного на этапе 1, и

- применение портативного сканирующего рефлектометра для полуколичественного определения концентрации пестицида в пробе.

Этапы настоящего изобретения включают создание нового индикаторного иммуноконъюгата для целей обнаружения в формате иммунологического анализа с использованием указателя уровня. Для этого сначала, используя стандартный метод, опубликованный ранее [K.V. Singh et al., (2003) J. Anal. Bioanal. Chem.], синтезировали производное целевого пестицида - атразина (производное атразина и меркаптопропионовой кислоты). Это делалось путем медленного добавления при постоянном перемешивании раствора 3-меркаптопропионовой кислоты (5,5 ммоль) и 85%-ного раствора KOH (10,8 ммоль) в 10 мл этанола к раствору 5,01 ммоль атразина в 50 мл этанола. Смесь кипятили с обратным холодильником 6 часов и затем растворитель выпаривали при пониженном давлении. Остаток вводили в 25 мл 5%-ной NaHCO₃ и три раза промывали хлороформом. Водный слой раствора подкисляли 6 н. HCl, что вызывало немедленное осаждение кислотного производного. Всплывший слой сливали, а производное сушили в неглубоком вакууме. Затем осадок растворяли в этаноле и затем оставляли при пониженном давлении и 37°C для образования кристаллов производного меркаптопропионовой кислоты (MPAD). Конъюгаты производного атразина с комплексом белок-золото получали смешением раствора белка и производного атразина и меркаптопропионовой кислоты, растворенного в 1 мл диметилформамида (ДМФ), вместе с 125 мкмоль дициклогексилкарбодиимида (DCC) и 125 мкмоль N-гидроксисукцинимидилового эфира (NHS). Смесь инкубировали 4 ч и затем центрифугировали для удаления осадка мочевины. Комплекс образовывали инкубированием белка в течение ночи при 4°C в присутствии меркаптоэтиламина, который разрывает дисульфидные связи белка для связывания с частицами золота и образования стабильного комплекса. Полученный конъюгат применялся в формате указателя уровня, использующего нитроцеллюлозную мембрану, на которой антитела против пестицида были иммобилизованы на измерительной линии, а другое антитело (антитело к яичному альбумину) - на контрольной линии в зоне обнаружения. Проба вводится через прокладку для пробы, прикрепленную у одного конца нитроцеллюлозной мембраны, а на другом конце закреплена гигроскопическая прокладка для усиления потока молекул на мембрану. Проба вместе с конъюгатом движется по нитроцеллюлозной мембране, где эти две разные молекулы конкурируют в реакции с доступными центрами связывания антител к атразину, нанесенными на мембрану. Интенсивность образующегося (обратимо) окрашивания указывает на присутствие определяемого элемента в образце. Далее проводят его полуколичественное определение, используя маленький ручной сканирующий рефлектометр.

Соответственно, настоящим изобретением дается способ получения нового иммуноконъюгата, включающий:

(a) получение производного атразина и меркаптопропионовой кислоты (гаптена) известным способом,

(b) хемосорбирование частиц коллоидного золота размером примерно 20 нм на восстановленном белке-носителе через его тиоловые группы с получением комплекса золото-белок,

(c) смешение комплекса, полученного на стадии (b), с гаптеном вместе с дициклогексилкарбодиимидом (DCC) и N-гидроксисукцинимидиловым эфиром (NHS), растворенными в растворителе диметилформамиде (ДМФ),

(d) инкубирование смеси, полученной на стадии (c), с последующим центрифугированием для удаления осадка мочевины и получения желаемого способа получения нового иммуноконъюгата.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения производное атразина - гаптен синтезируют известным способом, какой описан в [K.V. Singh et al., (2003) J. Anal bioanal. Chem.].

В другом варианте осуществления настоящего изобретения раствор частиц коллоидного золота получают нагреванием примерно 200 мл 0,01%-ного раствора хлорида золота до температуры кипения.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения в кипящий раствор хлорида золота добавляют примерно 4 мл 1%-ного тринатрий-цитрата.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения цвет раствора хлорида золота немедленно становится темно-фиолетовым, что указывает на образование раствора коллоидного золота.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения спектры в видимой и УФ-области обнаруживают пик раствора коллоидного золота при 525 нм.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения коллоидное золото хемосорбируется на белок-носитель (яичный альбумин) при смешении восстановленного яичного альбумина с гаптеном (производным атразина и меркаптопропионовой кислоты).

