ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ PANAX GINSENG C.A. MEY - ПРОДУЦЕНТ ГИНЗЕНОЗИДОВ Российский патент 1995 года по МПК C12N5/04 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, пищевой и парфюмерной промышленности.

В настоящее время культивируемые клетки женьшеня Раnах ginseng C.A. Mey активно изучаются как источник получения ценных биологически активных веществ гинзенозидов (тритерпеновых гликозидов даммарановой группы). В Японии получены клеточные линии женьшеня активные продуценты гинзенозидов [1-4]
Известные штаммы культивируемых клеток женьшеня, используемые в промышленности, либо не содержат гинзенозидов [5] либо продуцируют их в следовых количествах [6]
В литературе не содержится сведений, характеризующих штаммы культивируемых трансформированных клеток женьшеня продуцентов гинзенозидов.

Таким образом, предлагаемый штамм R1 культивируемых клеток растений Рanax ginseng C.A. Mey продуцент гинзенозидов, аналогов не имеет.

Штамм R1 получен в результате гинетической трансформации в Биолого-почвенном институте Дальневосточного отделения Российской Академии Наук и Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений при Институте физиологии растений АН СССР им. К.А.Тимирязева под коллекционным номером ВСКК (ВР) 38. Наименование штамма R1.

Штамм R1 характеризуется следующими признаками.

Описание исходного материала: проростки семян женьшеня настоящего Panax ginseng C.A. Mеy трехмесячного возраста, инокулированные агробактериями Agrobacterium rhizogenes A4. Опухоли, полученные на стеблях проростков в местах инокуляции бактерий, переведены в стерильную культуру и явилиcь исходным материалом для получения каллусного штамма R1. Семена женьшеня настоящего Приморской популяции получены из Зональной опытной станции Всесоюзного института лекарственных растений (пос. Старая Варваровка Приморского края).

Культуральные свойства.

Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции светло-зеленого цвета, реже желто-зеленого цвета без запаха. Ростовой индекс культуры 14±2 по сырому весу для каллусов начальной массой 80 мг, содержание сухого вещества 5,3±1,3% Живых клеток в середине экспоненциальной фазы роста 90-94% Способ культивирования выращивание в накопительном режиме на агаризованной питательной среде в отсутствие освещения при температуре 25±1^оС, относительной влажности воздуха 70±10% на питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 350-450 KNO₃ 1500-2300 CaCl₂˙2H₂O 400-480 MgSO₄˙7H₂O 350-400 KH₂PO 150-190 H₃BO₃ 4,2-8,0 MnSO₄.4H₂O 15,6-26,7 CoCl₂˙2H₂O 0,02-0,03 CuSO₄˙5H₂O 0,02-0,03 ZnSO₄˙7H₂O 6,0-10,3 Na₂MoO₄˙2H₂O 0,2-0,3 KJ 0,53-0,90 FeSO₄˙7H₂O 25,0-30,6 Na₂EDTA˙2H₂O 33,6-41,0 Тиамина гидрохлорид 0,15-0,25 Пиридоксина гидро- хлорид 0,4-0,6 Никотиновая кислота 0,4-0,6 Мезо-инозит 80-120 Казеина гидролизат 80-120
4-Хлорофенокси- уксусная кислота (А-СРА) 0,35-0,45 Сахароза 23000-30000 Агар 5800-6200
рН среды до автокла- вирования 5,6-5,8
Каллусы пассируются с интервалом 30 сут.

Номер пассажа 19-й.

Цитологическая и кариологическая характеристики штамма.

Ткань состоит на 86-94% из клеток меристематического типа круглой или овальной формы размером в среднем 57 х 67 мкм, и из клеток паренхимного типа удлиненной формы размером в среднем 80 х 160 мкм. Кривая митотической активности имеет одновершинный характер с максимумом на 9-й день культивирования. Среднее число хромосом 56±6 с вариацией от 24 до 190.

