ШТАММ PANAX GINSENG C.A.MEY - ПРОДУЦЕНТ ГИНЗЕНОЗИДОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИНЗЕНОЗИДОВ Российский патент 1996 года по МПК A01H4/00 C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, парфюмерной, косметической и пищевой промышленности.

Известны штаммы женьшеня настоящего Panax ginseng C.A. Mey ИФРЖ1, ИФРЖ2, ИФРЖ3 продуценты биологически активных веществ женьшеня - панаксозидов (гинзенозидов).

Известны способы получения панаксозидов путем культивирования штаммов - продуцентов на питательных средах. Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения панаксозидов путем выращивания штамма ИФРЖ1 на питательной среде следующего состава, мг/л воды:
NH₄NO₃ 1650
KNO₃ 1900
CaCl₂ • 2H₂O 440
MgSO₄ • 7H₂O 370
KH₂PO₄ 170
H₃BO₃ 6,20
MnSO₄ • 4H₂O 22,80
ZNSO₄ • 7H₂O 8,60
KJ 0,83
Na₂MoO₄ • 2H₂O 0,25
CuSO₄ • 5H₂O 0,025
CoCl₂ • 6H₂O 0,025
FeSO₄ • 7H₂O 27,80
Na₂ ЭДТА (натриевая соль этилендиаминтетра, уксусной кислоты) 37,30
Тиаминбромид (B1) 0,40
α-нафтилуксусная кислота (НУК) 2,0
Кинетин 1,0
Инозит 80
Гидролизат казеина 500
Сахароза 30000
Агар-агар 7000
(Сведения приведены в а. с. N 1058281, кл. C 12 N 5/00. Штамм Panax ginseng ИФРЖ2 продуцент биологически активных веществ и способ получения биологически активных веществ. Р.Г. Бутенко, Н.А. Мясоедов, З.Б. Шамина, Л. И. Слепян. Приоритет от 04.01.82; а.с. N 1058282, кл. C 12 N 5/00. Штамм Panax ginseng ИФРЖ3 процент биологически активных веществ и способ получения биологически активных веществ. Р.Г. Бутенко, Н.А. Мясоедов, З.Б. Шамина, Л. И.Слепян. Приоритет от 04.01.82).

Однако известные технические решения не позволяют определить качественный и количественный состав продуцируемых гинзенозидов.

Заявляется способ получения гинзенозидов, включающий выращивание штамма-продуцента на питательной среде, содержащей микро- и макросоли, стимуляторы роста, сахарозу и агар, с последующим выделением целевого продукта, в котором в качестве штамма-продуцента используют штамм 1c Panax ginseng C.A. Mey, а выращивание ведут на среде, содержащей, мг/л воды:
NH₄NO₃ 350 450
KNO₃ 1500 2300
CaCl₂ • 2H₂O 400 800
MgSO₄ • 7H₂O 350 400
KH₂PO₄ 150 190
H₃BO₃ 4,2 8,0
MnSO₄ • 4H₂O 15,6 26,7
CoCl₂ • 2H₂O 0,02 0,03
CuSO₄ • 5H₂O 0,02 0,03
ZnSO₄ • 7H₂O 6,0 10,3
Na₂MoO₄ • 2H₂O 0,20 0,30
KJ 0,53 0,9
FeSO₄ • 7H₂O 25,0 30,6
Na₂EDTA • 2H₂O 33,6 41,0
Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25
Пиридоксина гидрохлорид 0,45 0,55
Никотиновая кислота 0,45 0,55
Мезо-инозит 80 120
Казеина гидролизат 80 120
4-хлорфеноксиуксусная кислота (4-СРА) 0,35 0,45
Сахароза 23000 27000
Агар 5800 6200
Штамм 1c Panax ginseng C.A. Mey продуцент гинзенозидов получен и депонирован во Всесоюзную коллекцию клеток высших растений ВСКК (ВР) при Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР под коллекционным номером 41. Наименование штамма 1c.

Штамм 1с характеризуется следующими признаками.

Описание исходного материала. Исходным материалом для получения штамма 1с были стебли проростков семян женьшеня настоящего Panax ginseng C.A. Mey двухмесячного возраста сорта "Мимаки".

Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой ткань рыхлой консистенции светло-желтого цвета без запаха. Ростовой индекс 10 для каллусов начальной массой 100 мг, содержание сухого вещества 4,9% Живых клеток 89 94% в середине экспоненциальной фазы роста. Штамм 1с выращивают при температуре 24 ± 1^oC, относительной влажности воздуха 60 ± 10% освещенность отсутствует. Сосуды для выращивания колбы Эрленмейера емк. 100 мл, содержащие 40 мл питательной среды.

