СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИПОВ ЛЕПРОМАТОЗНОЙ ЛЕПРЫ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, а именно к лепрологии, лабораторным методам исследования и может быть, в частности, использовано для определения типов лепроматозной лепры.

В настоящее время существуют традиционные способы определения типов и форм лепры, а именно клинический осмотр, бактериоскопическое и гистологическое исследование поражений, включающие определение бактериального и гистологического индекса. Но они оказываются недостаточно информативными и точными при определении типов лепроматозной лепры.

Из практики медицины в комплексе с традиционными способами известен иммунодиагностический способ, который в комплексе с традиционными способами может быть применен для определения формы лепры (Былыбин Е.C., Урляпова Н.Г. Способ определения формы лепры, 2006, патент №2279087), заключающийся в том, что в мононуклеарах переферической крови определяют уровень цАМФ через 0,5, 2, 20, 24, ч инкубации их с лепронином в концентрации 20 мкг/мл и по полученному характеру временной динамики этого уровня определяют форму лепры.

Недостатком известного способа является недостаточная точность и информативность, так как данный способ не позволяет выделять субполярный (LLs) и полярный (LLp) типы лепроматозной лепры согласно классификации Ридли Джоплинга, что является существенным в прогнозировании течения лепрозного процесса.

Из практики медицины известен иммунодиагностический способ, который в комплексе с традиционными способами может быть применен для определения формы лепры (Wilkinson K.A., Katoch К., Sengupta U., at al. Immune response to recombinant proteins of Mycobacterium leprae // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol.l79. - P.1034-1037), заключающийся в том, что по периферической крови больных, нагруженной рекомбинантными белками M.leprae, определяют состояние продукции гамма-интерферона, свидетельствующей о принадлежности к той или иной форме заболевания.

Недостатком известного способа является недостаточная точность и информативность, так как данный способ не позволяет выделять субполярный (LLs) и полярный (LLp) типы лепроматозной лепры согласно классификации Ридли Джоплинга, что является существенным в прогнозировании течения лепрозного процесса.

Известен также иммунодиагностический способ определения формы лепры, который может использоваться в комплексе с традиционными (Medina F., Camargo A., Moreno J., Zonana-Nacach A., Aceves-Avila J., A. Fraga. Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies in leprosy // British J.Rheumatology. - 1998. - P.270-273), заключающийся в том, что в плазме больных лепрой определяют наличие антинейтрофильных цитоплазматических антител (ANCA), наличие или отсутствие которых определяет принадлежность к той или иной форме заболевания. Существенным недостатком данного способа является то, что он не дает возможности различить между собой типы лепроматозной лепры (LLs и LLp) согласно классификации Ридли Джоплинга, что не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности и информативности способа.

Наиболее близким способом к предлагаемому является гистологический способ определения типов лепроматозной лепры (D.S.Ridley, M.F.Waters. Significance of variations within the lepromatous groupe, Leprosy Rev., Vol.40, P.143, 1969), который в комплексе с традиционными способами может быть применен для определения типов лепроматозной лепры, заключающийся в том, что гистологически определяют тип клеток гранулемы, ее микобактериальную насыщенность, количество и распределение лимфоцитов, характер и интенсивность поражения нервов, состояние субэпидермальной зоны.

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к лабораторным методам, основаны на исследовании иммунного ответа организма в отношении микобактерий лепры и позволяют определять тип лепроматозной лепры.

Недостатками известного способа является:

- недостаточная точность и информативность, так как известный способ не позволяет быстро и качественно определить тип лепроматозной лепры;

- многоэтапное осуществление способа, что в итоге определяет большую трудоемкость и техническую сложность в осуществлении способа, даже для исследователя, владеющего определенными навыками специальной подготовки;

- большая травматичность способа из-за взятия материала методом малой хирургии с использованием биопсии участка кожного покрова со специфическими лепрозными поражениями;

- большая продолжительность осуществления способа.

Эти недостатки не дают возможность получить конкретный технический результат - повышение точности и информативности способа.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности и информативности определения типов лепроматозной лепры. Предлагаемое изобретение позволяет дифференцировать лепроматозные типы - полярный (LLp) и субполярный (LLs). Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением технического результата.