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения восстановленный раствор белка-носителя образован инкубированием яичного альбумина с меркаптоэтиламином в течение ночи при примерно 4°C, чтобы разорвать дисульфидные связи белка для связывания с частицами коллоидного золота (20 нм) для получения стабильного комплекса белок-золото.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения гаптен ковалентно связан с комплексом белок-золото через группы лизина.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения использующимися связующими агентами являются дициклогексилкарбодиимид (DCC) и N-гидроксисукцинимидиловый эфир (NHS) в отношении 1:1, растворяемые в растворителе диметилформамиде (ДМФ) при комнатной температуре в течение примерно 4 часов.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения смесь центрифугировали со скоростью примерно 10000 об/мин в течение примерно 5 мин для удаления осадка мочевины и получения нового иммуноконъюгата.

Кроме того, настоящим изобретением дается также новый иммуноконъюгат.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный иммуноконъюгат содержит золото, белок и гаптен в отношении, варьирующемся в диапазоне 1:25:0,48-1:26:0,5.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения использующийся гаптен является производным атразина и меркаптопропионовой кислоты.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения использующийся белок является яичным альбумином со средним радиусом молекулы примерно 5 нм.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения число молекул белка на частицу золота варьируется в пределах 25-26, при допущении, что белок покрывает примерно 50% площади поверхности.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения число молекул гаптена на молекулу белка-носителя находится в диапазоне 12-13, при допущении, что молярное отношение гаптен-белок равно 1:50.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный размер коллоидного золота составляет примерно 20 нм.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения число частиц коллоидного золота на мл составляет примерно 5×10¹².

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения доступная площадь поверхности на частицах коллоидного золота размером 20 нм составляет 1256 нм².

Настоящее изобретение предоставляет также набор для быстрого обнаружения пестицида в пробе воды, содержащий, по меньшей мере, одну тестовую линию, контрольную линию, иммобилизованную в зоне обнаружения, имеющейся на или в подложке, и иммуноконъюгат.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антиген к яичному альбумину иммобилизован в зоне обнаружения, имеющейся на подложке или в подложке, т.е. нитроцеллюлозной мембране.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения проба воды, загрязненной атразином, вводится через прокладку для пробы, закрепленную на одном конце нитроцеллюлозной мембраны.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения прикрепляется гигроскопическая прокладка, чтобы усилить поток молекул на мембрану.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения обнаружение атразина (пестицида, присутствующего в пробе воды) основано на конкурентном связывании специфичных антител к атразину с иммуноконъюгатом и образцом атразина.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения проводится полуколичественное определение атразина с помощью маленького ручного рефлектометра.

Кроме того, настоящим изобретением дается способ обнаружения и измерения пестицида в пробе воды.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения в лунку для проб вводится 50 мкл пробы воды.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения 50 мкл конъюгата золото-белок-гаптен добавляется в пробу воды.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения проба вместе с конъюгатом продвигается по нитроцеллюлозной мембране, где эти две разные молекулы конкурентно реагируют с доступными центрами связывания антител к атразину, нанесенных на мембрану.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения бордовая окраска образуется на тестовой линии (покрытой антителами к атразину) и контрольной линии (покрытой антителами к яичному альбумину), что указывает на присутствие пестицида (атразина).

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения окраска обнаруживается визуально, что указывает на присутствие и количество пестицида.

Еще в одном варианте осуществления настоящего изобретения калибровочная кривая образована в виде наглядного представления, которое показывает уровень пестицидов в пробе воды.

Окраска разработанного конъюгата гаптен-белок-золото не обнаруживает существенной потери интенсивности даже после 6 недель хранения при температуре окружающей среды. Это объясняется главным образом образованием более сильных связей в комплексе золото-белок, полученных хемосорбцией частиц коллоидного золота на восстановленном альбумине с образованием сильных связей Au-S. Таким образом, этот указатель уровня мог бы с успехом применяться в течение примерно 6-8 недель при нормальных внешних условиях.