Состав агаризованной среды, мг/л воды:
NH₄NO₃ 350 450
KNO₃ 1500 2300
CaCl₂ • 2H₂O 400 480
MgSO₄ • 7H₂O 350 400
KH₂PO₄ 150 190
H₃BO₃ 4,2 8,0
MnSO₄ • 4H₂O 15,6 26,7
CoCl₂ • 2H₂O 0,02 0,03
CuSO₄ • 5H₂O 0,02 0,03
ZnSO₄ • 7H₂O 6,0 10,3
Na₂MoO₄ • 2H₂O 0,20 0,30
KJ 0,53 0,90
FeSO₄ • 7H₂O 25,0 30,6
Na₂EDTA • 2H₂ 33,6 41,0
Тиамина гидрохлорид 0,15 0,25
Пиридоксина гидрохлорид 0,45 0,55
Никотиновая кислота 0,45 0,55
Мезо-инозит 80 120
Казеина гидролизат 80 120
4-хлорфеноксиуксусная кислота (4-СРА) 0,35 0,45
Сахароза 23000 27000
Агар 5800 6200
pH среды до автоклавирования 5,6 5,88
Продолжительность цикла выращивания 30 суток.

Номер пассажа 23.

Цитологические и кариологические характеристики штамма 1с.

Ткань представляет гетерогенную популяцию, состоящую на 76 88% из клеток меристематического типа круглой или овальной формы, имеющих средние размеры 63 77 мкм, и из клеток паренхимного типа размером 213 267 мкм, содержание в популяции 12 24%
Кривая митотической активности имеет одновершинный характер с максимумом на 14 день культивирования.

Распределение клеток по числу хромосом, клеток в модальном классе, приведено в табл. 1.

Способность к морфогенезу. В культуре наблюдается редко спонтанный ризогенез при увеличении продолжительности культивирования в одном пассаже для полутора двух месяцев.

Характеристика биосинтеза гинзенозидов. Штамм 1с продуцирует гинзенозиды гликозиды даммарановой группы Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd. Максимальное накопление гинзенозидов наблюдается на 30 сутки культивирования.

Общее содержание гинзенозидов (Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd) в каллусах штамма 1с составляет 8,1 ± 1,1 мг/г сухой массы.

Выхода гинзенозидов в среду культивирования не наблюдается.

Штамм 1с продуцирует гинзенозиды в количествах, сравнимых с их содержанием в корнях плантационных растений (табл. 2).

Культура продуцирует редкие гинзенозиды Rg2 и NG-R2, характеризуется стабильными соотношениями
Rb-группа/Rg-группа 0,12 0,17
Гликозид Re/гликозид Rg1 1,4 1,7
Использование штамма 1с в качестве продуцента гинзенозидов и способ получения гинзенозидов иллюстрируется следующим примером.

В колбы Эрленмейера емкостью 100 мл наливают по 40 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды:
NH₄NO₃ 400
KNO₃ 1900
CaCl₂ • 2H₂O 440
MgSO₄ • 7H₂O 370
KH₂PO₄ 170
H₃BO₃ 6,2
MnSO₄ • 4H₂O 22,3
CoCl₂ • 2H₂O 0,025
CuSO₄ • 5H₂O 0,025
ZnSO₄ • 7H₂O 8,6
Na₂MoO₄ • 2H₂O 0,25
KJ 0,83
FeSO₄ • 7H₂ 27,8
Na₂EDTA • 2H₂ 37,3
Тиамина гидрохлорид 0,2
Пиридоксина гидрохлорид 0,5
Никотиновая кислота 0,5
Мезо-инозит 100
Казеина гидролизат
100
4-хлорофеноксиуксусная кислота (4-СРА) 0,4
Сахароза 25000
Агар 6000
pH среды 5,60
Колбы со средой автоклавируют при температуре 117^oC в течение 20 мин, затем охлаждали. В асептических условиях в каждую колбу помещают по 100 мг клеточной биомассы штамма 1с. Культивирование проводят в темноте при 24^oC и относительной влажности воздуха 60% в течение 30 суток. В каждой колбе накапливается от 1 до 1,5 г сырой биомассы. После лиофильной сушки каллусов в них определяют содержание гинзенозидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) масс-спектроскопии.