Решение поставленной задачи предлагаемым способом состоит в том, что при исследовании иммунологического состояния организма больного лепрой в выделенных из периферической крови нейтрофильных гранулоцитах (фагоцитах), инкубированных с лепромином в соотношении 10 микробных тел на фагоцит, определяют уровень хемилюминесценции (ХЛ) и по уровню максимальной интенсивности ХЛ, активированной лепромином, определяют тип лепроматозной лепры, причем субполярный тип (LLs) лепроматозной лепры определяют по ХЛ выше 1552.1 единиц люминесценции (ЕЛ); полярный тип лепроматозной лепры (LLp) определяют по уровню ХЛ, равной или ниже 1552,1 ЕЛ соответственно.

Проблема определения форм и типов лепрозного процесса остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. При этом важнейшим ее аспектом является своевременное выявление именно типов лепроматоза, которые до настоящего времени диагностируются только гистологически и клинически.

Правильное позиционирование процесса в рамках этих двух типов довольно актуально для клинициста, так как по динамике проявлений субполярный лепроматоз (LLs) отличается большей иммунологической неустойчивостью и непредсказуемостью, что проявляется в его склонности к возникновению реверсивных и нисходящих лепрозных реакций (реакции первого типа), приводящих к многочисленным осложнениям. Напротив, полярный тип лепроматозной лепры (LLp) относится к стабильной форме заболевания. В этом случае процесс протекает довольно монотонно и в большинстве случаев наиболее трудно поддается химиотерапии, становясь часто почвой для длительного персистирования возбудителя в инфицированном организме.

В настоящее время наиболее доступным лабораторным способом определения указанных типов является анализ немногих специфических гистологических признаков, что практически невозможно в период бактериоскопической негативации больного при отсутствии гистоморфологического субстрата. Клинические критерии, среди которых скорость бактериоскопической негативации, становятся доступными в основном лишь в период уже развившихся лепрозных реакций, что не позволяет признать их эффективными и удовлетворительными. Поэтому поиск дополнительных критериев, способствующих уточнению классификации процесса при лепроматозной лепре и совершенствованию прогнозирования течения заболевания, представляет значительный интерес.

Предлагаемым способом достигается дифференцирование лепроматозных типов (полярного и субполярного) на разных стадиях заболевания, а также повышение точности и информативности в определении типов лепроматозной лепры.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Нейтрофильные гранулоциты выделяют из гепаринизированной крови на градиенте фиколл-гипак (плотность 1,114). Для этого гепаринизированную венозную кровь (50 Ед/мл гепарина) в количестве 3,5 мл наслаивают на 3,0 мл градиента и центрифугируют 40-50 мин при 3000 об/мин.

После центрифугирования в градиенте формируются два клеточных слоя в виде беловатых слоев. Верхний слой - лимфоциты, нижний - нейтрофилы. Нейтрофильный (нижний) слой с помощью пастеровской пипетки переносят в отдельную пробирку. Нейтрофильные клетки трижды отмывают в 5 мл раствора Хенкса. Объем доводят до 1 мл, после чего клетки подсчитывают и оценивают их жизнеспособность по окраске трипановым синим. Нейтрофилы в количестве 2×10⁶ инкубируют 30 минут при 37°С в атмосфере СО₂, к клеткам добавляют лепромин в соотношении 10 микробных тел на фагоцит. Затем добавляют люминол в конечной концентрации 50 мкг/мл в 1% диметилсульфоксиде. Для измерения хемилюминесценции используют флюориметр-люминометр FL 600 (Bio-Tek Instruments Inc., США). Измеряют максимум интенсивности индуцированной лепромином ХЛ в условных единицах люминесценции.

Для измерения хемилюминесценции используют универсальный флюориметр-люминометр FL 600 (Bio-Tek Instruments Inc., США).

Статистическую обработку полученных результатов проводят с использованием программного пакета Microsoft Office Excell для Windows 2003 с вычислением среднего арифметического (М), среднего квадратичного отклонения (δ) и критерия Стьюдента (t).

Изложенная сущность изобретения поясняется таблицей.

Таблица Группа обследованных больных n Индуцированная лепромином ХЛ (в ЕЛ) М δ Р Первая группа (Больные LLp типом) 13 1300,9 251,2 <0,005 Вторая группа (Больные LLs типом) 11 2005,8 394,1 Примечание: ХЛ - хемилюминесценция; ЕЛ - единицы люминесценции; n - число наблюдений в группе; М - среднее арифметическое; δ - среднее квадратическое отклонение; Р - вероятность достоверности нулевой гипотезы.

Из таблицы видно, что среднее значение (М) индуцированной лепромином ХЛ у больных с LLp типом лепры (первая группа), составляет 1300,9. С учетом среднего квадратического отклонения (δ) верхняя граница допустимого интервала (М±δ) равняется 1552,1 ЕЛ. Эта граница была принята в качестве критерия, при значениях равных и ниже которого у больных лепрой определяют LLp тип лепры.

