СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПРЫ Российский патент 2001 года по МПК A61K39/04 G01N33/569 G01N33/53 G01N33/561 

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии? и может быть, в частности, использовано для диагностики лепры.

Из практики медицины известен способ диагностики лепры, заключающийся в обнаружении в крови антител к возбудителю лепры с помощью иммуноферментного анализа, использующего в качестве антигена M.lufu, культивируемые in vitro. (патент N 2124730, 1999 г. Способ диагностики лепры. Юшин М.Ю., Дячина М.Н., Дегтярев О.В., Калянина О.В.).

Недостатками известного способа является то, что способ инвазивен, для его осуществления требуется взятие крови у обследуемых с использованием инструментария, что несет потенциальную опасность инфекционного заражения и не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Известен способ диагностики лепры в полевых условиях, состоящий в обнаружении специфического антигена M. leprae - фенольного гликолипида-1 (ФГЛ-1) в моче обследуемых в реакции Dot ELISA на нитроцеллюлозной мембране (R. R. J. Kaldany, A. Nurlign. Development of a dot-ELISA for detection of leprosy antigen uria under field conditions. Leprosy Rev., 1986, v 57, Suppl. 2. p. 95-100). Недостатками известного способа являются: низкая диагностическая чувствительность (способом возможно обнаружение антигена только у больных с высокой бактериальной нагрузкой; через 2 месяца лечения антигены M.leprae перестают обнаруживаться данным способом в моче у больных), труднодоступность реагентов для проведения анализа (моноклональные антитела к ФГЛ-1), возможность получения только качественных (да/нет), а не количественных результатов анализа, многоэтапность и сложность подготовки пробы для исследования (концентрирование мочи в 10 раз, лиофилизация, растворение лиофилизата мочи до 1/100 начального объема, экстракция ФГЛ-1 смесью хлороформ-метанол, центрифугирование, лиофилизация, ультразвуковая дезинтеграция). Известный способ не позволяет получить конкретный технический результат - повышение точности способа.

Наиболее близким к заявляемому является способ диагностики лепры, основанный на иммуноферментном определении в слюне нелеченных больных лепрой антител класса IgA к специфическому антигену M.leprae - ФГЛ-1 (M.Abe., J.Miyaji, T Okushita, F. Minagawa, Y. Yoshina, Y. Sakamoto, K. Saikawa. Anti-mycobacterial antibodies in saliva. Leprosy Rev. 1986, Sup. 2. p. 213-223).

Сходство данного способа с предлагаемым заключается в том, что оба они относятся к диагностике лепры, объектом исследования является слюна человека, а исследование проводится с помощью иммуноферментного анализа.

Однако известный способ имеет следующие недостатки:
- недостаточная точность способа, обусловленная использованием в качестве антигена ФГЛ-1 - компонента M. leprae, обладающего узкой видовой специфичностью, и конъюгата меченных пероксидазой антител к IgA человека, не выявляющих специфические антитела других классов иммуноглобулинов;
- труднодоступность ФГЛ-1 в качестве антигена.

Предлагаемое изобретение решает основную задачу - повышение точности диагностики лепры. Сущность изобретения выражена совокупностью существенных признаков, достаточных для обеспечиваемого изобретением положительного результата. Решение поставленной задачи заключается в том, что при обнаружении в слюне антител к M.leprae класса IgA в иммуноферментном анализе предлагается совокупность отличительных от прототипа признаков, т.е. дополнительно определяют антитела к M.leprae классов IgG и IgM с помощью антигенов M.lufu и по показателям оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру.

Предлагаемым способом достигается повышение точности диагностики лепры, т. е. повышение чувствительности способа, возможность прогнозирования активации болезни у больных с регрессом и контроля за эффективностью противолепрозного лечения, а также снижение трудоемкости способа.

