СПОСОБ ОЦЕНКИ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К МЕТАЛЛАМ-АЛЛЕРГЕНАМ (ВАРИАНТЫ) Российский патент 2002 года по МПК G01N33/52 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, медицинской экологии и предназначено для установления степени сенсибилизирующего воздействия металлов-аллергенов.

Изобретение предназначено для широкого использования как в специализированных клиниках, так и в неспециализированных учреждениях практического здравоохранения, лаборатории которых оснащены иммуноферментным анализатором.

Известно, что в качестве аллергенов могут выступать низкомолекулярные вещества (лекарственные вещества, соли тяжелых металлов, другие химические аллергены), являющиеся гаптенами. Гаптены становятся иммуногенными только после образования комплекса с тканевыми или сывороточными белками-носителями, что усложняет изготовление на основе гаптенов диагностических препаратов. Наиболее часто используемые в иммуносорбции полисахариды, даже при условии их активации, не способны служить сорбентом для атомов тяжелых металлов в связи с тем, что последние в нормальных условиях существуют в качестве солей и в растворе диссоциируют на ионы, не улавливаемые стабильно полисахаридами. В то же время использование изолированно способа образования конъюгата "гаптен-белок" не решает проблемы применения его в качестве диагностикума ввиду растворимости комплекса, что делает затруднительным его идентификацию.

Известен ряд способов оценки сенсибилизации к химическим соединениям с использованием твердой фазы, в частности, нитроцеллюлозной подложки, и с использованием в качестве маркера реагинового механизма аллергических реакций уровня содержания иммуноглобулина Е (IgE) в пробах крови [1, 2]. При этом уровень содержания IgE определяют методом иммуноферментного анализа.

Недостатком указанных известных способов является крайне низкая точность оценки сенсибилизации в отношении металлов-аллергенов при наличии вышеуказанных причин.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по совокупности признаков является способ оценки сенсибилизации к химическим соединениям, согласно которому осуществляют подготовку опытной и контрольной нитроцеллюлозной подложки, для чего на опытной подложке сорбируют аллерген, а контрольную оставляют в первоначальном виде, производят их инкубацию в опытной и контрольной исследуемой пробе сыворотки крови, после удаления подложек из проб производят иммуноферментный анализ этих проб с получением окрашенных комплексов, устанавливают содержание в них общего IgE и по разности этого содержания в контрольной и опытной пробах определяют аллерген специфичный IgE, по которому судят о сенсибилизации к химическому соединению - аллергену [3].

Однако и этот известный способ не позволяет с достаточной долей точности и достоверности оценивать сенсибилизацию к металлу-аллергену, так как, во-первых, металл-аллерген, находясь в ионной форме, не может образовывать стабильные связи с нитроцеллюлозной, за счет этого истинное количество металла, адсорбированного на подложке и оказывающее влияние на антитела, будет занижено; во-вторых, не учитывается влияние на антитела других факторов, такие как анион соли металла.

Технической задачей, решаемой предлагаемым способом, является повышение его точности и достоверности при одновременном обеспечении доступности его использования в учреждениях практического здравоохранения любого уровня.

Указанная техническая задача обеспечивается тем, что готовится опытная нитроцеллюлозная подложка, на которую сорбируется альбумин с последующей последовательной конъюгацией на нее гипоаллергенной соли металла-аллергена, и по первому варианту - две контрольных подложки, на первую из которых наносят альбумин, а на вторую - альбумин и раствор соли, сходной по аниону с солью металла-аллергена, затем каждая из подложек помещается в отдельный исследуемый образец пробы сыворотки (плазмы) крови пациента, после чего проводится иммуноферментный анализ образцов с получением окрашенных комплексов, и при наличии превышения оптической плотности опытного образца пробы над обоими контрольными образцами, причем при превышении над первым контрольным образцом не менее чем в 1,5 раза, при одновременном обнаружении металла-аллергена в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую, диагностируют специфическую сенсибилизацию под воздействием металла-аллергена.

Согласно второму варианту, когда в качестве соли металла-аллергена используют хлорид (неаллергенный анион), в качестве контрольной используют лишь одну нитроцеллюлозную подложку с адсорбированным на ней альбумином.

Решение поставленной задачи обеспечивается благодаря следующему.

