ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЯ ЖЕНЬШЕНЯ НАСТОЯЩЕГО Pg-1 (Panax ginseng C.A. Mey) В УСЛОВИЯХ IN VITRO - ПРОДУЦЕНТ ГИНЗЕНОЗИДОВ Российский патент 2011 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Область применения.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии.

Уровень техники.

Из 12 произрастающих на Земле видов применение в медицине получили Р. ginseng, P. japonicus, P.notoginseng, P. quinquefolium и Р. vietnamensis (Choi D.W. 2007. Ginseng. // Biotech. In Agriculture and Foresty. 61. Transgenic Crops VI (ed.E.C. Pua and M.R. Devey) Springer-Verlag. Heidelberg. P.149-168). Безусловно, самый известный Р. ginseng, именно его называют женьшень настоящий.

В 60-х годах прошлого столетия химики России и Японии установили, что лечебными свойствами обладают соединения - сапонины, которые являются уникальными тритерпеноидными даммарановыми сапонинами и синтезируются только в растениях рода Panax. Они получили название гинзенозиды (Tanaka О., Kasai R. Saponins of Ginseng and Rrelated Plants. // Progress in the Chemistry of Organic Natural Products / Eds. Hertz W. Grisebach H., Kirby G.W., Tamm Ch.: Springer-Verlag, Berlin 1984. V.46. P.1-764).

В результате проведенных работ многими авторами было установлено, что гинзенозиды по структуре агликона разделяются на две группы: 20(S)-протопанаксадиола (Rb-группа - Rb₁, Rb₂, Rc, Rd гинзенозиды) и 20(S)-протопанаксатриола (Rg-группа - Rf, Rg₁, Re гинзенозиды). Эти соединения в растении представлены в значительных количествах.

В местах естественного произрастания в разных частях растения Р. ginseng суммарное содержание гликозидов даммаранового ряда колеблется от 0.5 до 10% от сухой биомассы, при этом содержание индивидуальных компонентов является более важной характеристикой, чем суммарное количество гинзенозидов. Именно по их присутствию оценивают сырье женьшеня при использовании его в медицине.

Гинзенозиды женьшеня обладают тонизирующим, стимулирующим и адаптогенным действием на организм человека. Экстракт из корня женьшеня оказывает иммуномодулирующее, противодиабетическое и противолучевое действия, улучшает кровоснабжение мозга, увеличивает потребление кислорода, активизирует кроветворение, является противоопухолевым препаратом, а также оказывает положительное влияние на центральную нервную систему.

Композиция гинзенозидов и отношение соединений Rb- и Rg-групп в определенной степени являются индикатором лечебного действия препаратов женьшеня, чем объясняется обоснованность дифференцированного применения растений рода Panax в традиционной восточной медицине (Liang Y., Zhao S. Progress in Understanding of Ginsenoside Biosynthesis // Plant Biology. 2008. V.10. P.415-421).

В связи с тем, что ареал распространения растений женьшеня достаточно узок и количество их в природе сокращается, а плантационное выращивание - процесс трудоемкий (необходимо 6 лет для выращивания женьшеня), появилась необходимость получения гинзенозидов альтернативным путем, используя культуру клеток высших растений (Wu J., Zhong J.-J. Production of Ginseng and its Bioactive Components in Plant Cell Culture: Current Technological and Applied Aspects // J. Biotechnol. 1999. V.68. P.89-99).

Количество и качественный состав гинзенозидов в клетках в условиях in vitro изучали многие авторы и было показано, что в некоторых из них присутствует тот же состав гинзенозидов и с теми же фармакологическими свойствами, что и в растениях женьшеня (Mathur A., Mathur АK., Pal M., Uniyal G.C. Comparison of Qualitative and Quantitative in in vitro Ginsenoside Production in Callus Cultures of Three Panax Species // PlantaMed. 1999. V.65, P.484-486).

Известен штамм культивируемых клеток женьшеня настоящего №66, который был получен в ИФР'е из корня растения, привезенного из Кореи (Ginseng&Tobacco Company,

Южная Корея), и депонирован в Российскую коллекцию культивируемых клеток высших растений РККК-ВР при учреждении Российской Академии наук, институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН (Смоленская И.Н., Решетняк О.В., Смирнова Ю.Н., Черняк Н.Д., Глоба Е.Б., Носов A.M., Носов А.В. Противоположное влияние синтетических ауксинов - 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 1-нафтилуксусной кислот на рост культуры клеток женьшеня настоящего и синтез гинзенозидов. Физиология растений, 2007. Т.54. №2. С.243-253).