Выделение суммарной гликозидной фракции. Один грамм измельченной лиофильно высушенной ткани экстрагируют трижды 85% водным метанолом при перемешивании. Объединенный раствор упаривают досуха при 50^oC на роторном испарителе. Осадок после испарения экстрагируют пентаном (5 мл х 2) и насыщенным водой н-бутанолом (5 мл х 3). Промытый 5 мл воды бутанольный экстракт при тех же условиях упаривают до сухого остатка, который и составляет суммарную гликозидную фракцию (СГФ).

Анализ ВЭЖХ. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии анализируют раствор СГФ концентрацией 10 30 мг/мл. Разделение проводят на хроматографе "Милихром" со стальной колонкой 64х2 мм, заполненной сорбентом Spherisorb ODS 5 мл. На колонку наносят 10 15 мкл раствора СГФ. Элюцию осуществляют градиентом смеси ацето-нитрил вода в соотношении от 20:80 до 50:50 объемных процентов. Детектирование элюата осуществляют при 204 нм. Время разделения 20 мин при скорости подачи растворителя 100 мкл/мин.

Значения индексов удерживания индивидуальных гликозидов приведены в табл.3.

Анализ масс-спектров.

а) Плазменно-десорбционные масс-спектры (ПДМС) с расположением осей источник-мишень-детектор. Активность источника 10 мккюри. На мишень, покрытую нитроцеллюлозной матрицей, наносят 3 мкл метанольного раствора фракций после ВЭЖХ.

б) Бомбардировка ускоренными атомами.

Эксперименты выполнены на FINIGANN MAT 8030 инструменте с FN11 источником ускоренных атомов, 8 кВ, 1 мкА. На мишень наносят мкл раствора фракции после ВЭЖХ, метанол отгоняют струей теплового воздуха, затем добавляют 1 мкл глицерина и проводят измерения.

Получены следующие величины m/z ионов гликозидов, специфических для штамма 1 с:
Величины m/z ионов:
MNa⁺793 (M 770) NG-R2;
MNa⁺807 (M 784) Rg2;
MNa⁺1131 (M 1108) Rb1;
M-H 769 (M 770) NG-R2;
M-H 783 (M 784) Rg2
Содержание гинзенозидов представлено в таблице 4.

Таким образом, заявляемым способом, использующим штамм 1с каллусной культуры растений Panax ginseng C.A. Mey продуцент гинзенозидов в количествах, сравнимых с их содержанием в плантационных корнях интактных растений женьшеня настоящего, получен спектр гинзенозидов Rg1, Re, Rf, NG-R2, Rg2, Rb1, Rc, Rb2, Rd, из которых Rg2 и NG-R2 являются редкими. Штамм 1с характеризуется стабильными соотношениями:
Rb-группа/Rg-группа 0,12 0,17;
Гликозид Re/гликозид Rg1 1,4 1,7. ТТТ1 ТТТ2

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: получен штамм клеток Panax ginsing C.A. Mey ВС КК-ВР N 41 - продуцент гинзенозидов. Способ получения гинзенозидов заключается в культивировании на питательной среде указанного штамма и выделении целевого продукта. При этом питательная среда содержит нитраты аммония 350 - 450 мг/л и дополнительно в нее вводят тиамин гидрохлорид 0,15 - 0,25 мг/л, пиридоксина гидрохлорид 0,45 - 0,55 мг/л, никотиновую кислоту 0,45 - 0,55 мг/л, мезо-инозит 80 - 100 мг/л, казеина гидролизат 80 - 120 мг/л и 4-хлорфеноксиуксусную кислоту 0,35 - 0,45 мг/л. 2 с.п. ф-лы, 4 табл.

1. Штамм культуры клеток Panax ginseng C.A. Mey ВСКК-ВР N 41 продуцент гинзенозидов. 2. Способ получения гинзенозидов путем выращивания штамма-продуцента на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы, стимуляторы роста, сахарозу и агар, и последующего выделения целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм культуры клеток Panax ginseng C. A.Mey ВСКК-ВР N 41, при этом питательная среда содержит нитрат аммония 350 - 450 мг/л и дополнительно в нее вводят тиамин гидрохлорид 0,15 0,25 мг/л, пиридоксина гидрохлорид 0,45 0,55 мг/л, никотиновую кислоту 0,45 0,55 мг/л, мезо-инозит 80 120 мг/л, казеина гидролизат 80 120 мг/л и 4-хлорфеноксиуксусную кислоту 0,35 0,45 мг/л.