В качестве белковой субстанции в состав опытной подложки включен альбумин, имеющий в составе своей молекулы свыше 3000 активных центров для связывания с антигенными детерминантами. Известно, что in vivo альбумины участвуют в транспорте гормонов, липидов, многих метаболитов, лекарственных веществ. Последовательная сорбция на полисахаридный носитель (нитроцеллюлозную подложку) альбумина и конъюгация атомов тяжелых металлов позволяет осуществить формирование диагностического "сэндвича", в котором, с одной стороны, ковалентная связь "целлюлоза-альбумин" стабилизируется атомами металлов, с другой стороны, присоединение активной гаптеновой составляющей на этапе конъюгации обеспечит в дальнейшем ее приоритетный по отношению к несущей детерминанте контакт с антителами сыворотки, что является необходимым условием реализации реакции "антиген-антитело" при использовании данного типа подложки в идентификации специфичных антител к металлам в сыворотке больного. Таким образом, опытная подложка представлена комплексом, представляющим собой перекрестно связанные полисахаридно-белковый иммуносорбент и конъюгат "гаптен-белок", где в качестве гаптена будут выступать атомы тяжелых металлов. И благодаря этому все атомы металла без потерь будут участвовать в реакции "антиген-антитело", что повышает точность и достоверность способа.

Благодаря тому, что при осуществлении предложенного способа по первому варианту берут три образца исследуемой пробы сыворотки (опытный и два контрольных), обеспечиваются равнозначные условия в этих дублированных образцах пробы условиям опыта и появляется возможность учесть мешающее влияние других веществ, находящихся на опытной подложке помимо металла-аллергена, что повышает достоверность определения.

По второму варианту, в случае использования соли - хлорида, берут два образца исследуемой пробы сыворотки крови (опытный и один контрольный), так как экспериментально создаются естественные (физиологические) условия формирования комплекса "антиген-антитело", что не требует постановки контроля 2, поскольку в качестве аниона в соли металла-аллергена выступает ион физиологического раствора, не обладающий свойствами аллергена.

Использование в качестве показателя сравнения опытного и контрольного образцов проб оптической плотности делает способ удобным и легко осуществимым в учреждениях практического здравоохранения любого уровня.

Благодаря тому, что в предложенном способе в качестве критерия диагностики сенсибилизации берут три фактора:
а) превышение оптической плотности опытной пробы над обоими образцами контрольных проб,
б) превышение оптической плотности опытного образца пробы над первым контрольным образцом пробы не менее чем в 1,5 раза,
в) наличие в крови концентрации металла-аллергена, превышающей терапевтическую,
обеспечивается высокий уровень достоверности способа.

Для реализации предлагаемого способа по первому варианту осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- специальным перфоратором нарезают нитроцеллюлозные подложки, например, в форме диска;
- для подготовки опытной подложки диск инкубируют в течение 2 часов при постоянном шейкировании и комнатной температуре с 0,25% раствором альбумина (не рекомендуется использовать физиологическую концентрацию альбумина, так как из-за высокой осмотичности раствора может пострадать целостность подложки);
- далее эту подложку, предварительно однократно отмытую фосфатным буфером (рН 7,0-7,2), конъюгируют через белковую составляющую с исследуемым металлом-аллергеном благодаря экспозиции с терапевтической концентрацией (соответствующей норме) (по металлу) соли данного металла в объеме 50 мкл в течение 2 часов;
- опытная подложка готова к использованию и может храниться в условиях холодильника (+4^oС) в герметично укупоренной минитаре с добавлением фосфатного буфера до 6 месяцев;
- в качестве контроля 1 применяется нитроцеллюлозная подложка на стадии "целлюлоза-альбумин" без конъюгации с металлом;
- контроль 2 готовится по вышеприведенной технологии с использованием в качестве конъюгированной с альбумином соли, гомологичной исследуемой по аниону и гипоаллергенной по составляющему ее катиону;
- производят забор крови у пациента;
- получают из нее образцы сыворотки или плазмы;
- берут три образца исследуемой пробы (опытный образец и два контрольных);
- в опытный вводят материал - целлюлозную подложку с иммобилизованным на ней альбумином, который в свою очередь конъюгирован с прикрепленным к нему тестируемым металлом-аллергеном;
- в 1-й контрольный образец вводят целлюлозную подложку "целлюлоза-альбумин", не содержащую тестируемый металл-аллерген, 2-й контрольный образец тестирует исследуемую пробу по содержащемуся в ней аниону соли изучаемого металла;
- выдерживают подложки в образцах пробы 90 минут;
- далее после трехкратной промывки подложек добавляют в пробы конъюгат в виде анти-IgЕ-антител с пероксидазой;
- затем добавляют хромоген для проявления окраски, которую фотометрируют при длине волны 450 нм на вертикальном спектрофотометре с определением содержания в пробах аллерген специфичного IgE;
- устанавливают разницу в оптической плотности в опытной и 1-й и 2-й контрольной пробах в виде кратности, по которой судят о наличии аллергенспецифичных IgE в пробе сыворотки (плазмы) крови;
- о специфической сенсибилизации под воздействием исследуемого металла-аллергена достоверно судят лишь при наличии одновременно трех факторов: а) наличие превышения оптической плотности опытной пробы над обеими контрольными пробами; б) превышение оптической плотности опытной пробы над соответствующей оптической плотностью контрольного образца (контроль 1) не менее чем в 1,5 раза; в) одновременное обнаружение металла-аллергена в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую.