Проблема диагностики лепры остается одной из наиболее актуальных в современной лепрологии. Иммунодиагностика лепры основана на определении в биологических средах человека антигенов и/или антител к M.leprae. Необходимость эпидемиологических обследований среди контактных лиц, а также больших групп населения регионов распространения лепры требует разработки технически простых, достаточно информативных и максимально неинвазивных способов диагностики. Одним из подходов для разработки таких методов диагностики является использование слюны в качестве объекта для исследования. Известно, что в слюне человека можно обнаружить многие метаболиты сыворотки крови, в том числе и различные классы иммуноглобулинов (антител) к возбудителям инфекционных заболеваний. Обнаружение антител к M.leprae в слюне можно использовать для диагностики инфицирования, а изучение динамики их уровня в процессе лечения - для оценки эффективности специфического лечения. При выявлении антител к M.leprae в слюне необходимо исследование "параллельных" проб сывороток крови и слюны для максимально возможных совпадений результатов в обеих биологических средах, так как в слюну антитела попадают главным образом из сыворотки крови.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Слюну от каждого исследуемого пациента в количестве 2-3 мл. собирали в стеклянные флаконы и хранили до использования при -20^oC. В день постановки иммуноферментного анализа флаконы размораживали, центрифугировали 15 мин при +4^oC со скоростью 3000 об./мин, надосадочную жидкость использовали в цельном виде без разведения.

M. lufu культивировали на среде Левенштейна-Иенсена в течение 7 дней, затем смывали со среды 0,85% раствором NaCl (из расчета: 500 мг бакмассы - 10 мл раствора NaCl). Бактериальную суспензию подвергали ультразвуковому разрушению на аппарате MSE-100 (Англия) (7-10 мин дробно при 18 кГц). Разрушенную суспензию центрифугировали 30 мин при 10000 об./мин. Супернатант использовали в качестве антигена для сенсибилизации планшетов.

Постановку ИФА осуществляли на поскодонных полистироловых планшетах для иммунологических реакций (Ленмедполимер ТУ 64-2-278-79). Антиген M.lufu разводили в 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера pH 9,6 (Na₂CO₃ 1,59 г, NaHCO₃ 2,93 г H₂O 1 л) до конечной концентрации белка 5 мкг/мл и заливали в лунки планшета по 100 мкл. Планшет инкубировали 18 часов при +4^oC. Затем планшет трижды отмывали забуференными физраствором (34 г NaCl на 4 л H₂O, доводили pH до 7,4 2М Na₂PO₄ + 0,05% Твин-20) и заливали в каждую лунку по 100 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (0,584 г NaCl, 12,8 г Na₂HPO₄, 2,62 г NaHPO₄, pH 7,2-7,4) и инкубировали 1 час при +37^oC. Затем планшет вновь отмывали вышеуказанным способом.

Образцы слюны (цельные) от больных лепрой и контрольных лиц заливали в лунки планшета (по 2 лунки на каждый образец) по 50 мкл в каждую лунку. В качестве положительного контроля (K+) использовали сывороточный пул от больных с активной лепрой, показатель оптической плотности (ОП) уровня антител которого в ИФА с антигеном M.lufu соответствовал 1,50 - 1,70. Планшет инкубировали 1 час при +37^oC. После инкубации планшет отмывали, как указано выше. Затем в лунки вносили по 100 мкл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека - IgG, IgA, IgM классов, меченные пероксидазой, производства ВЕКТОР-БЕСТ) в разведении 1:1000 и инкубировали 1 час при +37^oC. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрата (4 мг ортофенилендиамина, 0,1 мл 3,3% H₂О₂, 10 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5, 0,05М лимонная кислота + 0,05М однозамещенный фосфорнокислый натрий) и инкубировали 40-60 мин при +20^oC. Об окончании реакции судили по появлению желто-коричневого окрашивания в лунках положительного контроля (K+), после чего реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2М H₂SO₄. Результаты реакции оценивали на фотометре "УНИПЛАН" при длине волны 490 нм и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Вычисляли среднюю величину ОП уровня антител в слюне для доноров, которая составила 0,20±0,02. Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели отрицательного контроля т.е. 0,40 и более.