В группе больных с LLs типом процесса (вторая группа) среднее значение индуцированной лепромином ХЛ составляет 2005,8; при этом нижняя граница доверительного интервала с учетом среднеквадратического отклонения (M-δ) соответствует 1611,7; что существенно выше верхней границы доверительного интервала для LLp группы (1552,1). Следовательно, обследованные группы больных достоверно (Р<0,01) отличаются по уровню активированной лепромином ХЛ нейтрофилов периферической крови. Значение границы ХЛ 1552,1 было принято в качестве критерия, при значениях равных и ниже которого у больных лепрой определяют LLp тип лепры.

Таким образом, у больных лепрой с LLp типом лепры снижен уровень индуцированной лепромином ХЛ в Нф периферической крови, что позволяет использовать данный показатель в качестве лабораторного теста для определения типа лепроматозной лепры.

Таким образом, авторами предложен новый, никем ранее не предлагаемый, способ определения типов лепроматозной лепры.

Предлагаемый способ может быть рекомендован к клиническому использованию в противолепрозных учреждениях.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике ФГУ «НИИ по изучению лепры Росздрава» на 60 больных лепрой в течение 2007-2009 годов.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1

Больной Д., 1944 г.р., № истории болезни 2983. Болен лепрой с 14.04.1961 г. Рецидивы: 27.11.1975, 02.03.1982, 07.02.2007. Диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs), в стадии регресса. Хронически специфический полиневрит. Специфический хронический остеомиелит. Трофическая язва левой стопы. Атеросклероз сосудов головного мозга. Симптоматическая гипертония. Остеохондроз грудного отдела позвоночника. При осмотре: периферические нервные стволы утолщены, б/болезненные. На подошвенной поверхности левой стопы трофическая язва, ампутированы III-IV пальцы левой стопы. Стабильная контрактура V-x пальцев обеих кистей, гипотрофия m. hypothenon с двух сторон. Гипостезия до середины трети бедра справа и до коленного сустава слева; гипостезия до локтевых суставов с двух сторон. На левой стопе трофическая язва с серозно-гнойным отделяемым. Гистологическое исследование не проводилось. Лепроминовая проба отрицательная. ВН - БИН: 0-0-0. Лечение: с 10.04.2008-10.2008 дапсон 100 мг один раз в день. Для осуществления предлагаемого способа использовали гепаринизированную венозную кровь (50 Ед/мл гепарина), которую в количестве 3,5 мл наслаивают на 3,0 мл градиента фиколл-гипак (плотность 1,114) и центрифугируют 40-50 мин при 3000 об/мин.

После центрифугирования в градиенте формируются два клеточных слоя в виде беловатых слоев. Верхний слой - лимфоциты, нижний - нейтрофилы. Нейтрофильный (нижний) слой с помощью пастеровской пипетки переносят в отдельную пробирку. Нейтрофильные клетки трижды отмывают в 5 мл раствора Хенкса. Объем доводят до 1 мл, после чего клетки подсчитывают и оценивают их жизнеспособность по окраске трипановым синим. Нейтрофилы в количестве 2×10⁶ инкубируют 30 минут при 37°С в атмосфере СО₂, к клеткам добавляют лепромин в соотношении 10 микробных тел на фагоцит. Затем добавляют люминол в конечной концентрации 50 мкг/мл в 1% диметилсульфоксиде. Для измерения хемилюминесценции используют флюориметр-люминометр FL 600 (Bio-Tek Instruments Inc., США). Измеряют максимум интенсивности индуцированной лепромином ХЛ в условных единицах люминесценции.

ХЛ, индуцированная лепромином, - 2100 ЕЛ - является выше уровня 1552,1, что соответствует субполярному типу лепроматозной лепры (LLs).

Пример 2

Больная А., 1932 г.р., № истории болезни 1875. Больна лепрой с 1949 года. Рецидивы: 17.04.1954; 13.03.1958; 05.08.1965; 29.01.1965. Диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLs). Остиомиелит костей стоп. Хронический специфический полиневрит. При осмотре: кожный покров свободен от активных проявлений лепры. Умеренно утолщен левый локтевой нерв, безболезнен при пальпации. Остальные периферические нервы не утолщены, безболезнены. Амиотрофии, контрактур, мутиляций - нет. Деформация концевых фаланг II-V, с двух сторон. Отсутствует тыльное сгибание левой стопы. На подошвенной поверхности левой стопы - трофическая язва. Гиперестезия до верхней трети предплечья с двух сторон, на тыльной поверхности кистей рук - до степени анестезии. На нижних конечностях гипостезия до верхней трети голени. Гистологическое исследование не проводилось. Лепроминовая проба отрицательная. ВН - БИН: 0-0-0. 20.08.2001. Получает лечение: дапсон 100 мг один раз в день. ХЛ, индуцированная лепромином, - 2461 ЕЛ - является выше уровня 1552,1, что соответствует субполярному типу лепроматозной лепры (LLs).