Для реализации предлагаемого способа по второму варианту осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:
- специальным перфоратором нарезают нитроцеллюлозные подложки, например, в форме диска;
- для подготовки опытной подложки диск инкубируют в течение 2 часов при постоянном шейкировании и комнатной температуре с 0,25% раствором альбумина (не рекомендуется использовать физиологическую концентрацию альбумина, так как из-за высокой осмотичности раствора может пострадать целостность подложки);
- далее эту подложку, предварительно однократно отмытую фосфатным буфером (рН 7,0-7,2), конъюгируют через белковую составляющую с исследуемым металлом-аллергеном благодаря экспозиции с терапевтической концентрацией (соответствующей норме) (по металлу) соли данного металла в объеме 50 мкл в течение 2 часов;
- опытная подложка готова к использованию и может храниться в условиях холодильника (+4^oС) в герметично укупоренной минитаре с добавлением фосфатного буфера до 6 месяцев;
- в качестве контроля применяется одна нитроцеллюлозная подложка на стадии "целлюлоза-альбумин" без конъюгации с металлом;
- производят забор крови у пациента;
- получают из нее образцы сыворотки или плазмы;
- берут два образца исследуемой пробы (опытный и контрольный образец);
- в опытный образец вводят материал - целлюлозную подложку с иммобилизованным на ней альбумином, который в свою очередь конъюгирован с прикрепленным к нему тестируемым металлом-аллергеном;
- в контрольный образец вводят целлюлозную подложку "целлюлоза-альбумин", не содержащую тестируемый металл-аллерген, тестирование по аниону не требуется, т. к. он представлен хлор-ионом, являющимся. во-первых, неаллергенным, во-вторых, физиологичным, представляющим естественную гомеостатическую среду организма;
- выдерживают подложки в образцах пробы 90 минут;
- далее после трехкратной промывки подложек добавляют в пробы конъюгат в виде анти-IgЕ-антител с пероксидазой;
- затем добавляют хромоген для проявления окраски, которую фотометрируют на вертикальном спектрофотометре с определением содержания в пробах аллерген специфичного IgE;
- устанавливают разницу в оптической плотности в опытной и контрольной пробах в виде кратности, по которой судят о наличии аллергенспецифичных IgE в пробе сыворотки (плазмы) крови;
- о специфической сенсибилизации под воздействием исследуемого металла-аллергена, достоверно судят лишь при наличии одновременно двух факторов: а) превышение оптической плотности опытной пробы над соответствующей оптической плотностью контрольного образца не менее чем в 1,5 раза; б) одновременное обнаружение металла-аллергена в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую.

В качестве примеров приводим результаты исследований предлагаемым способом по определению реального уровня специфической сенсибилизации к металлу-аллергену кобальту детского населения, проживающего в зоне влияния выбросов металлургического комбината (таблица 1) и к металлу-аллергену никелю (таблица 2).

Результаты исследований, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о наличии аллергии к кобальту у пациентов 2, 5, 6, 8, установленной по критерию 1,5 превышения оптической плотности (ОП) опытной пробы (иммуносорбент, конъюгированный с нитратом кобальта) над соответствующей оптической плотностью контроля 1 (неконъюгированный иммуносорбент) и соблюдением условия превышения ОП опытной пробы над ОП контроля 2 (иммуносорбент, конъюгированный с аналогичной по аниону солью - нитратом натрия), что указывает на отсутствие аллергии к нитрату, либо на ее незначительные проявления по сравнению с сенсибилизацией к кобальту. Полученный результат подтверждается одновременным обнаружением кобальта в пробе крови в концентрации, превышающей допустимую.

Результаты примера, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о наличии аллергии к никелю у пациентов 1, 7, 8, 9, установленной по критерию 1,5 превышения оптической плотности (ОП) опытной пробы (иммуносорбент, конъюгированный с хлоридом никеля) над соответствующей оптической плотностью контроля 1 (не конъюгированный иммуносорбент). Использование в качестве металлсодержащей соли хлорида нe требует постановки контроля 2, т.к. в данном случае в качестве аниона выступает ион физиологического раствора, не обладающий свойствами аллергена. Полученный результат подтверждается одновременным обнаружением никеля в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую.