Предлагаемый способ прошел успешную апробацию в клинике и амбулатории НИИ по изучению лепры на 116 больных лепрой в течение 1998-1999 г. В качестве здорового контроля (лица, не контактировавшие с больными лепрой) обследованы 23 рабочих одного из промышленных предприятий г. Астрахани, проходившие ежегодные профилактические медицинские осмотры. Ниже приводятся результаты апробации.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется таблицей 1.

Из таблицы 1 видно, что проведенный корреляционный анализ результатов тестирования предлагаемым способом образцов сыворотки крови и слюны у больных лепрой показал высокую степень связи уровня антител в обеих биологических средах, что подтверждает возможность использования слюны в качестве биосреды, альтернативной сыворотке крови, для выявления антител к M.leprae.

Пример 1.

Больная К. , 1932 г.р., история болезни N 2044. Больна лепрой с 1955 г. Диагноз: лепроматозный тип лепры (LLs). С 1968 г. выписана на амбулаторное лечение, но периодически поступает в клинику НИИ по изучению лепры по поводу осложнения лепрозного процесса - хронического специфического полиневрита, хронического остиомиелита костей стоп, трофических язв стоп. В декабре 1998 г. поступила в клинику с обострением полиневрита. В настоящее время у больной специфический процесс находится в состоянии регресса. Активных проявлений на коже нет, БИН=0, M.leprae в коже не обнаружены. При посещении амбулатории и в период пребывания в клинике было произведено исследование содержания антител к M.leprae в слюне. В примере 1 и в последующих примерах приведены также показатели ОП уровня антител к M.leprae в образцах сывороток крови у этих же больных, чтобы показать, что уровень антител к M.leprae в слюне коррелирует с таковым в сыворотке крови. Слюну больной К. собирали в стеклянные флаконы, центрифугировали 15 мин при 3000 об./мин, надосадочную жидкость использовали для ИФА в цельном виде. Планшет сенсибилизировали антигеном M. lufu, разведенным в 10 мл карбонат-бикарбонатного буфера (Na₂CO₃ 1,59 г, NaHCO₃ 2,93 г, Н₂О 1 л pH 9,6) до конечной концентрации белка 5 мкг/мл по 100 мкл в каждую лунку. Планшет инкубировали при +4^oC 18 часов. Затем планшет трижды отмывали забуференным физраствором (34 г NaCl на 4 л H₂О, доводили pH до 7,4 2М Na₂PO₄ + 0,05% Твин-20) и заливали в каждую лунку по 100 мкл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина в 0,02 М фосфатно-солевом буфере (0,584 г, NaCl, 12,8 г Na₂HPO₄, 262 г NaHPO₄ pH 7,2-7,4) и инкубировали 1 час при +37^oC. Затем планшет вновь промывали вышеуказанным способом. Образцы слюны (цельные) заливали в 2 лунки планшета по 50 мкл в каждую лунку. В качестве положительного контроля (K+) использовали сывороточный пул от больных с активной лепрой, показатель оптической плотности (ОП) уровня антител которого в ИФА с антигеном M.lufu соответствовал 1,50 - 1,70. Планшет инкубировали 1 час при +37^oC. После инкубации планшет отмывали, как указано выше. Затем в лунки вносили по 100 мкл конъюгата (кроличьи антитела к общим иммуноглобулинам человека - IgG, IgA, IgM классов, меченные пероксидазой, производства ВЕКТОР-БЕСТ) в разведении 1:1000 и инкубировали 1 час при +37^oC. После отмывки планшета в лунки вносили по 100 мкл субстрата (4 мг ортофенилендиамина, 0,1 мл 3,3% H₂O₂, 10 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,5, 0,05М лимонная кислота + 0,05М однозамещенный фосфорнокислый натрий) и инкубировали 40-60 мин при +20^oC. Об окончании реакции судили по появлению желто-коричневого окрашивания в лунках положительного контроля (K+), после чего реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл 2М H₂SO₄. Результаты реакции оценивали на фотометре "УНИПЛАН" при длине волны 490 нм и выражали в единицах оптической плотности (ОП). Положительными считали образцы, показатели ОП которых в 2 и более раз превышали показатели отрицательного контроля т.е. 0,40 и более. В данном случае уровень антител к M. leprae IgG, IgA и IgM классов у больной К. составил 0,40, т.е. был положительным.