Штамм №66 хорошо растет. Суспензия женьшеня настоящего по числу клеток, сырому и сухому весу за пассаж прирастала в разных опытах от 3-х до 5-ти раз. Пик митотической активности (МИ) приходится на 5-6 сутки. Рост суспензии клеток сбалансирован. Штамм имеет высокую жизнеспособность - до 90% живых клеток, средне агригирован и в основном состоит из мелких меристемоподобных клеток.

Однако вышеуказанный штамм не является активным продуцентом гинзенозидов. С помощью жидкостной хроматографии обнаруживаются только следовые количества гинзенозидов, при этом в основном они представлены соединениями Rg-группы.

Таким образом, исходный штамм практически не продуцирует гинзенозиды, хотя и обладает высокими ростовыми качествами.

Задача изобретения.

Задача изобретения - получение нового штамма культуры клеток женьшеня (Panax ginseng С.А. Меу) - продуцента гинзенозида с достаточным его накоплением в биомассе суспензионной культуры при высоком отношении соединений Rg- и Rb-групп и при его стабильности в течение нескольких последовательных циклов культивирований.

Решение задачи.

Эта задача была решена созданием нового штамма культивируемых в условиях in vitro клеток растения женьшеня настоящего (Panax ginseng C.A Mey), депонированного в Российскую коллекцию культивируемых клеток высших растений при учреждении Российской Академии наук институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под обозначением Pg-1 - продуцента гинзенозидов: соединений групп Rg и Rb. Справка о депонировании представлена.

Реализация изобретения.

Штамм Pg-1 был получен следующим способом. Исходный штамм №66 культивируют при температуре 26±1°С, влажности помещения 70%, в темноте, в колбах, на жидкой питательной среде следующего состава.

КNО₃ 2500±1.0 (NH₄)₂SO₄ 170±0.5 MgSO₄×7H₂O 370±1.0 KH₂PO₄ 170±0.5 CaCl₂×2Н₂О 640±0.8 Н₃ВО₃ 6.2±0.01 KI 0.83±0.08 ZnSO₄×7H₂O 8.6±0.001 Na₂MoO₄×2H₂O 0.25±0.001 CuSo₄×5H₂O 0.025±0.0002 CoCl₂×6H₂O 0.025±0.0001 FeSO₄×7H₂O 2.785±0.01 Na₂ ЭДТА 3.722±0.015 Тиамин 0.1±0.005 Пиридоксин 0.1±0.001 Никотиновая к-та 0.5±0.001 α-афтилуксусная 2.0±0.2 кислота (НУК)   6-бензиламинопурин 1.0±0.02 Сахароза 30000±5000

Суспензию клеток выращивают в течение 12-14 последовательных пассажей, в каждом из которых определяют ростовые, цитоморфологические, цитогенетические и биосинтетические характеристики.

Сущность изобретения.

По мнению авторов, предлагаемое изобретение состоит в том, что замена состава гормонов - дихлорфеноуксусной кислоты (2.4-Д) на α-нафтилуксусную кислоту (НУК) - приводит к тому, что получен новый штамм Pg-1, синтезирующий значительное количество гинзенозидов - до 4% от абсолютно сухой биомассы в отличие от штамма №66, практически не синтезирующего гинзенозиды.

Результаты изобретения.

Штамм женьшеня настоящего Pg-1 обладает следующими признаками. Культуральные признаки. Биомасса клеток гомогенная, белой или бело-желтой окраски, культуральная жидкость прозрачная.

Описание визуальных и цитологических наблюдений.

Индекс роста (кратность прироста биомассы за одно субкультивирование) определяли по числу клеток, по сырой и сухой биомассе. Число клеток подсчитывали в камере Фукса-Розенталя после мацерации суспензии в 10%-ном растворе хромовой кислоты при 60°С в течение 15 мин. Для определения сырой массы клетки отделяли от среды культивирования на бумажных фильтрах под вакуумом, промывали два раза водой и взвешивали. Сухую массу клеток получали после высушивания образцов при 60°С. Жизнеспособность оценивали по числу неокрашенных в 0.1%-ном водном растворе эозина клеток и агрегатов. Средний объем клеток в образце определяли как частное от деления сырой биомассы на число клеток.