Данные, приведенные в таблицах 1 и 2, показывают:
- наличие связи между соотношением оптической плотности опытной пробы над контрольной и положительными результатами химического анализа крови на содержание никеля;
- благодаря созданию особой нитроцеллюлозной подложки, конъюгированной с исследуемым аллергеном-металлом, появилась возможность проводить идентификацию аллерген специфичных антител к металлопротеиновому комплексу in vitro, а введение критерия 1,5 при оценке превышения оптической плотности опытного образца над контрольным позволяет не только определять количественное значение специфического IgЕ, но и качественно характеризовать состояние пациента как наличие сенсибилизации к конкретному химическому металлу-аллергену.

Источники информации
1. Патент США 4774177, кл. G 01 N 33/53 от 1988 г.

2. Патент РФ 2118823, кл. G 01 N 33/53 от 1993 г.

3. Патент РФ 2152034, кл. G 01 N 33/53 33/538, от 1999 г. (прототип).

Изобретение относится к медицине и медицинской экологии. Способ включает по I варианту подготовку опытной нитроцеллюлозной подложки путем последовательной сорбции на нее альбумина и гипоаллергенной соли металла-аллергена и двух контрольных подложек, на первую из которых наносят альбумин, а на вторую альбумин и раствор соли, сходной по аниону с солью металла-аллергена, проведение последующего иммуноферментного анализа образцов с получением окрашенных комплексов и сравнение показателей опытного образца пробы с контрольным, при этом в качестве показателя сравнения опытного образца пробы с контрольным используют оптическую плотность, и при наличии превышения оптической плотности опытного образца пробы над обоими контрольными образцами проб, причем при превышении над первым контрольным образцом не менее чем в 1,5 раза, при одновременном обнаружении металла-аллергена в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую, диагностируют специфическую сенсибилизацию под воздействием металла-аллергена. По II варианту - в качестве контрольной используют одну подложку с сорбированным на ней альбумином. Повышается точность и достоверность способа при одновременном обеспечении доступности его использования в учреждениях практического здравоохранения любого уровня. 2 с.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ оценки сенсибилизации к металлам-аллергенам, включающий подготовку опытной и контрольной нитроцеллюлозной подложки, инкубацию их соответственно с опытным и контрольным образцами пробы сыворотки (плазмы) крови пациента, проведение последующего иммуноферментного анализа образцов с получением окрашенных комплексов и сравнение показателей опытного образца пробы с контрольным, отличающийся тем, что подготовку опытной нитроцеллюлозной подложки осуществляют путем последовательной сорбции на нее альбумина и гипоаллергенной соли металла-аллергена, а в качестве контрольной нитроцеллюлозной подложки используют две подложки, на первую из которых наносят альбумин, а на вторую - альбумин и раствор соли, сходной по аниону с солью металла-аллергена, и каждую из них используют для отдельного контрольного образца пробы, при этом в качестве показателя сравнения опытного образца пробы с контрольным используют оптическую плотность и при наличии превышения оптической плотности опытного образца пробы над обоими контрольными образцами проб, причем превышение над первым контрольным образцом не менее чем в 1,5 раза, при одновременном обнаружении металла-аллергена в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую, диагностируют специфическую сенсибилизацию под воздействием металла-аллергена. 2. Способ оценки сенсибилизации к металлам-аллергенам, включающий подготовку опытной и контрольной нитроцеллюлозной подложки, инкубацию их соответственно с опытным и контрольным образцами пробы сыворотки (плазмы) крови пациента, проведение последующего иммуноферментного анализа образцов с получением окрашенных комплексов и сравнение показателей опытного образца пробы с контрольным, отличающийся тем, что подготовку опытной нитроцеллюлозной подложки осуществляют путем последовательной сорбции на нее альбумина и соли хлорида металла-аллергена, а подготовку контрольной нитроцеллюлозной подложки осуществляют путем сорбции на нее альбумина, при этом в качестве показателя сравнения опытного образца пробы с контрольным используют оптическую плотность, и при наличии превышения оптической плотности опытного образца пробы над контрольным образцом не менее чем в 1,5 раза, при одновременном обнаружении металла-аллергена в пробе крови в концентрации, превышающей терапевтическую, диагностируют специфическую сенсибилизацию под воздействием металла-аллергена.