Из приведенных в табл. 2 данных видно, что у больной К. лепрозный процесс в стадии регресса, но обострение полиневрита подтверждено серологически повышением уровней антител к M.leprae как в сыворотке крови (0,45), так и в слюне (0,40). Снижение уровня антител в процессе лечения также шло параллельно в сыворотке и слюне.

Пример 2.

Больная Г. , 1939 г.р., история болезни N 3861. Поступила в клинику НИИ по изучению лепры 26.02.98 с диагнозом: лепроматозный тип лепры (LLp), лепрозный полиневрит прогрессирующего течения, хронический остиомиелит костей кистей. На коже - активные проявления лепрозного процесса: пятна, инфильтраты, лепромы. В скарификатах кожи M.leprae, БИН-7,86, 16,68, 4,14, 1,83+. Гистология кожи - инфильтрат лепроматозной структуры с наличием большого количества гомогенных M. leprae. Несмотря на проводимое противолепрозное лечение, инфекционный процесс имел прогрессирующее течение с частыми обострениями. Трижды проводилось определение уровня антител к M.leprae в сыворотке крови и в слюне, как описано в примере N 1.

В приведенном примере (см. табл. 3) у больной Г. клинически активная лепра, подтвержденная бактериоскопически и серологически. Высокий уровень антител к M.leprae в сыворотке крови коррелировал с высоким уровнем антител в слюне (0,82-1,00 -0,65). Показатели уровня антител в слюне больше 0,40.

Пример 3.

Больной А., 1967 г.р., история болезни N 3859. Поступил в клинику НИИ по изучению лепры 08.08.94. Диагноз - лепроматозный тип лепры (LLs). Клинически на коже туловища, конечностей - инфильтраты, лепромы. Бактериоскопически в скарификатах кожи большое количество M.leprae. БИН-11,7-11,7-0,8-1,8+. Биопсия кожи - инфильтрат лепроматозного характера с большим количеством M.leprae. Серология - высокий уровень антител к антигенам M.leprae в сыворотке крови. С 1997 года лепрозный процесс стал постепенно регрессировать.

На коже - остаточные элементы лепрозных проявлений, БИН=0, в скарификатах кожи M.leprae не обнаружены. Серология - антитела к M.leprae не обнаружены. Биопсия - регрессирующий инфильтрат лепроматозной структуры без M.leprae. У больного трижды было произведено определение антител к M.leprae в крови и слюне по методике, описанной в примере N 1.

Как видно из примера (см. табл. 4), у больного А. третий год лепрозный процесс в стадии клинического и бактериоскопического регресса, что подтверждается результатами серологических анализов сыворотки крови и слюны: показатели ОП слюны ниже фоновых значений (0,02-0,15-0,06) т.е. < 0,40. Это свидетельствует, что у серонегативного больного К. отсутствуют антитела к M. leprae и в слюне.

Пример 4.

Больная Б., 1950 г.р., история болезни N 3848. Поступила в НИИ по изучению лепры 11.07.94. с диагнозом: Лепроматозный тип лепры (LLs), лепрозный полиневрит. В результате проведенного специфического лечения с середины 1997 г. появились признаки регресса заболевания: на коже на местах бывших элементов остались бледно-синюшние пятна, исчезла инфильтрация кожи, в скарификатах кожи исчезли M.leprae, БИН=0. В январе 1999 г. у больной появились признаки активации лепрозного процесса: на коже - наличие активных проявлений, инфильтраты, в скарификатах кожи единичные M.leprae, БИН-0,57, 2,8, 2,8, 0,33. К концу 1999 г. у больной исчезли активные проявления лепры на коже, БИН= 0, в скарификатах M.leprae не обнаруживались. У больной трижды проведено исследование крови и слюны на наличие антител к M.leprae по методике, указанной в примере N 1.