Следующие примеры даны для иллюстрации и, следовательно, не могут рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Иммуноконъюгат, содержащий гаптен, белок (яичный альбумин) и частицы коллоидного золота, был создан для обнаружения атразина в пробах воды в формате иммунологического анализа с применением указателя уровня. Для этого готовили раствор частиц коллоидного золота (размером 20 нм) путем нагревания 200 мл 0,01%-ного раствора хлорида золота до температуры кипения. В кипящий раствор хлорида золота быстро добавляли 4 мл 1%-ного тринатрий-цитрата. Цвет раствора сразу же менялся на темно-фиолетовый, что указывает на образование коллоидного золота. Спектры в видимой и УФ-области обнаруживают пик при 525 нм. Коллоидное золото хемосорбировалось на белок-носитель (яичный альбумин) при смешении восстановленного яичного альбумина с гаптеном (производное атразина и меркаптопропионовой кислоты). Производное атразина синтезировали, как описано ранее [K.V. Singh et al. (2003) J. Anal. Bioanal. Chem]. Конъюгаты этого производного с комплексом белок-золото готовили смешением раствора белка и производного атразина, растворенного в 1 мл диметилформамида вместе с 125 мкмоль дициклогексилкарбодиимида и 125 мкмоль N-гидроксисукцинимидилового эфира. Смесь инкубировали 4 ч при комнатной температуре и затем центрифугировали 5 мин со скоростью 10000 об/мин для удаления осадка мочевины. Комплекс золото-белок был образован инкубированием белка в течение ночи при 4°C в присутствии меркаптоэтиламина, который разрывает дисульфидные связи белка для связывания с частицами коллоидного золота (размером 20 нм) и получения стабильного комплекса золото-белок.

ПРИМЕР 2

Создание формата стержневого указателя уровня для мониторинга концентрации пестицидов.

Анализ основан на конкурентном связывании специфичных антител к атразину (связанных с нитроцеллюлозной мембраной) с фиксированным количеством конъюгата гаптен-белок-золото и образца с атразином. Анализ проводится путем нанесения 50 мкл пробы воды в лунку для пробы указателя уровня с последующим добавлением 50 мкл вышеуказанного конъюгата. Окраска (бордовая), возникшая на тестовой линии (покрытой антителами к атразину) и контрольной линии (покрытой антителами к яичному альбумину), указывает на присутствие атразина в пробе. Для полуколичественной характеристики опытных образцов применялся ручной сканирующий рефлектометр на длине волны 657 нм. Калибровочную кривую получали со стандартными растворами атразина (от 0 ppb до 5000 ppb) и использовали в дальнейшем для установления корреляции с концентрацией атразина в пробе воды. Разработанный подход является очень быстрым и мог бы быть очень полезным для мониторинга в полевых условиях.

Преимущества

Основными преимуществами настоящего изобретения являются:

1. Использование стабильных иммунореактивов для быстрого обнаружения пестицидов.

Повышенный срок хранения нового иммуноконъюгата (конъюгат белок-золото-гаптен) означает, что конъюгат не обнаруживает никакой потери активности и чувствительности даже после трех месяцев хранения при 4°C.

2. Быстрый скрининг образцов пестицидов.

3. Полуколичественное определение пестицидов, присутствующих в пробе, возможно при использовании менее сложного ручного сканирующего рефлектометра.

Изобретение относится к области иммунохимии. Предложен новый иммунореактив, содержащий гаптен (производное атразина и меркаптопропионовой кислоты) с белком и золотом, для обнаружения пестицидов. Конъюгат MPAD-белок-золото конкурирует с определяемым элементом за конечное число центров связывания, предоставленных антителами к атразину, нанесенными на нитроцеллюлозную мембрану. Вновь созданный конъюгат имеет длительный срок хранения с высокой стабильностью при 4°С. Диапазон динамических концентраций для стандартных растворов атразина показывает линейное ингибирование (уменьшение интенсивности окраски) от 10 ppb до 1 ppm атразина в пробах воды. 4 н. и 22 з.п. ф-лы, 2ил.

