СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ "ИСКУССТВЕННЫХ СЕМЯН" ИЗ КУЛЬТУРЫ КОРНЯ ШЛЕМНИКА БАЙКАЛЬСКОГО (Scutellaria baicalensis Georgi) Российский патент 2011 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Область применения.

Изобретение относится к области физиологии растений, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в промышленном производстве лекарственного сырья корневого происхождения для фармакологической, пищевой и косметологической отраслей.

Уровень техники.

Идея создания так называемых «искусственных семян» (ИС) возникла при культивировании соматических эмбрионов растений, которые заключали в искусственный эндосперм и ограничивали искусственной семенной оболочкой [Murashige Т. Plant growth substances in commercial uses of tissue culture. In Frontiers of Plant Tissue Culture, edited by T.Thrope, pp.15-26, Calgary: International Association of Plant Tissue Culture (1978)].

В дальнейшем понятие ИС было расширено, и в настоящее время искусственными семенами называются капсулированные в гелевую оболочку не только соматические эмбрионы, но и пазушные и верхушечные почки, стеблевые и корневые сегменты, предназначенные для последующего культивирования в условиях in vitro или in vivo. В ИС копируется строение растительного семени. ИС состоит из растительной части (соматического эмбриона, почки и т.д.), капсулы (эндосперм) и иногда семенной оболочки. В семени содержатся все питательные вещества, необходимые для развития проростка. Оболочка семени защищает зародыш от высыхания и от заражения микроорганизмами.

В настоящее время техника капсулирования растительного материала используется при изготовлении ИС в основном из соматических эмбрионов и надземных частей растений.

Имеется несколько японских работ по инкапсулированию фрагментов pRi Т-ДНК трансформированных корней (называемых также культурой корня) хрена обыкновенного (Armoracia rusticana) [Uozumi N., Nakasbimada Y., Kato Y., Andy Kobayasbi T. Production of artificial seed from horseradish hairy root. J. Ferment. Bioeng., 74: 21-26 (1992)]. А также живучки ползучей (Ajuga reptans) [Uozumi N., Ohtake A., Nakashmada Y., Morikawa Y., Tanaka N., Kobayashi T. Efficient Regeneration from GUS-Transformed Ajuga Hairy Roots. J. Ferment Bioeng. 81: 374-378 (1996)].

Кроме того, проводились исследования возможного применения метода инкапсулирования фрагментов pRi Т-ДНК трансформированных корней для подготовки их к криосохранению на примере культуры корня барвинка малого (Vinca minor) [Hirata K., Mukai M., Goda S., Ishio-Kinugasa M., Yoshida K., Sakai A., Miyamoto K. Cryopreservation of hairy root cultures of Vinca minor (L.) by encapsulation-dehydration. Biotechnology Letters 24: 371-376, 2002.].

В вышеуказанных работах решались задачи микроклонального размножения растений и криосохранения растительного материала.

Однако при выращивании культуры корня шлемника байкальского основной задачей является периодическое оздоровление длительно культивируемых корней, элиминирование случайно внесенной или эндогенной бактериальной инфекции и сохранение жизнеспособности корней при длительном хранении в условиях низких положительных температур.

Задача.

Задачей создания нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi) является оздоровление культуры корня, элиминирование бактериальной инфекции и сохранение жизнеспособности корней при длительном хранении в условиях низких положительных температур.

Решение задачи.

Поставленная задача решается использованием нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), заключающемся в сегментировании корней на 2-3 мм фрагменты, их капсулировании в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран в концентрации 300-550 мг/л, с последующим хранением.

Сущность изобретения.

Сущность нового способа получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского заключается в иммобилизации при низких положительных температурах фрагментов молодых участков корней в гелевых капсулах, содержащих питательные вещества и антибиотик. Локальное действие антибиотика способствует более точному проникновению в клетки корней и элиминированию эндогенной бактериальной инфекции. Питательные вещества гелевого матрикса поддерживают жизнеспособность корневых фрагментов при их хранении в условиях низких положительных температур, а отсутствие в ИС экзогенных регуляторов роста не изменяет морфологию корней и состав их вторичных метаболитов. Таким образом, при воспроизведении культуры корня шлемника байкальского из ИС можно получить оздоровленную, хорошо растущую и продуктивную массу корней.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Искусственные семена получают из культуры корня шлемника байкальского, культивируемой в условиях in vitro, но содержащую случайно внесенную или эндогенную бактериальную инфекцию.

Периферийные участки корней вручную разрезают на фрагменты длиной 2-3 мм, которые затем смешивают с гелеподобным 3,5% раствором Na-альгината, содержащим питательные вещества культуральных сред без добавления гормональных регуляторов роста. В состав гелевого матрикса также входит антибиотик клафоран (cefotaxime) в концентрации 450 мг/л. Для закрепления геля и образования капсул используют 70 мМ раствор CaCl₂ - время выдерживания капсул в растворе CaCl₂ составляет 8-10 минут, после чего их промывают дистиллированной водой. Для избежания преждевременного прорастания ИС (см. чертеж) помещают на хранение в стерильные чашки Петри без питательной среды в условия низких положительных температур на 2-6 недель, проводя, таким образом, иммобилизацию корневых фрагментов. Состав питательной среды гелевого матрикса.