Способность к морфогенезу.

Наблюдается редко спонтанный ризогенез при увеличении продолжительности культивирования каллусов в пассаже до 1,5-2,0 месяцев.

Характеристика биосинтеза гинзенозидов.

Штамм продуцирует гинзенозиды (гликозиды даммароновой группы) Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rb2, Rd в количествах, сравнимых с их содержанием к корнях плантационных растений (табл. 1).

Гинзенозиды в среду культивирования не выделяются.

Общее содержание гинзенозидов (Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rb2, Rd) в каллусах штамма R1 4,3±1,0 мг/г сухой массы.

П р и м е р. В колбы Эрленмейера емкостью 100 мл разливают по 30 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: NH₄NO₃ 400 KNO₃ 1900 CaCl₂˙2H₂O 440 MgSO₄˙7H₂O 370 KH₂PO₄ 170 H₃BO₃ 6,2 MnSO₄˙4H₂O 22,3 CoCl₂˙2H₂O 0,025 CuSO₄˙5H₂O 0,025 ZnSO₄˙7H₂O 8,6 Na₂MoO₄˙2H₂O 0,25 KJ 0,83
FeSO₄˙7H₂O 27,8 Na₂EDTA˙2H₂O 37,3 Тиамина гидрохлорид 0,2 Пиридоксина гидрохлорид 0,5 Никотиновая кислота 0,5 Мезо-инозит 100 Казеина гидролизат 100
4-Хлорофенокси- уксусная кислота (4-СРА) 0,4 Сахароза 25000 Агар 6000
рН до автоклавирования 5,6.

Колбы со средой автоклавируют при 117^оС в течение 20 мин, затем охлаждают. На поверхность агара помещают каллусы штамма R1 в количестве 0,5 г в каждую колбу. Культуру инкубируют в темноте при 25^оС и относительной влажности воздуха 70% в течение 30 сут. Затем каллусы извлекают из колб и взвешивают. Результаты приведены в табл. 2. После лиофильной сушки каллусов в них определяют содержание гинзенозидов по методу, разработанному в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО АН СССР (Маханьков В.В. Самошина Н.Ф. Малиновская Г.В. Атопкина Л.Н. Денисенко В.А. Исаков В.В. Калиновский А.И. Уварова Н.И. Анализ гликозидов даммаранового ряда в природных и синтетических смесях методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Химия природных соединений, 1990, N 1, с.57-61).

Для этого сухую биомассу штамма R1 исчерпывающе экстрагируют 70%-ным водным метанолом. Полученный упаренный экстракт растворяют в 70%-ном водном метаноле. Полученный упаренный экстракт растворяют в воде и последовательно экстрагируют сначала пентаном, а затем насыщенным водой н-бутанолом. Бутанольную часть упаривают при пониженном давлении до постоянного веса, затем растворяют в метаноле. Полученную сумму гинзенозидов анализируют при помощи микроколончатого хроматографа "Милихром" со стальными колонками 64 х 2 мм, заполненными сорбентом "Сферисорб" ОДС 5 мкм. Элюируют градиентом смеси ацетонитрил вода от 20:80 до 50:50. Время разделения 25 мин, расход растворителя 2,5 мл. Детектирование элюата осуществляют при 204 нм. Результаты представлены в табл. 2.

Таким образом, полученный штамм R1 культивируемых клеток растений Panax ginseng C.A. Mey является продуцентом редких и ценных гинзенозидов Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rb1, Rc, Rn2, Rd, в количествах, сравнимых с их содержанием в корнях плантационных растений.

Использование: биотехнология, культивирование растительных тканей и клеток, фармакология, медицина. Сущность изобретения: получен штамм культивируемых клеток растений Panax ginseng C.A.Mey - продуцент гинзенозидов. 2 табл.

Штамм культивируемых клеток растений Panax ginseng C.A. Mey ВСКК ВР N 38 продуцент гинзенозидов.