1. Способ получения нового иммуноконъюгата, включающий:
(a) получение производного атразина и меркаптопропионовой кислоты (гаптена) известным способом;
(b) хемосорбирование коллоидных частицы золота размером примерно 20 нм на восстановленный белок-носитель через его тиоловые группы, чтобы получить комплекс золото-белок;
(c) смешивание комплекса, полученного на этапе (b), с гаптеном вместе с дициклогексилкарбодиимидом (DCC) и N-гидроксисукцинимидиловым эфиром (NHS), растворенными в растворителе диметилформамиде (ДМФ);
(d) инкубирование смеси, полученной на стадии (с), с последующим центрифугированием для удаления осадка мочевины и получения желаемого иммуноконъюгата.

2. Способ по п.1, в котором использующиеся частицы коллоидного золота получены кипячением раствора хлорида золота в присутствии тринатрий-цитрата.

3. Способ по п.1, в котором раствор восстановленного белка-носителя образован инкубированием яичного альбумина с меркаптоэтиламином в течение ночи при примерно 4°С, чтобы разорвать дисульфидные связи белка.

4. Способ по п.1, в котором используемый гаптен ковалентно связан с указанным конъюгатом белок-золото через группы лизина.

5. Способ по п.1, в котором смесь на стадии (d), полученную на стадии (1с), подвергают инкубированию в течение примерно 4 ч при комнатной температуре с последующим центрифугированием в течение примерно 5 мин со скоростью примерно 10000 об/мин с получением нового иммуноконъюгата.

6. Новый иммуноконъюгат, полученный способом по пп.1-5.

7. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором указанный иммуноконъюгат содержит золото, белок гаптен в отношении, варьирующемся в диапазоне 1:25:0,48-1:26:0,5.

8. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором использующийся гаптен является производным атразина и меркаптопропионовой кислоты.

9. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором использующийся белок является яичным альбумином, имеющим средний радиус молекулы примерно 5 нм.

10. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором число белковых молекул на частицу золота варьируется в диапазоне 25-26, считая, что белок покрывает примерно 50% площади поверхности.

11. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором число молекул гаптена на молекулу белка-носителя варьируется в диапазоне 12-13, принимая, что молярное отношение гаптен-белок составляет 1:50.

12. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором размер указанного коллоидного золота составляет примерно 20 нм.

13. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором число частиц коллоидного золота на мл равно примерно 5·10¹².

14. Новый иммуноконъюгат по п.6, в котором доступная площадь поверхности на частицах коллоидного золота размером 20 нм составляет 1256 нм².

15. Набор для быстрого обнаружения пестицидов в пробе воды, содержащий, по меньшей мере, одну тестовую линию, контрольную линию, иммобилизованную в зоне обнаружения, находящейся на подложке или в подложке, и иммуноконъюгат по п.1.

16. Набор по п.15, в котором использующаяся тестовая линия является антителом к атразину.

17. Набор по п.15, в котором использующаяся контрольная линия является антителом к яичному альбумину.

18. Набор по п.15, в котором указанный набор содержит, кроме того, сканирующий рефлектометр.

19. Набор по п.15, в котором использующаяся подложка является нитроцеллюлозой.

20. Набор по п.15, в котором использующийся пестицид является атразином.

21. Набор по п.15, в котором обнаружение основано на конкурентном связывании специфичных к атразину антител с иммуноконъюгатом и пробой атразина.

22. Способ обнаружения и измерения пестицидов в пробе, включающий контактирование набора по п.15 с пробой и обнаружение и/или измерение уровня пестицидов.

23. Способ по п.22, в котором контактирование пробы с набором по п.15 приводит к окрашиванию тестовой линии.

24. Способ по п.22, в котором возникшая окраска является бордовой.

25. Способ по п.22, в котором окраска обнаруживается визуально, указывая на присутствие и количество пестицида.

26. Способ по п.22, в котором калибровочная кривая в форме наглядного представления получена с использованием стандартных растворов атразина (от 0 до 5000 ppb).