ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ PANAX GINSENG C.A.MEY - ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ Российский патент 2000 года по МПК C12N5/04 A61K35/78 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению биологически активных веществ из культивируемых растительных клеток, и может быть использовано в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности.

Известны различные штаммы женьшеня, полученные от корня: ИФРЖ-2¹, ИФРЖ-3², или суспензионные штаммы, например штамм клеток женьшеня ДАН-25³. Эти штаммы имеют недостаточно высокую продуктивность по биомассе.

Наиболее близким к предлагаемому является штамм женьшеня, полученный от 6-летнего корня женьшеня⁴. Он представляет собой биомассу беловатого или кремового цвета, мелкозернистую, легко рассыпающуюся на мелкие кусочки. Основная масса ткани на 90% состоит из паренхимных клеток размером 74,7-122,5 мкм и мелких меристематических клеток размером 34,9-72,9 мкм. Штамм культивируется на плотной питательной средес с пересадками через 40 суток. Ростовой индекс - 5, содержание суммы гликозидов - 3,0-3,5%. Недостаток - не очень высокий выход биомассы и биологически активных веществ. Кроме того, все эти штаммы продуцируют биологически активные вещества (БАВ), характерные для корня женьшеня.

Известно, листья женьшеня тоже содержат много БАВ^5,6. Они содержат, кроме тритерпеновых сапонинов (панаксозидов), флавоноиды (кемпферол, трифолин, панасенозид), каротиноиды, алифатические, ароматические, гетероциклические аминокислоты и др. Однако использование листьев женьшеня в промышленности затруднена сезонностью их заготовки, нестандартностью содержания в них БАВ и, кроме того, плантационное возделывание женьшеня предусматривает неоднократную обработку листьев средствами для борьбы с вредителями, что делает невозможным их использование в качестве сырья.

Задача изобретения - получить штамм женьшеня, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, характерных для листьев женьшеня, имеющий высокую продуктивность, расширить ассортимент БАВ растительного происхождения.

Поставленная задача реализуется предлагаемым штаммом культивируемых клеток растений Panax ginseng C.A.Mey - продуцентом биологически активных веществ.

Штамм получают следующим образом:
Семена Panax ginseng C.A.Mey Приморской популяции тщательно промывают мыльным раствором, ополаскивают водой и в течение одной минуты стерилизуют в концентрированной серной кислоте. Затем промывают водой и в течение 30 мин стерилизуют активным хлором (0,1%). Простерилизованные таким образом семена помещают на питательную среду, содержащую половину дозы минеральных солей и микроэлементов по Мурасиге-Скугу и дополненную следующими компонентами (мг/л): агар - 6000,0; сахароза - 20000,0; инозит - 100,0; тиамин бромид - 1,0; бензиламинопурин - 0,5, и ингубируют в термостате (24^oC) с 16 часовыми фотопериодами. В течение 30 - 40 дней семена прорастают. Проростки освобождают от околоплодника и переносят на среду для побегообразования, содержащую (мг/л): макро- и микроэлементы по Мурасиге-Скугу, агар - 6000,0; сахароза - 25000; инозит - 100,0; тиамин бромид - 1,0; бензиламинопурин - 0,5. На этой питательной среде 15 - 25 дней происходит образование многочисленных побегов с развитыми листьями. Листья побегов, размноженных in vitro, служат стерильным материалом для получения каллуса. Литья в асептических условиях разрезают на сегменты и помещают на питательную среду для каллусообразования (мг/л): KNO₃-2000,0; NH₄NO₃-1000,0; MgSO₄•7H₂O; CaCl₂-300,0; KH₂PO₄-100,0; агар-6000,0; сахароза-25000,0; инозит-100,0; пиридоксин-1,0; тиамин бромид-1,0; 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота-2,0; кинетин-1,0. Каллус формируется в течение 3 дней, после чего его изолируется в течение 30 дней, после чего его изолируют от листьев и продолжают субкультивирование, регулярно пересаживая ткань на свежую питательную среду, содержащую повышенное количество сахарозы-50000,0 - 60000,0 мг/л.

К моменту подачи заявки, изолированный штамм, названный Л-66, прошел 48 пассажей. Он хранится в коллекции растительных культур ЗАО "2-й цех".

Штамм Л-66 имеет следующие характеристики:
Морфолого-анатомические признаки.

Штамм представляет собой рыхлую массу желтовато-кремового цвета со специфическим запахом и горьким вкусом. Клетки культуры, как правило, округлые, тонкостенные, содержат одно ядро с одним, реже с несколькими ядрышками, размер большинства клеток составляет 50 - 120 мкм. В биомассе обнаружены проводящие ткани, представленные трахеидами, частично одревесневшими, и механические волокна.

Физиологические и цитологические признаки.

Цикл роста штамма Л-66 характеризуется S-образной кривой с 3 - 5 дневной лаг-фазой, фазой экспоненциального роста 5 - 12 суток, линейной - 15 - 20 суток и стационарной фазой 25 - 30 суток.

Ростовой индекс на конец культивирования равен по сырой биомассе - 20, по сухой - 10. Кривая митотической активности имеет трехвершинный характер, однако делящиеся клетки встречаются и в конце цикла роста. Штамм представлен в основном анеуплоидными клетками, при этом частота гаплоидных клеток составляет 75%, диплоидных - 23%, триплоидных - 2%. Маркерные хромосомы отсутствуют, но часто встречаются двуядерные метафазы, в том числе и с диплохромосомами.