Таблица 1 Характеристики роста суспензий клеток штамма Pg-1 Показатели Значения Индексы роста:   сухая биомасса 3.4±0.5 сырая биомасса 3.1±1.3 число клеток 2.7±0.3 Максимальный МИ, % 1.4±0.1 Жизнеспособность, % 85.4±1.4

Как видно из таблицы 1, число клеток, сырая и сухая биомасса имеют близкие значения, что говорит о сбалансированности роста суспензии клеток. Штамм имеет высокую жизнеспособность - до 90% живых клеток. Средний индекс роста по сырой массе имел значение 3.1, митотический индекс (МИ) не поднимался выше 1.4%.

Характеристики роста. Время удвоения числа клеток составляет 1.3 сут. Удельная максимальная скорость роста по числу клеток 0.13±0.02 сут^-1. Рассчитанный на основании данных по числу клеток и сырой массе средний объем клеток суспензии в начале субкультивирования был равен 13.2×10⁴ мкм³. К концу субкультивирования средний объем клеток в суспензии увеличивался до 36.3×10⁴ мкм³. Клетки формировали многоклеточные агрегаты до 3-4 мм. Количество агрегатов с числом клеток >50 значительно возрастает после нескольких субкультивирований на всех средах с НУК, особенно к концу пассажей (табл.2).

Таблица 2 Агрегированность и состав клеточной популяции в суспензии штамма Pg-1 Число клеток в агрегатах Тип клеток, % 1-10 10-20 20-50 >50 МП (≤100 мкМ) ПП (100-200 мкМ) УК (>200 мкМ) Доля агрегатов в популяции клеток, % 2.0±1.2 4.7±0.9 10.0±0.6 83.3±1.5 7.9±0.9 69.0±3.4 23.1±1.4 Примечание: МП - меристемоподобные клетки; ПП - паренхимоподобные клетки; УК - удлиненные клетки

При этом суспензия содержит клетки всех трех видов: меристемоподобные, крупные паренхимоподобные и удлиненные большого размера.

Известно, что основная масса гензенозидов в корнях интактного растения Р. ginseng локализуется в наружной части - между флоэмой и перидермой, состоящей из паренхимных клеток. Основываясь на этих данных, можно предположить, что в суспензионной культуре Pg-1 накопление гинзенозидов происходит в клетках обоих типов, но в большей степени - в паренхимоподобных, образующих крупные агрегаты.

Сравнение результатов, полученных в 6-ти независимых субкультивированиях, показывает, что число клеток и прирост биомассы остаются практически постоянными.

Анализ состава и количества гинзенозидов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Образцы клеток (2-3 г сырой биомассы) дважды экстрагировали метанолом при постоянном перемешивании - сначала 3 ч и после сбора первой порции экстракта еще 1 ч. Суммарный экстракт упаривали досуха на роторном испарителе при 45-50°С. Сухой остаток растворяли в воде и очищали на патронах Sep-Pak ("Tessek", Чехия) размером 9×12 мм и объемом сорбента - Separon SGX С18 (60 мкм) - 1 мл. Патрон с пробой последовательно промывали водой, 20%-ным и 80%-ным этанолом. Сухой остаток последней фракции растворяли в смеси ацетонитрил:вода (35:65 по объему), пропускали через тефлоновые микрофильтры ("Tessek") с порами 0.2 мкм и использовали для ВЭЖХ. Разделение гинзенозидов проводили на приборе фирмы "LKB" (Швеция), используя стальную колонку (4×250 мм), заполненную Lichrosorb RP-18 с размером частиц 5 мкм. Применяли два различных изократических режима при скорости потока 0.5 мл/мин: 1) для гинзенозидов Rf, Rb₁, Rc, Rb₂, Rd - ацетонитрил:вода в объемном соотношении 35:65; 2) для гинзенозидов Rg₁, Re - ацетонитрил:вода в объемном соотношении 22:78. Детектирование проводили при длине волны 203 нм. Для количественного определения использовали метод абсолютной калибровки относительно индивидуальных гинзенозидов фирмы "Sigma" (США). Суммарное содержание семи гинзенозидов пересчитывали на абсолютно сухую массу. Чувствительность определения каждого гинзенозида составляла 20 мкг/г сухой массы. Идентификацию агликонов проводили по методу (Решетняк О.В., Черняк Н.Д., Смоленская И.Н., Орешников А.В., Смирнова Ю.Н., Носов A.M. Сравнительный анализ гинзенозидов в разных частях корней и в культивируемых клетках женьшеня настоящего //. Хим.-фарм. журнал. 2008. Т.42. С.34-39).