Среда Гамборга (В-5) мг/л сахароза 20000 NaH₂PO₄·2H₂O 169 KNO₃ 250 (NH₄)₂SO₄ 134 MgSO₄·7H₂O 250 CaCl₂ 150 MnSO₄·4H₂O 13,6 Н₃ВО₃ 3 ZnSO₄·7H₂O 2 Na₂MoO₄·2H₂O 0,25 CoCl₂·6H₂O 0,025 CuSO₄·5H₂O 0,025 KI 0,75 тиамин 10 пиридоксин 1 никотиновая кислота 1 мезоинозит 100 клафоран 450

При переносе ИС после хранения при пониженных положительных температурах на питательную среду в условия +26°С активизируются корневые меристемы инкапсулированных фрагментов, что на 3-4-й день приводит к прорастанию корней через альгинатную оболочку и образованию хорошо растущей массы ветвящихся корней.

Разный состав питательных веществ гелевого матрикса ИС приводит к различной всхожести ИС после хранения при низких положительных температурах. Корневые фрагменты шлемника байкальского лучше сохраняются в оболочке со средой Гамборга (В-5), чем с другими питательными средами.

Проросшие молодые корневые кончики отделяют и помещают в жидкую питательную среду того же состава и культивируют в условиях качания (90 об/мин) в темноте до образования хорошо растущей массы корней (3-4 недели). Для контроля стерильности полученных таким образом из ИС корневых культур берут пробы культуральной среды на контаминацию. Установлено, что даже после 2-недельной иммобилизации инфицированных корневых фрагментов в оболочке, содержащей антибиотик, ИС дают начало обновленной корневой культуре шлемника байкальского, сохраняющей стерильность в течение последующих пассажей.

Ростовая активность и масса обновленной культуры корня шлемника байкальского, полученной из ИС, в течение одного пассажа почти в 2 раза превышает массу исходной культуры корней того же возраста, а общее содержание основных флавонов в пересчете на 1 г сухой корневой массы становится почти в 3 раза выше. Таким образом, общая продуктивность культуры корня существенно возрастает.

Результаты примера 1 представлены в таблицах 1 и 2.

Пример 2.

Аналогично примеру 1, за исключением уменьшенной концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе - 300 мг/л.

При концентрации антибиотика клафоран ниже 300 мг/л элиминирования бактериальной инфекции не происходит.

Результаты примера 2 представлены в таблицах 1 и 2.

Пример 3.

Аналогично примеру 1, за исключением увеличенной концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе - 550 мг/л.

При концентрациях более высоких, чем 550 мг/л, всхожесть ИС снижается вследствие ингибирования прорастания корневых сегментов, что уменьшает выход оздоровленного растительного материала.

Результаты примера 3 представлены в таблицах 1 и 2.

Результаты изобретения.

Как видно из таблицы 1, повышение концентрации антибиотика клафорана в гелевом матриксе ИС приводит к снижению всхожести ИС при хранении в условиях низких положительных температур. Понижение же содержания антибиотика ведет к риску недостаточного элиминирования бактериальной инфекции в культуре корня шлемника байкальского.

В таблице 2 приведены основные показатели продуктивности культуры корня шлемника байкальского. Как можно видеть, обновленная культура корня, полученная из ИС, по ростовой активности и массе корней в течение одного пассажа почти в 2 раза превышает массу исходной культуры корня того же возраста, которая была ослаблена внезапно проявившейся бактериальной инфекцией. Кроме того, общее содержание основных флавонов в пересчете на 1 г сухой корневой массы в обновленной культуре корня шлемника байкальского становится почти в 3 раза выше, и соответствует содержанию флавонов в стабильно растущей исходной неинфицированной культуре.

С помощью способа получения ИС из длительно растущей культуры корня шлемника байкальского получена оздоровленная культура, не проявляющая признаков бактериальной инфекции в течение полутора лет и имеющая более высокие показатели ростовой активности и содержания основных флавонов, по сравнению с исходной культурой корня. В ИС сохраняется стерильность и жизнеспособность корневых фрагментов при их длительном хранении в условиях низких положительных температур.

Таблица 1. Жизнеспособность ИС в зависимости от концентрации антибиотика в гелевом матриксе и сроков хранения при низких положительных температурах. Концентрация антибиотика клафоран в оболочке ИС, мг/л Всхожесть ИС после разных сроков хранения, % 2 недели 4 недели 6 недель 300 90 85 85 450 90 82 80 550 80 75 70

Таблица 2. Сравнительная оценка продуктивности 6-недельной культуры корня шлемника байкальского, выращиваемой в колбах, до и после применения нового способа получения ИС. Основные показатели Исходная неинфицированная корневая культура Инфицированная корневая культура до обновления Корневая культура, полученная из ИС Сырой вес корней, г 18,5±1,3 11,4±1,3 19,3±1,5 Доля сухого вещества, % 6,3±0,2 9,9±0,2 6,4±0,2 Содержание основных флавонов, мг/г сух.в. 22,4±0,2 8,2±0,1 21,4±0,4 Содержание флавонов в 6-недельной культуре, мг/колба 26,1±0,3 9,3±0,2 26,4±0,4

Корни шлемника байкальского разрезают на сегменты размером 2-3-мм. Полученные сегменты капсулируют в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран. Концентрация клафорана составляет 300-550 мг/л. Способ позволяет получить оздоровленную культуру, не проявляющую признаков бактериальной инфекции в течение полутора лет и имеющую более высокие показатели ростовой активности и содержания основных флавонов, по сравнению с исходной культурой корня. Полученные «искусственные семена» сохраняют жизнеспособность корневых фрагментов при их длительном хранении в условиях низких положительных температур. 1 ил., 2 табл.

Способ получения «искусственных семян» из культуры корня шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), заключающийся в сегментировании корней на 2-3-мм фрагменты, капсулировании их в альгинатную оболочку, содержащую безгормональную питательную среду Гамборга с добавлением антибиотика клафоран в концентрации 300-550 мг/л, с последующим хранением.