Пример 3

Больная У., 1928 г.р., № истории болезни 3696. Больна лепрой с 03.05.1982. Диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLp) в стадии регресса. Хр. специфический полиневрит. Активность процесса: лепрозный процесс без активных проявлений, в стадии регресса. При осмотре: кожные покровы свободны от активных проявлений лепрозного процесса. Гипестезия на нижних и верхних конечностях по полиневротическому типу. Локтевые и малоберцовые нервы несколько утолщены, безболезненны при пальпации. Лепроминовая проба отрицательная. БИН: 0-0-0. Гистологическое исследование не проводилось. Лечение: дапсон 100 мг один раз в день. ХЛ, индуцированная лепромином, - 1091 - является ниже уровня 1552,1, что соответствует полярному типу лепроматозной лепры (LLp).

Пример 4

Больной К., 1927 г.р., № истории болезни 1927. Болен лепрой с 13.02.1958. Диагноз: лепра, лепроматозный тип (LLp) в стадии регресса. Хр. специфический полиневрит с чувствительными амиотрофическими нарушениями. Атеросклероз сосудов головного мозга, сердца, аорты. Симптоматическая гипертония. Активность процесса: лепрозный процесс без активных проявлений, в стадии регресса. При осмотре: кожные покровы свободны от активных проявлений лепрозного процесса. Локтевые нервы умеренно утолщены, при пальпации безболезненны. Остальные периферические нервы пальпации не доступны. Гипотрофия межкостностных мышц, m.thenara, hypothenara с двух сторон, западение I межпальцевого промежутка, грубее справа. Сгибательных контрактур нет. Гипостезия до с/3 голеней и в/3 предплечий. Мутиляций, трофических язв нет. Лепроминовая проба отрицательная. БИН: 0-0-0. Гистологическое исследование не проводилось. Лечение: дапсон 100 мг один раз в день. ХЛ, индуцированная лепромином, - 1552 ЕЛ - это равно уровню 1552,1, что соответствует полярному типу лепроматозной лепры (LLp).

Предлагаемый способ дает возможность с большой точностью и информативностью определить тип лепроматозной лепры. Способ позволяет дифференцировать лепроматозные типы - полярный (LLp) и субполярный (LLs). Предлагаемый способ не является трудоемким и технически сложным. Он может быть осуществлен любым исследователем, владеющим определенными навыками специальной подготовки. Предлагаемый способ менее травматичный по сравнению с прототипом, так как исключает хирургическое вмешательство. Предлагаемый способ выполняется в течение рабочего дня, независимо от активности лепрозного процесса, что свидетельствует о непродолжительности осуществления способа.

Предлагаемый способ может быть рекомендован для уточнения классификации процесса при лепроматозной лепре и совершенствования прогнозирования течения заболевания в лепрозных учреждениях системы здравоохранения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, в частности к способу определения типов лепроматозной лепры. Способ определения типов лепроматозной лепры заключается в определении в выделенных из периферической крови нейтрофильных гранулоцитах (фагоцитах), инкубированных с лепромином, уровня хемилюминесценции (ХЛ), и по уровню максимальной интенсивности ХЛ, активированной лепромином, определяют тип лепроматозной лепры. Вышеописанный способ повышает точность и информативность определения типов лепроматозной лепры. 1 табл.

Способ определения типов лепроматозной лепры, состоящий в исследовании иммунного ответа организма в отношении микобактерий лепры, отличающийся тем, что в выделенных из периферической крови нейтрофильных гранулоцитах (фагоцитах), инкубированных с лепромином в соотношении 10 микробных тел на фагоцит, определяют уровень хемилюминесценции (ХЛ) и по уровню максимальной интенсивности ХЛ, активированной лепромином, определяют тип лепроматозной лепры, причем субполярный тип (LLs) лепроматозной лепры определяют по ХЛ выше 1552.1 единиц люминисценции (ЕЛ); полярный тип лепроматозной лепры (LLp) определяют по уровню ХЛ, равной или ниже 1552,1 ЕЛ соответственно.