Таблица 3 Содержание гинзенозидов в мг/г абсолютно сухой биомассы в суспензии штамма Pg-1 Rb₁ Rc Rb₂ Rd Rf Rg₁ Re Rb-гр Rg-гр Rg/Rb содержание гинзенозидов, % 3.39 1.75 0.40 0.25 0.34 2.81 32.00 5.79 35.15 6.1 4.1

В результате заявленного изобретения, как представлено в таблице 3, в штамме Pg-1 содержание гинзенозидов в среднем составляло 4% от абсолютно сухой биомассы, что в 25 раз выше, чем в штамме №66. При этом в отдельных опытах этот показатель достигал значения 5,5%, а к 7 пассажу был равен 11-12%. В течение длительного культивирования (6-7 циклов) стабильно присутствовали все семь гинзенозидов, характерных для растений. В обеих группах - Rb и Rg пропорционально увеличивалось содержание всех гинзенозидов, но, главным образом, в штамме Pg-1 активизировался синтез соединений Rb-группы и особенно Re гинзенозида. Кроме того, отношение соединений Rg/Rb групп было достаточно высоким и становилось стабильным в течение нескольких последовательных циклов культивирования в результате того, что выравнились процентные отношения отдельных гинзенозидов, таким образом, получен новый штамм женьшеня настоящего Pg-1, синтезирующего полный состав соединений Rg- и Rb-групп гинзенозидов.

В результате заявленного изобретения получен штамм женьшеня Pg-1, синтезирующий значительное количество гинзенозидов - до 4% от сухой биомассы клеток. При этом сохраняется высокая скорость роста по сухой и сырой биомассе и жизнеспособность клеток. Необходимо отметить, что в штамме Pg-1 качественный состав всех соединений гинзенозидов Rb и Rg-групп и их количество было равно значениям, имеющимся в дикорастущем растении женьшеня настоящего.

Кроме того, удобство использования клеточной биомассы для получения гинзенозидов состоит в отсутствии сезонной зависимости их накопления. Получение сырья доступно круглый год, тогда как растения для этой цели используются только в осенний период.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности культивированию клеток растения женьшеня настоящего, и может быть использовано для получения ценных биологически активных соединений - гинзенозидов, которые широко используются в фармацевтической промышленности и косметологии. Штамм культивируемых в условиях in vitro клеток растения женьшеня настоящего Pg-1 (Panax ginseng С.А Меу) депонирован в Российской коллекции культивируемых клеток высших растений при учреждении Российской Академии наук, институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под №68 - продуцент гинзенозидов: соединений групп Rg и Rb. В течение длительного культивирования (6-7 циклов) стабильно присутствовали все семь гинзенозидов, характерных для растений. В штамме Pg-1 активизировался синтез соединений Rb-группы и особенно Re гинзенозида. Отношение соединений Rg/Rb групп было достаточно высоким и оставалось стабильным в течение нескольких последовательных циклов культивирования. Полученный штамм женьшеня настоящего Pg-1 синтезирует полный состав соединений Rg и Rb групп гинзенозидов и их значительное количество - до 4% от сухой биомассы клеток. Качественный состав всех соединений гинзенозидов Rb- и Rg-групп и их количество было равно значениям, имеющимся в дикорастущем растении женьшеня настоящего. 3 табл.

Штамм культивируемых клеток растения женьшеня настоящего Pg-1 (Рапах ginseng C.A. Меу) в условиях in vitro, депонированный в Российской коллекции культивируемых клеток высших растений при учреждении Российской Академии наук Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН под номером 68 - продуцент гинзенозидов соединений групп Rg и Rb.