Характеристика продуктов вторичного метаболизма.

Штамм Л-66 является продуцентом биомассы, содержащей биологически активные вещества: тритерпеновые сапонины (панаксозиды), из которых идентифицированы гинзенозиды Rg₁, Rf, Re, Rc, микроэлементы, полиацетилены, аминокислоты, стерины, флавоноиды и др. Отличительным признаком штамма является его горький вкус. Он способен расти на концентрированной среде, содержащей 5 - 6% сахарозы, к концу цикла выращивания дает не менее 3,4 г сухой биомассы на 1 флакон (100 мл) или 34 г на 1 л среды. Содержание суммы гликозидов в расчете на 1 л среды - 1080±52 мг, кроме того, он синтезирует флавоноиды. В питательной среде продукты биосинтеза штамма не обнаружены.

Пример 1. В культуральные банки разливают по 100 мл питательной среды с увеличенным содержанием сахарозы до 50000-60000 мг/л. Банки со средой стерилизуют при 1 атм 15 мин. Посадку осуществляют инокулятом массой 3 - 5 г на 1 флакон. Банки с инокулятом инкубируют при 24^oC и относительной влажности воздуха 70%. По истечении 25 дней инкубации биомассу отделяют от остатков агара, взвешивают и высушивают.

Сравнительная характеристика биомассы штамма Л-66 и штамма-аналога представлена в таблице.

Была исследована фармакологическая активность спиртовой настойки, изготовленной из биомассы штамма Л-66 по традиционной методике ^7,8.

В опытах на животных установлено, что предварительное в течение недели введение внутрь настойки в суточной дозе 50 капель повышало выживаемость крыс на 30% после моделирования циркуляторной гипоксии мозга путем перевязки сонных артерий по сравнению с контролем. Курсовое 3-недельное ежедневное введение настойки внутрь в той же дозе препятствовало развитию постишемической гипоперфузии и способствовало восстановлению нарушенных ишемией ауторегуляторных реакций мозговых сосудов. Снижение сосудистого сопротивления мозговых сосудов после ишемии свидетельствует о прямом избирательном действии биологически активных веществ на сосуды мозга, что, по-видимому, и приводит к улучшению мозгового кровообращения. Таким образом, комплекс биологически активных веществ из биомассы штамма Л-66 может быть апробирован в качестве средства профилактического при гипоксических и ишемических нарушениях мозгового кровообращения.

Таким образом, заявляемый штамм Л-66, полученный из листьев женьшеня, имеет ряд существенных отличий от известных и обладает рядом преимуществ:
- синтезирует флавоноиды в отличие от штаммов, полученных от корня;
- растет на концентрированной питательной среде, содержащей 50000,0-60000,0 мг/л сахарозы;
- имеет специфический горький вкус, отличный от вкуса биомассы штаммов-аналогов, полученных от корня;
- имеет большую продуктивность: по биомассе в 3 раза выше и в 3 раза выше по выходу суммы гликозидов.

Кроме того, полученный из биомассы экстракт (настой) БАВ, проявляет биологическую активность при гипоксических и ишемических нарушениях мозгового кровообращения, не обнаруженную у препаратов из корня женьшеня и штаммов аналогов.

Литература
1. А.С. СССР N 1058281, C 12 N 5/00, 1982.

2. А.С. СССР N 1058282, C 12 N 5/00, 1982.

3. Патент РФ N 2052925, A 01 H 4/00, БИ N 3 1996.

4. Слепян Л. И. Женьшень на ранних этапах онтогенеза и в культуре изолированных тканей. Автореферат канд.дис. на соискание ученой степени к.б.н., Ленинград, 1969 г. С. 19.

5. Легостева А.Б. и др. Растительные ресурсы. 1986. N 4. С. 523 - 26.

6. Брижихач Б. и др. Растительные ресурсы. 1982. т. 18. вып. 3. С. 357-363.

7. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М. "Медицина". 1993. ч. 1. С. 162.

8. ВФС 42-1890. Настой биоженьшеня.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению биологически активных веществ из культивируемых растительных клеток, и может быть использовано в фармацевтической, косметической и пищевой промышленности. Штамм получен из листьев растений Panax ginseng С.А.Меу приморской популяции. Хранится в коллекции растительных культур "ЗАО"2 цех" код Л-66. Изолированный штамм прошел 48 пассажей, растет на концентрированной питательной среде, содержащей 50000,0-60000,0 мг/л сахарозы, имеет горький вкус. Продуцирует биомассу, содержащую биологически активные вещества: тритерпеновые сапонины /панаксозиды/, микроэлементы, полиацетилены, аминокислоты, стерины, флавоноиды и др. В отличие от штаммов, полученных от корня, имеет более высокую продуктивность по биомассе и по выходу суммы гликозидов. Экстракт из биомассы штамма проявляет биологическую активность при гипоксических и ишемических нарушениях мозгового кровообращения. 1 табл.

Штамм культивируемых клеток растений Panax ginseng C.A.Mey Л-66 - продуцент биологически активных веществ.