Пример 4 (см. табл. 5) показывает, что у больной Б. в стадии регресса заболевания соответственно были низкие показатели уровней антител к M.leprae как в сыворотке, так и в слюне (0,25) < 0,40. При активации процесса эти показатели возросли (0,68), а при регрессе вновь снизились (в слюне 0,13, < 0,40). Это показывает прямую зависимость появления антител к M.leprae в крови и в слюне от активности лепрозного процесса.

Пример 5.

Показатели уровня антител (ОП) к M.leprae в слюне здоровых лиц, определенные предлагаемым способом, описанным в примере N 1.

Пример 5 (см. табл. 6) показывает, что у 23 здоровых лиц, (не контактных по лепре) уровни антител к общим иммуноглобулинам человека классов IgA, IgG, IgM (по показателям ОП) к М.leprae в слюне колебались от 0,18 до 0,29 (в среднем 0,200±0,016).

Таким образом, предлагается никем ранее не предлагавшийся способ диагностики лепры по уровню антител к М.leprae в слюне, выявляемых методом иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигена M.lufu, обладающего большим сходством по составу антигенов с М.leprae, и конъюгата антител к общим иммуноглобулинам человека, меченных пероксидазой, позволяющий кроме антител класса IgA выявлять антитела классов IgG и IgM, что дает возможность увеличить процент совпадений результатов определения уровня антител в слюне и сыворотки крови до 73,3% (против 45,9% в прототипе) и получить положительный результат в виде повышения диагностической точности способа, а использование более доступного антигенного материала - M.lufu, культивируемых in vitro, позволяет снизить трудоемкость в осуществлении способа.

Преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом поясняются таблицей 7.

В таблице 7 представлены сравнительные результаты определения антител к M. leprae в сыворотке крови и слюне больных лепрой, изложенные в прототипе и полученные предлагаемым способом. Показано, что результаты способа диагностики лепры, изложенные в прототипе, позволяют выявить лишь 45,9% случаев совпадений уровня антител класса IgA к ФГЛ-1 в слюне и сыворотке крови больных лепрой. Предлагаемый способ позволяет повысить до 73,3% число совпадений уровня антител к M.leprae в слюне и сыворотке крови больных лепрой за счет использования в качестве антигена M.lufu и конъюгата антител к общим иммуноглобулинам человека (IgG, IgA, IgM), меченных пероксидазой.

Таким образом, преимущества предлагаемого способа по сравнению с прототипом состоят в:
- повышении точности способа диагностики лепры на 27,4%
- снижении трудоемкости в осуществлении способа посредством использования M. lufu, культивируемой in vitro, вместо труднодоступного антигена ФГЛ-1
- повышении чувствительности способа путем дополнительного выявления в слюне антител классов IgG и IgM
- возможности применения способа для оценки эффективности лечения и прогнозирования активации процесса, т.к. способ позволяет обнаруживать в слюне антитела к M. leprae и у длительно леченных больных лепрой (более 5 лет), находящихся в стадии регресса (в прототипе - только у активных больных), что показано в примерах 1 и 4.

Предложенный способ может быть рекомендован для осуществления в противолепрозных учреждениях, а также в научных и клинических лабораториях, занимающихся проблемами туберкулеза.

Изобретение относится к медицине, а именно к лепрологии, и может быть использовано для диагностики лепры. Сущность изобретения состоит в том, что при обнаружении в слюне антител к М. leprae класса IgA иммуноферментным анализом в слюне дополнительно определяют антитела к М. leprae классов IgG и IgM с помощью антигенов М. lufu и по показателю оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру. Техническим результатом является повышение точности диагностики лепры. 7 табл.

Способ диагностики лепры, состоящий в обнаружении в слюне антител к М. leprae класса lg А иммуноферментным анализом, отличающийся тем, что в слюне дополнительно определяют антитела к М. leprae классов lg G и lg М с помощью антигенов М. lufu, и по показателю оптической плотности уровня антител 0,40 и более диагностируют лепру.